DETERMINACIONES ENZIMÁTICAS DIAGNOSTICAS INTEGRANTES: GUILLERMO ÁVILA VALERIA CORTEZ YESSENIA DIAZ SARA MÉNDEZ ENZIMAS PANCREÁTICAS Dos enzimas de este órgano tienen aplicación diagnostica en los casos de pancreatitis aguda: la amilasa y la lipasa. Alfa amilasa.- Son enzimas que catalizan la hidrolisis de los polisacáridos y su medición en suero y orina es muy importante en la evaluación de la pancreatitis aguda, la amilasa que se encuentra en la sangre, es principalmente elaborada en el páncreas y en pequeñas cantidades en las glándulas salivales y las trompas de Falopio. Las células acinares pancreáticas son las células encargadas de su secreción, luego se elimina vía producto pancreático llegando al duodeno, donde participa en la degradación de los hidratos de carbono. Para determinar la Amilasa pancreática realizamos la determinación en suero u orina (Amilokit de la línea Wiener) para esta prueba nos proveen de dos reactivos: Reactivo A.- Solución de almidón 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer fosfatos 0,1 mol/l en CINa 0,15 mol/l. Reactivo B.- Solución 0,01 eq/l de yodo en ácido clorhídrico 0,02 mol/l. Material requerido.- - Espectrofotómetro o fotocolorímetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Baño de agua a 37ºC. - Reloj o timer. Procedimiento.- Los reactivos provistos se encuentran listos para usar. Antes de utilizar el reactivo A, agitarlo suavemente unos segundos para homogeneizar cualquier eventual depósito de almidón en el fondo del frasco. En 2 tubos marcados C (Control) y D (Desconocido) colocar: C D 1 ml 1 ml Reactivo A: Dejar unos minutos en baño de agua a 37º C y agregar: Muestra (Suero u orina) Incubar a 37º C. A los 7 minutos y medio exactos, agregar: Reactivo B: Mezclar por agitación suave. Retirar los tubos del baño y agregar: Agua destilada: Mezclar por inversión. Leer en fotocolorímetro con filtro rojo o en espectrofotómetro alrededor de 640 nm, llevando a cero el aparato con agua destilada. Para calcular los resultados se utiliza la siguiente formula: Amilasa (UA/dl) = C - D/C x 1000. Los valores de referencia son: Suero: < 120 UA/dl - 20 ul 1 ml 8 ml 1 ml 8 ml Orina: < 260 UA/hora. Lipasa.- Son enzimas que se producen principalmente a nivel de las células acinares del páncreas y se vierten al duodeno junto con el jugo pancreático, con la finalidad de producir hidrolisis de lípidos a nivel del tubo digestivo. Las sales biliares, calcio y albumina son sustancias activadoras de la lipasa necesarias para que pueda cumplir su función. El páncreas constituye el origen principal y primario de la lipasa sérica, aunque también se encuentra presente en menor concentración en el estómago, intestino, leucocitos y células adiposas. La cuantificación de la lipasa sérica se considera más específica, pero menos sensible para el diagnóstico de daño pancreático, que la amilasa. Como la liberación de amilasa, lipasa es liberada al torrente circulatorio después de la lesión de la célula secretora pancreática, sus valores se incrementan después de los de la amilasa, dentro de un lapso de 24 a 48h por lo general alcanza su valor máximo alrededor del cuarto día y permanecen aumentados por más tiempo, siete a diez días, observándose incluso en algunos casos incrementos hasta catorce días. La lipasa se mantiene más tiempo elevado que la amilasa, debido a su mayor peso molecular, lo que le proporciona una mayor vida media en el plasma sanguíneo. Para determinar la Lipasa realizamos la determinación de lipasa en suero y plasma para lo cual utilizamos el método cinético (Lipasa AA líquida de la línea Wiener) en esta prueba nos proveen de dos reactivos: Reactivo A.- Buffer de Goods 50 mmol/l, tiene un pH de 8,0, contiiene colipasa y sales biliares. Reactivo B.- Solución de 1,2-O-dilauril-rac-glicerol-3-glutárico-(6’metilresorufina)-éster (sustrato de la lipasa) en buffer tartrato 10 mmol/l. Material requerido.- - Material volumétrico para medir los volúmenes indicados. - Analizador automático Procedimiento.- Los reactivos provistos se encuentran listos para usar. Colocamos la muestra (suero o plasma heparinizado) 2 ul, añadimos el reactivo A 100 ul, llevamos a incubación durante 300 segundos a 37º C. Luego añadimos el reactivo B 25 ul, llevamos a incubación durante 90 segundos a 37º C. Posteriormente realizamos la lectura de absorbancia inicial que se realiza a 575 nm (A1). A los 60 segundos exactamente medidos con cronómetro, se registra una segunda lectura (A2). Para obtener el resultado de lipasa en U/l, se multiplica la diferencia de absorbancia (∆A = A2 - A1) por el factor. Los valores de referencia son: Adultos: 13 - 60 U/l (37ºªC). Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. ENZIMAS HEPÁTICAS Fosfatasa alcalina (ALP).- La fosfatasa alcalina tiene como función la transferencia de un grupo fosfato de un donador a otro receptor y se caracteriza debido a que su pH óptimo es fuertemente alcalino. En la actualidad se consideran cinco formas moleculares diferentes: hepática, ósea, renal intestinal y placentaria. De ellas, la forma renal aparece en la orina bajo determinadas circunstancias especiales, la placentaria solo durante el embarazo mientras que la intestinal aparece incrementada en la sangre solo después de la ingesta de alimentos y tiene una vida media muy corta. La fosfatasa alcalina se origina principalmente en los huesos y de manera accesoria en hígado, placenta y con alguna actividad a nivel de los riñones e intestino, aunque para algunos investigadores solamente es segregada por los osteoclastos siendo el hígado sólo su vía de excreción. Está muy bien definida la relación que existe entre la fosfatasa alcalina y la actividad osteoclástica relacionada con la formación ósea, por lo que el ritmo rápido de crecimiento óseo infantil, corre paralelo con valores elevados de esta enzima. Si el crecimiento se bloquea, las concentraciones descienden a nivel del adulto. Para determinar la fosfatasa alcalina realizamos determinación de la actividad de fosfatasa alcalina en suero con la prueba de fosfatasa alcalina optimizada (de la línea Wiener), en esta prueba nos proveen de tres reactivos: Reactivo A.- 4-aminoantipirina 29 mmol/l en solución de aminometil propanol 3 mol/l. Reactivo B.- Fenilfosfato de sodio, 1,4 mmoles. Reactivo C.- Ferricianuro de potasio, 10 mmol/l. S. Standard: solución de fenol equivalente a 200 UI/l. Material requerido.- Espectrofotómetro o fotocolorímetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Tubos. - Probeta. - Baño de agua a 37o C. - Reloj o timer. Procedimiento.- Para la preparación del reactivo A debemos transferir el contenido del frasco del reactivo B volcándolo directamente en el frasco de reactivo A y mezclándolo hasta disolución completa (concentración final 14 mM). Anotar en el rótulo la fecha de preparación. En tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B reconstituido: 0,5 ml a 37o C unos minutos. Luego agregar: Suero: Standard exactamente 10 minutos (cronómetro) y agregar: Reactivo C: 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Mezclar de inmediato cada tubo. Retirar los tubos del baño y leer en espectrofotóme- tro a 520 nm o en fotocolorímetro con filtro verde, llevando el aparato a cero de absorbancia con agua destilada. Para calcular los resulatos se utiliza la siguiente formula; Fosfatasa alcalina (UI/l) = factor x (D-B) donde: 0,5 ml - S 50 ul D Reactivo A 0,5 ml Preincubar en baño de agua 50 ul - Mezclar, incubar Factor = 200 UI/l/(S-B) Los valores de referencia son: Adultos: 68 - 240 UI/l Niños: 100 - 400 UI/l Nota: Debido al proceso osteoblástico, la isoenzima ósea se encuentra aumentada en la niñez y adolescencia (hasta los 18 años aproximadamente), proporcionando valores de fosfatasa alcalina más elevados que en los adultos, habiéndose observado valores de hasta 700 UI/l en niños sin patología que justificara un origen extraóseo de la enzima. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Aminotransferasas o Transaminasas Las aminotranferasas desempeñan una importante función en el metabolismo de los aminoácidos al transferir grupos aminos al cetoglutarato para formar glutamato y en la reacción inversa, del glutamato a cetoácidos aceptores para formar los correspondientes aminoácidos. Existe dos aminotransferasas muy importantes en el diagnóstico clínico estas son, la aspartatoaminotransferasa (ASAT) denominada también transaminasa glutámicooxalacetica (TGO) y la alaninoaminotransferasa (ALAT) o transaminasa glutámico pirúvica (TGP), estas enzimas tienen una vida media en sangre de 17 y 47 horas respectivamente. Aspartato aminotransferasa (ASAT) (TGO) Transfiere el grupo amino del ácido aspártico al ácido alfacetoglutárico para formas ácido oxalacético y glutámico. Como se indicó, es una enzima que presenta una localización citoplasmática (20%) y principalmente mitocondrial (80%), por lo que es considerada bilocular. Se encuentra presente en el hígado, miocardio, epidermis de la piel, músculo estriado, páncreas, riñones y eritrocitos. Agentes químicos como el etanol que producen necrosis mitocondrial producen liberación de la enzima, al igual que la hepatitis viral. Tiene mucha utilidad clínica como marcador de la actividad hepática y cronicidad en la hepatitis viral. Para la determinación de Aspartato aminotransferasa (ASAT) (TGO) utilizamos el método UV optimizado (IFCC) en suero o plasma (línea Wiener), para lo cual nos proveen dos reactivos: Reactivo A.- Viales conteniendo 2-oxoglutarato, nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH), malato deshidrogenasa (MDH) y lactato deshidrogenasa (LDH). Reactivo B.- Solución de buffer TRIS pH 7,8 (a 30o C) con L-aspartato. Concentraciones finales (según IFCC y SSCC): TRIS......................................... 80 mmol/l; pH 7,8 (a 30ºC) L-aspartato ........................................................240 mmol/l NADH ...............................................................0,18 mmol/l MDH ..................................................................... ≥ 420 U/l LDH...................................................................... ≥ 600 U/l 2-oxoglutarato......................................................12 mmol/l Material requerido.- - Espectrofotómetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento. - Cronómetro. Procedimiento.- El reactivo B se encuentra listo para usar, para la preparación del reactivo A se debe agregar 20 ml del reactivo B al frasco del reactivo A. Tapar, agitar hasta la disolución completa y poner fecha. 30 ó 37ºC MACROTECNICA.- En una cubeta mantenida a 30-37o C, colocar: Reactivo A reconstituido: 2 ml Muestra: 200 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. Luego de 1 minuto registrar la absorbancia inicial y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (∆A/ min), restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. Utilizar este promedio para los cálculos. MICROTECNICA.- En una cubeta mantenida a 30-37ºC, colocar: Reactivo A reconstituido: 1 ml Muestra: 100 ul Mezclar inmediatamente. Continuar de modo similar al descripto en el procedimiento (A-I). 25ºC MACROTECNICA.- Emplear 500 ul de Muestra. Luego de agregar la muestra mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. Luego de 3 minutos registrar la absorbancia inicial, continuar de modo similar al descrito en A-I. Para calcular los resultados se utiliza la siguiente formula: GOT (U/l) = ∆A/min x factor En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción seleccionada (30-37ºC o 25ºC), como se indica en la siguiente tabla: Temperatura: ------------------ 30-37ºC 25ºC Long. onda 340 nm 1.740 791 334nm nm 1.780 3.207 809 1.453 Los valores de referencia son: Temperatura: Hombres: hasta 18 U/l hasta 25 U/l hasta 38 U/l Mujeres: hasta 15 U/l hasta 21 U/l hasta32U/l Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. 25ºC 30ºC 366 37ºC Alanina aminotranferasas (ALAT) (TGP) Transfiere el grupo amino de la alanina al ácido alfacetoglutárico para formar ácido pirúvico y glutámico. Se trata de una enzima citoplasmática del hepatocito, que es liberada muy fácilmente cuando existe alteración celular, se la ha identificado en todos los procesos inflamatorios necróticos del hígado y es muy empleada como prueba de screaning en donadores de sangre, para descartar hepatitis viral activa. Es también muy utilizada para realizar el seguimiento evolutivo en las hepatitis virales debido a su rápido incremento al iniciarse la lesión y regresión paulatina con la mejoría. La elevación en sus concentraciones séricas es muy manifiesta en la ictericia de origen viral mientras que se eleva muy poco en la de origen obstructivo y es un marcador mucho más específico de enfermedad hepática que la TGO. Se observan valores bajos en pacientes con deficiencia de piridoxina, lo mismo que en mujeres con tratamiento anticonceptivo oral y en pacientes sometidos a hemodiálisis. Para la determinación de Alanina aminotransferasa (ALAT) (TGP), utilizamos el método UV optimizado (IFCC) en suero o plasma (línea Wiener), para lo cual nos proveen dos reactivos: Reactivo A.- Viales conteniendo 2-oxoglutarato, nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH) y lactato deshidrogenasa (LDH). Reactivo B.- Solución de buffer TRIS pH 7,5 (a 30o C) conteniendo L-alanina. Concentraciones finales (según IFCC y SSCC) TRIS....................................... 100 mmol/l; pH 7, 5 (a 30ºC) L-alanina............................................................500 mmol/l NADH...............................................................0,18 mmol/l LDH................................................................... ≥ 1.200 U/l 2-oxoglutarato......................................................15 mmol/ Material requerido.- - Espectrofotómetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir. - Cronómetro. Procedimiento.- El reactivo B se encuentra listo para usar, para la preparación del reactivo A se debe agregar 20 ml del reactivo B al frasco del reactivo A. Tapar, agitar hasta la disolución completa y poner fecha. 30 ó 37ºC MACROTECNICA.- En una cubeta mantenida a 30-37o C, colocar: Reactivo A reconstituido: 2 ml Muestra: 200 ul Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. Luego de 1 minuto registrar la absorbancia inicial y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (∆A/ min), restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. Utilizar este promedio para los cálculos. MICROTECNICA.- En una cubeta mantenida a 30-37ºC, colocar: Reactivo A reconstituido: 1 ml Muestra: 100 ul Mezclar inmediatamente. Continuar de modo similar al descripto en el procedimiento (A-I). 25ºC MACROTECNICA.- Emplear 500 ul de Muestra. Luego de agregar la muestra mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. Luego de 3 minutos registrar la absorbancia inicial, continuar de modo similar al descrito en A-I. Para calcular los resultados se utiliza la siguiente formula: GPT (U/l) = ∆A/min x factor En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción seleccionada (30-37ºC o 25ºC), como se indica en la siguiente tabla: Temperatura: ------------------ 30-37ºC 25ºC 1.740 791 366 nm Long. onda 340 nm 1.780 1.453 Los valores de referencia son: Temperatura: Hombres: 25ºC hasta 22 U/l 809 30ºC hasta 29 U/l 334nm 3.207 37ºC hasta 41 U/l Mujeres: hasta 17 U/l hasta 22 U/l hasta 31U/l Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Proporción ASAT-ALAT (COCIENTE DE RITIS) En las enfermedades hepatocelulares, la ASAT y la ALAT se encuentran marcadamente elevadas alcanzando valores de 20, 50 y en algunas ocasiones valores de 100 veces el límite superior de referencia. En las hepatitis virales, los valores máximos aparecen alrededor de 1 a 2 semanas después de la iniciación de la infección, para luego disminuir en la tercera a quinta semana. En enfermedades hepatocelulares distintas de la hepatitis viral la elevación de transaminasas es tal que la proporción de ALAT-ASAT es menor de 1. Esta proporción llamada cociente de Ritis, a menudo se encuentra invertida en la hepatitis viral, facilitando su diagnóstico. El aumento de transaminasas luego de realizar ejercicio físico es un hecho fisiológico ya que éstas también tienen origen a nivel de la musculatura esquelética. Gamma glutamil-transferasa (GGT) o Gamma glutamil-transpeptidasa (GTPG) Esta enzima se encuentra encargada de la transferencia de un grupo glutamil a otro péptido u otro aminoácido, se encuentra ensertada en la membrana celular de los tejidos con elevada capacidad secretora y la absorción, como el hepático, pancreático y en menor cantidad en renal y prostático. La GGT sérica es predominantemente de origen hepático, por lo que la determinación de su concentración es un muy buen marcador de enfermedad hepato biliar. En las hepatopatías con daño parenquimatoso, se muestran elevaciones de 2 a 5 veces el límite superior de referencia, mientras que si existe colestasis, intra o extrahepática, los incrementos suelen ser mayores a 5 veces, superando en algunos casos incluso las 50 veces el límite superior de referencia. Para la determinación de Gamma glutamil transferasa (GGT) (GTPT) utilizamos el método (Szasz modificado) en suero o plasma. Sustrato recomendado por la IFCC. Para lo cual nos proveen de dos reactivos: Reactivo A.- Solución de buffer Tris conteniendo glicilglicina. Reactivo B.- Solución de L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitro-anilida. Concentraciones finales: Buffer Tris.............................................. 100 mmol/l; pH 8,5 L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida................> 2,9 mmol/l Glicilglicina.........................................................100 mmol/l Material requerido.- - Espectrofotómetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas. - Baño de agua a la temperatura de reacción seleccionada. - Cronómetro Procedimiento.- Los reactivos provistos estan listos para usar. Estos pueden usarse separados o como reactivo único, mezclando 4 partes de reactivo A con 1 parte de reactivo B. En una cubeta mantenida a la temperatura seleccionada colocar: Reactivo único: 1 ml Preincubar unos minutos. Luego agregar: Muestra: 100 ul Mezclar rápidamente y proseguir de inmediato la incubación disparando simultáneamente el cronómetro. Registrar la absorbancia a los 1, 2 y 3 minutos. Determinar la diferencia promedio de absorbancia (∆A/min) restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. Utilizar este promedio para los cálculos. Para los cálculos se utiliza la siguiente formula: γ-glutamil transferasa (U/l) = ∆A/min x 1.158 y para la conversión de de unidades al sistema se utiliza: γ-GT (U/l) x 0,017 = γGT (ukat/l). Los valores de referencia son: Temperatura: Hombres: Mujeres: 25ºC 30ºC 37ºC 6 a 28 U/l 4-18 U/l 8 a 38 U/l 5-25 U/l 11 a 50 U/l 7-32 U/l 5-Nucleotidasa (5-NT) La 5-nucleotidasa se origina en los conductos biliares y su cuantificación es utilizada para incrementar la especificidad de la determinación de la fosfatasa alcalina en las enfermedades hepáticas, muy empleada para la diferenciación entre la ictericia obstructiva y la hepatocelular, así como entre la enfermedad hepatobiliar y la ósea. Los niveles apreciablemente levados se presentan especialmente en la enfermedad hepatobiliar, sobretodo en paciente con ictericia post hepática, colestasis intrahepática y lesiones infiltrativas del hígado. En pacientes con enfermedad hepatocelular las elevaciones no son importantes, mientras que en pacientes con enfermedad ósea, los valores son normales.
