2013 Espectrofotometría PROFESOR: Luis Briceño INTEGRANTES: - Alcázar Vilca, Francis - Bartolini Aguirre, Stefani - Salgado Cabada, Renato - Sotomayor Quispe, Karen 10/06/2013 I. Introducción La espectrofotometría se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en función de la longitud de onda. Cada componente de la solución posee un patrón de absorción de luz característico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luz de una muestra versus soluciones estándar, es posible determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la muestra (solución incógnita). Las ventajas de la espectrofotometría sobre otros métodos analíticos de laboratorio son varias: es rápida, precisa, versátil, fácil de usar y eficiente en costo. Los espectrofotómetros se han mejorado en precisión y versatilidad en los últimos años con los avances de tecnología, y hoy se consideran indispensables en un laboratorio. En el control de calidad de los alimentos se utilizan con mucha frecuencia las técnicas fotométricas los que permiten establecer concentración de determinados componentes en solución, en base a la intensidad de la luz absorbida por dicha solución, previo tratamiento bajo condiciones especiales. En la naturaleza, los carbohidratos se presentan como monosacáridos (azucares simples), oligosacáridos (contienen de dos a diez unidades monosacáridos) y polisacáridos (glúcidos poliméricos más grandes). Los monosacáridos se clasifican en aldosas si tienen grupo aldehído y cetosas si tienen un grupo cetona. Todos los monosacáridos, aldosas o cetosas y la mayoría de los disacáridos son azucares reductores (excepto la sacarosa) porque uno de sus dos carbonos anoméricos no está formando enlace glucosídico. El método del DNS es una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5 dinitrosalisílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 550nm de los azúcares reductores. El objetivo del presente laboratorio es conocer uno de los métodos de espectrofotometría para alimentos como la mermelada, néctar de durazno y miel de abeja; para determinar su contenido de azucares reductores por el método del DNS. II. Materiales y Métodos 2.1. Materiales Muestras de alimentos: miel de abeja, mermelada de fresa “Gloria” y néctar de durazno “Frugos”. Embudo Buchner Fiola Tubos de ensayo Pipetas y propipetas Espectrofotómetro 3.2 Reactivos Solución de DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico) Sal de Rochelle Solución estándar de glucosa 3.3 Procedimiento 3.3.1 Preparación de la curva estándar Se pesaron 0,2 g de glucosa anhidra. Se colocó la glucosa en una fiola de 100 ml la cual se enrasó con agua destilada. Se tomaron alícuotas de 7, 9, 11, 14.5, 18 y 22 ml. Estas se colocaron en fiolas de 25 ml, las cuales se enrasaron con agua destilada. Se colocaron 0,5 ml de cada solución de glucosa en tubos de ensayo, se adicionaron 3 ml de la solución de DNS a cada tubo y se calentaron a ebullición durante 5 minutos. Se adicionaron 1 ml de sal de Rochelle y 10 ml de agua destilada. Acto seguido se mezcló. Para realizar la curva estándar se tomó por triplicado cada solución y se incluyó un blanco. Se leyeron las absorbancias de cada solución en el espectrofotómetro y se efectuó un análisis de regresión lineal. 3.3.2 Análisis de la muestra La muestra se diluyo usando agua destilada, para dar una concentración final de 2.5 a 9 x 4 10 gr de glucosa anhidra/ 0.5 ml de solución y se procedió al igual que para las soluciones de la curva estándar. Fig. N°1 Fig. N°3 Fig. N°2 Fig. N°4 Fig. N°5 Con la absorbancia que se obtuvo, se fue a la curva estándar y se determinó la concentración de azúcares reductores expresados como glucosa. III. Revisión de Literatura 3.1. Espectrofotómetro Es un instrumento sencillo, también conocidos como absorciómetros refinados, diseñados para la detección sensible de bandas muy angostas de longitudes de onda en el rango que va desde UV hasta el infrarrojo cercano, esto es, de 190 a 1000mm. Las lámpara de deutrio se usan como fuentes luminosas para UV y las lámparas de tungsteno y de haluros de tungsteno para la luz visible; por otro lado, las compuertas ajustables, cuñas de interferencia, primas y rejillas de difracción permiten limitar el paso de la radiación (2- 14nm). Los tubos fotoemisores, los diodos y lo tubos fotomultiplicadores de electrones se emplean para detectar la radiación transmitida por la muestra en solución (Kirk et al, 1996). Los instrumentos de un solo rayo tiene solamente una trayectoria para la luz desde la fuente hasta el detector. Sin embargo, los avances modernos en el diseño de instrumentos y la tecnología de los componentes han conducido a obtener espectrofotómetros muy exactos y estables, de uno o de doble canal, de lectura directa con medidor de aguja o indicador digital y facilidades de expansión de la escala para poder trabajas con soluciones que son capaces de absorber mucho o muy poco (Kirk et al, 1996). 3.2. Espectrofotometría visible y ultravioleta La absorción en estas regiones del espectro involucra transformaciones de las moléculas en sus electrones externos o de valencia, pasando del estado fundamental a estados excitados. Estas técnicas se aplican, fundamentalmente, a especies en disolución, midiéndose la radiación transmitida (no absorbida) por las mismas. La región visible del espectro se extiende entre 400 y 700nm; en ella se integran la luz blanca y las distintas radiaciones visibles que la componen. Como los espectros visibles y ultravioleta están provocados por cambios electrónicos moleculares, dependen, como el color transmitido o reflejado, del tipo de combinación química de los átomos (Burriel et al, 2008). 3.3. Ley de Beer Según Beer, la absorbancia presentada por una sustancia es función directa de su espesor y de su concentración: A = a.b.c Siendo “b” el espesor (longitud de paso óptico), “c” la concentración y “a” una constante de proporcionalidad característica del sistema absorbente. Si la concentración se expresa en gramos/litro y el espesor en centímetros, la constante “a” se denomina absortividad. El valor de “a” es constante para cada sistema absorbente a una longitud de onda determinada (Burriel et al, 2008). 3.4. Cumplimiento de la ley de Beer En realidad no hay excepción al cumplimiento de la ley de Beer, pero en la práctica muchos sistemas químicos se apartan de ella. Las causas de estas desviaciones pueden ser químicas, físicas o instrumentales. La ley está enunciada con la condición de que la radiación sea monocromática, que sólo haya procesos de absorción y que no se modifique la especie química absorbente. Si estas condiciones no se cumplen puede haber desviaciones a la ley. Por consiguiente: El haz de luz incidente ha de ser monocromático. Si es policromático hay desviaciones a la ley que dependen del margen de longitudes de onda y de la amplitud de la banda policromática. Para evitar procesos diferentes a la absorción el haz incidente debe ser perpendicular a la muestra y las disoluciones han de ser diluidas, homogéneas, exentas de turbidez y no fluorescentes. La especie absorbente no debe modificar su naturaleza al variar su concentración. Esta suele ser la causa más frecuente de desviaciones a la ley ya que a veces es imposible mantener estrictamente esta condición. Para evitar errores en el análisis, también es muy importante controlar en las disoluciones diversos parámetros que pueden afectar a las medidas, como son la presencia de posibles interferentes, el pH del medio, el tipo de disolvente, la temperatura, etc. Las asociaciones iónicas o moleculares, la disociación de complejos y ácidos poco estables, la solvatación de especies, etc., pueden ocasionar desviaciones aparentes a la ley de Beer (Burriel et al, 2008). 3.5. Curva de calibración (estándar) La preparación de una recta de calibrado permite relacionar el valor de la absorbancia del analito con su concentración. En primer lugar, se elige la longitud de onda más adecuada para realizar las medidas que corresponderán a un máximo de absorbancia. A continuación, se mide en el espectrofotómetro la absorbancia de disoluciones patrón del analito con concentraciones crecientes y conocidas. Estas disoluciones deben tener unas características similares a la disolución problema de la muestra que se quiere analizar. (Sierra, 2009) Para obtener la recta de calibrado, se procede a representar los valores obtenidos de absorbancia frente a la concentración de las disoluciones patrón, ajustándose los valores experimentales obtenidos, mediante el método de los mínimos cuadrados, a una línea recta (Sierra, 2009). Si el compuesto a analizar se encuentra en una matriz compleja en la que otros componentes absorben a la misma longitud de onda, es posible recurrir a una reacción de derivatización mediante la cual se transforma el analito, de manera específica y total, en un derivado que presenta absorción en una región del espectro libre de cualquier interferencia por efecto de la matriz (Sierra, 2009). 3.6. Determinación de azúcares reductores por el método del DNS El método del DNS se basa en la reducción del ácido 3,5 dinitrosalicílico (amarillo) a ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico (rojo) por el grupo carbonilo libre de los azúcares reductores. El complejo formado es medido espectrofotométricamente a 550nm, siendo la densidad óptica proporcional a la concentración de azúcares reductores (Bello et al, 2006). No se recomienda utilizar este método para la determinación de azúcares reductores en muestras intensamente coloreadas como mieles y caldos de fermentación que la contengan. Estudios de Otero y colaboradores muestran dispersión en la determinación de azúcares reductores en mieles por el método del DNS (Bello et al, 2006). 3.7. Néctar El contenido de azúcares reductores en el néctar está determinado por el promedio del aporte que realiza cada fruta que lo constituye (Camacho, 1992). Cuadro N°1: Contenido porcentual de azúcares reductores de algunas variedades de durazno. Variedad Okinawa Amarillo – Rojo Moqueguano Blanquillo Fuente: Lazo (1973) Azúcares reductores (%) 2.155 2.131 2.123 Promedio (%) 2.136 En el Cuadro se presentan los contenidos porcentuales de azúcares reductores de 3 variedades de durazno: Okinawa, Amarillo-Rojo Moqueguano y Blanquillo. Cuadro N°2: Composición en azúcares reductores y no reductores de la pulpa de durazno. Azúcares reductores Fruta Glucosa Durazno 1.5 % Fuente: Gil (2010) Fructosa 0.9 % Azúcares no reductores Sacarosa 6.7 % En el Cuadro se muestra la composición en azúcares de la pulpa de durazno. Se observa que esta contiene un 2,4% de azúcares reductores (1.5% de glucosa y 0.9% de fructosa) y un 6.7% de sacarosa (azúcar no reductor). Durante el tratamiento y almacenamiento de los zumos se va hidrolizando la sacarosa en azúcares reductores: glucosa y fructosa. Cuando la sacarosa se hidroliza el sabor dulce aumenta porque los monosacáridos (glucosa y fructosa) libres aportan más dulzor que la sacarosa (Gil, 2010). 3.8. Miel de abeja Factores adicionales de composición y calidad La miel podrá tener los siguientes factores de composición y calidad: Contenido de azúcares i. ii. Contenido aparente de azúcar reductor Calculado como azúcar invertido: a) Mieles no indicadas a continuación no menos de 65g/100g. b) Miel de mielada, mezclas de miel de mielada con miel de flores no menos de 45g/100gr. c) "Grass Tree" no menos de 53g/100g. (Xanthorrhoea preissii) Métodos de análisis Determinación del contenido de azúcar reductor Principio del método El método es una modificación del procedimiento de Lane y Eynon (1923) que consiste en reducir la modificación de Soxhlet de la solución de Fehling titulándola, al punto de ebullición, con una solución de los azúcares reductores de la miel, utilizando azul de metileno como indicador interno. Para lograr la máxima exactitud en este tipo de determinación es preciso que la reducción de la solución de Fehling se realice a volumen constante durante el proceso de normalización y en la determinación de los azúcares reductores en la solución de miel. Por tanto, es esencial proceder a una titulación preliminar para determinar el volumen de agua que debe añadirse antes de realizar las determinaciones (Codex, 1981). Fuente: (Codex, 1981) Tabla 1. Composición fisicoquímica de mieles de erica (M. favosa) y guanota (M. compressipes) de Venezuela. Se presentan medias y (desviación estándar) entre paréntesis. Azucares reductores (g/100g miel) Erica Tipo de mieles Erica comercial Guanota 75.20 (± 6.94) 70.73 (± 1.99) 75.06 (± 0.07) Guanota comercial 71.39 (± 1.46) de Método: el método de Lane y Eynon, según se indica en la norma COVENIN (1984a). Fuente: (Vit; 2008) 3.9. Mermelada de fresa En el etiquetado de la mermelada de fresa el contenido de azucares es de 6.8gr de azúcar en 10gr de mermelada. IV. Resultados y Discusiones a. Curva estándar Cuadro N°3: Datos experimentales para la elaboración de la curva estándar Concentración (g/ml) 5.6x10-4 7.2x10-4 8.8x10-4 11.6x10-4 14.4x10-4 17.6x10-4 Lectura 1 0.104 0.150 0.185 0.266 0.393 0.448 Absorbancia Lectura 2 0.101 0.133 0.177 0.248 0.313 0.495 Absorbancia promedio 0.1025 0.1415 0.1810 0.2570 0.3530 0.4715 Figura N°6: Curva estándar 0,002 Concentración (g/ml) 0,0018 0,0016 y = 0,0032x + 0,0003 R² = 0,9926 0,0014 0,0012 0,001 Ряд1 0,0008 Линейная (Ряд1) 0,0006 0,0004 0,0002 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Absorbancia En la Figura se muestra la curva de calibración obtenida por regresión lineal a partir de la relación entre la concentración conocida de los estándares de glucosa anhidra y sus respectivas absorbancias (ver Cuadro) medidas a una longitud de onda de 550nm. Cuadro N°4: Resultados del análisis espectrofotométrico. Muestra Dilución A1 A2 Absorbanci a promedio Concentració n (g/ml) Mermelada de fresa “Gloria” Miel de abeja Néctar de durazno Frugos” 0.0032 g/ml 0.444 0.289 0.3665 1.4728x10-3 0.0022 g/ml 0.435 0.480 0.4575 1.764x10-3 0.05 ml/ml 0.154 0.146 0.15 0.78x10-3 (a) Conversiones Usadas o En 1ml de dilución hay 0,0032g de mermelada 1𝑚𝑙 … … … … 0,0022𝑔 𝑥 … … … … 10𝑔 𝑥 = 3.125 𝑚𝑙 1.760 ∗ 10−3 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 … … … … .1𝑚𝑙 𝑦 … … … … … 3.125 𝑚𝑙 𝑦 = 4.6 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 o En 1ml de dilución hay 0,0022g de miel de abeja 1𝑚𝑙 … … … … 0,0022𝑔 𝑥 … … … … 100𝑔 100 𝑥= 𝑚𝑙 0,0022 1.760 ∗ 10−3 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 … … … … .1𝑚𝑙 𝑦 …………… 𝑥 𝑦 = 80𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 Para la mermelada de fresa De acuerdo al etiqueta de la mermelada, esta contiene 6.8 gr de azúcar (glucosa +fructosa) en 10gr de mermelada, lo cual equivale a una concentración de 0.68 gr de azúcar/gr de mermelada o 68% de azucares reductores. En la determinación del laboratorio la concentración es de 1.5 x10-3 gr/ml, lo que equivale a 4.6 gr de azúcar en 10 gr de mermelada. La concentración salió más baja de lo especificado en el empaque, ello pudo deberse a un mal manejo de la muestra o que el producto contiene menos azucares que lo especifica en la etiqueta; y para comprobar ello se podría hacer un nuevo análisis. Para la miel de abeja Por lo que la concentración de azucares reductores en la miel de abeja es 80g de azúcar/100g de miel; comparando los resultados obtenidos con los del marco teórico según CODEX STAN 12-1981 la cantidad de azucares reductores no debe ser menos que 65g/100g ; por lo cual se acepta el resultado obtenido; (según Vit, 2008) en tres tipos de miel (Erica 75.20 (± 6.94); Erica comercial 70.73 (± 1.99); Guanota 75.06 (± 0.07); Guanota comercial 71.39 (± 1.46) 𝑒𝑛 100𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑒𝑙) la concentración obtenida se encuentra muy cercana a estos ; si bien se debe tener en cuenta tres componentes principales para un correcto análisis de la miel los cuales son : actividad antimicrobiana, composición fisicoquímica y recursos florales de los que proviene. Con los cuales se podrá obtener una mayor exactitud de los resultados. También se debe tomar en que el método empleado usado para la comparación con el marco teórico; en el laboratorio se empleó el método del DNS a diferencia del método que usan los autores citados (CODEX STAN 12-1981: El método modificado del procedimiento de Lane y Eynon (1923); Vit; 2008 el método de Lane y Eynon). Para el néctar de durazno De acuerdo al etiquetado del envase, el néctar de durazno “Frugos” contiene 30 g de azúcar (sacarosa) por porción de 240 ml, que equivale a una concentración de 0.125g/ml. Según Camacho (1992), el contenido de azúcares reductores del néctar está determinado por el aporte que realiza la fruta que lo constituye. La pulpa de durazno contiene 2.4% según Gil (2010) de azúcares reductores y 2.136% según Lazo (1973). Gil (2010) además afirma que durante el tratamiento de la pulpa, parte de la sacarosa se hidroliza en azúcares reductores tales como glucosa y fructosa. De acuerdo a lo afirmado, el contenido de azúcares reductores del néctar de durazno proviene de la fracción aportada por el durazno y por la fracción de sacarosa que se hidroliza durante su elaboración. V. Conclusiones El contenido de azúcares reductores del néctar está determinado por la fracción que aporta la fruta y por la fracción de sacarosa que se hidroliza durante su elaboración. Los resultados obtenidos para la miel de abeja nos indican que esta tiene un alto contenido de azucares reductores. El contenido de azúcar en la mermelada resulto ser inferior a lo especificado en el etiquetado en la determinación. VI. Bibliografía CAMACHO G. 1992. Uso de las pulpas de frutas. Memorias del curso Obtención y control de calidad de pulpas de pulpas de frutas. ICTA, Univ. Nacional de Colombia. Bogotá. Disponible en: <http://www.virtual.unal.edu.com> Codex Stan 12-1981; Codex norma para la miel www.codexalimentarius.org/input/download/standards/310/cxs_012s.pdf BELLO D.; CARRERA E. y DÍAZ Y. Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar [en línea] 2006, XL (Mayo-Agosto). Disponible en:<http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120664006> ISSN 0138-6204 BURRIEL F.; LUCENA F.; SIRO J. y HERNÁNDEZ J. 2008. Química Analítica Cualitativa. 18va edición. Editorial Paraninfo S.A. Madrid (España). GIL A. 2010. Tratado de Nutrición: Composición y Calidad Nutritiva de los Alimentos. 2 da edición. Editorial Médica Panamericana. Madrid. Kirk et al. 1996. Composición y Análisis de Alimentos de Pearson. Segunda edición. Compañía Editorial Continental, S.A. de C.V. México. LAZO R. 1973. Elaboración de pulpas y néctares de durazno (Prunus persica). Tesis para optar por el título de Ingeniero en Industrias Alimentarias. UNALM, Perú. SIERRA I.; PÉREZ D.; GÓMEZ S. y MORANTE S. 2009. Análisis Instrumental. Editorial Netbiblo S.L. España. Vit Patricia 2008; la miel precolombina de abejas sin aguijón (meliponini), aún no tiene normas de calidad www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/26436/1/miel-precolombina.pdf
