El ion calcio

El ion calcio: su regulación y función en la célula ß pancreática
Dr. Oscar Díaz Horta 1
Resumen
En el presente trabajo se realiza una revisión del conocimiento actual sobre la
regulación de las concentraciones intracelulares del ion calcio, los principales
mecanismos de entrada y salida de este a través de la membrana plasmática, con
especial atención en el intercambiador Na+/Ca2+, y la función de este importante
segundo mensajero en la secreción de insulina, así como la muerte celular
programada de las células ß pancreáticas.
Palabras clave: Calcio, intercambio Na+/Ca2+, apoptosis, insulina.
El ion calcio es utilizado por las células para regular múltiples actividades. Al inicio
de la vida, un incremento rápido de Ca+2 intracelular durante la fertilización
desencadena el desarrollo de un nuevo organismo.1
Una vez diferenciadas las células, el Ca2+ es utilizado como una señal intracelular
para el control de diferentes procesos, entre los cuales se encuentran la contracción
muscular, la secreción, el metabolismo, la excitabilidad y la proliferación celular. El
Ca2+ no puede ser degradado como ocurre con otras moléculas que actúan como
segundos mensajeros, por lo tanto, las células regulan estrictamente las
concentraciones intracelulares de este ion. En el agua de mar, donde se originó la
vida, la concentración del otro catión divalente más común, el Mg2+, es mayor que
la del Ca2+, sin embargo, este no es excluido del citoplasma en la magnitud que
ocurre con el Ca2+. Una explicación para esta singularidad es la capacidad que
posee el Ca2+, en mayor grado que el Mg2+, de precipitar al fosfato, el cual es
empleado por las células para almacenar y utilizar la energía. Las principales fuentes
de Ca2+ son el medio extracelular y algunos organelos intracelulares: el retículo
endoplasmático (RE) o el retículo sarcoplasmático (RS) en las células musculares.1
Se plantea que el mecanismo general de acción del Ca2+ es el siguiente: cuando
las concentraciones del Ca2+ citoplasmático se mantienen en niveles bajos (10-00
nmol/L), las células permanecen quiescentes; sin embargo, cuando esas
concentraciones se elevan (500-1 000 nmol/L) dichas células se activan para
realizar sus funciones específicas. Existen sensores intracelulares responsables de
la detección de los aumentos de Ca2+, como son la calmodulina (CAM) y la
troponina C (TnC). Esta señal es traducida en respuestas específicas de las
células.1
La activación de las células está determinada por un balance entre mecanismos
Ca2+-ON y Ca2+-OFF (figura 1). Como se detalla a continuación, todos los
elementos que promueven la entrada de Ca2+ hacia el citosol forman parte de los
mecanismos ON, y los que realizan la función contraria se incluyen en los
mecanismos OFF.
FIG. 1. Resumen de los principales mecanismos ON y OFF que regulan la
concentración intracelular de Ca2+. Los estímulos elevan su concentración
mediante la activación de los mecanismos ON, los cuales promueven la entrada de
Ca2+ externo y/o la liberación de Ca2+ de los reservorios intracelulares (RE/RS).
Los cambios en Ca2+ son atenuados por tampones situados ya sea en el retículo
endoplasmático, como en el citoplasma. Los mecanismos OFF devuelven los bajos
niveles o de "reposo" de Ca2+ mediante su extracción hacia el medio extracelular o
hacia los reservorios intracelulares. Los efectos de una concentración elevada de
Ca2+ están mediados por sensores como la calmodulina (CAM) o la troponina C
(TnC) para la regulación de una gran variedad de actividades celulares.
Mecanismos de entrada del Ca2+ hacia el citoplasma (ON)
Las células presentan dos fuentes principales de Ca2+: la extracelular y la existente
en organelos intracelulares. El reservorio más importante de Ca2+ intracelular es el
retículo endoplasmático, el cual es denominado retículo sarcoplasmático en las
células musculares. Por ser la concentración de Ca2+ en el exterior de la célula
~20,000 veces mayor que en el citoplasma y que el interior de la célula, y está
cargado negativamente con respecto al exterior, existe un gradiente electroquímico
que favorece la entrada de Ca2+. Los 2 grupos de canales encargados de la
liberación de Ca2+ hacia el citosol son: los canales de Ca2+ de la membrana
plasmática1 y los canales de Ca2+ intracelulares.1,2 El primer grupo se compone
de los canales sensibles a voltaje (VOCs), los canales regulados por ligando (ROCs)
y los canales activados por liberación de Ca2+ (CRAC). En el segundo grupo se
incluyen los canales intracelulares: los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato2 y los
receptores de rianodina (RyRs).2 Además, el Ca2+ puede salir del retículo
endoplasmático a través de un mecanismo denominado "fuga de Ca2+".3
En las células no excitables, como son las sanguíneas, los hepatocitos y las
endoteliales, el incremento de las concentraciones de Ca2+ se realiza
predominantemente a través de la vía del inositol 3-fosfato (InsP3). Existen dos
clases de receptores que conducen a la liberación de InsP3 por diferentes vías: los
receptores que se acoplan a la proteína G (GCR) y los receptores con función de
tirosino-quinasas (RTK). Los receptores GCR activan a la fosfolipasa Cß mientras
que los RTK realizan la misma función sobre la fosfolipasa Cg. Ambas fosfolipasas
catalizan la conversión del fosfatidilinositol (4,5) difosfato en InsP3 y diacilglicerol.4
El InsP3 actúa como un segundo mensajero mediante su unión al receptor
tetramérico del InsP3 (~ 310 kD a cada subunidad) situado en la membrana del
retículo endoplasmático y este produce la liberación de Ca2+ almacenado en este
organelo.1 La liberación de Ca2+ por esta vía puede incrementar la concentración
de Ca2+ citosólico desde ~0,1 hasta ~1 µmol/L. El receptor de InsP3 se encuentra
expresado, en mayor o en menor medida, en todos los tipos celulares. La unión del
InsP3 a cada subunidad del receptor ocurre en la región N-terminal cargada
positivamente porque esta es rica en arginina y lisina. Esta unión puede ser
bloqueada por la heparina y no se conoce otro antagonista efectivo hasta el
momento. El receptor de InsP3 posee una homología parcial con el receptor de
rianodina, mientras que esta semejanza no es significativa en relación con los
canales de Ca2+ sensibles a voltaje. La región N-terminal de este receptor contiene
dos sitios de unión a ATP y un sitio de unión al Ca2+ 5. La regulación de la actividad
del receptor de InsP3 es compleja, pues este se desensibiliza por el propio InsP3,
es sensible a las concentraciones de Ca2+ citoplasmático y puede ser fosforilado
por la protein-quinasa A.6 La sensibilidad de este receptor es mayor a
concentraciones de InsP3 entre 0,5 y 1 µmol/L; además, no es sensible al InsP3 a
muy altas o muy bajas concentraciones de Ca2+ citoplasmático.6,7
Las células excitables, como son las nerviosas y musculares, además de poseer el
sistema descrito anteriormente para las no-excitables, poseen canales de Ca2+
sensibles a voltaje. Estos canales de Ca2+ producen incrementos superiores de la
concentración citosólica de Ca2+ en comparación con los receptores del retículo
endoplasmático. Esto permite que las proteínas cercanas a la superficie interna de
la membrana plasmática, las cuales constituyen sensores de las variaciones de la
concentración de Ca2+, inicien funciones especializadas como son la exocitosis de
neurotransmisores en las neuronas y la contracción en el músculo. La
despolarización a partir del potencial basal de membrana (entre -90 y -70 mV,
generalmente) inicia cambios conformacionales en los canales de Ca2+
dependientes de voltaje, específicamente en regiones especiales sensibles a voltaje
denominadas S4.1 Estos cambios conformacionales permiten el flujo de Ca2+ a
través de la membrana plasmática. Para el Ca2+, el balance entre las fuerzas
químicas y eléctricas es equivalente a la fuerza eléctrica resultante de un voltaje
aproximado de +150 mV, por lo tanto, existe un gradiente favorable para la entrada
de este ion en todos los potenciales de membrana fisiológicos (desde -90 hasta +60
mV). La actividad de los canales de Ca2+ sensibles a voltaje está autolimitada, ya
que estas proteínas se inactivan rápidamente después de la despolarización. Por
otra parte, una despolarización de mayor magnitud sólo provocaría la disminución
de la fuerza electroquímica que permite la entrada de Ca2+ al citoplasma. En las
células excitables, la entrada de Ca2+ a través de los canales de Ca2+ sensibles a
voltaje produce directamente la activación de los receptores de rianodina, los cuales
provocan la liberación del Ca2+ acumulado en el retículo endoplasmático.1 El
receptor de rianodina es tetramérico y está formado por subunidades de ~560 kDa
de peso molecular relativo. Su función es modulada por Ca2+, Mg2+ y ATP; sin
embargo, la inhibición ejercida por los primeros iones ocurre en el rango de los
mmol/L de concentración. Relativamente, el receptor de rianodina no es selectivo
para los cationes aunque sí excluye a todos los aniones.1
A principio de la década del 90, fue descrito que el vaciamiento de los reservorios
intracelulares de Ca2+ inducía la entrada de este ion a través de la membrana
plasmática por un mecanismo desconocido hasta ese momento.8 Este fenómeno se
denominó entrada capacitiva de Ca2+. Por ejemplo, la estimulación de los
receptores muscarínicos tipo 3, los cuales incrementan las concentraciones de
InsP3 a través de la activación de la fosfolipasa Cß, producen una elevación rápida
y durante un período corto de las concentraciones de Ca2+ en el citosol como
consecuencia de la salida de Ca2+ del retículo endoplasmático.9 Sin embargo, las
altas concentraciones de Ca2+ citosólico se mantienen por un tiempo prolongado
mediante mecanismos de entrada capacitiva de Ca2+. El potencial de membrana
puede influir en este proceso, pues la hiperpolarización puede incrementar la
concentración de Ca2+ en el citoplasma. Se ha propuesto que el papel fisiológico
de la entrada capacitiva de Ca2+ es permitir el retorno del Ca2+ a los reservorios
intracelulares de una forma más rápida. La entrada de Ca2+ a través de la
membrana plasmática en ausencia de despolarización ha sido descrita por varios
autores10-12 y esta pudiera ocurrir a través de los denominados canales activados
por liberación de Ca2+ (CRAC); sin embargo, ninguno de estos supuestos canales
iónicos ha sido purificado o clonado. Por otra parte, la corriente neta de Ca2+
relacionada con el mecanismo de entrada capacitiva es ~ 5 pA en una célula entera,
a diferencia de los cientos de pA de corriente neta que atraviesan la membrana
plasmática a través de los canales de Ca2+ sensibles a voltaje. La entrada
capacitiva de Ca2+ es, además, inactivada por altas concentraciones de Ca2+ en el
citoplasma.
Aunque el incremento de Ca2+ citosólico producido por la salida de Ca2+ del retículo
endoplasmático ocurre fundamentalmente a través de los receptores de InsP3 y
rianodina, se ha descrito la existencia de un fuga basal de Ca2+ el cual es
independiente de estos mecanismos.3 Por ejemplo, la inhibición de la Ca2+-ATPasa
del retículo endoplasmático como consecuencia de la exposición a la tapsigargina o
la eliminación de ATP, da lugar a la liberación relativamente rápida del 92 % del
Ca2+ secuestrado en este organelo en células ß de ratón.13
Aunque la principal función del intercambiador Na+/Ca2+ es el transporte de Ca2+
desde el citoplasma hacia el medio extracelular, esta proteína también contribuye a
la entrada de Ca2+ mediante un fenómeno denominado intercambio Na+/Ca2+ en
modo reverso. Como se describe posteriormente, el intercambio Na+/Ca2+ en el
modo reverso puede ocurrir en determinadas condiciones fisiológicas, por ejemplo,
durante la despolarización de la membrana o el incremento de la concentración
intracelular del ion sodio.
En la célula ß pancreática, los mecanismos de entrada de Ca2+ hacia el citoplasma
son similares a los presentes en las células excitables, aunque los primeros
muestran algunas particularidades importantes. Por ejemplo, la exposición a la
cafeína (10 mmol/L) o a la rianodina (1 µmol/L) no produce la liberación del Ca2+
almacenado en el retículo endoplasmático de las células ß, y esto ocurre por la
ausencia de receptores de rianodina;13 sin embargo, estas células sí poseen
canales de Ca2+ sensibles a voltaje en la membrana plasmática, característica típica
de las células excitables. Por consiguiente, la entrada de Ca2+ a través de estos
canales, inducida indirectamente por las altas concentraciones de glucosa
extracelular y el incremento del contenido de ATP intracelular, lejos de provocar un
aumento adicional de la concentración de Ca2+ citosólico por el vaciamiento del
retículo endoplasmático, facilita la entrada de Ca2+ a este organelo a través de la
Ca2+-ATPasa localizada en su membrana. Por otra parte, y a diferencia de las
células musculares, la membrana del retículo endoplasmático de las células ß
exhibe altos niveles de fuga pasiva de Ca2+, y este fenómeno puede ser observado
cuando las células se exponen a inhibidores de la Ca2+-ATPasa del retículo
endoplasmático o se les limita la disponibilidad de ATP.13 Estas peculiaridades de
la célula ß en cuanto al manejo del Ca2+ se ajustan estrechamente a su función
principal, la producción y secreción de insulina. En este sentido, un grupo de
investigadores reveló la importancia de la presencia de un alto contenido de Ca2+
en el retículo endoplasmático para el correcto procesamiento de la proinsulina y la
transferencia de este precursor a los gránulos secretores.13
Tampones y sensores de Ca2+ intracelular
Las células poseen una gran variedad de proteínas que unen Ca2+, y estas
contribuyen a las señales mediadas por Ca2+, ya sea cuando actúan como
tampones del Ca2+ libre, que modulan la respuesta celular, o cuando lo hacen como
sensores que median el papel del Ca2+ como mensajero intracelular (figura 1).14
Las proteínas capaces de funcionar como tampones de Ca2+ se encuentran tanto
en el citoplasma como en el interior del RE. Sólo una pequeña proporción de
moléculas citoplasmáticas capaces de unir Ca2+ actúan como sensores, el resto
parece funcionar exclusivamente como tampones. El Ca2+ unido a estos tampones
se encuentra en equilibrio con el Ca2+ citoplasmático libre y como los mecanismos
de extrusión disminuyen la concentración del Ca2+ citoplasmático, la cantidad de
Ca2+ unido a estos tampones también disminuye.5
La calmodulina es el principal sensor de Ca2+ en las células ß.16 Esta proteína de
17 kDa de peso molecular relativo es un receptor intracelular ubicuo de Ca2+ el cual
contiene, como el elemento estructural que une Ca2+ de manera específica, a la
denominada mano-EF.17 El término mano-EF describe a dos secuencias de
estructura helicoidal las cuales se orientan perpendicularmente entre ellas y están
conectadas por un lazo que contiene residuos aminoacídicos con alta afinidad por
el Ca2+.
Las proteínas que contienen este elemento estructural son denominadas proteínas
de mano-EF.18 La calmodulina contiene 4 elementos del tipo mano-EF y todos
pueden unir Ca2+ con una afinidad entre 10-5 y 10-6 mol/L con alguna
cooperatividad y una leve dependencia de las concentraciones de Mg2+. Después
de la unión del Ca2+, la calmodulina es capaz de interactuar con algunas proteínas
dentro de las que se destacan las protein-quinasas dependientes de
calmodulina/Ca2+. Las regiones de interacción con la calmodulina/Ca2+ de estas
proteínas no constituyen secuencias conservadas, aunque generalmente son
estructuras helicoidales a con un alto contenido de aminoácidos básicos.
La calbindina-D28 es otra proteína de la superfamilia de proteínas de mano-EF. Esta
posee 6 elementos estructurales del tipo mano-EF pero el sexto elemento es
aberrante y no une Ca2+. Se sugiere que la calbindina-D28 cumpla la función de
tampón de Ca2+ citoplasmático en la célula ß, pues no se han encontrado enzimas
que interactúen con ella.19
Desde el descubrimiento de la calmodulina como la principal proteína que une Ca2+
en las células ß pancreáticas16 se sugirió que las protein-quinasas dependientes de
Ca2+/calmodulina (quinasas CaM) eran las principales mediadoras de la acción del
Ca2+ como segundo mensajero. Seguidamente, se observó actividad de la quinasa
de la cadena ligera de la miosina (MLCK) en preparaciones de células de islotes
pancreáticos,20 lo cual indicaba que la fosforilación de la miosina ejercía una
influencia en la secreción de insulina a través de la modulación de la interacción
actina-miosina;20,21 sin embargo, recientemente se describió que la acción de la
MLCK se limita a promover la movilidad de los gránulos secretores proximales.22
Contemporáneamente, se encontró que las células ß poseían otra enzima con
actividad de quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina, la cual fosforilaba proteínas
diversas.23,24 Se determinó que esta proteína era la denominada quinasa CaM II y
su activación provocada por secretagogos de insulina se correlacionaba con la
secreción de esta hormona.25 A pesar de que la quinasa CaM II es una enzima que
puede fosforilar varias proteínas, su función puede ser limitada por su localización
intracelular. En la célula ß, la quinasa CaM II se localiza en los gránulos
secretores,26 lo cual indica la participación específica de esta enzima en el proceso
de secreción de insulina. Para conocer la relevancia de la activación de la quinasa
CaM II en la secreción de insulina, se identificaron las proteínas que son fosforiladas
por esta enzima, además de los efectos que las modificaciones de estas pudieran
tener en su función. La sinapsina I y la MAP-2 son los únicos substratos de la
quinasa CaM II validados hasta la actualidad en la célula ß27,28 y estas realizan
funciones similares en la secreción neuronal.29,30 La última etapa de la exocitosis
de la insulina comienza con la interacción de proteínas que se encuentran en las
vesículas secretoras (v-SNARE) y la membrana plasmática (t-SNARE).31 Este
complejo de anclaje, en realidad, es un receptor que reconoce a la NSF (proteína
de fusión sensible a la N-etil-maleimida) y a la SNAP (proteína de adherencia a la
NSF soluble). La NSF posee la capacidad de hidrolizar ATP y suministra la energía
requerida en la formación de vesículas competentes (denominadas vesículas
"iniciadas") para la fusión con la membrana plasmática.32 La fusión de los gránulos
secretores a la membrana plasmática es independiente de protein-quinasas y se
piensa que este proceso ocurra por la acción directa del Ca2+ a través de proteínas
que unen complejos Ca2+/fosfolípidos, como son la sinaptotagmina 33 y la
sincollina.34 Para la fusión de los gránulos secretores a la membrana plasmática,
las concentraciones de Ca2+ deben estar en el orden de los µmol/L y es muy
probable que estas se alcancen en esta zona, pues los canales de Ca2+ tipo-L se
concentran en las regiones de la membrana plasmática donde la exocitosis es más
activa.35 Sólo una mínima fracción (~1 %) de los gránulos secretores se encuentran
en el estado de vesículas "iniciadas"36,37, o sea, listos para fusionarse con la
membrana plasmática; sin embargo, esta pequeña proporción de vesículas
competentes puede contener la insulina suficiente para suplir la denominada primera
fase de liberación de insulina.36 Por su parte, la secreción prolongada de la hormona
depende del reclutamiento de gránulos de los reservorios adicionales o de reserva
donde la quinasa CaM II desempeña un papel importante.
La fosforilación de la sinapsina I por la quinasa CaM II ha sido propuesta como el
mecanismo clave en el reclutamiento de vesículas sinápticas, en células neuronales,
para la liberación de su contenido hacia el medio extracelular. En la célula ß
pancreática, la sinapsina I es fosforilada por la quinasa CaM II cuando las
concentraciones de Ca2+ citoplasmático se elevan a niveles que se correlacionan
con la secreción de insulina.28,38
El proceso de ensamblaje y el desensamblaje de los microtúbulos es un factor
importante en la secreción celular. La estabilidad de estas estructuras es controlada
por el estado de fosforilación de proteínas asociadas a los microtúbulos.39 La
fosforilación de la proteína MAP-2 por la quinasa CaM II reduce su afinidad por la
tubulina y favorece la ruptura del microtúbulo.30 La MAP-2 aparentemente
desempeña un papel importante en la secreción de insulina, pues se determinó que
los gránulos secretores purificados sólo interactúan con los microtúbulos en
presencia de MAP-2 exógena.40 Además, la utilización del agente fosfato de
estramustina, el cual interactúa selectivamente con el dominio de unión de la MAP2 con los microtúbulos, es capaz de inhibir la secreción de insulina.41 La
fosforilación de la MAP-2 también puede regular la secreción de insulina por su
influencia sobre la interacción de los microtúbulos con los microfilamentos de
actina.42,43 En la célula ß, los microfilamentos forman una red que actúa como una
barrera que impide la migración de los gránulos secretores hacia la membrana
plasmática, aunque también puede proveer la fuerza motriz de dicha migración a
través de su contracción cuando la célula es estimulada.44 El reordenamiento de la
red de actina cortical es dependiente de Ca2+ en células neuroendocrinas.45
La quinasa CaM II posee la capacidad de autofosforilarse. Esta característica
permite que la enzima pueda fosforilar substratos durante un cierto tiempo posterior
al cese del estímulo, lo cual es importante e incluso crítico para la función de la célula
ß.41 Por ejemplo, la célula ß para responder apropiadamente a estímulos repetidos
requiere de adecuadas reservas de gránulos secretores. Por lo tanto, la activación
de la quinasa CaM II es importante no sólo para el sustento de la denominada
segunda fase de liberación de insulina, sino también para el reaprovisionamiento de
las reservas de gránulos después que la estimulación cesa. La quinasa CaM II es
desfosforilada por la proteína-fosfatasa I, pero la inactivación total de esta ocurre
alrededor de 5 minutos después que el estímulo finaliza.46
La calsecuestrina es el principal tampón de Ca2+ en el retículo sarcoplasmático de
los músculos estriados, y su función principal es el almacenamiento de Ca2+ en este
organelo.47 Esta proteína de 45 kDa de peso molecular relativo facilita el transporte
de Ca2+ desde los sitios de entrada a través de la Ca2+ ATPasa del retículo
sarcoplasmático hasta los sitios de liberación a través de los receptores de
rianodina. La calsecuestrina, además de unir Ca2+ con una baja constante de
disociación (400-600 µmol/L en presencia de KCl 150 mmol/L y 100 µmol/L en
presencia de KCl 20 mmol/L) y una alta capacidad (40-50 mol/mol), posiblemente
neutraliza los efectos potencialmente negativos de las altas concentraciones de
Ca2+ sobre la función del retículo sarcoplasmático (ej. la inhibición de la Ca2+
ATPasa).48 El punto isoeléctrico de este tampón es pH 3,75 y posee más de un 30
% de residuos ácidos. La calsecuestrina se expresa también en el músculo liso y en
otros tipos celulares como las neuronas e incluso en células de plantas.15
La calreticulina, cuyo peso molecular relativo es de 60 kDa, se considera la proteína
homóloga de la calsecuestrina en células no musculares, y aunque está presente
en el retículo endoplasmático a altas concentraciones, también se expresa en el
núcleo celular. La calreticulina contiene 37 residuos ácidos en el dominio cercano al
extremo carboxilo-terminal y une Ca2+ de dos modos: con alta capacidad (25
mol/mol) y baja afinidad (Kd ~ 250 µmol/L) y con baja capacidad (1 mol/mol) y alta
afinidad (Kd ~ 1 µmol/L). El extremo carboxilo terminal culmina con la secuencia
señal KDEL (lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina). Esta secuencia
interactúa con el receptor KDEL, y por lo tanto, la calreticulina es retenida
mayoritariamente en el retículo endoplasmático. Además de su función como
tampón de Ca2+, la calreticulina realiza otras funciones, dentro de las cuales se
destacan la regulación de la proliferación celular y la transcripción génica.49
Mecanismos de extrusión del Ca2+ citoplasmático (OFF)
Una vez que el Ca2+ citoplasmático alcanza el nivel umbral para generar señales
de activación de la célula, se desencadenan los procesos que promueven el retorno
al estado basal de la concentración de Ca2+. Estos procesos son muy activos, pues
deben extrudir no sólo el Ca2+ libre sino también el Ca2+ unido a tampones y
sensores cuando el catión se disocia de estos. La eliminación del Ca2+
citoplasmático es realizado por bombas e intercambiadores.
Las Ca2+-ATPasas
Las células disponen de 2 familias de Ca2+-ATPasas: la Ca2+-ATPasa de la
membrana plasmática (PMCAs)50 y la Ca2+-ATPasa del retículo
sarco/endoplasmático (SERCAs),15 cuyas funciones son transportar el Ca2+
introducido en el citoplasma hacia el medio extracelular o hacia el retículo
endoplasmático, respectivamente. Ambas Ca2+-ATPasas utilizan el ATP como
fuente de energía para transportar Ca2+ contra el gradiente electroquímico existente
a través de las membranas donde estas se localizan.50 Ellas son miembros de las
ATPasas tipo P, pues forman un intermediario covalentemente fosforilado durante
el ciclo de reacción.15,50
La PMCA es una proteína de ~135 kDa de la cual se han descrito hasta la actualidad
4 isoformas. Cada isoforma de la PMCA puede mostrar variabilidad estructural, la
cual es generada por splicings alternativos de los transcriptos primarios.51 Esta
proteína parece estar expresada en todas las células eucarióticas y se considera
que constituye el principal transportador de Ca2+ de alta afinidad localizado en la
membrana plasmática.52 La PMCA posee 10 segmentos que atraviesan la
membrana plasmática, mientras que los extremos carboxilo y amino se localizan en
la parte citoplasmática de esta. La mayor parte de la PMCA se encuentra localizada
hacia el citosol y consiste en 3 grandes fragmentos: un lazo intracelular limitado por
los segmentos transmembrana 2 y 3, otro entre los segmentos 4 y 5 y finalmente
una larga "cola" a continuación del último segmento transmembrana. El segundo
lazo (constituido por ~400 residuos) contiene el dominio catalítico el cual incluye el
sitio de unión del ATP y el residuo de aspartato que forma el intermediario acil fosfato
durante la hidrólisis del ATP. La extensa "cola" carboxiterminal constituye el principal
dominio regulatorio de la PMCA.53 El complejo Ca2+-calmodulina se une a una
secuencia situada a una distancia de ~40 aminoácidos posterior al último segmento
transmembrana. En ausencia de Ca2+-calmodulina esta secuencia actúa como un
dominio autoinhibitorio, pues interactúa con dos sitios situados en el primer y
segundo lazos citosólicos, mientras mantienen a la proteína en un estado inactivo.
Cuando se incrementa la concentración de Ca2+ en el citosol, aumenta también la
concentración del complejo Ca2+-calmodulina, el cual se une con alta afinidad al
sitio autoinhibitorio. Consecuentemente, la PMCA se libera de la autoinhibición y su
actividad se recupera. La Km para el Ca2+ de la PMCA es 0,4-0,7 µmol/L en
presencia de Ca2+-calmodulina.54
La estructura de la SERCA se asemeja considerablemente a la estructura de la
PMCA. La diferencia estructural principal entre ambas bombas está confinada a la
"cola" carboxi-terminal. Este segmento es mucho más pequeño en la SERCA (~20-
50 residuos) que en la PMCA (~70-200 residuos). El peso molecular relativo de la
SERCA es de ~110 kDa y transporta 2 iones Ca por cada ATP hidrolizado, a
diferencia de la PMCA, la cual transporta solo 155. Mediante estudios de
mutagénesis se han identificado 2 sitios (I y II) de alta afinidad por el Ca2+ en la
SERCA, formados en su mayor parte por residuos ácidos conservados en todas las
bombas tipo P. Estos sitios se encuentran localizados dentro de los segmentos
transmembrana 4, 5 y 6.56 La PMCA, sin embargo, conserva sólo el sitio II. La
SERCA, además, contiene secuencias que interactúan con la tapsigargina, su
inhibidor específico, el cual fue aislado originalmente de la planta Thapsia
garganica.57
El intercambiador Na+/Ca2+
El intercambiador Na+/Ca2+ (NCX) se encuentra en la membrana plasmática y
utiliza la energía almacenada en el gradiente electroquímico de Na+ para extrudir
Ca2+ de la célula.58 Este mecanismo de extrusión está más desarrollado en células
excitables como son las neuronas, el músculo cardíaco y liso, y en células
neuroendocrinas, como las ß pancreáticas. El intercambiador Na+/Ca2+ puede, en
ocasiones, operar en el modo reverso y causar influjo de Ca2+, como ocurre en el
potencial de acción cardíaco, donde un incremento temporal de la concentración de
Na+ en el citoplasma revierte la dirección de operación del intercambiador, que
resulta en un rápido influjo de Ca2+. Una vez que la concentración de Na+ disminuye
en el interior de la célula, el intercambiador revierte su acción a la extrusión de Ca2+
59.
El intercambiador Na+/Ca2+ de la membrana plasmática
En la década de los años 60, se obtuvieron las primeras evidencias acerca de la
existencia del intercambiador Na+/Ca2+ en el músculo cardíaco60,61 y desde
entonces esta proteína ha sido detectada virtualmente en todos los tejidos62 y en
especies, como el hombre,63 el perro,64 el calamar65 y la mosca de la fruta.66 La
función principal del intercambiador Na+/Ca2+ es la de extrudir Ca2+ desde el
citosol, intercambiándolo por Na+, sin consumo directo de ATP, pues utiliza el
gradiente electroquímico favorable del último ion. Este intercambiador puede actuar
en el modo reverso bajo algunas condiciones, permitiendo la entrada de Ca2+ al
citosol. Además, el intercambiador Na+/Ca2+ puede realizar intercambios
Ca2+/Ca2+ y Na+/Na+.67 Todas las formas del movimiento de iones del
intercambiador se resumen en la figura 2.
FIG. 2. Diferentes modos de transporte de iones vía el intercambiador Na+/Ca2+.
El intercambio Na+/Ca2+ es electrogénico, pues su estequiometría es 3Na+:1Ca2+.
68,69 Por lo tanto, se crea una corriente eléctrica hacia el citoplasma por el
movimiento de una carga positiva neta. Además, el intercambiador Na+/Ca2+ es
sensible a cambios en el potencial de membrana y al gradiente de Na+.
Recientemente, determinaciones realizadas del potencial reverso de la corriente del
intercambio Na+/Ca2+, han sugerido que la estequiometría de la proteína
intercambiadora pudiera ser de 4Na+:1Ca2+ y que esta varía en dependencia de
las concentraciones iónicas de Na+ y Ca2+ en el lado citoplasmático.70
El intercambio Na+/Ca2+ es una reacción que incluye 2 sustratos y su mecanismo
puede ser clasificado como secuencial o consecutivo (ping-pong). En el mecanismo
consecutivo, el primer sustrato es unido por la proteína y el primer producto es
liberado antes de la unión del segundo sustrato, mientras que en el secuencial,
ambos sustratos se unen a la proteína antes de la liberación de los productos.
Mediante la determinación de las velocidades iniciales de incorporación de 45Ca2+
dependiente de Na+ a proteoliposomas reconstituidos con el intercambiador
Na+/Ca2+, donde se incorporó el agente quelante EDTA y el estudio de los
parámetros cinéticos, se propuso que el intercambio Na+/Ca2+ se realiza a través
de un mecanismo consecutivo.71
De igual forma, la utilización de técnicas electrofisiológicas de alta resolución ha
permitido resolver ciclos de reacciones parciales en el intercambio Na+/Ca2+ 72.
Aparentemente, el paso electrogénico de este mecanismo de transporte iónico
incluye la translocación del ion sodio, mientras que el movimiento del Ca2+ es
electroneutral. Esto último implica que 2 cargas negativas pertenecientes a la
proteína del intercambiador Na+/Ca2+ atraviesan el campo eléctrico creado a través
de la membrana plasmática mediante cambios conformacionales que acompañan el
transporte iónico.69,73,74 El ciclo de reacción hipotético para el intercambio
Na+/Ca2+ se muestra en la figura 3.75,76
FIG. 3. Mecanismo de intercambio Na+/Ca2+ en el modo directo (extrusión de
Ca2+). El intercambiador expone su sitio de unión a iones hacia el lado
citoplasmático (conformación E2), une un Ca2+ y provoca así un cambio de
conformación hacia E1. Posteriormente el Ca2+ es liberado en el lado extracelular,
se unen 3Na+ y ocurre un cambio de conformación de regreso hacia E2. El sitio que
une Na+ se expone hacia la cara citoplasmática, se liberan los iones de Na+, y el
intercambiador vuelve a unir Ca2+ para completar el ciclo.
Características moleculares del intercambiador Na+/Ca2+
Clonaje del intercambiador Na+/Ca2+. Hasta el momento, 3 isoformas del
intercambiador han sido clonadas en mamíferos: la NCX1,64 la NCX277 y la
NCX3.78 La NCX1 se encuentra ampliamente distribuida en el corazón63 y en
muchos otros tejidos y tipos celulares.62 En cambio, la expresión de la NCX2 y la
NCX3 se limita al cerebro y al músculo esquelético.77,78 Otras isoformas del gen
que codifica para el intercambiador Na+/Ca2+ se han clonado en la Drosophila
melanogaster (Dmel/Ncx),66 el nemátodo Caenorhabditis elegans79 y el calamar
(NCX-SQ1).65 La isoforma NCX1 posee sitios de splicing alternativos en 6 exones:
A, B, C, D, E y F.80 Sin embargo, todas las variantes incluyen a los exones A o B,
que se excluyen mutuamente. Las isoformas con combinaciones de exones
diferentes presentan variabilidades especie-específicas y expresiones tejidoespecíficas (tabla 1).80-82 Los tejidos excitables poseen usualmente
intercambiadores que contienen el exón A, mientras que en otros tejidos predomina
el exón B. Por ejemplo: en el corazón se encuentra una isoforma única (NCX1.1,
combinación de exones ACDEF) del intercambiador, mientras otros órganos como
el riñón, el cerebro, los ojos, etc, presentan 2 o más isoformas.81,83 Hasta el
momento, no se conoce el significado fisiológico y funcional de la existencia de
diferentes variantes de splicing descritas.
Tabla 1. Expresión tejido-específica de las diferentes isoformas del intercambiador
Na+/Ca2+ en ratas
Isoformas NCX1
1 12 5 4 2 9 7 3 10 11
Exones
ACDF
ADEF
ADFADBCD
BDEBDF
BD BDEF
BCDEF
Corazón
Ö
Músculo esquelético
Ö
Ö Ö Ö
Cerebro
Ö Ö Ö
Ö Ö
Ojos
Ö Ö
Ö
Aorta
Ö Ö
Ö
Riñon
Ö Ö
Intestino
Ö Ö
Timo
Ö Ö
Bazo
Ö Ö
Células endoteliales
Ö Ö
Células b
Ö Ö
La isoforma NCX1 fue inicialmente clonada en el corazón del perro, constituida por
2 910 pares de bases que codificaban para una proteína de 970 aminoácidos, cuyo
peso molecular teórico correspondía a 110 kDa.64
Estructura y topología en la membrana del intercambiador Na+/Ca2+. Los modelos
iniciales basados en análisis hidropáticos de la isoforma NCX1 del intercambiador
Na+/Ca2+ sugerían que esta proteína poseía 12 segmentos transmembrana.
Posteriormente, se encontró que el segmento hidrofóbico inicial de 32 aminoácidos
es un péptido señal, el cual se separa de la proteína durante su procesamiento inicial
en el retículo endoplasmático.84,85 En la actualidad, se plantea que el
intercambiador posee solamente 9 segmentos transmembrana.86 La región Nterminal de esta proteína está glicosilada en la posición 9, y por lo tanto, es
extracelular. Se ha descrito que la glicosilación85 y la hidrólisis del péptido señal no
influyen significativamente en la función de este transportador.87,88
El intercambiador Na+/Ca2+ posee dos dominios hidrofóbicos que contienen los
fragmentos transmembrana. Estos dominios están separados por un lazo
intracelular largo constituido por 550 aminoácidos (figura 4). El dominio hidrofóbico
N-terminal posee 5 segmentos transmembrana y el C-terminal está formado por 4
segmentos de este tipo. Mediante la eliminación del lazo intracelular, se demostró
que esta región no es esencial para el transporte iónico y que los segmentos
transmembranas son los responsables de la función de la proteína. Sin embargo, el
lazo intracelular contiene secuencias relacionadas con funciones reguladoras, tales
como una zona de splicing alternativo y un dominio de unión a Ca2+.
FIG. 4. Modelo actual de la topología del intercambiador Na+/Ca2+. La proteína
posee 9 segmentos, los cuales atraviesan la membrana plasmática. El extremo
amino-terminal se glicosila y es extracelular. Entre los segmentos 7 y 8 hay un
fragmento hidrofóbico con estructura similar al lazo P presente en los canales de K+
(área sombreada con gris claro, GIG: Gli-Ile-Gli). Las regiones homólogas a, las
cuales intervienen directamente en el transporte iónico y se sitúan en los segmentos
transmembrana 2,3 y 7, se indican con sombreado gris oscuro. Se muestran además
en el lazo intracelular la región reconocida por el péptido inhibitorio XIP, el sitio de
unión al Ca2+ regulatorio y la región correspondiente a la secuencia de ARN donde
ocurre el splicing alternativo. El lazo citoplasmático no está dibujado a escala, pues
constituye más de la mitad de la longitud de la proteína (550 aminoácidos). Tomado
de: (Philipson y Nicoll, 2000).
Existen regiones del intercambiador Na+/Ca2+ que muestran una homología
intramolecular. La secuencia que abarca una parte de los segmentos
transmembrana 2 y 3 es muy similar a la secuencia correspondiente al segmento 7
(figura 4). Las regiones homólogas anteriores se denominaron a-1 y a-2,
respectivamente, y aparentemente desempeñan un papel importante en el
transporte iónico. Esta homología indica que durante la evolución del intercambiador
ocurrió un evento de duplicación génica. La actividad de intercambio Na+/Ca2+ es
muy sensible a mutaciones en las regiones a. Por ejemplo, un cambio del
aminoácido serina por alanina, cisteína o treonina en la posición 110 inactiva al
intercambiador Na+/Ca2+. Lo mismo ocurre cuando se sustituye el ácido glutámico
por el ácido aspártico o la glutamina en la posición 113. Algunas mutaciones en la
región cercana al citoplasma del segmento 2 alteran la selectividad a iones.89
Normalmente, el intercambiador utiliza solamente el ion sodio para realizar su
función y este requerimiento es muy riguroso. La sustitución de la treonina por la
valina en la posición 103 no solo permite la realización de intercambio Na+/Ca2+,
sino también Li+/Ca2+.
Existen también secuencias homólogas en el lazo intracelular. Estas poseen un
tamaño aproximado de 60 aminoácidos y se denominaron ß-1 y ß-2. Sin embargo,
hasta el presente no se conoce la importancia de estas regiones en la función de la
proteína. Generalmente, el intercambio Na+/Ca2+ no se afecta por mutaciones en
el lazo intracelular, aunque algunas de estas pueden influir sobre las propiedades
reguladoras del propio Ca2+ 72. Por ejemplo, el intercambiador Na+/Ca2+ se
inactiva si no hay Ca2+ unido a un sitio localizado en el lazo intracelular. Algunos
autores han propuesto que las concentraciones de Ca2+ inferiores a 100-300 nmol/L
72 pueden inactivar el intercambiador Na+/Ca2+ y otros sugirieron que estas pueden
ser menores (20-50 nmol/L).90,91 Si estos últimos valores fueran las
concentraciones de Ca2+ requeridas para la activación del intercambio Na+/Ca2+,
entonces el sitio del lazo intracelular regulado por el Ca2+ quizás estuviera siempre
saturado, y su relevancia en la regulación de la función de la proteína fuera
insignificante. Si lo fuesen los primeros, el intercambiador sólo se activaría cuando
se elevan las concentraciones de Ca2+ citosólico, como ocurre durante la
contracción del músculo cardíaco. Hasta el presente, no existe un consenso en
relación con estos valores.
Los datos más recientes acerca de la topología del intercambiador se han obtenido
mediante experimentos de mutagénesis, en los que se sustituyeron diferentes
cisteínas de la secuencia aminoacídica de la proteína.86,89 El acceso a las
cisteínas, intracelulares y extracelulares, por reactivos que contienen grupos
sulfhidrilos ha ayudado al mapeo de casi la totalidad de la molécula del
intercambiador. El mapeo de epítopos también ha aportado informaciones útiles
sobre su topología.92 Los experimentos anteriormente mencionados han permitido
conocer que el intercambiador Na+/Ca2+ posee un enlace disulfuro extracelular
entre la cisteína de la posición 792 y la cisteína de la posición 14 ó 20.93 Además,
entre los fragmentos de membrana 7 y 8 (figura 4), se plantea que existe un lazo
parecido a las regiones formadoras de poros presentes en otros canales iónicos. El
centro de este fragmento hidrofóbico posee una secuencia aminoacídica (GIG,
glicina-isoleucina-glicina), la cual propicia la formación de un giro similar al motivo
característico del lazo P de los canales de K+. Por otra parte, las regiones de
homología intramolecular, específicamente las a, se encuentran en lados opuestos
de la membrana plasmática (figura 4). Esta disposición es similar a la presente en
los canales de agua: aquaporinas.94
Papel fisiológico del intercambiador Na+/Ca2+
El intercambiador Na+/Ca2+ en el control del acoplamiento de la excitacióncontracción del músculo cardíaco. En el músculo cardíaco, el acoplamiento de la
excitación-contracción comienza cuando se activan los canales de Ca2+ tipo L por
la despolarización del potencial de membrana.95 La entrada de Ca2+ a través de
estos canales incrementa localmente la concentración intracelular de Ca2+, hasta
valores suficientes para activar además la liberación de Ca2+ del RS por los canales
RyR, mediante un fenómeno conocido como "liberación de Ca2+ inducida por Ca2+"
96,97. El intercambiador Na+/Ca2+ extrude el Ca2+ que entra a la célula desde el
espacio extracelular, y este es distribuido por toda la superficie extracelular,
incluyendo los túbulos transversales.98 La eficiencia del intercambiador Na+/Ca2+
como principal ejecutor dentro del mecanismo de extrusión de Ca2+ resulta
posiblemente de su densa distribución (aproximadamente de 250 a 400 unidades
de intercambiador Na+/Ca2+ por micrómetro cuadrado).69,99,100
El intercambiador Na+/Ca2+ puede además operar en el modo reverso y suministrar
el Ca2+ necesario para activar los canales RyR, del mismo modo que lo hacen los
canales de Ca2+ tipo-L. Esto posiblemente ocurriría después de la despolarización,
cuando los niveles locales de Na+ intracelular pudieran favorecer la entrada de Ca2+
a través del intercambiador Na+/Ca2+.59,101,102
El retículo sarcoplasmático de los cardiomiocitos está poco desarrollado en muchos
mamíferos neonatos. El acoplamiento excitación-contracción de las células
cardíacas depende, en gran medida, de los flujos de Ca2+ a través de los canales
de Ca2+ y el intercambiador Na+/Ca2+ durante el inicio de la vida. De hecho, la
expresión del intercambiador Na+/Ca2+ cardíaco es mayor en mamíferos neonatos
y disminuye rápidamente con la edad. La disminución de la actividad de intercambio
Na+/Ca2+ es simultánea al desarrollo del retículo sarcoplasmático y los túbulos
transversos.
El intercambiador Na+/Ca2+ neuronal. Imágenes obtenidas mediante técnicas de
inmunofluorescencia han sugerido que existe una alta concentración del
intercambiador Na+/Ca2+ en las zonas de sinapsis neuronal y en las uniones
neuromusculares .103 Debido a que las señales locales de Ca2+ parecen ser
importantes en la sinapsis neuronal, probablemente el intercambiador Na+/Ca2+
participe en la extrusión de Ca2+ que entra a través de los canales de Ca2+ de la
membrana plasmática.104
El intercambiador Na+/Ca2+ en el riñón. El riñón, junto al corazón y al cerebro, son
3 fuentes ricas en proteína del intercambiador Na+/Ca2+. En el riñón, la más alta
concentración del intercambiador Na+/Ca2+ se localiza en el túbulo colector de la
neurona;81,105 sin embargo, los detalles referentes a su función no se conocen
totalmente. Se han descrito diferentes isoformas del intercambiador Na+/Ca2+ en el
riñón106 y estas pudieran explicar funciones diferentes para este tejido.
El intercambiador Na+/Ca2+ en las células ß del páncreas. En las células ß
pancreáticas el intercambiador Na+/Ca2+ participa de forma importante en el control
de la concentración citoplasmática de Ca2+.107-109 Recientemente, se
identificaron dos isoformas del intercambiador (NCX1.3 y NCX1.7) en la célula ß
pancreática, y su papel en la fisiología de esta fue caracterizado.108,110 Mediante
la utilización de oligonucleótidos que contenían una secuencia antisentido a la del
ARNm que codifica para el intercambiador Na+/Ca2+, con el objetivo de bloquear la
biosíntesis de la proteína, los autores de estos estudios demostraron que el
intercambio Na+/Ca2+ puede contribuir hasta en un 70 % al retorno de las
concentraciones citosólicas de Ca2+ ([Ca2+]i) a sus valores basales cuando cesa
un estímulo despolarizante.
Se describió además que esta contribución a la extrusión de Ca2+ a través del
intercambio Na+/Ca2+ se hace significativa a una concentración de Ca2+ citosólico
alrededor de 200-500 nmol/L, lo cual implica la participación limitada del
intercambiador Na+/Ca2+ en el mantenimiento de la [Ca2+]i basal (~150 nmol/L)
(Van Eylen et al., 1998). Este hallazgo concuerda con la baja afinidad por el Ca2+
referida para esta proteína. Sin embargo, está claro que el intercambiador Na+/Ca2+
participa activamente en la restauración de las [Ca2+]i y este es complementado por
otros efectores, como son los tampones intracelulares de Ca2+ y las Ca2+-ATPasa
de la membrana plasmática y del retículo endoplasmático. Por otra parte, el
intercambiador Na+/Ca2+ puede funcionar en el modo reverso, lo que permite la
incorporación de Ca2+ desde el medio extracelular bajo determinadas condiciones,
como son la despolarización de la membrana plasmática y la disminución o la
inversión del gradiente de Na+.
Papel del Ca2+ en la apoptosis
Apoptosis, definición y características. La apoptosis es un término empleado para
describir un modo de muerte celular que se caracteriza por la constricción de la
célula, la condensación del núcleo (sin afectar la permeabilidad de la membrana
citoplasmática) y la fragmentación de la célula, lo cual conduce a la formación de los
cuerpos apoptóticos.111 El destino de los cuerpos apoptóticos es un fenómeno de
gran importancia biológica; ellos son englobados por fagocitos "profesionales", como
pueden ser las células epiteliales adyacentes, sin provocar una respuesta
inflamatoria porque conservan su contenido hasta que ocurre la fagocitosis.112 De
esta forma, el daño accidental de los tejidos causado por la liberación de enzimas
de los gránulos está minimizado. Consecuentemente, esta forma de muerte celular
participa en la remodelación de los tejidos, prerequisito importante para un
desarrollo embriológico normal. Por esta razón, el término apoptosis se intercambia
de forma habitual con el de "muerte celular programada". La apoptosis ocurre donde
exista proliferación celular y es controlada por genes compartidos que participan en
el ciclo celular. La relación estrecha entre el control de la apoptosis y la proliferación
significa que un defecto en alguna de ellas probablemente de lugar a una alteración
del número de células. En realidad, algunos genes involucrados en la inducción de
la apoptosis (p53)113 se reconocen como clásicos genes supresores de tumores,
mientras otros que previenen la apoptosis e incrementan la proliferación celular
(blc2)114 son oncogenes clásicos. La apoptosis se diferencia de forma significativa
de la necrosis, ya que esta última es un evento accidental donde la célula pierde la
capacidad de mantener su vida, pues el resto de los procesos vitales se desacoplan
de la respiración, se pierde energía y finalmente se degrada de forma incontrolada.
Esto provoca la pérdida del contenido celular, que contiene además moléculas
reactivas y enzimas activas.114 La liberación de estas últimas hacia el intersticio
representa un potente estímulo para que ocurra una inflamación aguda que conduce
a un daño tisular adicional.
La regulación de la apoptosis y sus principales vías. El concepto filosófico que
proclama a "la muerte como una condición esencial de la vida" se evidencia en el
hecho de que la apoptosis es necesaria para el desarrollo normal de los organismos
pluricelulares.115 Pero también la apoptosis es un "arma de doble filo", y el
descontrol de este tipo de muerte celular está implicado en numerosas
patologías;116 por esta razón, este proceso debe estar estrechamente regulado.
Uno de los elementos implicados en dicho control es la compartimentación de los
componentes de la maquinaria apoptótica en diferentes organelos.
Sólo cuando la señal de muerte es enviada, los instrumentos de su ejecución son
llevados al citosol y el programa de suicidio es activado. Los organelos conocidos
que participan en esta compartimentación son la membrana plasmática, donde se
sitúan los receptores de muerte y supervivencia, la mitocondria, que alberga a
algunas proteínas que regulan la apoptosis, y muy recientemente fue incluido el
retículo endoplasmático, pues en él se localiza la enzima pro-apoptótica caspasa12.117,118
Las principales moléculas que participan en la ejecución de la muerte celular
programada son las caspasas. Estas proteínas pertenecen a la familia de proteasas
dependientes de cisteína y aspartato específicas.119 Según su función, se dividen
en 2 grupos conocidos como caspasas iniciadoras (caspasas-8 y -9), cuya función
es la de activar otras caspasas, y las caspasas ejecutoras (caspasas-3, -6 y -7), que
son responsables de la digestión de proteínas celulares, tanto funcionales como
estructurales.
Las caspasas de mamíferos son análogas al producto del gen de muerte celular
Ced-3 del nemátodo Caenorhabditis elegans. Estas proteasas normalmente se
encuentran en la célula en forma de proenzimas inactivas (procaspasas), y pueden
ser activadas mediante un corte proteolítico realizado por un complejo de activación
o por otra caspasa.120 Se ha descrito que la activación de las caspasas contribuye
a la muerte celular en la isquemia cerebral,121 en la isquemia cardíaca122 y en
enfermedades crónicas neurodegenerativas, como la enfermad de Alzheimer123 y
de Huntington.124
La activación de las caspasas se realiza por 2 vías, denominadas extrínseca e
intrínseca. La vía extrínseca consiste en la transducción de señales a través de
receptores de muerte, la cual provoca la activación de la caspasa-8. Esta activación
ocurre si los receptores de muerte, como el Fas y el receptor del factor de necrosis
tumoral, se oligomerizan después de la unión a sus ligandos específicos. A
continuación, la caspasa-8 produce la activación de caspasas efectoras como son
las caspasa-3 y -7125. La otra vía más estudiada, la intrínseca, se inicia con la
liberación de una proteína mitocondrial: el citocromo-c, el cual forma un complejo
con dATP y la proteína Apaf-1.126,127 Este complejo une a la caspasa-9 y le
produce un corte proteolítico. La caspasa-9 activa es liberada del complejo y cataliza
la
activación
de
las
caspasas
efectoras
-3, -6 y -7.127,128 Las caspasas efectoras activadas, ya sea por la vía extrínseca
como por la intrínseca, son capaces de hidrolizar proteínas estructurales del
citoesqueleto y del núcleo celular, y además, proteínas funcionales como la poliADP-ribosa polimerasa.129 Estas cascadas de reacciones conducen finalmente a
la muerte celular.
Recientemente, la activación de la caspasa-12 se asoció específicamente al estrés
del retículo endoplasmático.118 El tratamiento de las células con un inhibidor del
transporte desde el retículo endoplasmático hacia el complejo de Golgi: la brefeldina
A, y con un inhibidor de la N-glucosilación en el retículo endoplasmático: la
tunicamicina, provoca la activación de la caspasa-12. Sin embargo, la activación
más significativa de la caspasa-12 se obtiene al exponer las células a un inhibidor
de la Ca2+-ATPasa del retículo endoplasmático: la tapsigargina. La apoptosis
inducida por estímulos que no afectan al retículo endoplasmático, como es la
supresión de suero o activación del Fas, no resulta en una activación de la caspasa12.
La caspasa-12 forma parte de una subfamilia de caspasas denominada ICE
(interleukin-1ß converting enzime, en inglés).118 La secuencia aminoacídica de la
caspasa-12 murina contiene secuencias homólogas a las caspasas murinas -1 y 11 (39 % y 38 % de identidad, respectivamente) y a las caspasas humanas -4 y -5
(48 % y 45 % de identidad, respectivamente). La caspasa-12 está presente en todos
los tejidos de ratones, aunque la expresión es superior en el músculo, el hígado y el
riñón. Esta proteasa se localizó en las fracciones microsomales y solubles de células
nerviosas mediante la utilización de una técnica de fraccionamiento celular.118 Sin
embargo,
la
forma
inactiva
de
esta
proteína,
las
procaspasa
-12 (60 kDa de peso molecular relativo) se detectó predominantemente en la
fracción microsomal, mientras que su forma activa, la caspasa-12 (36 kDa de peso
molecular relativo), se localizó en la fracción soluble. Estas determinaciones
sugieren que la procaspasa-12 está asociada al retículo endoplasmático y que la
caspasa-12 se liberó durante el proceso de fraccionamiento celular. Además, la
asociación específica de esta proenzima con el retículo endoplasmático se
comprobó por inmunohistoquímica mediante la utilización de anticuerpos
monoclonales que reconocen a esta proteína y a proteínas asociadas a este
organelo.118
Por otra parte, se determinó que la activación de la caspasa-12 no ocurre a través
de la vía extrínseca descrita anteriormente, pues la exposición de timocitos aislados
de ratones transgénicos que expresan o no la procaspasa-12 (procaspasa-12 +/+ y
procaspasa-12 -/-, respectivamente) a un anticuerpo que reconoce al receptor Fas,
produjo decrementos similares de la vitalidad en ambos grupos de células. La
participación de la caspasa-12 en la vía intrínseca o mitocondrial también fue
descartada. Para demostrar esta hipótesis se realizaron estudios en fibroblastos
Sack2 (Apaf-1 -/-) los cuales carecen de la proteína Apaf-1. Las células Sack 2 son
resistentes al tamoxifeno, un activador de la vía apoptótica mitocondrial; sin
embargo, la exposición a la brefeldina A y a la tapsigargina redujeron la vitalidad de
estas células.118
La muerte celular y el ion calcio
La sobrecarga de Ca2+ ha sido relacionada con el daño celular en muchos tipos de
tejidos. En las neuronas, por ejemplo, la neurotoxicidad inducida por glutamato está
asociada con un incremento prolongado de las [Ca2+]i y se plantea que la
acumulación excesiva de este ion en el citosol produce pérdidas neuronales severas
como la isquemia y el trauma cerebral,130,131 además de enfermedades
degenerativas como la de Alzheimer.132,133 Otros estudios han mostrado que la
prevención de la sobrecarga de Ca2+, mediante el pretratamiento con agentes
quelantes134 y bloqueadores de canales de Ca2+ 135, puede poseer efectos
protectores sobre las células. De forma similar, se ha comprobado que las células
que expresan altos niveles de una proteína que une Ca2+ (calbindina-D28K), son
más
resistentes
a
la
muerte
celular.136
Teniendo en cuenta que el Ca2+ es un activador de algunas enzimas que participan
en el catabolismo de una gran variedad de biomoléculas, se supone que un
incremento sostenido de la [Ca2+]i pudiera resultar en la degradación incontrolada
de macromoléculas de importancia vital en el mantenimiento de la estructura y
función de la célula. En realidad, se conoce muy poco acerca de los sustratos
preferenciales de las proteasas activadas por Ca2+, aunque existen evidencias de
que algunas proteínas del citoesqueleto pueden ser degradadas por estas enzimas.
Otra enzima, como la fosfolipasa A2, por ejemplo, es dependiente de Ca2+ y
calmodulina, y al ser activada por altas y sostenidas [Ca2+]i pudiera degradar la
membrana de forma extensiva y generar metabolitos tóxicos.137
Se plantea que la sobrecarga de Ca2+ puede mediar la muerte celular del tipo
necrótico, aunque existen numerosas pruebas que involucran al Ca2+ en la
apoptosis. Por ejemplo, el corte de la cromatina nuclear en fragmentos
oligonucleosómicos, característico en el proceso apoptótico, es el resultado de la
activación de una endonucleasa dependiente de Ca2+ 138. Además, se ha descrito
que el incremento del ion calcio puede comenzar en el núcleo de algunos tipos
celulares, lo cual sugiere que un aumento selectivo de la concentración del ion
divalente en esa estructura pudiera ser suficiente para el inicio de la fragmentación
del ADN; Sin embargo, no resulta aun claro si la fragmentación del ADN mediada
por Ca2+ comienza con la activación de algunas endonucleasas o con la alteración
de la superestructura de la cromatina, lo cual pudiera hacer accesible sitios
adicionales de las cadenas de ADN a la digestión por endonucleasas. En realidad,
algunas determinaciones indican que el corte del ADN en fragmentos
internucleosómicos es secundario a la condensación de la cromatina y al
debilitamiento de la interacción histona-ADN.137
Recientemente, existe una creciente acumulación de pruebas que demuestran que
la disminución de la concentración de Ca2+ en el lumen del retículo endoplasmático
produce un estado de estrés en este organelo con la consiguiente afectación de sus
funciones, dentro de las cuales se encuentran la síntesis, el plegamiento y el
transporte de proteínas.139 Este evento se ha relacionado con la activación de una
vía apoptótica mediada por la proteasa caspasa-12117,118 y la inducción de un
factor de transcripción codificado por el gen CHOP, también conocido como
GADD153 (growth arrest and DNA-damage-inducible gene, en inglés) el cual es
capaz de detener el crecimiento celular y provocar daños en el ADN nuclear.139,140