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CINÉTICA Y PATOGENICIDAD DE Photorhabdus luminescens akhurstii SL0708 DURANTE
LA CURVA DE CRECIMIENTO EN MEDIO DE PRODUCCIÓN IN VITRO DE
Heterorhabditis indica SL0708
MARÍA TERESA OROZCO HIDALGO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
DIRECTORA
Adriana Sáenz Aponte
CODIRECTORA
Balkys Quevedo Hidalgo
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
Junio, 2018
Articulo 23 de la Resolución No.13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica
y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vean en
ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
AGRADECIMIENTOS
A mis papás, por darme la vida, quererme, apoyarme y enseñarme que con esfuerzo cualquier
sueño se puede cumplir.
A Luisa María Parrado, por su compañía, consejos, apoyo y amistad.
A Adriana Sáenz y Balkys Quevedo, por su apoyo permanente en este trabajo y la oportunidad
de ser parte de este proyecto.
A Ivonne Gutiérrez, por su colaboración en el análisis de datos.
A Alexander Rodríguez y el Departamento de Química de la Pontificia Universidad Javeriana,
por su ayuda con los métodos analíticos.
A Dios, por todo.
TABLA DE CONTENIDOS
Resumen …………………………………………………………………………………….. 1
1. Introducción ……………………………………………………………………………. 3
2. Justificación y planteamiento del problema ………………………………………….. 4
3. Marco teórico …………………………………………………………………………... 6
3.1 P. luminescens ……………………………………………………………………… 6
3.1.1 Características y generalidades ……………………………………………. 6
3.1.2 Ciclo de vida……………………………………………………………….. 6
3.1.3 Modo de acción ……………………………………………………………. 7
3.2 NEPs …………………………………………………….……………………………8
3.2.1 Definición y características ………………………………………………... 8
3.2.2 Modo de acción ……………………………………………………………. 8
3.3 Producción in vitro de NEPs ……………………………………………………........ 9
3.3.1 Definición y procedimiento ……………………………………………...... 9
3.3.2 Ventajas ……………………………...…………………………..……........ 9
3.3.3 Desventajas …………………………………….………………....…..….... 9
4. Objetivos …………………...………………………………………………………….. 10
4.1 Objetivo general ………...………………………………………………………….. 10
4.2 Objetivos específicos ……...……………………………………………………….. 10
5. Metodología …………………………………………………………………………… 11
5.1 Banco de trabajo …………………………………………………………………… 11
5.2 Curva de crecimiento microbiano ……………………………………..…………… 11
5.2.1 Producción de inóculo …………………………………………….……… 11
5.2.2 Fermentación discontinua ………………………………………...……… 11
5.2.3 Determinación de biomasa y descripción de colonias …………………… 12
5.2.4 Determinación de pH …………………………………………………….. 12
5.2.5 Determinación de azúcares reductores equivalentes a glucosa …………... 12
5.2.6 Determinación de metabolismo ……………………….…………………. 12
5.2.7 Patogenicidad en G. mellonella ………………………………………….. 13
5.3 Determinación de la fase de la bacteria ………………………………………...….. 13
5.4 Análisis de datos ………………………………………………………………..….. 14
6. Resultados y discusión ……………………………………………………………...… 15
6.1 Curva de crecimiento microbiano de P. luminescens akhurstii SL0708 en el medio de
producción in vitro de H. indica SL0708. …...………………………………………… 15
6.2 Fase y patogenicidad de P. luminescens akhurstii SL0708 ……………………...… 19
7. Conclusiones …………………………………………………………………………... 25
8. Recomendaciones ………………………………………………………………...…… 26
9. Bibliografía ……………………………………………………………………………. 27
10. Anexos ………………………………………………………………………………..... 30
10.1 Medio NBTA ……………………………………………………………………... 30
10.2 Medio LB …………………………………………………………………………. 30
10.3 Medio tripticasa de soya ………………………………………………………..… 31
10.4 Medio tripticasa de soya suplementado con 20% de glicerol ………………….…. 31
10.5 Solución salina al 0,85% ………………………………………………………….. 32
10.6 Medio de producción in vitro de H. indica SL0708 …...…………………………. 32
10.7 Curva patrón de glucosa (g/L) ………………………...………………………….. 33
10.8 Análisis de varianza (ANOVA) …………………………………………………... 33
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Características de las fases de P. luminescens. ……………………………….……… 13
Tabla 2. . Evaluación de la asimilación de carbohidratos (API 20NE) en P. luminescens
akhurstii SL0708 durante las 24, 48, 72 y 96 horas de cultivo.…………..……………….……. 24
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cinética de crecimiento de P. luminescens akhurstii SL0708 en medio de producción in
vitro de H. indica SL0708. ………………………………………………………….…………... 16
Figura 2. Modelo cinético de orden uno para A) 0-36 horas; y=0,1594x+17,388, 𝑟 2 =0,9291. B)
36-84 horas; y=0,548x+4,8394, 𝑟 2 =0,9415. …………….……………………………..……... 17
Figura 3. Colonias de P. luminescens akhurstii A)- B) en fase I; C)-D) en fase intermedia y II.
…………………………………………………………………………………………….…..… 20
Figura 4. Porcentaje de mortalidad de larvas de G. mellonella infectadas por bacterias de las 24,
48, 72 y 96 horas de cultivo durante 96 horas. ……………...………………………………….. 22
Figura 5. Sintomatología de larvas de G. mellonella causada por la infección de P. luminescens
akhurstii SL0708 de las 24, 48, 72 y 96 horas de cultivo en medio de producción in vitro de H.
indica SL0708. …………….…………………………………………………………………… 23
RESUMEN
El uso de nemátodos entomopatógenos (NEPs) como controladores biológicos en cultivos
agrícolas es una alternativa al uso de pesticidas de síntesis química, los cuales han demostrado ser
nocivos para el medio ambiente y el ser humano y además, han perdido efectividad por el
fenómeno de resistencia. Para suplir la demanda de los NEPs en campo se ha desarrollado el
método de producción in vitro, el cual a diferencia del convencional (in vivo) tiene mayor
rendimiento y es menos dispendioso. Dicho método requiere el diseño de un medio de cultivo con
composición similar al interior de las larvas de insectos y la capacidad de la bacteria simbionte
(para Heterorhabditis sp. es Photorhabdus luminescens) de digerir la biomasa del insecto, en este
caso los componentes del medio diseñado. Una de las mayores dificultades del método es
determinar el tiempo de inoculación de juveniles infectivos (JIs) debido el cambio de metabolismo
al cultivar la bacteria in vitro, donde la bacteria pasa de ser apta para digerir el medio (fase I) a no
ser apta para esta función (fase intermedia y II). Esta capacidad está dada principalmente por la
producción de enzimas líticas, antibióticos y “señales de alimentación”. Con base en lo anterior,
en este trabajo se evaluó la cinética de crecimiento, patogenicidad en Galleria mellonella
(Lepidoptera: Pyralidae) y cambio de fase I a intermedia y II de Photorhabdus luminescens
akhurstii SL0708 en medio de producción in vitro de Heterorhabditis indica SL0708; con el fin
de determinar en qué momento es oportuno inocular los JIs. Para lograr lo anterior se realizó una
curva de crecimiento microbiano en medio de producción in vitro de H. indica SL0708 durante
96h a 28ºC y 150 rpm. Mediante un muestreo destructivo de cada 12 horas, se determinó la
formación de biomasa (UFC/ml), características de las colonias en medio NBTA, luminiscencia
cualitativamente y cuantitativamente (UAL: unidades arbitrarias de luminiscencia), pH y azúcares
reductores equivalentes a glucosa (g/L). Adicionalmente, se hizo una valoración de asimilación de
carbohidratos utilizando API 20NE y de la patogenicidad en larvas del último instar de G.
mellonella. Cada ensayo se realizó por triplicado y la curva se hizo 3 veces en el tiempo. Como
resultado se obtuvo que la cinética de P. luminescens akhurstii SL0708 en el medio evaluado
consiste en una fase exponencial de 84 horas con dos velocidades de crecimiento diferentes y un
periodo diaúxico entre estas, y una fase estacionaria a partir de las 84 horas. De acuerdo con la
literatura revisada no se han reportado estudios con resultados cinéticos similares. Por otro lado se
determinó que la diferencia de las velocidades de crecimiento coincide con el cambio de fase I a
1
intermedia y II, y con el consumo de la mayoría de la glucosa (77,4%). Lo anterior resalta la
importancia de la glucosa como sustrato que mantiene la fase I, la cual tiene una velocidad de
crecimiento menor a la de la fase intermedia y II. Por último se observó que el cambio de fase I a
intermedia y II de la bacteria, no tiene efecto sobre la patogenicidad en larvas de G. mellonella y
la asimilación de carbohidratos.
2
1.INTRODUCCIÓN
Diversas investigaciones han demostrado que el uso de nemátodos entomopatógenos (NEPs) es
una alternativa efectiva para el manejo integrado de insectos plaga, ya que controla diferentes
especies y es amigable con el medio ambiente y el hombre (1). Teniendo en cuenta que el género
Heterorhabditis es de los más estudiados para los NEPs, en Colombia se aisló Heterorhabditis
indica SL0708 de suelos de guadual del Valle del Cauca, el cual ha mostrado alta efectividad en
el control de diferentes plagas de alta importancia económica (2). Debido al uso de esta estrategia
de manejo, la producción in vitro de NEPs ha tomado fuerza en los últimos años, ya que es
necesario suplir la demanda del controlador biológico en campo (3). Este proceso consiste en el
uso de un medio de cultivo diseñado para suplir los requerimientos nutricionales del NEP y la
capacidad de la bacteria simbionte de digerir los compuestos complejos del medio para que los
nematodos puedan tomarlos y completar su ciclo de vida (4). Esta estrategia de producción
presenta ventajas sobre la producción tradicional de NEPs, que se realiza in vivo, ya que es menos
laboriosa y más fácil de escalar a nivel industrial (5). Para que este proceso sea posible es necesario
conocer la biología del nematodo, en especial su relación simbiótica con la enterobacteria P.
luminescens akhurstii SL0708. Dicha bacteria presenta 3 fases (I, intermedia y II) al ser cultivada
in vitro, caracterizadas por la variación en la producción de factores de patogenicidad como lipasas
y proteasas, producción de antibióticos, absorción de tintas en medios de cultivo, producción de
pigmentos, bioluminiscencia, entre otros (6). La bacteria en fase I se ha observado en etapa
exponencial en cultivos in vitro; produce enzimas líticas y por lo tanto es la única apta para digerir
los componentes del medio a compuestos asimilables por el NEP, permitiendo así su crecimiento
y desarrollo. También esta fase ha demostrado una mayor producción de NEPs in vitro ya que
produce una “señal de alimentación” (molécula de bajo peso molecular) que induce el inicio del
desarrollo del NEP y además se ha demostrado que a diferencia de las otras fases, esta tiene la
capacidad de re-asociarse al nemátodo después de la infección al insecto (7) (8). Por lo anterior,
es indispensable asegurar esta fase para producir nemátodos in vitro (9). Por ende, en este trabajo
se evaluó la cinética de crecimiento y la patogenicidad de P. luminescens. akhurstii SL0708 en el
medio de producción in vitro de H. indica SL0708 con el fin de determinar en qué tiempo se deben
inocular los juveniles infectivos (JIs) para su posterior producción. El medio utilizado fue escogido
por demostrar una alta productividad frente a otras opciones evaluadas previamente (10).
3
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las plagas de insectos en cultivos agrícolas son un riesgo para su productividad y por lo tanto
representa pérdidas económicas. Para manejarlas, se han utilizado pesticidas químicos por muchos
años, pero con el tiempo han demostrado efectos adversos con el medio ambiente, la salud animal
y humana, además del fenómeno de resistencia que las plagas desarrollan hacia estos. Por lo
anterior el control biológico es una alternativa efectiva y sostenible ya que se utilizan enemigos
naturales para controlar y equilibrar las poblaciones (3). Una de estas estrategias es la aplicación
de NEPs como agentes controladores de diferentes especies y estadíos de insectos plaga (1). Con
los estudios realizados en el tema, cada vez son más los agricultores que prefieren este método
sobre los químicos, por lo que su demanda se ha incrementado en campo (3). Convencionalmente,
la producción de NEPs se hace in vivo, utilizando larvas de insectos; sin embargo, este método es
bastante laborioso y no tiene altos niveles de producción, por lo que en las últimas dos décadas se
ha empezado a desarrollar la producción in vitro que tiene como ventaja, su sencillez en
comparación con el método in vivo y además pueden escalarse los niveles de producción a grado
industrial. Este procedimiento consiste en el uso de un medio de cultivo diseñado para suplir los
requerimientos nutricionales del NEP y la capacidad de la bacteria simbionte de digerir los
compuestos complejos del medio, para que los nematodos puedan tomarlos y completar su ciclo
de vida (5). Un paso clave en el proceso es la bacteria simbionte, para el NEP H. indica SL0708
es P. luminescens akhurstii SL0708. Gracias a la producción de enzimas líticas como proteasas y
lipasas de parte de la bacteria, los compuestos del medio pueden ser degradados a compuestos
asimilables por el nemátodo, permitiendo así su producción. Sin embargo esta bacteria tiene una
variación de fase (I, intermedia y II) en relación a su metabolismo, producción de factores de
patogenicidad como enzimas líticas, producción de antibióticos, producción de pigmentos,
bioluminiscencia, entre otros; donde en la fase I se encuentran las características mencionadas y
en la fase intermedia y II se pierden (6). Además, la fase I asegura una mayor producción de
nemátodos por la excreción de una molécula de bajo peso molecular denominada “señal de
alimentación” que estimula el inicio desarrollo del NEP y asegura que la bacteria se pueda asociar
a los nuevos nemátodos producidos. (7) (8).
4
Por lo anterior, es indispensable conocer en qué tiempo del cultivo in vitro ocurre este cambio de
fase para incular los JIs de H. indica SL0708, con el fin que los nematodos puedan completar su
ciclo de vida exitosamente, se tengan altos niveles de producción y los NEPs producidos sean
patogénicos. Con lo anterior se garantiza que el producto ofrecido en campo controle
efectivamente los insectos plaga que afectan los cultivos, disminuyendo las pérdidas económicas
que estos causan.
5
3. MARCO TEÓRICO
3.1. P. luminescens
3.1.1. Características y generalidades
P. luminescens es un simbionte bacteriano presente en el intestino del estadío JI de los NEPs del
género Heterorhabditis. Estas bacterias son las responsables de la muerte del insecto hospedero
de los NEPs. P. luminescens es un bacilo Gram negativo perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae, bioluminiscente, anaerobia facultativa y órgano heterótrofa (11). Su
patogenicidad para el insecto hospedero se debe a que posee diferentes factores como enzimas
líticas, complejos tóxicos entre otros; adicionalmente licua la biomasa del insecto para hacer
disponible el alimento para el nemátodo y produce antibióticos para evitar la colonización de
microbiota acompañante (12).
3.1.2. Ciclo de vida
El ciclo de vida de P. luminescens puede dividirse en 3 momentos: 1. Simbionte del nemátodo, 2.
Patógeno de insecto y 3. Fuente de alimento del nemátodo (1). En el primero, la bacteria se
encuentra en el intestino de los JIs los cuales son de vida libre, es decir que se encuentran en el
suelo, poseen doble cutícula y tienen la boca y el ano cerrados (no se alimentan). En este estadío
los JIs buscan al insecto por señales químicas y una vez lo encuentran entran por sus aperturas
naturales (ano, espiráculos, boca) o por la cutícula (2). En el segundo, cuando el nematodo está
dentro del insecto, regurgita la bacteria liberándola en el hemocele. En este momento la bacteria
empieza a producir diferentes factores de patogenicidad que en 24-48 horas matan al insecto (12).
En el tercero, la bacteria licúa la biomasa del insecto con ayuda de sus enzimas líticas y hace
disponible el alimento para el nemátodo y para esta misma. Con este alimento, el nemátodo puede
completar su ciclo de vida; adicionalmente la bacteria produce sustancias antibióticas para evitar
la colonización de microbiota acompañante (11). Diferentes estudios reportan que cuando la
biomasa del insecto es licuada por la bacteria, esta produce una molécula de bajo peso molecular
conocida como “señal de alimentación”, que induce o le indica al JI que puede alimentarse y entrar
a un estado reproductivo, es por esta razón que cuando el alimento se agota el nemátodo vuelve a
entrar al estadío de JI (7) (13).
6
Con el cultivo in vitro de esta bacteria se han identificado diferentes fases relacionadas con su
metabolismo y patogenicidad; la fase I está asociada al insecto y al intestino del JI, esta se
caracteriza por producir toda su batería de factores de patogenicidad: bioluminiscencia, enzimas
líticas, antibióticos como ST, antraquinonas, toxinas, entre otros. La fase II está asociada al cultivo
in vitro de la bacteria y a las larvas muertas, esta se caracteriza por la pérdida de la mayoría de
factores de patogenicidad de la fase I. Adicionalmente se ha identificado una fase intermedia entre
las mencionadas anteriormente la cual está asociada al cultivo in vitro y es aquí donde la bacteria
empieza a perder sus factores patogénicos (9). El cambio de fase (I a intermedia o II) también
incluye la pérdida de la capacidad de re-asociarse al nemátodo cuando entra al estadío de JI después
de que se acaba el alimento, lo anterior afecta directamente la patogenicidad ya que sin la bacteria
no se tiene el mecanismo para darle muerte a los insectos (8). La caracterización de esta bacteria
in vitro se realiza en medio NBTA donde las bacterias en fase I demuestran bioluminiscencia en
oscuridad y tienen colonias redondas color azules verdosas (absorción del colorante azul de
bromotimol) con textura mucoide o cremosa. Las bacterias en fase II no demuestran
bioluminiscencia en oscuridad y tienen colonias redondas color marrón-rojizas con textura gomosa
(14). Las fases también se pueden comprobar con pruebas cualitativas de actividad enzimática
como actividad lipolítica (medio tributirina), actividad proteolítica (medio yema huevo y gelatina)
y actividad hemolítica (medio con sangre de oveja), para los cuales la fase I es positiva y la fase II
negativa (11).
3.1.3. Modo de acción
La bacteria es letal para el insecto debido a la producción de diferentes factores de patogenicidad
que contribuyen al establecimiento de la infección microbiana. Se han identificado cuatro grupos
de toxinas producidas por P. luminescens: complejos tóxicos (Tcs), las proteínas relacionadas con
insectos de Photorhabdus (Pir), las toxinas de flacidez (Mcf) y los casetes de virulencia de
Photorhabdus (PVC) (14). Un ejemplo del mecanismo de acción de estos factores de
patogenicidad es el del complejo tóxico (Tcs), el cual funciona como ADP-ribosil transferasa,
responsable de la aparición de conglomerados de actina que afectan el citoesqueleto de la célula
del insecto (16). Adicionalmente está la producción de enzimas líticas como fosfolipasas, proteasas
y lipasas que además de contribuir a la letalidad de la bacteria, degradan los tejidos del insecto
haciendo disponible alimento para el nemátodo y para la bacteria. Uno de los puntos clave de la
7
infección es el sistema inmune del insecto, por ejemplo, las proteasas degradan compuestos de la
respuesta humoral como PRPs y AMPs, dejando al insecto indefenso ante el ataque bacteriano; la
producción de sideroforos neutraliza la respuesta inmune del insecto (12). La unión de todos los
mecanismos anteriores lleva a diferentes síntomas en el insecto como diarrea y pérdida de la
turgencia celular, seguido por su rápida muerte (12). Por otro lado, la producción de antibióticos
permite que este alimento no sea asimilado por microbiota acompañante; se ha reportado la
producción de derivados de antraquinona, furano, estilbeno, fenol y genisteína en cultivos in vitro
y de 3,5-dihidroxi-4-isopropil estilbeno (ST) en cultivos in vivo, demostrando la efectividad del
último sobre bacterias intestinales de G. mellonella (17).
3.2. NEPs
3.2.1. Definición y características
El uso de NEPs es una de las estrategias de control biológico más utilizada y estudiada en las
últimas dos décadas por su capacidad de resistencia a productos químicos, colonización de
diferentes hospederos, adaptación a diferentes condiciones externas y el hecho de no ser dañinos
para plantas, mamíferos y el medio ambiente (2). Los NEPs son animales simples de cuerpo
blando, no segmentados, usualmente microscópicos e incoloros con la capacidad de colonizar
diferentes especies de insectos y estadíos de vida. Se conocen 24 familias de NEPs, entre las cuales
destacan Steinernematidae y Heterorhabditidae. La última tiene únicamente el género
Heterorhabditis con 16 especies reportadas (1).
3.2.2. Modo de acción
El género Heterorhabditis consiste en una primera generación hermafrodita y luego generaciones
anfimíticas que ocurren dentro del hospedero. Luego de varias generaciones se producen un
estadío de vida libre llamado juvenil infectivo (JI) cuya morfología y fisiología le permiten
permanecer en el suelo sin alimentarse durante largos periodos de tiempo hasta encontrar a su
hospedero (11). Esta búsqueda es mediada por señales químicas y cuando el JI encuentra su
hospedero lo invade por aberturas naturales (espiráculos, ano o boca) o por la cutícula. Una vez
dentro del insecto el JI regurgita las bacterias simbiontes en el hemocele del insecto (1). Este
género de nemátodos mantiene una relación simbiótica con el género de enterobacterias
8
Photorhabdus, las cuales se encargan de matar al insecto en cuestión de uno o dos días y hacer
disponible alimento para que el ciclo de vida del nemátodo continúe dentro del hospedero (9).
3.3. Producción in vitro de NEPs
3.3.1. Definición y procedimiento
La producción in vitro de NEPs, en este caso Heterorhabditis sp., es un método por el cual se
obtienen varias generaciones de JIs en medios de cultivo que le permiten a los nemátodos cumplir
su ciclo de vida, se hace tanto en medio sólido como líquido. El producto son JIs ya que estos son
aplicados en campo como agentes de biocontrol (1). El proceso consiste en la inoculación de la
bacteria simbionte, en este caso P. luminescens, en el medio de cultivo rico en nutrientes, minerales
y vitaminas necesarios para el desarrollo del nemátodo. La bacteria, al desarrollarse produce sus
factores de patogenicidad entre los cuales están las enzimas líticas que hidrolizan los compuestos
del medio, haciendo disponible alimento para los nemátodos. En este punto se inoculan los JIs
desinfectados superficialmente al medio para que puedan alimentarse y completar su ciclo de vida,
generando varias generaciones de JIs (5).
3.3.2. Ventajas
Este método presenta una ventaja sobre la producción in vivo ya que no es necesario mantener una
zoocría de insecto hospedero, lo que representa una reducción de costos y labores (1). Por otro
lado, el estudio de medios y condiciones de cultivo permiten la optimización y escalamiento de la
producción de JIs para cada una de las especies a evaluar y usar como agente de control biológico
(18).
3.3.3. Desventajas
Debido a que el cultivo in vitro de P. luminescens experimenta cambios de fase relacionados con
su metabolismo y patogenicidad, se desconoce el momento donde ocurre el cambio de fase durante
el cultivo en medios de producción. Lo anterior dificulta la determinación del tiempo de
inoculación de los JIs para que estos puedan alimentarse a partir del medio hidrolizado por la
bacteria en fase I (9).
9
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Determinar la cinética de crecimiento y patogenicidad de Photorhabdus luminescens akhurstii
SL0708 en medio de producción in vitro de H. indica SL0708.
4.2. Objetivos específicos
● Establecer la curva de crecimiento microbiano de Photorhabdus luminescens akhurstii
SL0708 en el medio de producción in vitro de H. indica SL0708.
● Determinar la fase I, fase Intermedia y fase II de Photorhabdus luminescens akhurstii
SL0708 y su patogenicidad en Galleria mellonella durante la curva de crecimiento
microbiano.
10
5. METODOLOGÍA
5.1. Banco de trabajo
Se partió de un vial del banco primario (-80ºC) y se reactivó la cepa de P. luminescens akhurstii
SL0708 en medio NBTA (Anexo 10.1) y LB (Anexo 10.2). Después de incubar por 48h a 28ºC,
se seleccionaron las colonias en fase I (bioluminiscentes, redondas, convexas, borde definido y
regular, color azul-verdoso, cremosas o mucoides con halo verde-amarillo a su alrededor) y se
sembraron por agotamiento en agar tripticasa de soya (Anexo 10.3), este se incubó a 28ºC por 48h.
Transcurrido este tiempo cada colonia se transfirió a un vial con 750 μl de caldo tripticasa de soya
suplementado con 20% de glicerol (Anexo 10.4). Estos viales se almacenaron a -80ºC. El banco
de trabajo tiene un total de 50 viales de conservación (19).
5.2. Curva de crecimiento microbiano
5.2.1. Producción de inóculo
A partir del banco de trabajo se reactivó la bacteria en medio LB y NBTA, incubando por 48h a
28ºC. Transcurrido este tiempo se verificó pureza por tinción de Gram, se tomó una muestra
abundante de colonias que mostraron luminiscencia y fueron transferidas a un tubo con 10 mL de
solución salina al 0.85% (p/v) (Anexo 10.5). Se homogenizó en vórtex para compararlo con el
tubo 1 de McFarland (3x108 cel/mL). Una vez se llegó a esta concentración se hizo la producción
del inóculo. En un matraz Erlenmeyer de 500 mL con 90 mL de medio de producción in vitro de
H. indica SL0708 (Anexo 10.6), se inocularon 10 mL de la suspensión celular en solución salina
preparados previamente. Se incubó por 24 h a 28ºC con 150 rpm. Se verificó pureza por coloración
de Gram al final del cultivo. A partir de este inóculo se empezó la fermentación discontinua.
5.2.2. Fermentación discontinua
El proceso de fermentación discontinua se evaluó por 96 h en medio de producción in vitro de H.
indica SL0708, en matraces de 100 mL con 18 mL de medio y 2 mL de inóculo. Los matraces se
mantuvieron en un agitador orbital termostatado Innova 42, a 150 rpm y 28ºC. Se tomaron 3
matraces cada 12 horas hasta llegar a las 96 horas. En cada hora de muestreo se evaluó la formación
de biomasa por recuento de UFC/mL en medio NBTA, pH, azúcares reductores equivalentes a
glucosa y asimilación de carbohidratos, utilizando API 20NE (BioMerieux, Inc.Durham, NC).
11
También se evaluó la patogenicidad en larvas de G. mellonella a las 24, 48 y 72 h. Este conjunto
de procedimientos se realizó 3 veces en el tiempo.
5.2.3. Determinación de biomasa y descripción de las colonias
Para la determinación de biomasa se tomaron 0,5 mL de cultivo en cada hora de muestreo y se
hicieron diluciones en solución salina 0.85% (p/v). Estas se sembraron por superficie en medio
NBTA y se sembró por triplicado cada dilución. Las placas se incubaron por 48h a 28ºC y se
realizó el recuento de UFC/mL. A partir de estos datos se determinaron parámetros cinéticos
(productividad de la biomasa, tiempo de duplicación y velocidad específica de crecimiento).
Adicionalmente se describieron las colonias en medio NBTA: forma, morfología, color y
bioluminiscencia por cada hora de muestreo. La última se determinó cualitativamente y
cuantitativamente en el equipo FluostarOptima con un filtro de excitación de 355 nm y un filtro
de emisión de 460 nm; para esto se tomaron 250 μl de medio de cultivo fresco y se transfirieron a
una placa COSTAR 96; los resultados se reportaron en unidades arbitrarias de luminiscencia
(UAL).
5.2.4. Determinación de pH
Para establecer el valor de pH se tomaron 8 mL del cultivo y se centrifugaron a 6000 rpm en una
centrífuga Hermle Z 206 A por 10 min. Se tomó el extracto crudo y se determinó el valor de pH
con el pHmetro.
5.2.5. Determinación de azúcares reductores equivalentes a glucosa
Las muestras de cada tiempo se centrifugaron a 18900 g durante 20 min y con el sobrenadante se
realizó la determinación de los azúcares reductores equivalentes a glucosa por el método del ácido
3,5 dinitrosalicílico (DNS) (20). Para esto se realizó una curva patrón de glucosa con
concentraciones de 0,5 a 1,7 g/L (Anexo 10.7).
5.2.6. Determinación de metabolismo
Para determinar la asimilación de carbohidratos se aplicó un API 20NE (BioMerieux, Inc.Durham,
NC). Se tomaron 1-4 colonias del medio NBTA (Numeral 5.2.3) y se inocularon en un tubo de
preparación de inóculo para tener una suspensión consistente con el tubo 0,5 de McFarland
12
(1,5x108 cel/mL). A partir de este inóculo se llenó cada pozo. Se incubó a 28ºC por 48h en una
caja de incubación húmeda (5mL de agua destilada). Se revelaron los resultados después del
tiempo de incubación con ayuda de la base de datos API 20NE (11).
5.2.7. Patogenicidad en G. mellonella
Para determinar la patogenicidad de la bacteria sobre larvas del último instar de G. mellonella se
tomaron colonias del medio NBTA provenientes del muestreo en las horas 24, 48 y 72 (Numeral
5.2.3), a partir de las cuales se realizó una suspensión en solución salina al 0,85% (p/v) con una
concentración equivalente a 1x104 UFC/mL. Se inyectó 10 𝜇𝑙 de suspensión con jeringa BD ultrafine (1 mL) en las larvas previamente desinfectadas con hipoclorito de sodio al 1% y agua
destilada. Las larvas se incubaron a 28ºC. Se registró el porcentaje de mortalidad, color y la
bioluminiscencia de las larvas cada 24 h hasta las 96 h (12).
5.3. Determinación de fase en la bacteria
Se determinó en qué fase se encuentra la bacteria durante la curva de crecimiento. Para lo anterior
se tomaron en cuenta las características morfológicas de las colonias en medio NBTA,
bioluminiscencia y patogenicidad. Las características que diferencian cada fase se encuentran en
la tabla 1.
Tabla 1. Características de las fases de P. luminescens (9).
Parámetro
Fase I
Fase intermedia
Fase II
Color colonias en
NBTA
Azules verdosas con
halo amarillo-verde
claro alrededor
Marrón con pequeña
zona de aclaramiento
a su alrededor, puede
ser verde o amarilla.
Rojo oscuro, no
presenta zona de
aclaramiento a su
alrededor.
Morfología colonias
en NBTA
Textura cremosamucoide, convexas,
borde definido y
regular, redondas,
brillantes.
Textura cremosa a
gomosa, convexas,
borde definido y
regular, redondas,
brillantes.
Textura gomosa, alta
adhesión al medio,
planas, redondas,
borde definido y
regular, opacas.
Bioluminiscencia
Si, se percibe a simple
vista en oscuridad.
Parcial, no se percibe
a simple vista en
oscuridad.
Muy leve o ausente,
no se percibe a simple
vista en oscuridad.
13
5.4. Análisis de datos
Con los datos obtenidos en la evaluación de la biomasa y la descripción de colonias (5.2.3),
determinación de pH (5.2.4) y determinación de azúcares reductores equivalentes a glucosa (5.2.5),
se construyó una gráfica integrada que incluye una curva de log (UFC/mL), pH, azúcares
reductores equivalentes a glucosa (g/L) y luminiscencia (UAL) en función del tiempo. Para cada
uno de estos datos se promediaron las 3 repeticiones planteadas y se reportó su desviación estándar.
Por otro lado, se realizó una gráfica integrada con el porcentaje de mortalidad de las larvas
infectadas con la bacteria a las 24, 48, 72 y 96h. Para cada uno de estos datos se promediaron las
3 repeticiones planteadas y se reportó su desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza
(ANOVA) para establecer las diferencias entre la mortalidad efectuada por la infección de las
bacterias obtenidas de los muestreos a las 24, 48, 72 y 96 h de cultivo.
14
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Curva de crecimiento microbiano de P. luminescens akhurstii SL0708 en el medio de
producción in vitro de H. indica SL0708.
Durante las 96 horas de la curva de crecimiento se observó un constante incremento de la biomasa,
empezando con una población de 2,4 × 108 UFC/mL y terminando con 5,7 × 1020 UFC/mL, es
decir con una productividad de 6,5× 1018UFC/ml/hora. Durante la hora 0 a la 24 se observó una
fase de crecimiento lento y sin un aumento de biomasa hasta la hora 36, momento en el cual se
consumió el 77,4% de los azúcares reductores equivalentes a glucosa disponible en el medio; luego
de esta hora se presenta otra fase de crecimiento con una mayor velocidad hasta la hora 84 y se
alcanzó a detectar la fase estacionaria de esta hora hasta las 96 horas (Figura 1). Teniendo en cuenta
lo anterior, se puede establecer que se presentó un comportamiento diaúxico, donde la bacteria usa
principalmente la fuente de carbono más sencilla, que es la glucosa, y luego de la hora 36, su
crecimiento se da probablemente por la presencia de otros compuestos del medio como proteínas,
lípidos y carbohidratos complejos (no determinados). Aunque la velocidad de la primera fase fue
lenta comparada con la otra fase de crecimiento, fue evidente que la glucosa juega una papel
importante en el crecimiento bacteriano.
15
Figura 1. Cinética de crecimiento de P. luminescens akhurstii SL0708 en medio de producción
in vitro de H. indica SL0708.
Con base en este fenómeno de crecimiento y en los diferentes sustratos, se consideró que deben
determinarse dos velocidades específicas de crecimiento para lo que se aplicó el modelo de orden
uno (Figura 2). En la figura 2A se encuentra la cinética de la primera fase con una velocidad
específica de crecimiento (𝜇𝑥 ) de 0,1594 ℎ−1,un tiempo de duplicación (td) de 4,35 h y un
rendimiento biomasa/sustrato de 2,4× 1012UFC/g de glucosa. En la figura 2B esta la cinética de
la segunda fase de crecimiento con una velocidad específica de crecimiento de 0,5481 ℎ−1 y un
tiempo de duplicación de 1,26 h; debido a que los demás componentes en el medio no fueron
monitoreados, no puede establecerse un rendimiento biomasa/sustrato en la segunda fase de
crecimiento.
16
A
B
Figura 2. Modelo cinético de orden uno para A) 0-36 horas; y=0,1594x+17,388, 𝑟 2 =0,9291. B)
36-84 horas; y=0,548x+4,8394, 𝑟 2 =0,9415.
El presente estudio mostró resultados no reportados anteriormente referentes a los tiempos de
crecimiento de la bacteria y su cinética. Según lo revisado en la literatura, las curvas de crecimiento
de P. luminescens consisten de fase de adaptación con duración de 0 a 8 horas, fase exponencial
entre 8 y 24 horas y la fase estacionaria con 16-24 horas en adelante (21) (22) (23) (24) (25); sin
embargo en este trabajo no se observó una fase de adaptación, la fase de crecimiento exponencial
tuvo una duración de 84 horas y el crecimiento estacionario se observó desde las 84 hasta las 96
horas. Asimismo, los valores encontrados para velocidad específica de crecimiento (𝜇𝑥 ) y tiempo
de duplicación (td) son alejados de la información publicada, teniendo reportes de 𝜇𝑥 de 0,36 ℎ−1y
0,33 ℎ−1, td de 2,1 h (21) (25). La variación entre los diferentes estudios es representativa,
posiblemente por los diferentes medios o sustratos utilizados, por las escalas de producción
evaluadas, régimen de muestreo y sobre todo por los diferentes aislamientos de la bacteria.
También es importante aclarar que en el presente estudio se observaron comportamientos
metabólicos diferentes, fase I,fase intermedia y II, y en la mayoría de los estudios a los que se hace
referencia, se estudia la bacteria en fase I, debido a que es el estado de interés para la producción
de NEPs.
17
Por otro lado, se analizó el papel de la glucosa como fuente de carbono en el medio utilizado. Es
evidente que el cambio en la velocidad de crecimiento entre las primeras 36 horas y el periodo de
48-84 horas, coincide con el consumo de la mayoría de la glucosa (Figura 1, Figura 2A y 2B). El
agotamiento de la glucosa en el medio ocasiona un cambio en la composición del sustrato, lo cual
causa un estrés en la bacteria, obligándola a adaptarse, razón por la cual se observa un
comportamiento diáuxico entre las hora 24 y 36. El cambio de fase I a fase intermedia y II también
coincide con estos tiempos (Tabla 1, Figura 1 y Figura 3), lo cual es coherente con lo reportado
por otros autores; la fase intermedia y II son inducidas por el estrés asociado al cambio del hábitat
nativo de la bacteria (intestino del JI e interior de larva de insecto), a condiciones de laboratorio
donde varía la temperatura, pH, concentración de oxígeno, concentración de 𝐶𝑂2 y cambio de
sustrato (6) (9). Además, se ha comprobado que la expresión génica de la fase intermedia y II
resulta en un metabolismo más activo, mayor producción de proteínas de estrés oxidativo, y
producción de proteínas de “stock”; estos mecanismos están destinados a facilitar la adaptación a
nuevos ambientes o condiciones, lo cual favorece el aumento de la velocidad de crecimiento (7)
(8). Lo anterior también puede ser apoyado por un estudio realizado por Jeffke y colaboradores en
el 2000, donde la suplementación constante de glucosa al cultivo permitió mayor rendimiento de
biomasa bacteriana y el mantenimiento de características fase I como bioluminiscencia,
producción de sustancias antibióticas y producción de cuerpos cristalinos de inclusión, en la
totalidad del ensayo (22).
Siguiendo el razonamiento previo, la adición de glucosa a medios de producción de NEPs tiene un
efecto positivo sobre el mantenimiento de la fase I, la cual es de interés para el proceso de
producción. Adicionalmente, se informa que la constante adición de este carbohidrato incrementa
significativamente (al doble) la producción de biomasa en fase I y la producción de sustancias
antibióticas (140%) (22). Lo anterior no solo evita contaminaciones del medio, sino que beneficia
el porcentaje de recuperación y el rendimiento final de JIs ya que, a mayor biomasa bacteriana en
fase I, mayor acumulación de la “señal de alimentación” (23). Esta molécula induce la abertura de
la boca y ano del JI, con el fin de que se empiece a alimentar, mude al siguiente estado y empiece
el ciclo de vida, el cual resultará en nuevas generaciones de JIs (7).
18
6.2. Fase y patogenicidad de P. luminescens akhurstii SL0708
Como ya se ha mencionado, en el tiempo de cultivo se observó la fase I de la hora 0 a la hora 36,
fase intermedia entre las 36 a 72 horas y fase II de las 72 a 96 horas. Lo anterior se puede ver en
la Figura 1 donde la luminiscencia, tiene un pico entre las 24-36 horas (3436,677 a 2709,778 UAL),
empieza a decrecer paulatinamente hasta las 72 horas (463,556 a 191,222 UAL), y tiene una
disminución significativa (14,222 a 7,111 UAL) hasta las 96 horas. Por otro lado, en las primeras
36 horas las colonias en medio NBTA mostraron características de fase I (Tabla 1 y Figura 3A), y
de las 48 hasta las 96 horas se evidenciaron características de fase intermedia y II (Tabla 1 y Figura
3B).
19
A
B
Intermedia
II
C
D
Figura 3. Colonias de P. luminescens akhurstii SL0708. A)- B) en fase I; C)- D) en fase
intermedia y II.
La fase I es requerida en la producción de NEPs especialmente por cuatro de sus características
metabólicas; 1) capacidad de degradar el medio a compuestos asimilables y necesarios para los
JIs, en especial esteroles, por medio de enzimas líticas; 2) secreción de “señales de alimentación”
con el fin de inducir el desarrollo y la producción de nuevas generaciones de JIs; 3) capacidad de
establecer la simbiosis o reasociarse/ adherirse al intestino del nemátodo; 4) secreción de
sustancias antibióticas que evitan la contaminación del medio (7) (8) (9) (18) (26). Por lo anterior
es muy importante mantener la fase I con el fin de aumentar el porcentaje de recuperación y obtener
mayores rendimientos de JIs en el proceso de producción. Esto puede lograrse teniendo
20
condiciones de cultivo estrictamente controladas y optimizando la composición del medio (18).
Como ya se discutió previamente, en este estudio se observó que bajo las condiciones de cultivo
evaluadas (composición del medio, cultivo por lote, 28ºC, 150 rpm, aireación determinada por
relación ⅕) la glucosa fue un factor determinante en el cambio y mantenimiento de la fase I, por
lo que la inoculación de JIs debe hacerse cuando no haya sido consumida, es decir hasta las 36
horas. En este tiempo se asume que parte del medio ha sido degradado y es asimilable por los
NEPs, hay una acumulación de la “señal de alimentación” que favorecerá su desarrollo y las
bacterias presentes son capaces de restablecer la simbiosis con las nuevas generaciones de JIs (6)
(27).
Otro punto interesante a tocar es la relación entre las fases de crecimiento y las fases metabólicas
de la bacteria; en la gran mayoría de estudios se reporta que la fase I se presenta en el periodo de
crecimiento exponencial tardío o al inicio del estacionario, indicando que la densidad poblacional
es un factor determinante en la variación de fase I a las formas intermedia o II (6) (9), sin embargo
en este estudio se observó la fase I está presente en el inicio del crecimiento exponencial, mientras
que la fase intermedia y II fue evidenciada en el periodo exponencial tardío y en el estacionario.
Esto indica que para el presente medio, condiciones evaluadas y aislamiento de la bacteria
utilizado, no hay relación entre la densidad poblacional bacteriana y la variación de fase
metabólica; esto se vio principalmente influenciado por la composición del medio.
En cuanto a la patogenicidad de la bacteria, a las 24, 48, 72 y 96 horas de cultivo se presentó
mortalidad a las primeras 24 horas de exposición. Como se observa en la Figura 4, en cada tiempo
de cultivo y exposición se alcanza un 100% de mortalidad. Lo anterior demuestra la efectividad
de la bacteria al ocasionar muerte al insecto, siendo que se reporta un tiempo promedio de 24-48
horas para esta acción (1).
21
Figura 4. Porcentaje de mortalidad de larvas de G. mellonella tras ser infectadas por bacterias de
las 24, 48, 72 y 96 horas de cultivo durante 4 días.
Por otro lado, la sintomatología observada en larvas de G. mellonella fue la misma en todos los
tiempos evaluados y es consistente con lo reportado en la literatura (Figura 5) (11). El análisis de
varianza muestra que no hay diferencias significativas entre la patogenicidad de las bacterias de
las 24, 48, 72 y 96 horas de cultivo en las 24, 48, 72 y 96 horas de exposición (F=0,934; gl=15;
P=0,5339) (Anexo 10.8). Con base en esto puede decirse que sin importar la fase metabólica en la
que se encuentre la bacteria, al entrar a la larva va a causar patogenicidad. Lo anterior ya ha sido
reportado en otros estudios y se le atribuye a la capacidad de la bacteria de revertir la fase
metabólica al ingresar a un ambiente controlado y con una composición específica que favorezca
la expresión de los metabolitos característicos de la fase I, en este caso el ambiente es el interior
de la larva (6) (8).
22
A
B
C
D
E
Figura 5. Sintomatología de larvas de G. mellonella causada por la infección de P. luminescens
akhurstii SL0708 proveniente de las 24, 48, 72 y 96 horas de cultivo en medio de producción in
vitro de H. indica SL0708. A) 0 horas, B) 24 horas, C) 48 horas, D) 72 horas y E) 96 horas de
exposición a la bacteria.
Por último, la evaluación de la asimilación de carbohidratos (API 20NE) mostró que, sin importar
la hora de cultivo (24, 48, 72 y 96 horas) y la fase metabólica (I, intermedia o II), la bacteria
presenta el mismo perfil (Tabla 2). Lo anterior se puede explicar por la inducción de la producción
de enzimas por la presencia del sustrato en la prueba, o porque simplemente la bacteria no presenta
variaciones frente a los caracteres evaluados. De acuerdo a lo reportado previamente para este
aislamiento, los resultados de este trabajo fueron congruentes (11).
23
Tabla 2. Evaluación de la asimilación de carbohidratos (API 20NE) en P. luminescens akhurstii
SL0708 durante las 24, 48, 72 y 96 horas de cultivo.
Prueba
24 h
48 h
72 h
96 h
Reducción de nitratos a nitritos
-
-
-
-
Reducción de nitratos a 𝑁2
+
+
+
+
Producción de indol (triptofanasa)
+
+
+
+
Fermentación de la glucosa
+
+
+
+
Arginina dihidrolasa
+
+
+
+
Ureasa
+
+
+
+
𝛽-glucosidasa
+
+
+
+
Proteasa
+
+
+
+
𝛽-galactosidasa
-
-
-
-
Asimilación de glucosa
+
+
+
+
Asimilación de arabinosa
-
-
-
-
Asimilación de manosa
+
+
+
+
Asimilación de manitol
+
+
+
+
Asimilación de N-acetilglucosamina
+
+
+
+
Asimilación de maltosa
+
+
+
+
Asimilación de gluconato de potasio
+
+
+
+
Asimilación de ácido cáprico
+
+
+
+
Asimilación de ácido adípico
-
-
-
-
Asimilación de malato
+
+
+
+
Asimilación de citrato de trisodio
+
+
+
+
Asimilación de ácido fenilacético
-
-
-
-
Oxidasa
-
-
-
-
24
7. CONCLUSIONES
P. luminescens akhurstii SL0708 fue capaz de crecer en el medio de producción in vitro de H.
indica SL0708, presentando dos fases de crecimiento exponencial debido a los componentes de
dicho medio, en especial la glucosa. Lo anterior se relacionó directamente con el cambio de fase I
a fase intermedia y II. Por otro lado, el cambio de fase I a intermedia y II no tuvo efecto sobre la
patogenicidad en larvas de G. mellonella y la asimilación de carbohidratos. Finalmente, los
resultados encontrados demuestran que a las 36 horas son el tiempo de inoculación que asegura el
mayor porcentaje de recuperación y rendimiento de JIs de H.indica SL0708.
25
8. RECOMENDACIONES
Debido a la importancia de la glucosa como sustrato para mantener la fase I de P. luminescens
akhurstii SL0708, es necesario evaluar concentraciones mayores de glucosa o adicionar un
carbohidrato en diferentes puntos del proceso en el medio de producción de JIs de H. indica
SL0708, con el fin de prolongar o mantener por mayor tiempo esta fase metabólica y obtener un
porcentaje de recuperación y rendimiento de JIs al final del proceso.
26
9. BIBLIOGRAFÍA
1. Devi G, Nath D. Entomopathogenic nematodes: A tool in biocontrol of insect pests of
vegetables-A review. Agricultural Reviews. 2017.137-44.
2. Sáenz Aponte A, López JC. Life cycle and pathogenicity of native isolate Heterorhabditis
sp. SL0708 (Rhabditida: Heterorhabditidae). Revista Colombiana de Entomología.
2011.43-7.
3. Abd-Elgawad M., Askary T., Coupland J. (2017). Biocontrol agents: entomopathogenic
and slug parasitic nematodes. 1era ed. CABI. 1-26.
4. Cho C. Submerged Monoxenic Culture Medium Development for Heterorhabditis
bacteriophora and its Symbiotic Bacterium Photorhabdus luminescens: Protein Sources.
Journal of Microbiology and Biotechnology. 2011. 869-873.
5. Inman FL III, Holmes LD, Singh S. Mass Production of the Beneficial Nematode
Heterorhabditis bacteriophora and Its Bacterial Symbiont Photorhabdus luminescens.
Indian Journal of Microbiology. 2012.316-24.
6. Gerritsen L, Smits P. The influence of Photorhabdus luminescens strains and form variants
on the reproduction and bacterial retention of Heterorhabditis megidis. Fundamental and
Applied Nematology. 1997. 317-322.
7. Aumann J, Ehlers R. Physico-chemical properties and mode of action of a signal from the
symbiotic bacterium Photorhabdus luminescens inducing dauer juvenile recovery in the
entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora. Nematology. 2001. 849-853.
8. Turlin E, Pascal G, Rousselle J, Lenormand P, Ngo S, Danchin A, Derzelle S. Proteome
analysis of the phenotypic variation process in Photorhabdus luminescens. Proteomics.
2006. 2705-2725.
9. Han R, Ehlers R-U. Effect of Photorhabdus luminescens phase variants on the in vivo and
in vitro development and reproduction of the entomopathogenic nematodes
Heterorhabditis bacteriophora and Steinernema carpocapsae. FEMS Microbiology
Ecology. 2001.239-47.
10. Neira E. Producción in vitro de Heterorhabditis indica SL0708 en medios de cultivo
sólidos. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana; 2016.
27
11. Sáenz Aponte A, Pulido OF, Jaramillo C. Isolation and characterization of bacterial
symbiont Photorhabdus luminescens SL0708 (Enterobacteriales: Enterobacteriaceae).
African Journal of Microbiology Research. 2014. 3123-30.
12. Salazar-Gutiérrez JD, Castelblanco A, Rodríguez-Bocanegra MX, Teran W, Sáenz-Aponte
A. Photorhabdus luminescens subsp. akhurstii SL0708 pathogenicity in Spodoptera
frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) and Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae).
Journal of Asia-Pacific Entomology. 2017.1112-21.
13. Strauch O, Ehlers R. Food signal production of Photorhabdus luminescens inducing the
recovery of entomopathogenic nematodes Heterorhabditis spp. in liquid culture. Applied
Microbiology and Biotechnology. 1998. 369-374.
14. M. Nouh G, Hussein M. Pathogenicity of Photorhabdus luminescens, a Symbiotic
Bacterium of an Entomopathogenic Nematode against Galleria Mellonella L. and
Spodoptera Littoralis (Boise). Egypt Journal of Zoology. 2015. 91-7.
15. Rodou Am Ankrah DO, Stathopoulos C. Toxins and Secretion Systems of Photorhabdus
luminescens. Toxins. 2010. 1250-64.
16. Lang A, Shmidt G, Schlosser A, Hey TD, Larrinua IM, Sheets JJ, Mannherz HG, Aktories
K. Photorhabdus luminescens Toxins ADP-Ribosylate Actin and RhoA to Force Actin
Clustering. Science. 2010.1139.
17. Hu K, Webster JM. Antibiotic production in relation to bacterial growth and nematode
development in Photorhabdus–Heterorhabditis infected Galleria mellonella larvae. FEMS
Microbiology Letters. 2000. 219-23.
18. Ehlers R-U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection.
Applied Microbiology and Biotechnology. 2001.623-33.
19. Arencibia D, Gámez R, Alfredo Rosario L. Métodos generales de conservación de
microorganismos. En: I Taller Científico de los Laboratorios LIORAD VI Taller de
Colecciones de Cultivos Microbianos y otros Materiales Biológicos.2008. 1-14.
20. Miller GL. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.
Analytical Chemistry. 1959. 426-8.
21. Singh S, Eric M, Floyd I, Leonard H. Characterization of Photorhabdus luminescens
Growth for the Rearing of the Beneficial Nematode Heterorhabditis bacteriophora. Indian
Journal of Microbiology. 2011. 325-331.
28
22. Jeffke T, Jende D, Mätje C, Ehlers R, Berthe-Corti L. Growth of Photorhabdus
luminescens in batch and glucose fed-batch culture. Applied Microbiology and
Biotechnology. 2000. 326-330.
23. Gil G.H, Choo H.Y, Gaugler R. Enhancement of entomopathogenic nematode production
in in-vitro liquid culture of Heterorhabditis bacteriophora by fed-batch culture with
glucose supplementation. Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. 751-755.
24. O’Campo J, Upadhyay D, Mandjiny S, Bullard-Dillard R, Frederick J, Holmes L.
Photorhabdus Luminescens Phase II Cells Growth Kinetic Study Using A 5L A Plus
Sartorius Stedim Biostat® Fermentation System. European Scientific Journal. 2017.32535.
25. Belur P, Inman F, Holmes L. Determination of specific oxygen uptake rate of
Photorhabdus luminescens during submerged culture in lab scale bioreactor. Biocontrol
Science and Technology. 2013. 1458-1468.
26. Han R, Ehlers R. Cultivation of Axenic Heterorhabditis Spp. Dauer Juveniles and Their
Response To Non-Specific Photorhabdus Luminescens Food Signals. Nematologica. 1998.
425-435.
27. Johnigk S, Ecke F, Poehling M, Ehlers R. Liquid culture mass production of biocontrol
nematodes, Heterorhabditis bacteriophora (Nematoda: Rhabditida): improved timing of
dauer juvenile inoculation. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. 651-658.
29
10. ANEXOS
10.1. Medio NBTA
Componente
Cantidad (g/L)
Azul de bromotimol (BTB)
0,025
Cloruro de trifeniltetrazolio (TTC)
0,04
Agar nutritivo
20
Se debe preparar el agar nutritivo y a este se le adiciona el BTB. Se manda esterilizar en autoclave
a 121ºC por 15 min. Cuando este se enfríe se añade el TTC y se sirve en las cajas Petri.
10.2. Medio LB
Componente
Cantidad (g/L)
Cloruro de sodio
5
Extracto de levadura
5
Peptona de caseína
10
Agar
12
Rehidratar el medio con agua destilada, calentar en agitación y esterilizar en autoclave a 121ºC
por 15 min. Dejar enfriar y servir en cajas Petri.
30
10.3. Medio tripticasa de soya
Componente
Cantidad (g/L)
Digerido pancreático de caseína
14,5
Digerido papaíco de harina de soja
5
NaCl
5
Factores de crecimiento
14
Agar
1,5
Rehidratar el medio con agua destilada, calentar en agitación y esterilizar en autoclave a 121ºC
por 15 min. Dejar enfriar y servir en cajas Petri.
10.4. Medio tripticasa de soya suplementado con 20% de glicerol
Componente
Cantidad (g/L)
Digerido pancreático de caseína
14,5
Digerido papaíco de harina de soja
5
NaCl
5
Factores de crecimiento
14
Glicerol 99,9 % (v/v)
200 ml
Rehidratar el medio con agua destilada, calentar en agitación y añadir el glicerol. Esterilizar en
autoclave a 121ºC por 15 min. Dejar enfriar y servir en cajas Petri.
31
10.5. Solución salina al 0,85% (p/v)
Componente
Cantidad
NaCl
850 g
Agua destilada
1L
Disolver el NaCl en agua destilada, agitar y esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 min.
10.6. Medio de producción in vitro de H. indica SL0708
Componente
Cantidad (g/L)
Extracto de levadura
10
Peptona
10
Harina de soya
3
Aceite de soya
30
Yema de huevo
6
Glucosa
3
NaCl
4
CaCl2
0,3
MgSO4
0,2
FeSO4
0,05
KCl
0,035
Mezclar los componentes y rehidratar con agua destilada. Agitar en calor y esterilizar en autoclave
a 121ºC por 15 min.
32
10.7. Curva patrón de glucosa (g/L)
Ecuación de la recta: y=0,6003x-0,0547; 𝑟 2 =0,9977.
10.8. Análisis de varianza (ANOVA)
33