Practica AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN DE AZUCARES TOTALES Introducción Los carbohidratos o hidratos de carbono son compuestos con estructura de polihidroxialdehído o de polihidroxicetona; son la fuente más abundante y barata de los alimentos de la naturaleza y por lo tanto los más consumidos por los seres humanos (en muchos países constituyen de 50 a 80% de la dieta del pueblo); los provenientes de las especies del reino vegetal son más variados y abundantes que los del reino animal. Son los principales compuestos químicos almacenadotes de la energía radiante del sol; de hecho, la glucosa sintetizada en las plantas por el proceso de fotosíntesis representa la materia prima fundamental para la fabricación de la gran mayoría de ellos: el bióxido de carbono reacciona con agua para formar glucosa, con el consecuente desprendimiento de oxígeno: 6CO2 + 12H2O C6H12O6 + 6º2 + 6H2O. A su vez, mediante diversas rutas bioquímicas, este azúcar da origen a muchos otros como la sacarosa y la fructosa, o bien a polímeros como la celulosa y el almidón. Introducción. La estructura química de los carbohidratos determina su funcionalidad y las características repercuten de diferente manera en los alimentos, principalmente en el sabor, viscosidad, la estructura y el color. Es decir, las propiedades de los alimentos, tanto naturales como procesados, dependen del tipo de carbohidrato que contenga y las reacciones en que estos intervienen Fundamento Los carbohidratos serán destruidos por calor y por ácido, son particularmente sensible a ácidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simples, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos obscuros o compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol. Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que estos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. La forma en que procede la reacción no es estequiometria y depende de la estructura del azúcar, por lo tanto se realiza una curva patrón (Nielsen, 1998). Objetivo El estudiante se concientizará del concepto y los instrumentos de medición utilizados en la espectrofotometría, y de la aplicación de curvas estándar utilizando el método de Carnal y Black, (1986). Material (por equipo). Pipetas graduadas de 1, 5 y 10mL Micropipetas de 1000 mL Centrifuga Tubos de ensaye de 10 y 15 mL Gradilla Espectrofotómetro Matraces aforados de 25mL Baso deprecipitado Baño de María Reactivos Agua destilada Etanol 80% Antrona H2SO4 Extracción de azucares. Pesar un gramo de muestra y depositarlo en un tubo, se adiciona 5mL de etanol (80%) se mezcla y se calienta en baño María a 75 °C por 5minutos. Se centrifuga a 10,700 rpm por 5min a -4°C. NOTA El procedimiento anterior se realiza dos veces con el fin de asegurar una buena extracción. La mezcla de sobrenadantes obtenidos se centrifuga a 13,100 rpm durante 25 minutos a –4°C. El sobrenadante obtenido se afora a 25 mL con etanol (80%). Se toman alícuotas para evaluar el contenido de azúcares totales presentes en la muestra procesada. Contenido de azúcares totales. Se toma una alícuota de 0.1 mL del sobrenadante aforado, se añaden 2 mL de reactivo de Antrona, el blanco de calibración se prepara con agua destilada, se agitan y se colocan los tubos en baño María a 80°C durante 10 minutos y enfriar durante 2 minutos. Leer a 620 nm. Se elabora una curva estándar, empleando diferentes concentraciones de glucosa. Reactivo de Antrona: 200mg en 100 ml de H2SO4 95-98%. Elaboración de curva de calibración. Se prepara una solución stock de Glucosa haciendo una dilución 200mg/L (200 ppm). Se pesan 100mg de Glucosa y se afora con agua. En la siguiente tabla se indica las diluciones en mL que se llevan a cabo para realizar la curva patrón. Para este trabajo las lecturas se anotan en la siguiente tabla. Agua mL 1 2 3 4 muestra 1 0.75 0.5 0.25 0.5 Solución stock mL 0 0.25 0.50 0.75 0.5 Antrona mL 2 2 2 2 2 Absorbancia Figura 1. Ejemplo de recta de calibrado de glucosa Cuantificación e interpretación de los resultados A partir de los valores de absorbancia obtenidos de cada concentración de glucosa se construirá la correspondiente recta de calibrado. ¿Cómo se pueden cuantificar los azucares en la muestra de alga con los datos de la recta patrón? Para ello hay que sustituir el valor de la absorbancia obtenida para la muestra de alga en la ecuación de la recta de calibrado (valor de la ordenada, “y”) y despejar “x” que corresponde a la concentración de ácido gálico en el zumo. Veámoslo con un ejemplo: si hemos obtenido un valor de absorbancia de 0,590 → x= (0,590-0,2985)/0,1018 = 2.86 mg/L de glucosa de la alga. Despeje X = (y + 0.1245)/0.1636 Solución X = (0.509 + 0.1245)/0.1636 = 3.87 mg/L de glucosa Bibliografía A.O.A.C. Official Methods of Analysis. 1980. Horwitz W. (ed). Ed. 13th. Washington, U.S.A. Carnal C W, C C Black (1989) Soluble sugars as the carbohydrates reserves for CAM in pineapple leaves. Plant Physiol. 90: 91-100. NIELSEN S.; Food Analysis Second Edition; An Aspen Publication, Gaithersburg, Maryland. 1998. Ting, S.V. 1956. Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food Chem. Vol. 4(3) 263-266.
