Técnicas Microscópicas: Práctica de Laboratorio de Biología

Práctica 1
Introducción a las técnicas microscópicas
Según recoge la guía docente de la asignatura Laboratorio Integrado de Biología, el objetivo
general de esta parte de la asignatura es saber identificar estructuras celulares y tejidos al
microscopio.
Los objetivos específicos son: a) saber utilizar el microscopio como herramienta principal en la
observación de muestras biológicas; b) identificar y evaluar muestras biológicas de células y
tejidos animales; c) procesar en el laboratorio muestras biológicas de células y tejidos animales
para su posterior observación y estudio.
Los organismos pluricelulares están formados por células que son muy diversas en forma y
función. Las células se asocian formando tejidos. Un tejido es un conjunto de células, matriz
extracelular, y fluido corporal que cooperan para llevar a cabo una o varias funciones en un
organismo. Distintos tejidos se asocian entre sí para formar los órganos. La histología es una
disciplina eminentemente descriptiva que se dedica a la observación de los diferentes tejidos
mediante microscopios. La mayoría de las técnicas histológicas van encaminadas a preparar el
tejido para su observación con el microscopio. Ello es debido a que la composición de los
tejidos, salvo contadas ocasiones, no tienen contraste ni colores permitan diferenciar sus
estructuras de una manera clara mediante la observación directa con los microscopios. Por ello
hay que procesar las muestras, primero para que no se deterioren y después para resaltar sus
estructuras y poder estudiarlas en detalle.
De manera general, para alcanzar este objetivo es necesario realizar los siguientes pasos:
‐ Toma de la muestra
‐ Fijación
‐ Inclusión
‐ Microtomía
‐ Coloración o tinción
‐ Montaje
Obtención de muestras.‐ Se realiza mediante biopsias de un ser vivo, o mediante disección de
uno muerto. En este último caso hay que proceder de forma lo más inmediata posible la
muerte y siguiendo los usos aceptados y permitidos. Una vez extraídos de un ser vivo, los
órganos cesan en sus funciones vitales y se trata de impedir las modificaciones post morten
que pueda sufrir las células (procesos autolíticos), manteniendo la estructura morfológica de
células y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos. Se trata también de evitar la
putrefacción por acción bacteriana. Estos procesos se consiguen mediante las técnicas de
fijación.
Fijación.‐ Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más
parecidas posibles a las que poseía en su estado vivo. Esto se consigue inmovilizando (por
coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las
enzimáticas haciéndolas insolubles. Esta acción garantiza la integridad de las células y tejidos.
Aunque detiene todos los procesos vitales, este proceso conserva la estructura de células y
tejidos. Se efectúa mediante agentes químicos denominados fijadores o mediante agentes
físicos. Para ello se sumerge la muestra en el fijador o este se inyecta en el torrente sanguíneo
para su rápida difusión a todas las partes (perfusión).
Los fijadores físicos se basan bien en una congelación muy rápida del tejido o bien en la
aplicación de calor elevado. La congelación en realidad más que un método de fijación es un
método de conservación, y en la mayoría de los casos, para conseguir las preparaciones
microscópicas, se requiere en algún momento una fijación química. Tiene la ventaja de que no
altera en absoluto las conformaciones moleculares, que sí se ven afectadas por los procesos
químicos. El calor elevado coagula las proteínas, pero conserva la estructura morfológica. El
ejemplo más claro de fijación por calor es un huevo cocido: aunque la clara y la yema se
coagulan, el huevo sigue conservando su aspecto.
Los fijadores se pueden clasificar en tres grandes grupos según su acción sobre el tejido: los
coagulantes, los que establecen enlaces cruzados y los oxidantes
coagulantes: provoca la desnaturalización de las proteínas sin modificarlas
químicamente. Entre ellos se encuentran sustancias como los alcoholes, el ácido
acético, el cloruro de mercurio, etc
entrecruzantes: establecen enlaces cruzados entre distintas moléculas generando con
ellas una red tridimensional. Entre ellos se encuentran los aldehídos. El formaldehido
es un fijador ampliamente usado que se une a grupos funcionales de las proteínas. Esta
unión hace que muchos enzimas queden inactivas. Los grupos a los que se une son
amino, sulfidrilos, guanidilos, grupos hidroxilos alifáticos, etcétera. La unión a uno de
estos grupos produce un grupo hidroximetileno. Es el hidroximetileno el que reacciona
con grupos de otra, o de la misma, proteína para la formación de puentes.
oxidantes: La acción oxidante de estos fijadores le confieren a las células ciertas
condiciones que posibilitan una mejor aplicación de las sustancias colorantes. Entre
ellos se encuentran el dicromato potásico y el tetróxido de osmio. Éste último forma
puentes entre los enlaces insaturados de las cadenas de ácidos grasos de los lípidos de
las membranas celulares. Las hace insolubles, oscuras y opaca a los electrones, por lo
que es usado en microscopía electrónica.
Inclusión y corte.‐ Para poder observar los tejidos en un microscopio es preciso que la muestra
posea la dureza y la consistencia suficientes para obtener secciones delgadas y transparentes
lo suficientemente finos (8‐10 µm) como para que los atraviese la luz. Incluir significa infiltrar
el tejido con un medio líquido que posteriormente se solidificará y endurecerá sin afectar las
características estructurales de la muestra. El medio de inclusión más usado para obtener
secciones finas es la parafina; una mezcla de hidrocarburos de cadena larga que en estado
sólido tiene la consistencia de la cera. Las más usadas tienen un punto de fusión de 55‐60ºC y
la infiltración ha de realizarse con la parafina en estado líquido. Como la parafina no es
miscible con el agua se ha de sustituir el agua de la muestra por un líquido compatible. Se
utiliza alcohol etílico de gradación creciente (70‐100%) haciendo varios cambios en un tiempo
que puede durar 1‐6 horas, según el tamaño de la muestra. La parafina tampoco es miscible
con el alcohol, por lo que se introducen baños cortos en un solvente orgánico miscible tanto
en alcohol como en parafina, normalmente el xileno. Tras 2‐3 baños de 1 hora en parafina
líquida, tras lo cual la muestra estará infiltrada de parafina y al transferirse a un molde y dejar
enfriar tendremos un bloque de parafina con la muestra que podemos cortar con un
micrótomo. La figura muestra un esquema del proceso:
Una vez incluidos los tejidos y la parafina integran un solo bloque que, posee la dureza y la
consistencia suficientes para obtener secciones delgadas y transparentes. Las secciones
delgadas o “cortes” se obtienen utilizando instrumentos mecánicos diseñados para que en
forma más o menos automática, seccionen el bloque de parafina en cortes delgados y de
grosor uniforme. Los instrumentos se denominan “microtomos”. Los micrótomos más usados
son los de rotación, como el de la figura
Están dotados de una cuchilla y un portamuestras que sujeta el bloque de parafina y que se
desplaza arriba y abajo accionado por una manivela; en cada desplazamiento la manivela
acciona un tornillo que determina el avance del bloque según el grosor seleccionado. se
obtienen tiras de cortes que se colocan sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a
unos 40 °C. El portaobjetos ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la
hidrofobicidad de la parafina hacen que las secciones se estiren sobre la superficie del agua y
una vez evaporada queden adheridas al portaobjetos.
Tinción.‐ Para poder ver los cortes en el microscopio todavía hay que solucionar el problema
de la visibilidad: nosotros “vemos” las cosas por la luz que emiten (color) o por la diferencia en
el índice de refracción entre el objeto y el medio: un porta no tiene color, pero vemos sus
bordes por la diferencia del índice de refracción entre el vidrio y el aire; si el porta lo
introdujésemos en agua sería más difícil de ver porque la diferencia en el índice de refracción
es menor. En las muestras biológicas al menos el 75% es agua y color solo tienen los
pigmentos, que son pocos y se encuentran en células restringidas (hemoglobina en los
eritrocitos, melanina en los melanocitos…..).
Para solucionar esta circunstancia se recurre al uso de colorantes, sustancias coloreadas que
son capaces de unirse de manera más o menos específica a estructuras del tejido aportándoles
color. Los colorantes son normalmente hidrosolubles, por lo que antes de proceder a la tinción
tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el
desaparafinado y la hidratación con baños sucesivos de etanol en concentración decreciente.
Por otra parte, una vez teñidos los cortes interesa conservarlo para poder observarlos cuantas
veces queramos. Para ello se recurre a las técnicas de montaje, que consisten en conservarlas
con una gota de resina transparente y un cubreobjetos. Como las resinas de montaje no suelen
ser hidrosolubles es necesaria la deshidratación con baños de etanol de concentración
creciente y el paso por xileno.
Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina‐eosina sobre
cortes de parafina. Se usa un colorante básico, la hematoxilina (morada), que tiene apetencia
por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular
como los glicosaminoglicanos, y otro ácido, la eosina (rosa), que tiene apetencia por
sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y
también por el colágeno de la matriz extracelular.
Un ejemplo del resultado de esta tinción se
muestra en la figura: de color morado los
núcleos y de color rosa los citoplasmas y
fibras colágenas.
Se usan también métodos tricrómicos para
poder distinguir núcleos, citoplasmas y
fibras colágenas. La imagen corresponde a
una tinción tricrómica de Gomori, cuyos
resultados son: colágeno, verde oscuro‐
celeste; músculo, rojo; citoplasma, rosado;
núcleo morado‐negro.
El esquema resume todos estos procesos
El texto en color son enlaces a videos sobre la realización de los procesos que se han descrito:
Proceso de inclusión en parafina
Corte con un microtomo de rotación
Colocación y estiramiento de cortes de parafina
Tinción general de hematoxilina y eosina en cortes de parafina
Técnicas histoquímicas.‐ Además del carácter ácido o básico de los componentes de los tejidos, también es
posible conocer con algún detalle su naturaleza química. El objetivo de la histoquímica es poner de
manifiesto una molécula o familia de moléculas. Estas moléculas son difícilmente discernibles con técnicas
generales y por tanto es necesario realizar pasos previos para poner de manifiesto la molécula que
queremos detectar. Las reacciones químicas consisten en la modificación química de moléculas del tejido
para posteriormente poder colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y
nucleótidos. La técnica histoquímica más empleada es la reacción de PAS (Periodic Acid Schiff). Se utiliza
para la detección de hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando están en cantidades relativamente
grandes en los tejidos. La modificación química del tejido consiste en la oxidación mediante el ácido
periódico de los enlaces entre los carbonos próximos que contienen grupos hidroxilos. Esto provoca la
formación de grupos aldehídos que serán reconocidos por el reactivo de Schiff, el cual se combinará con
ellos para dar un color rojizo brillante.
La histoenzimología se basa en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener funcional su
centro activo tras el proceso de fijación. Estos enzimas y las células que los poseen se ponen de manifiesto
mediante una reacción enzimática que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos
insolubles y coloreados. Los sustratos son específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar
preciso donde se produjo la reacción, es decir, donde se localiza el enzima. Las enzimas que se pueden
detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa,
etcétera.
La inmunocitoquímica es una técnica para la localización de moléculas en los tejidos mediante el empleo de
anticuerpos. Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a
moléculas y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o con
sustancias fluorescentes permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido.
Microscopio óptico
El microscopio óptico es un elemento esencial para los estudios generales de histología puesto que es el que
nos permite observar las diferentes características morfológicas de las células y los tejidos. Se basa en el uso
de lentes para aumentar los rayos de luz que atraviesan la muestra de tejido. Un microscopio óptico
compuesto está formado por las siguientes partes (ver el esquema):
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Oculares, son las lentes que forman la imagen que observaremos con nuestros ojos. Todos los
microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo. Al menos uno de los oculares
puede regularse para alejar o acercar la lente al objetivo, permitiendo ajustar el enfoque a las
condiciones de visión, dioptrías, de cada observador.
Objetivos, son las lentes que reciben la luz directamente tras atravesar la sección histológica y
poseen un tambor o revólver donde se encuentran varios objetivos. Cada uno de ellos posee
‐
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‐
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‐
lentes que permiten diferentes aumentos (4x, 10x, 20x, 40x y 100x). Rotando el revólver se
puede seleccionar el objetivo y por tanto el aumento al que queremos observar la preparación.
Platina, es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con nuestro tejido. Posee un
dispositivo para sujetar el portaobjetos, el cual se puede desplazar en el plano de la platina,
movimiento controlado manualmente.
Condensador, es un dispositivo con una lente que concentra y focaliza la luz proveniente de la
fuente sobre la sección de tejido.
Diafragma, se sitúa entre la fuente luminosa y el condensador. Permite aumentar el contraste de
la muestra y la profundidad de campo, es decir, el espesor de la muestra que está enfocado.
Fuente luminosa, es la que proporciona la luz que atraviesa la sección de tejido. Se usa una
lámpara cuyo haz de luz atraviesa el diafragma, el condensador, la muestra, y tras ello penetra
por el objetivo y atraviesa los oculares hasta nuestros ojos. La intensidad de la fuente luminosa
se puede regular mediante un reostato.
Macrométrico y micrométrico: el enfoque de la muestra se consigue variando la distancia de la
muestra a la lente del objetivo. La distancia se controla mediante dos ruedas denominadas
macrométrico y micrométrico, respectivamente. La primera permite movimientos ascendentes y
descendentes amplios de la platina y la segunda ajustes finos.
El enlace es a un video que explica las distintas partes y la forma de usar el microscópio.
https://youtu.be/N96x3Xtp95w
Microscopio electrónica
Los microscopios ópticos tienen un límite máximo de resolución de 0,2 µm. El poder de resolución es la
distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos. Este límite viene determinado por la longitud
de onda de la fuente de iluminación, en este caso la luz visible. Usando microscopios ópticos avanzados se
consiguen unos 1000‐1500 aumentos (objetivo de 100x junto con oculares de 10x o 15x). Sin embargo, no
debemos confundir los aumentos con el poder de resolución. Por más que consigamos aumentar una
imagen tomada de un microscopio, incluso con metodología digital, no se puede aumentar la resolución de
la imagen. Cuando se quieren observar estructuras celulares que están por debajo del límite de resolución
del microscopio óptico se recurre al microscopio electrónico. Este tipo de microscopio tiene un límite de
resolución más pequeño que 1 nanómetro gracias a que no usa la radiación electromagnética de la luz visible
sino la alta frecuencia de un haz de electrones que incide sobre la muestra, y permite aumentos de varios
millones de veces. El microscopio electrónico no usa lentes sino imanes que concentran los haces de
electrones emitidos por un filamento. Normalmente son aparatos grandes puesto que el viaje de los
electrones tiene que ocurrir en vacío, si no los electrones chocarían con las partículas de aire.
En el microscopio electrónico de transmisión se produce un haz de electrones en un filamento de tungsteno
que se condensan mediante electroimanes y se focalizan sobre una sección de tejido. Las secciones de tejido
deben ser muy finas, se denominan ultrafinas (de unas decenas de nanómetros), para permitir que sean
atravesadas por los electrones. Previamente las secciones deben ser tratadas con metales pesados como el
osmio y el uranilo. La función de estos metales es similar a las tinciones usadas en el microscopio óptico pero
en este caso para introducir elementos densos a los electrones. El osmio se une a los dobles enlaces de los
lípidos y el uranilo a los complejos proteicos. De esta forma se consigue densidad electrónica en las
membranas y los complejos macromoleculares. Los electrones que chocan con estos metales rebotarán y no
cruzarán el tejido. Aquellos que consigan atravesar el tejido chocarán contra una pantalla fluorescente que
emitirá un destello luminoso tras cada choque. Esa imagen emitida por la pantalla fluorescente es la que
podemos observar nosotros. Por ello las imágenes observadas con el microscopio electrónico son siempre
en blanco y negro.
Este enlace es de un video en el que describe todo el proceso para preparar muestras para visualizar a
microscopía electrónica de transmisión.
También podéis ver distintas estructuras celulares en un microscopio electrónico de transmisión en este
enlace.
ACTIVIDADES A REALIZAR
1.‐ Los alumnos realizarán dos tinciones histológicas con preparaciones que se darán previamente
desparafinadas e hidratadas.
TINCIÓN 1. HEMATOXILINA‐EOSINA
1. Una vez hidratados los cortes se tiñen con hematoxilina durante 10 minutos.
2. Lavar con agua.
3. Azulear los núcleos (unos 2 minutos) en agua amoniacal (amoníaco al 2%).
4. Lavar con agua.
5. Teñir con eosina durante 30 segundos.
6. Enjuagado rápido en agua.
7. Deshidratar con etanol de 96º y luego, etanol de 100º (dos cambios de 2 minutos).
8. Aclarar en xileno (dos cambios de 2 minutos cada uno). Montar los cortes con DPX,
procurando que no se sequen y evitando la formación de burbujas.
TINCIÓN 2. AZUL ALCIÁN‐HEMALUMBRE‐PICROCARMIN DE ÍNDIGO
1. Una vez hidratados los cortes se tiñen con azul alcián durante15 minutos.
2. Lavar con agua.
3. Teñir con hemalumbre durante 10 minutos.
4. Lavar con agua.
5. Teñir con picrocarmín de índigo, de 30 segundos a 1 minuto.
6. Lavar con agua.
7. Deshidratar los cortes pasándolos directamente por alcohol de 100º (dos cambios
de 2 minutos cada uno).
8. Aclarar en xileno (dos cambios de 2 minutos cada uno). Montar los cortes,
procurando que no se sequen y evitando la formación de burbujas.
2.‐ Utilización del microscopio óptico manejando correctamente todos sus elementos: iluminación,
enfoque, aumentos, etc.
3.‐ Distinguir las células y sus elementos con distintos métodos de tinción. Apreciar las formas de las
células, su tamaño, la morfología de los núcleos, las relaciones entre las células, las fibras, etc.
REFERENCIAS
Las diferentes figuras y videos incluidos en el guion proceden del Departamento de Biología Funcional y
Ciencias de la Salud. Facultad de Biología. Universidad de Vigo (https://mmegias.webs.uvigo.es/)