Primera Unidad Enzimología y Metabolismo Energético - EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE OXIDORREDUCCION -INTRODUCCION: Los equivalentes reductores: átomos de hidrógeno o electrones, provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebs y otros metabolitos; son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. Este sistema se localiza en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física entre sus componentes y su integración en la membrana. Este sistema multienzimático, es conocido también como cadena transportadora de electrones, enfatizando que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. Los inhibidores más usados se clasifican en tres grupos según el sitio donde actúen en la cadena respiratoria. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. Inhibidores de localización son: el amital, los esteroides, los detergentes, algunos anestésicos volátiles como el halotano, etc. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transferencia de electrones entre los citocromos b y c. El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina, inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido, el BAL y barbiturato de sódio, se les denomina inhibidores del sitio II. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 del citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno, comprenden el cianuro, el monóxido de carbono, la azida, etc. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. Para determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones, se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen; así por ejemplo el 2-6 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado, que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. Como hay flujo de electrones en la cadena, ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. Si al administrar un inhibidor de la cadena, éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore), quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN, inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I), pero si el indicador se decolora, entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. La p-fenilendiamina, es otro indicador que actúa como sustrato; es decir que es capaz de ceder electrones. Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). En la cadena REDOX, el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno, es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena, la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador, entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol, entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). FINALIDAD: ▪ Demostrar que los inhibidores: rotenona, barbital sódico y azida de sodio, actúan en las regiones cercanas al sitio I, sitio II y sitio III, respectivamente, mediante el uso de indicadores conocidos como 2 – 6 diclorofenolindofenol y p – fenilendiamina. MATERIAL Y EQUIPO: ▪ Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4 ▪ 2,6-diclorofenolindofenol 0.02 % ▪ p-fenilendiamina 1% ▪ Malato de sodio 0.1M ▪ Rotenona 0.1M ▪ Barbiturato de sodio 0.1M ▪ Azida de sodio ▪ Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) Primera Unidad Enzimología y Metabolismo Energético PROCEDIMIENTO: 1) Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el siguiente sistema agregando lo que se indica en el siguiente cuadro: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml) I II III IV V VI Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 1.2 1.5 1.0 0.5 0.5 0.5 2-6 diclorofenolindofenol 0.02% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Malato 0.1M -0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Rotenona 0.1M ---0.5 --Barbiturato de sodio ----0.5 -Azida de sodio -----0.5 Homogenizado Mitocondrial 10% 0.5 -0.5 0.5 0.5 0.5 Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente. Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color). 1 2 3 4 5 2) Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar: el siguiente sistema agregando lo que se indica: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml) I II III IV V Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 2.0 1.5 1.0 1.0 1.0 Azida de sodio --0.5 --Barbiturato de sodio 0.1M ---0.5 -Rotenona 0.1M ----0.5 p-fenilendiamina 1% 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Homogenizado de mitocondrias 10% -0.5 0.5 0.5 0.5 Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente. Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color). 1 2 3 4 5 6 6 Primera Unidad Enzimología y Metabolismo Energético ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO: Explique bioquímicamente lo encontrado. PREGUNTAS DE APLICACIÓN: 1) ¿Cuál fueron los objetivos de la práctica? 2) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. 3) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características. 4) ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 5) Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica, la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. 6) Grafique en la cadena respiratorio los sitios I, II y III. 7) Menciones 5 ejemplos de situaciones clínicas relacionadas con la inhibición de la cadena respiratoria. 8) Esquematice la acción del halotano sobre la cadena respiratoria. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
