Conceptos clave tema 1: Introducción • • • • • • • • • • • • Teoría celular La célula como unidad fundamental del ser vivo Pasteurización Postulados de Koch Sopa primitiva y experimento de Stanley Miller Dogma central de la biología molecular Categorización de los seres vivos (complejidad, fenotipo y genotipo) Eucariota / Procariota (tabla) Teoría endosimbiótica Árbol filogenético y cronómetro evolutivo Los 3 dominios Clasificación de los microorganismos (celulares y acelulares) 2. Determinación de organismos de interés biotecnológico. Introducción a biología celular y microbiología. Teoría celular, el origen de la vida, tipos de células, teoría endosimbionte taxonomía y filogenia. Microbiología I. Células Procariotas: Taxonomía, morfología, estructura, nutrición y reproducción. Procariotas de interés biotecnológico. Microbiología II. Células Eucariotas: Taxonomía, morfología, estructura, nutrición y reproducción. Eucariotas de interés biotecnológico. Membranas e interacción con el medio: La membrana celular y el transporte. Estructura de la membrana. Transporte activo y pasivo. Ósmosis. Endocitosis. Exocitosis. Genética básica: La replicación, la transcripción y la traducción del ADN. Código genético y síntesis de proteínas. Conceptos de gen y de cromosoma (exones e intrones). Microbiología III. Virus: Tipos, estructura, reproducción. Utilidades y potenciales aplicaciones biotecnológicas. Viroides y priones. Biología de organismos superiores I. Células animales: Tejidos, órganos y sistemas básicos. Inmunidad y oncología básica. Diferenciación y cel. madre. Animales y cel. animales de interés biotecnológico. Biología de organismos superiores II. Células vegetales: Anatomía y tejidos vegetales. Agua y otros nutrientes. Factores externos y diferentes cultivos. Plantas y cel. vegetales de interés biotecnológico. PRINCIPIOS DE BIOTECNOLOGÍA 2. DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO: 2. 2 Microbiología I. Células Procariotas ❑ Morfología y tamaño ❑ Reproducción y crecimiento ❑ Estructura y funciones ❑ Introducción a genética bacteriana ❑ Movimiento y tactismos ❑ Resumen Bacteria y Archaea ❑ Nutrición y metabolismo ❑ Procariotas de interés Víctor Nájera – Alesón [email protected] Procariotas Bacteria Archaea MORFOLOGIA DE LA BACTERIA Procariotas: Bacteria y Archaea Forma: - Coco: esférica u ovoide - Bacilo: cilíndrica o de bastoncillo - Filamentosos: filamentosa - Hifas: filamentos largos multinucleados - Bacilos largos retorcidos: espirilos y espiroquetas MORFOLOGIA DE LA BACTERIA Procariotas: Bacteria y Archaea Agrupaciones MORFOLOGIA DE LA BACTERIA Procariotas: Bacteria y Archaea Tamaño: -De 0,3 (Mycoplasma) a 7 μm (Oscillatoria) de diámetro -Existen bacterias tan grandes como células eucariotas -E.coli: 1,1 a 1,5 μm de ancho y de 2 a 6 μm de largo) BACTERIAS GIGANTES Epulopiscium fishelsoni Thiomargarita namibiensis Estructura de célula procariota Membrana plasmática. • Rodea el citoplasma de procariotas y eucariotas • Barrera con permeabilidad selectiva, punto clave de contacto entre medio intra y extra celular. • Compuesta por: Lípidos y proteínas Lípidos anfipáticos que forman bicapas Fosfolípidos: ácidos grasos (hidrofóbicos) + glicerol (hidrofílico) • Ausencia de esteroles presentes en eucariotas • Presencia de hopanoides, similares a esteroides (estabilidad) • 5 a 10 nm de grosor Esterol (colesterol, eucariotas) Hopanoide (diplopteno, procariotas) Membrana plasmática. • Los lípidos de membrana de Arqueas son diferentes • Unidos por enlaces éter (en vez e éster) • No poseen ácidos grasos, sino hidrocarburos: - Diéteres y tetraéteres de glicerol - Tetraéteres está unidos covalentemente formando una monocapa de mayor resistencia (hipertermófilas) Membrana plasmática. Modelo del mosaico fluido Singer y Nicholson (1972) Bicapa lipídica * proteínas periféricas: 20-30% del total solubles en soluciones acuosas algunas son lipoproteínas * proteínas integrales: 70-80% del total insolubles en soluciones acuosas anfipáticas pueden llevar unidos hidratos de carbono (Glicoproteinas) - Estabilidad por puentes de H e interacciones hidrofóbicas. Membrana plasmática. Funciones Retiene el citoplasma y lo separa del medio exterior Barrera selectivamente permeable en ambos sentidos Porta los sistemas de transporte específicos para muchas sustancias Lleva a cabo procesos metabólicos (respiración, fotosíntesis, síntesis de lípidos…) Favorece la diferencia de potencial entre el medio exterior e interior para generar energía (ATP) Tiene moléculas receptoras específicas Sistemas internos de membranas: Aumenta la proporción superficie /volumen Mesosomas: - Invaginaciones de la membrana plasmática (vesículas, tubos, lamelas) - Próximos a los cromosomas. Plegamientos internos extensos: - en cianobacterias, bacterias púrpuras, etc - mayor actividad metabólica La pared celular • Capa rígida que cubre la membrana plasmática • Da forma y protege de la lisis osmótica ¿ÓSMOSIS? • Morfología diferente en bacterias: Tinción de Gram: Gram+ y Gram• Gram+: pared de peptidoglicano (o mureína), de 20-80 nm • Gram- : capa de peptidoglicano de 2-7 nm rodeada por una membrana externa de 7-8 nm *La pared de Gram positivas en mas fuerte Bacillus subtillis (gram +) Escherichia coli (gram -) Ósmosis y pared celular La presión osmótica dentro de una bacteria puede llegar a 2 atm Procariotas sin pared celular: excepciones! Micoplasma: patógeno, esteroles de membrana (gram+ ¿?) Thermoplasma. Arquea, extremófila. Lipoglicanos de membrana La pared celular Protege a las bacterias de destrucción por la presión osmótica: -Lisis en hábitat hipotónicos -Plasmólisis en hábitat hipertónicos *Lisozima (ENZIMA antibacteriana): Saliva, lagrimas, mucosa… rompe el enlace entre NAM y NAG En solución isotónica: Protoplastos: bacterias Gram+ sin peptidoglicano Esferoplastos: bacterias Gram-con membrana externa y parte de peptidoglicano **Penicilina (antibiótico): inhibe la síntesis del peptidoglicano La pared celular - Envoltura celular: pared y cápsulas si existen - Espacio periplásmico en Gram+ y GramSupone un 20-40% del volumen total de la envoltura celular •en Gram-: hay proteínas (captación de nutrientes, respiración, transporte, síntesis de peptidoglicano…). •en Gram+: casi no hay espacio, no hay tantas proteínas, las secretan (exoenzimas). Peptidoglicano o mureína. Componente estructural de la pared. Gran polímero formado por subunidades idénticas: - N-acetil glucosamina (NAG) y N-acetil murámico (NAM)+ 4 amino ácidos (tetrapéptido) - Acido D- glutámico - Alanina (D- y L-) - L-Lisina - Ácido meso-diaminopimélico (DAP) *no están presentes en proteínas. La pared celular Gram - Peptidoglicano o mureína. En Gram+ tiene además cadenas entrecruzadas de 5 glicinas (pentaglicina) Existe gran variabilidad en la estructura del peptidoglicano y en los aa que forman el tetrapéptido. (se conocen más de 100 tipos) Gram - : Gram + Gram + La pared celular GRAM + - Mureínas (peptidoglicano) enlazadas por puentes peptídicos (pentaglicina) - Ocupa el 90% de la pared, en una o varias capas - Muchos ácidos teicoicos (polímeros de glicerol y ribitol unidos por fosfatos) unidos a D-ala y glucosa Unidos en unión covalente al peptidoglicano (ac. teicoico – NAM): Carga negativa de la superficie celular Unidos a veces a lípidos de membrana: Ac. Lipoteicoicos La pared celular GRAM - La capa de peptidoglicano no está entrelazada y es un 10% de la pared celular. Tienen una membrana externa (que cubre el peptidoglicano) En el medio se encuentra el espacio periplásmico: gelatinoso (alta concentración de proteínas, sustratos y productos del metabolismo de proteínas) Membrana externa. Es una bicapa lipídica pero no igual que la membrana plasmática Contiene además de fosfolípidos y proteínas: - Lipopolisacáridos(LPS) Polisacáridos unidos covalentemente a los lípidos de membrana. *Es lo mas característico - Hay zonas de contacto directo con la membrana plasmática: zonas de adhesión La membrana externa es una barrera protectora y además es permeable a ciertas sustancias (modulo 2.4) - Existen canales estrechos formados por 3 moléculas de porina - Existen transportadores específicos para proteínas mayores de 700 da - … La pared celular GRAM - La pared celular GRAM LPS - Tiene mucha variabilidad entre bacterias y entre cepas - Permite la adhesión en de bacterias patógenas a células y tejidos huésped - Es el causante de las reacciones inmunitarias innatas más comunes aunque también induce tolerancia en algunos casos Estructura •Lípido A: -2 glucosaminas unidas a 3 ac. grasos y un fosfato insertado en la mb externa -Puede ser tóxico (endotoxina) •Core o núcleo: 10 azúcares poco comunes unidos al péptido A •Cadena lateral O: - Cadena polisacarídica - Puede tener azúcares peculiares - Estructura de defensa frente al huésped - Contribuye a la carga negativa de la superficie - Estabilización de la estructura de la membrana Tinción Gram Christian Gram (1853 - 1938) 1. Recogida de muestra y fijación 2. Coloración: Cristal Violeta+ : Colorante. Lugol (disolución de Iodo I2-): mordiente. Cristal violeta – Iodo (complejo insoluble) 3. Decoloración: Alcohol- acetona (Paso diferencial) decolorante, disuelve el complejo. Disolvente orgánico: destruye los lípidos y deshidrata el peptidoglicano 4. Contraste: Safranina: Colorante Componentes externos a la pared celular: Confieren protección, fijación y permiten su desplazamiento Capa S Muy común en arqueas y presente en algunas bacterias Gram + y Gram –. Compuesta de proteínas o glicoproteínas ordenadas y veces polisacáridos. En Gram- adherida a la membrana externa (LPS) En Gram+ directamente asociada al peptidoglicano Da forma y rigidez a las bacterias y permite su adhesión a superficies Funciones: Refuerzo estructural. También interfase filtros y redes de retención Protege frente a cambios de pH, [iones], enzimas, estrés osmótico, ataque de agentes patógenos, fagocitosis, etc.. Glicocálix: Capsula y capas mucosas (slime o limo) Capa S: Thermonaerobacter Célula *BIOFILMS Capa externa a la pared celular. Compuesta principalmente de polisacáridos que interaccionan con la pared y con el material donde habita la bacteria. Diferentes niveles de hidratación. (cápsula o mucosa) Confieren ventajas como la adhesión, deslizamiento, resistencia a la desecación y protección frente al sistema inmune del hospedador. Cápsula: Rhizobium trifoli Cápsula Apéndices bacterianos Son estructuras filamentosas que sobresalen en la superficie celular. Hay bacterias que no tienen ningún apéndice Fimbrias y Pelos (pili ) Son tubos huecos, formados por proteínas que aparecen en la superficie externa de algunas bacterias. Las fimbrias son cortas y muy numerosas, y sirven para que la célula pueda fijarse al sustrato (tejidos animales en patógenos, p.ej: en humanos Salmonella (salmonelosis) o para crear biofilms. Los pili son largos y sólo aparecen uno o dos por bacteria. Casi exclusivas de Gram- en el proceso de conjugación, intervienen en el intercambio de material genético con otras bacterias. A veces también están implicados en colonización y un tipo raro de movimiento (deslizamiento) Flagelos Apéndices locomotores. Estructuras delgadas y rígidas de 20 nm de ancho y 15-20 mm de largo El nº de flagelos varía en las distintas bacterias: • monotricas, 1 flagelo • anfitricas, 1 flagelo en cada polo • lofotricas, un grupo de flagelos en uno o ambos extremos • peritricas, distribución uniforme por la superficie Movimiento bacteriano Movimiento flagelar: Hélice rígida que gira y produce el movimiento de velocidad variable (270rps E.coli - 1100rps Vibrio) la dirección de rotación determina acelerar o frenar (agujas del reloj). El motor en la base del flagelo no se conoce el mecanismo de rotación (turbina de protones (1000 protones /r)). El movimiento se produce a través de carreras, tumbos y re-orientación al azar. Tactismos: movimiento en respuesta sensorial Quimiotaxis: en respuesta sustancias químicas atrayentes o repelentes: A través de receptores de membrana y cascadas de activación se “pone en marcha” el motor flagelar. Experimentos de demostración con capilar. *Tb otros tactismos como Fototaxis Percepción de quorum Mecanismo por el cual las bacterias evalúan su densidad de población antes de iniciar una respuesta que requiera de una cierta densidad celular para surtir efecto. Por ejemplo, una bacteria patógena o la formación de una Biofilm Molécula señal: Autoinductor. Difunde libremente a través de las membranas. Cuando hay alta concentración en el interior celular significa que hay muchas bacterias de su especie cercanas. El autoinductor se une a una proteína activadora que activa la transcripción de genes específicos. El más estudiado es AHL (lactonas de acilhomoserina) Bioluminiscencia por percepción de quorum Aliivibrio fischeri Genoma bacteriano Genoma: todo el DNA presente en una célula o virus Gran diversidad en tamaño y geometría Procariotas: 1 juego de genes (1N, solo una dotación cromosómica) y a menudo poseen elementos genéticos extracromosómicos: Plásmidos Plásmido: Pequeña molécula de ADN circular separado del cromosoma. Se replican de forma independientemente. Pocos genes, algunos de resistencia a los antibióticos. Todas las Archaea y la mayoría de bacterias tienen un cromosoma de DNA circular de doble cadena superenrollado. El número de cromosomas es variable, generalmente 1 El cromosoma bacteriano se compacta en el nucleoide y está asociado a proteínas. NO tiene membrana ni envuelta. Resumen funciones estructurales procariotas Cápsula o capas de limo: Resistencia a fagocitosis y adherencia a superficies. Pared bacteriana: Cuerpos de inclusión Soporte estructural y de protección frente riesgo de lisis en ciertos medios. Barrera semipermeable, límite mecánico celular, transporte de nutrientes y desechos, localización de muchos procesos metabólicos (respiración, fotosíntesis), captación de señales y quimiotaxis. Contiene enzimas hidrolíticas y proteínas de unión para el procesamiento y consumo de nutrientes. Almacenamiento de carbono, fosfato, etc. Vacuolas de gas Flotabilidad en medio acuoso Nucleoide Localización del material genético ADN Ribosomas Sintesis de proteinas Fimbrias y pilus (pili) Adhesion a superficies y "apareamiento celular" Flagelo Movimiento Endosporas Supervivencia en condiciones extremas Membrana plasmática: Espacio periplasmico • • • Estructura altamente conservada DNA “libre” sin encapsular Ausencia de orgánulos Reproducción de los seres vivos: Crecimiento bacteriano Tiempo de generación Fisión binaria Proteínas FtsZ presentes en Archaea, Bacteria, mitocondrias y cloroplastos. *Muestra similitud con al tubulina eucariota - Replicación del DNA: proteínas Min (MinE) interaccionan con los nucleoides antes de que se forme el anillo FtsZ - Determinación del punto medio real. - Divisoma: Anillo de FtsZ alrededor del cilindro celular hacia dentro (10.000 moléculasaprox.) define el plano de división celular. También hay proteínas de síntesis de peptidoglicano. Dirige la síntesis de nuevos materiales de pared y membrana. - Constricción para formar las dos células hijas: despolimerización del anillo FtsZ. Síntesis de pared hacia el interior FtsZ tiene energía para la polimerización/despolimerización Crecimiento de poblaciones microbianas. Incremento del número de células o de masa Curva de crecimiento Fase de latencia(fase lag) - No hay incremento neto de masa. Fase exponencial o logarítmica(log) - Crecimiento y división al máximo nivel posible. - Velocidad de crecimiento constante. *Logaritmo: Exponente al que hay que elevar un número, llamado base, para obtener otro número determinado. Fase estacionaria. - Cesa el crecimiento de la población - Aprox:109células/ml en bacterias). - Limitación de nutrientes - Acumulación de residuos tóxicos. Fase de muerte. - Disminución del número de células viables - Muerte: pérdida irreversible de la capacidad de dividirse - Hay células particularmente resistentes - Representación gráfica del incremento del número de células del cultivo con el tiempo. Cultivo discontinuo o cerrado. Si representamos el logaritmo del nº de células frente al tiempo Endosporas bacterianas - Estructuras latentes muy resistentes a calor (algunas hasta más de 140ºC), radiación, desecación, agentes químicos, etc. - NO SON ESPORAS!!! (de plantas, levaduras y algunos tipos de bacterias) - En algunas bacterias Gram+ (Bacillus, Clostridium son los mas estudiados). - Algunos formadores de endosporas son patógenos. Estructura de la endospora Endosporas bacterianas Termorresistencia: - 15% del peso seco es ácido dipicolínico con Ca2+. Proteínas ácido solubles ligadas al DNA (SASP) Cubierta de la espora Enzimas reparadoras del DNA Eliminación de agua del protoplasto por el córtex (deshidratación 90 -75 % menos de agua). Formación de la endospora o esporulación. - Cuando hay falta de nutrientes y cesa el crecimiento. Más de 200 genes implicados. Proceso complejo y rápido (8 horas en Bacillus subtilis). - Germinación: activación por calor y presencia de nutrientes, suele durar minutos. ¿Cuánto tiempo puede sobrevivir una espora? Nutrición Macronutrientes: Carbono C, nitrógeno N, hidrogeno H y oxígeno O. Micronutrientes: Fósforo P, potasio K, azufre S, magnesio Mg. Elementos traza: Zinc, cobre, manganeso, molibdeno, cobalto. Carbono: el 50% del peso seco de una célula media. Presente en todos los compuestos orgánicos: aminoácidos, ac. grasos, azucares… Puede ser asimilado a partir de otras moléculas obteniendo energía y ser reutilizado para formar otras biomoléculas. Puede ser asimilado del CO2 para construir las biomoléculas y obtener la energía de la luz o de compuestos inorgánicos (NH3, NO2-, H2S, S2O, Fe2+...). Nitrógeno: 12% del peso seco de una célula media. Muy importante para ácidos nucleicos (ADN, ARN) y proteínas. Puede ser de origen orgánico e inorgánico, la mayor parte de las bacterias pueden usar NH3 (amoniaco) y algunas incluso N2 gaseoso (bacterias fijadoras de nitrógeno). Metabolismo y Bioenergética: Reacciones endergónicas y exergónicas, energía libre ∆G Oxidación – Reducción Agentes reductores (trasportadores de electrones) Aceptor final de electrones Conservación de la energía: ATP Adenosín trifosfato 1. La forma en la que el organismo obtiene la energía para vivir y crecer: Quimiótrofo. La energía se obtiene de compuestos químicos externos Fotótrofo. La energía se obtiene de la luz. 2. Obtención de carbono: Autótrofo. El carbono se obtiene del dióxido de carbono (CO2). Heterótrofo. El carbono se obtiene de compuestos orgánicos (glucosa…). Mixótrofo. El carbono se obtiene tanto de compuestos orgánicos como fijando el dióxido de carbono. 3. Reductores para biosíntesis y energía: Litótrofo. Los equivalentes reductores se obtienen de compuestos inorgánicos. Organótrofo. Los equivalentes reductores se obtienen de compuestos orgánicos (carbono). 4. Aceptor final de electrones en la respiración: Aerobio: SI RESPIRACIÓN Anaerobio: NO FERMETACIÓN Dominio Bacteria - Procariotas: Gram+ y Gram- en función de la estructura de la pared celular - Clasificación por sus propiedades fenotípicas y genotípicas - Reproducción mediante fisión binaria - Paredes celulares compuestas por peptidoglicano - Gran variedad de tipos nutricionales y rutas metabólicas - Miles de bacterias en el organismo humano y en todos los hábitat naturales Dominio Archea Diversidad morfológica: - Fenotípicamente similares a eubacterias - Esféricos, bacilos, espirales lobulados, irregulares o pleomórficos - Tinción Gram: grampositivos y gramnegativos - Unicelulares, filamentos o agregados - Reproducción: fisión binaria, gemación, fragmentación u otros mecanismos Diversidad fisiológica: - Aerobios, anaerobios facultativos o anaerobios estrictos - Quimiolitoautótrofos a organotrofos - Mesófilos e hipertermófilos (+ 100 ºC) Hábitat: - Ambientes extremos acuáticos y terrestres - Ambientes anaerobios - hipersalinos /altas temperaturas /ambientes fríos - 34 % biomasa procariota en aguas costeras superficiales del Antártico - Especies simbióticas digestivo animales - No causan enfermedades conocidas en humanos
