revew paper celula de origen de cancer de pulmon de celulas pequeñas
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Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 1 “Célula de origen del cáncer de pulmón de células pequeñas: Inactivación de Trp53 y Rb1 en distintos tipos de células pulmonares de ratón adulto” Nicolás Lefin H. Carrera: Ingeniería Civil Química Junio 2020. Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 2 Introducción: El cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es una de las enfermedades humanas más letales y constituyen a el 15% de todos los casos de cáncer de pulmón (Ferone, 2020), esto se debe a la cantidad de células presentes en el pulmón y a la dificultad de diagnosticar este cáncer en fases iniciales para poder precisar en qué célula o posibles células se origina el SCLC. Una de las células que son posibles candidatas para originar tumores son los tejidos de células madres, ya que estas al tener mayor longevidad podrían acumular mutaciones genéticas que podrían generar tumorigenesis. Es posible que progenitores y células diferenciadas también sirvan como candidatas, pero esto dependerá de muchos factores como modificaciones específicas en la capacidad de autorrenovación . El entender la jerarquía celular normal del pulmón también es muy importante a la hora de identificar las células que dan origen a el cáncer. Hasta la fecha del estudio, sólo se conocía una comprensión de la relación entre tipos de células y existencia de células madre o progenitoras de pulmón en modelos de ratones. El epitelio de la tráquea del ratón contiene poblaciones abundantes de células basales, así como células del revestimiento epitelial ciliado (células caliciformes y algunas células clara). También se encontraron células neuroendocrinas (NE) solitarias, pero son mucho más raras. En la tráquea, las células basales positivas para la queratina 5 ( Krt5+ ) actúan como células madres ya que estas se auto-renuevan y dan lugar a las células claras (Rock, 2009). En las vías aéreas más lejanas, las células claras abundan y recubren los bronquios y bronquiolos pequeños. En estas regiones las células claras adquieren la capacidad de auto-renovarse como las células madres además de generar células ciliadas tanto para su mantenimiento (homeostasis) como también en respuesta de lesiones epiteliales. Por otro lado, en las vías respiratorias intrapulmonares se ve que hay número limitado de células NE, estos se encuentran en grupos llamados cuerpos neuroepiteliales (NEB). Los NEB se encuentran mayormente en las zonas de unión de las vías respiratorias en los bronquiolos. La zona distal del pulmón contiene un complejo sistema de alveolos, estos están compuestos por células alveolares de tipo 1 (AT1) y 2 (AT2). En los alvéolos la AT2 se considera célula madre debido que tiene la capacidad de Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 3 auto-renovarse y también da a lugar a células AT1 (Evans, 1975). La transición entre los bronquiolos terminales y los alvéolos se conoce como unión del conducto bronquioalveolar (BADJ). Aún no se conoce muy bien los tipos de células que al alterarse genéticamente, dan lugar a SCLC, pero al estudiar los subtipos de tumores pulmonares se ve un patrón de distribución proximal a distal, que se mueve desde la tráquea: carcinoma de células escamosas (SCC), SCLC y adenocarcinoma / carcinoma bronquioalveolar (Giangreco, 2007). Por lo que se puede concluir que distintas clases de tumores surgen de células muy similares y en regiones definidas. Incluso las observaciones del SCLC muestra carcinomas muy similares al carcinoma de células no pequeñas (NSCLC), esto podría deberse a la existencia de una célula de origen “común” para estos cánceres de pulmón. Se ha visto que el estudio de la enfermedad y las alteraciones genéticas están fuertemente asociadas. Por ejemplo, la pérdida de la función del gen Rb1 en los pulmones ha demostrado una regulación negativa en la diferenciacion de celulas NE, y esto puede explicar porque la pérdida de Rb1 se asocia a el SCLC. En cambio, mutaciones activadoras en K-ras son exclusivamente encontrados en NSCLC, mientras que la pérdida de las funciones de Trp53 se observa tanto en SCLC como en NSCLC (Meuwissen, 2005). Aunque las distintas lesiones genéticas se asocian a tipos específicos de células tumorales, se sigue sin dejar en claro si la célula de origen es un factor en el fenotipo del tumor. Objetivo El objetivo del estudio es ver si estos tres tipos de células (células claras, células AT2 y células neuroendocrinas) pueden ser posibles candidatas a ser célula de origen de la SCLC. Es por esto que se utilizó genes específicos de cada célula para así generar un vector adenoviral recombinante, permitiendo así la mutación esporádica en un pequeño número de células, imitando la forma que se desarrollan tumores en el hombre. Para la célula clara utilizó el gen CC10 (Ray, 1993), para la célula AT2 utilizó el gen SPC (Glasser, 2005) y para la célula neuronal se utilizó el gen CGRP (Johnston, 1998). Estas secuencias limitan la expresión transgénica de las células descritas anteriormente. Además de analizar este tipo de Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 4 células candidatas a producir la SCLC también se utilizó un modelo de cáncer de pulmón basado en la inactivación de los genes Trp53 y Rb1 los cuales son genes supresores de tumores específicamente de células epiteliales pulmonares utilizando el vector Ad5-CMV-Cre, para poder hacer una comparación de esta con los resultados anteriores (Sutherland, 2011). Luego de tener los vectores (Ad5-CC10-Cre, Ad5-SPC-Cre y Ad5-CGRP-Cre), se utilizaron una cepa de ratones específicas y se administraron estos vectores. Luego de 3 semanas se comenzaron a ver resultados y se comenzaron a analizar estos ratones. Esto se repitió igualmente para el vector Ad5-CMV-Cre. Métodos y materiales Cepa de ratones Los ratones fueron autorizados por el instituto de cáncer de los países bajos. Los ratones utilizados en el modelo de SCLC fueron cruzados con Rosa26R-LacZ. Los ratones mT/mG de doble fluorescente se les cambio el genotipo utilizando cebadores. Generación de virus adeno-cre de células específicas de células recombinantes Para lograr apreciar diferencias y analizar cada una de las células las cuales identificaron como posibles candidatas, se utilizó un método para dirigir , expresar y eliminar una expresión Cre específica a un número pequeño de células pulmonares adultas, específicamente a promotores específicos del gen epitelial pulmonar, utilizando un adenovirus como vector de transferencia de gen, este sistema se llama Cre-loxP. Para generar los virus adeno-cre específicos de células pulmonares recombinantes, se utilizó un enlazador de PCR (attB-anked),el cual contiene distintos sitios de clonación de enzimas. Estos se amplificaron y se recombinó en el vector pDONR221™. Para la expresión de la Cre recombinasa en la célula, se tomó un marco de lectura abierto con un intrón sintético Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 5 N-terminal y una señal de poliadenilación C-terminal fue aislado del pOG231. Este fragmento de Cre se insertó ya sea detrás del gen promotor del ratón CC10 de 2.1 kb en pDONR221™ o detrás del promotor del surfactante de proteína C en pDONR221™. Luego estos se recombinan en un vector pAd-PL DEST , para generar construcciones adenovirales Ad5-CC10-Cre y Ad5-SPC-Cre. El promotor de calcitonina/CGRP de 2 kb fue clonado desde 3´ al igual que los otros dos. Los adenovirus fueron amplificados y purificados. Administracion de virus Adeno-cre Los ratones de 7 semanas fueron tratados con ciclosporina A por vía oral en agua potable, una semana antes de la administración de adenovirus, y dos a tres semanas después de la infección por adenovirus. Los ratones fueron intubados forma intratraqueal con 20 μL de virus Adeno-Cre purificado. Inmunohistoquímica y tinción de X-Gal El análisis histológico se realizó inyectando etanol-ácido acético-formalina (EAF) en los pulmones y esto se fijo durante 24 hrs. Luego los tejidos fueron deshidratados, incrustados en parafina y seccionados ( 2 μm ) y teñidas por hematoxilina y eosina (H&E). Se realizaron inmunohistoquímica para: anti-Ncam1, anti-sinaptofisina, anti-pro-SPC, anti-CCSP, Ki67, Cytokeratin. La inmunohistoquímica es un método de laboratorio la cual se utilizan anticuerpos en forma de marcadores para la determinacion de antigenos, generalmente estos anticuerpos van unidos a una enzima o un tinte fluorescente(de Dios Soler & Acosta Haab, 2018, pp. 1–3). La estreptavidina-peroxidasa o PowerVision Poly-HRP, se utilizaron para la visualización y la diaminobencidina como un cromógeno. Para detectar la actividad de galactosidasa, se tiñeron los pulmones complementamente con una solución de tinción de X-gal que es un compuesto azul insoluble utilizada como indicador de células que expresan enzima beta-galactosidasa, codificada en el gen lacZ del operón lac (colaboradores de Wikipedia, 2020). Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 6 Microscopía de inmunofluorescencia Los pulmones se inflaron con paraformaldehido al 4% (PFA) durante 4 hrs. Se lavaron en PBS, se protegieron con sacarosa y se montaron en cryomatrix. La tinción inmunohistoquímica se realizó usando: anti-CCSP, anti-pro-SPC, anti-sinaptofisina (Syn) y péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP). y se utilizó un microscopio confocal de doble disco giratorio mejorado con microlentes. Análisis de expresión génica Se aisló el ARN total de los tumores pulmonares de los ratones usando un reactivo (TRIzol), y luego tratado con un kit DNA-free. El ADN complementario se preparó usando la primera cadena sintetizada con un kit para RT-PCR el cual se realizaron 40 ciclos de amplificación. Resultados y Discusión Al tener distintos tipos de vectores y células, la discusión se presenta de una manera ordenada para facilitar la comprensión de este por lo que se dividirán por vectores y se hará un análisis general cuando la discusión lo permita. En general los vectores adenovirales tuvieron un nivel muy alto de especificidad respecto de la célula a la cual se dirige, ya que los marcadores que se utilizaron dieron resultados sumamente específicos para cada vector. Por lo que los resultado de estos vectores en su mayoría se pueden analizar y llegar a buenos resultados. 1. Ad5-CMV-Cre: La pérdida inducida de Trp53 y Rb1 en las células NE da lugar a una alta formación de tumores pulmonares con diferenciación NE y morfología SCLC, estas lesiones genéticas en conjunto harían que se promoviera una transformación neoplásica de las células NE. Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 7 2. Ad5-CC10-Cre: Los tumores que se produjeron con este vector también fueron NE, pero a niveles mucho menores, esto se puede deber a que en los NEB se encuentran células claras y variantes de estas. Por lo que puede que exista una relación entre estas dos células. 3. Ad5-SPC-Cre: Se observó que una población de células que marcaban positivo para SPC pueden dar lugar a SCLC después de pérdida de Trp53 y Rb1. Por lo que se ha propuesto que células BASC sean células de origen de k-ras-NSCLC inducido ya que estas células ubicadas en el BADJ expresan CCSP y SPC por lo que estarían dirigidos a los virus CC10 y SPC, pero debido a que los resultados de CC10 no fueron significativos al momento de generar tumores específicos NE se descarta la idea de que las células BASC sean células de origen de SCLC. Existen otros tipos de células que sí expresan SPC al momento de producir SCLC y tiene la capacidad de diferenciarse a tumores NE. Esto podría deberse a que es un progenitor común que está en el pulmón el cual se diferencia bajo la presión de la pérdida de Trp53 y Rb1. Esto alude a que puede que exista una célula multipotente pero esto es una hipótesis ilusoria ya que aún no se comprueba esta teoría. 4. Ad5-CGRP-Cre: Los tumores producidos por este vector se ubicaron en el centro del pulmón, siendo agresivos y teniendo la capacidad de producir metástasis en el hígado. Además de expresar marcadores celulares parecidos a el de los humanos, como los TTF-1. Estos resultados dan una clara y fuerte evidencia de que las células NE servirá como célula objetivo de origen de SCLC. La noción de que las células NE son las células de origen de SCLC implica que deberíamos concentrarnos en este tipo de célula y buscar terapias o estrategias que puedan erradicar este tipo de células. Se sabe muy poco sobre este linaje, aunque sí se ha visto que estas células no se comportan como células madres a pesar del microambiente en el que se encuentra, se muestra más bien una célula progenitora uni-potente. También se tiene que considerar que existen otras vías las cuales esta célula podría sufrir modificaciones tras activación de otras vías de señalización como el caso de la vía K-ras produciendo NSCLC. Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 8 Conclusión El estudio de células progenitoras de SCLC es el inicio de lo que podría ser una cura para estos tipos de cancer, ademas de poder diferenciar entre otros tipos de cánceres como el NSCLC y cánceres provenientes del pulmón. El hecho de que se haya encontrado una célula candidata hace que en las áreas de investigación oncológicas puedan expandirse y dirigirise a esas células específicas y generar posibles terapias que puedan atacar a esta célula. Además, es posible identificar como las otras células y genes se diferencian unas de otras dando formaciones a distintos tipos de cánceres como en el caso de las células NE originando NSCLC al momento de irse por otro tipo de vías de señalización como la K-ras. Un estudio reciente logro identificar que la utilización de un nuevo vector con un gen de expresión K5 actúa por medio de Cre recombinasa, induciendo así los genes Rb1 y Trp53 solo a las células progenitoras basales del epitelio traqueal o bronquios principales. y observaron que esta nueva célula produce más tumores que el método utilizado anteriormente. Ademas, este estudio comprobo que al utilizar Ad5-CMV-Cre dirigida a las células epiteliales pulmonares esta no permite una identificación de un tipo de célula específica como la Ad5-K5-Cre ya que existirían diversas lesiones NE en distintas células pulmonares, y que si lo hay, esta actuaría como célula de origen de LCNEC (Carcinoma neuroendocrino de células grandes del pulmón), no de SCLC (Santos, 2020, p. 1702413). Se ha encontrado paralelamente al estudio anterior, que el hecho de que el vector Ad5-CMV-Cre entregue una diversidad de lesiones NE, se acerque más a las lesiones centrales “típicas” que tendría un SCLC humano y lesiones periféricas que son más benignas. Además se encontró un nuevo gen llamado FGFR1 el cual mejora la penetración y el número de lesiones periféricas NE, conservando las lesiones benignas y que requeriría de lesiones conductores adicionales como la p130 o la sobreexpresión de Nfib para transformar estos tumores periféricos en tumores con metástasis más agresivas, por lo que esta sobreexpresión del gen sería una especie de amplificador y potenciador de SCLC, pero solo en etapas Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 9 tempranas de la tumorigénesis, por lo que inhibir esta expresión en una etapa temprana hace muy difícil de realizarse (Ferone, 2020). Referencias Colaboradores de Wikipedia. (2020, 2 marzo). X-gal. Wikipedia, la enciclopedia libre. https://es.wikipedia.org/wiki/X-gal De Dios Soler, M., & Acosta Haab, G. (2018). Guía de inmunohistoquímica para técnicos (1a ed.) [Libro electrónico]. http://iah.salud.gob.ar/doc/Documento203.pdf Evans, M. J. (1975, febrero). Transformation of Alveolar Type 2 Cells to Type 1 Cells Following Exposure to NO2. PubMed. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/163758/ Ferone, G. (2020, 17 marzo). FGFR1 Oncogenic Activation Reveals an Alternative Cell of Origin of SCLC in Rb1/p53 Mice. ScienceDirect. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124720302138 Giangreco, A. (2007, 15 marzo). Lung Cancer and Lung Stem Cells: Strange Bedfellows? PubMed. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17158280/ Glasser, S. W. (2005, abril). The Murine SP-C Promoter Directs Type II Cell-Specific Expression in Transgenic Mice. PubMed. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15579627/ Johnston, D. (1998, 23 enero). Expression of v-Ha-ras driven by the calcitonin/calcitonin gene-related peptide promoter: a novel transgenic murine model for medullary thyroid carcinoma. Oncogene. https://www.nature.com/articles/1201478?error=cookies_not_supported&code=ce0322d1-99 65-4a4a-866e-8cb0f5d59767 Universidad de La Frontera. Facultad de Ingeniería, ciencias y administración Departamento de Ingeniería Química Informe Biología Celular 10 Meuwissen, R. (2005, 15 marzo). Mouse Models for Human Lung Cancer. PubMed. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15769940/ Rawlins, E. L. (2009, 5 junio). The Role of Scgb1a1+ Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway, but Not Alveolar, Epithelium. PubMed. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19497281/ Ray, M. K. (1993, 30 noviembre). Cloning and Characterization of the Mouse Clara Cell-Specific 10-kDa Protein Gene: Comparison of the 5′-Flanking Region with the Human, Rat, and Gene. 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