SeminarioCROMATOGRAFIA

PRACTICA CROMATOGRAFIA EN GEL
Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
J.A. REIG
Para saber lo que tengo debo
separar las
l partes y cuantificar
ifi
1 de 20€
2 de 10€
1 moneda de 1 €
10 monedas 0.20€
4 monedas 0.10€
3 monedas
d de
d 0.02€
0 02
2 monedas de 0.01€
CROMATOGRAFIA Y ELECTROFORESIS:
Técnicas de separación y resolución de una mezcla de moléculas para
aislar un componente o llevar a cabo un análisis.
PRACTICA DE BIOQUIMICA : CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL Y
DETERMINACION DE PROTEINA EN PLASMA
Perfil cromatografico
de un veneno
Fracción IV
CROMATOGRAFIA  Diferente velocidad de desplazamiento de moléculas
en una mezcla al ser arrastradas por una fase movil a través de un
soporte sólido o estacionario… arrastre por presión, capilaridad etc.
Punto
de aplicación
Fase estacionaria
Fase movil
eluyente
CROMATOGRAFIA EN PAPEL
distancia migrada por molecula
Rf= -------------------------------------distancia migrada por frente
CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA
((SILICAGEL ((SiO2)
ALUMINA (Al2O3)
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
PRACTICA DE LABORATORIO
H2O
Bi G l P4
BioGel
VASO PLASTICO CON
ELUYENTE (AGUA DESTILADA)
COLUMNA
CON GEL
EN SUSPENSION
PLACA POROSA
CANULA GOMA
GRADILLA
CON TUBOS
MARCADOS
SIN NUMERAR
PIPETA PASTEUR
PINZA DE ROSCA
TUBO EPPENDORF
MUESTRA A SEPARAR
CROMATOGRAFIA
SEGÚN EL SOPORTE
INTERCAMBIO IONICO
Separa por carga
Intercambio aniónico
Intercambio catiónico
AFINIDAD
Separa por afinidad en la
unión con un dominio
FILTRACION EN GEL
Separa por tamaño
CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL
O DE EXCLUSION MOLECULAR
LAS MOLECULAS SE SEPARAN EN FUNCION DEL TAMAÑO
LAS GRANDES FLUYEN MAS RAPIDAMENTE,
RAPIDAMENTE LAS PEQUEÑAS SE QUEDAN RETENIDAS
MAS TIEMPO EN EL GEL Y SALEN MAS TARDE DE LA COLUMNA, DISTINTA VELOCIDAD
DE MIGRACION
Azul dextrano+Vit B12
3ml
1
2
3
4
5
6…………………….
Cuantificaremos
C
antifica emos
X colorimetria
AZUL DEXTRANO
PM=200.000
VOLUMEN DE EXCLUSIÓN (V0) 6x3ml=18ml
VIT. B12
PM=1355
Aplicar la muestra
MUESTRA
azul
1 quitar tapa
1.quitar
Tubo
eppendorf
2.Vaciar
2
Vaciar con
Pipeta pasteur
3. Aplicar muestra
y... quitar pinza!!
eluyente
Dejar resbalar por las
paredes de la columna,
sin bombardear el gel!
3mL
L muestra
La
t debe
d b penetrar
t
en ell gell
sin que se seque el gel!!
añadiremos un poco (2 dedos)
de eluyente, para evitar distorsiones y
conectamos la cánula al erlenmeyer
en la leja superior con la fase movil.
Ley de Lambert-Beer
AZUL
DEXTRANO
VIT. B12
Relación exponencial
entre la transmisión
de luz a través de una
sustancia y su concentración
V0
Ve
Absorbancia
bso ba c a 1A=log
og Io/I
o/
A=1  lg
g Io/I
o/ =1 Io/I=10
o/
0  inciden
c de 100
00 y salen
sa e 10
0
Se absorbe un 90% de luz.
Si la absorbancia es 2 Io/I=100 se absorbe un 99%
Cuanto mayor absorbancia mayor concentración MAS LUZ SE ABSORBE,MENOS SALElog Io/I
Vo
Ve
Gel P4 RANGO EXCLUSION
800-4000
D=1,7cm
r=0,85cm
VitB12
AD
AD=200.000 excluido
Vit B12=1355 parcialmente incluida
Vt= πr2xh
Vt (cc = ml)
Vo volumen exterior de la columna recorrido
por moléculas no incluídas (marcador= azul dextrano)
Ve volumen al que sale la vit. B12
Se puede normalizar para cada columna el comportamiento cromatografico en función de
los paramentros de cada columna.
Ve-Vo
Kd= --------Vt-Vo
2ª parte de la práctica
DETERMINACION DE CONCENTRACION PROTEICA
MEDIANTE REACCION CON BIURET
REACTIVO DE BIURET:
Cu(SO4) y NaOH
PROHIBIDAS LAS SIESTAS
DETERMINACION DE LA CANTIDAD DE PROTEINA EN UNA MUESTRA DE SUERO
REACTIVO
BIURET (azul)
123456 M
Muestra
M
t
suero
Abs
SOLUCION
ESTÁNDAR
ALBUMINA 10mg/ml
Y=mX+b  Y=mX
MAbs
0 1
3
x
5
8 10
mg proteina
Reactivo 1
abs
0.15
0.12
0.1
0.05
8,5mg/0.1ml
0 1
3
5
8
mgg Proteina
10
0 15
0.15
0.1
ajustar una recta
0.05
100L=0.1mL
0 1 3
5 8 10
PIPETAS DE VIDRIO Y PIPETEADORES
INDIVIDUAL!!
NOMBRES Y APELLIDOS (CON MAYUSCULAS)
Tubo/Abs
1-0
2-0,03
2
0,03
3-0,01
4-0,06
5-0,7
6-0,23
7 0 40
7-0,40
-----etc
Cromatografia en gel que separa por….
P4/800-4000
Abs
0.50
A
Vo
Φ=1,7 cm
Ve
0.25
Tubo/abs
1(0mg)/0
2(1mg)/0,05
(
g)/0,05
…
…
6(10mg/0,28
Tubo nº/ml
1 2 3 4 5 6......
3 mL
Abs
0.2
0
2
0.15
0.1
0.05
Manual=77
Ordenador=72,7
A=0.12
X=7,7mg/0.1ml
x10
0
1
3
5
8
mg PROTEÍNA
10
77mg/mL
 3 l/ i
=3ml/xmin
LOS CUESTIONARIOS
SE ENTREGAN AL FINALIZAR!
OTRAS CROMATOGRAFIAS
CROMATOGRAFIA DE GASES
Identificacion en base a standars
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION (HPLC)
Adsorventes de distinta
hidrofobicidad son
empaquetados en columnas
sac
¿?
Si
F2F1+
sac
ELECTROFORESIS:
MIGRACION DIFERENCIAL DE MOLECULAS EN EL SENO DE UN CAMPO ELECTRICO
SOBRE UN SOPORTE DETERMINADO.
PAPEL
AGAROSA
POLIACRILAMIDA
MOVILIDAD DEPENDE
DE CARGA Y TAMAÑO
pI
+
ELECTROFORESIS EN AGAROSA
ACIDOS NUCLEICOS
ELECTROFORESIS DE SDS-POLIACRILAMIDA
PROTEINAS
REVELADO CON COLORANTES:
AZUL DE COOMASSIE
MUCHO
UC O CUIDADO
CU
O EN EL
LABORATORIO...!
No
No
No
No
olvideis
olvideis
olvideis
olvideis
la bata de laboratorio
los guiones de prácticas
traer firmado la hoja de conocimiento de normativa
una calculadora, un lapiz y una goma....