Marta Boira Martí Paula Guillamón Gil L4 3ºBCB PRÀCTICA 1: EXPRESSIÓ PERIÒDICA DE LA CICLINA Clb2 I L’INHIBIDOR CDK Sic1 EN S. cerevisiae L’objectiu d’aquesta pràctica és observar l’eixida de mitosi i l’expressió periòdica dels gens en el cicle cel·lular de S. Cerevisiae, en aquest cas, comprovant la variació del nivells de proteïna Clb2 (ciclina mitòtica que apareix en l’ona transcripcional de transició G2/M y es degrada per APC-Cdh1 per l’eixida de mitosis) i Sic1 (inhibidor de la CDK mitòtica, que desapareix en començar la fase S per la via SCF). En el procediment s’ha utilitzat un mutant termosensible cdc15, que participa en la ruta MEN, la qual no es funcional a 37º. Com a conseqüència la ruta MEN no es pot activar i la cèl·lula no pot eixir de mitosi, quedant bloquejada en telofase. Amb aquesta restricció per temperatura, s’ha aconseguit sincronitzar els cultius, quedant totes les cèl·lules bloquejades en telofase i presentant un fenotip observable al microscopi òptic anomenat fenotip “dumbell”. La soca que s’ha utilitzat és MCY123 (cdc15 CLB2-HA SIC1-MYC) per estudiar les diferents fases del cicle. Tot seguit, amb la inmunodetecció per Western utilitzant els anticossos anti-HA i anti-myc que reconeixen les etiquetes HA i MYC unides a Clb2 i Sic1 respectivament, es van poder comprovar els resultats esperables. Esquema del protocol: Marta Boira Martí Paula Guillamón Gil L4 3ºBCB Resultats esperats: MICROSCOPIA: En el recompte es van a diferenciar quatre tipus cel·lulars: cèl·lules en G1 (1); cèl·lules en fase S, caracteritzades per una gemma de grandària menor a la cèl·lula mare (2); cèl·lules bloquejades en telofase, amb dos gemmes de la mateixa grandària, en les que no s'ha pogut produir el procés de separació de citoplasma encara que el nucli ja està dividit, anomenades cèl·lules amb fenotip dumbell (3) i cèl·lules que després d'haver estat bloquejades en telofase han tornat a entrar en el cicle, cèl·lules regemadas (4) . Segons les dades del professor, al cultiu asincrònic i als temps de 10 a 40 minuts hem d’observar una baixa proporció de l’estat regemmat, en els quals l’estat predominant seran les cèl·lules dumbell. No obstant, va disminuint, i a partir de temps 30 comença a augmentar la proporció de cèl·lules regemmades. En els temps de 50 a 70 minuts, augmenta notablement la quantitat de cèl·lules regemmades que mostren aquest fenotip al passar de nou per START, i que degut als problemes dels mutants en la citocinesi mostren aquest fenotip característic. Per últim, a partir dels 80 minuts, les cèl·lules comencen de nou la mitosi, observant l’estat de regemmació perquè, degut a les dificultats en la citocinesi, no podran avançar en el cicle. WESTERN BLOT: El que esperem al Western és que en el patró no trobem cap banda ja que no està marcat per anticossos. A més a més, en la soca asincrònica apareixeran ambdues molècules ja que tenim cèl·lules en totes les fases del cicle perquè no estan sincronitzades. No obstant, a temps 0 com les cèl·lules estan sincronitzades en telofase sols apareixeran alts nivells de Clb2 ja que la ruta MEN no s’ha activat encara, i per tant no es podran veure nivells de Sic1. Als 10 min, els nivells de Clb2 hauran de disminuir ja que s’activa Cdc14, i com a conseqüència començarà també a activar-se la via degradativa APC-Cdh1, encarregada de degradar per ubiquitinació a les ciclines mitòtiques (clb2). Conforme s’active la ruta MEN y cdc14 s’active també completament, Sic1 començarà a aparèixer per l’activació del seu factor transcripcional (swi5) i la seva propia estabilització per fosforilació de cdc14. Mentre Clb2 anirà desapareixent. Als 30-40 min, quan s’ix a fase G1, s’observarà com tenim Sic1 i Clb2 ja haurà sigut degradada. Als 50-60 min Sic1 haurà de desapareixer ja que tornarem a START i a la transició de fase G1/S, Als 70-80 minuts tornarem a estar en transició G2/M acumulant-se Clb2, fins que a temps 90 tornem a tindre Clb2 amb l’entrada a mitosis de nou. Marta Boira Martí Paula Guillamón Gil L4 3ºBCB Resultats obtinguts: RECOMPTE DE CÈL·LULES Figura 1. En aquesta taula es veu reflectit el recompte cel·lular realitzat pels 4 grups del laboratori (A, B, C i D) . S'han comptat en un període de 90 minuts de creixement del cultiu sincronitzat, des de l'eixida del bloqueig en telofase (t = 0) , en intervals de 10 minuts. A més, este recompte també s'ha realitzat en un cultiu asincrònic, on no s'ha bloquejat les cèl·lules en telofase (as). En aquest recompte s'han diferenciat quatre tipus cel·lulars ja explicats abans: cèl·lules en G1 (1), cèl·lules en fase S, caracteritzades per una gemma de grandària menor a la cèl·lula mare (2), cèl·lules bloquejades en telofase, amb dos gemmes de la mateixa grandària, en les que no s'ha pogut produir el procés de separació de citoplasma encara que el nucli ja està dividit, anomenades cèl·lules amb fenotip dumbell (3) i cèl·lules que després d'haver estat bloquejades en telofase han tornat a entra en el cicle, cèl·lules regemmades (4). Podem confirmar com, segons allò que s'esperava, en els primers 20-30 minuts de creixement la majoria de cèl·lules són de tipus 3, amb un fenotip dumbell, ja que és un cultiu que ha eixit d'un bloqueig en aquest punt del cicle. Conforme passa el temps, podem veure com van apareixent cèl·lules tipus 4, que han tornat a entrar en el cicle després del bloqueig. Tornen a crear una gemma al arribar a la fase S, però a causa del bloqueig produït abans, presenten problemas en la separació de les dos cèl·lules sorgides de la divisió anterior, per això es pot apreciar eixe fenotip característic de les cèl·lules regemmades. Quan s’arriba al temps 80-90 min, es pot veure com la majoria de les cèl·lules del recompte son de tipus 4, ja que quasi totes han tornat a dividir-se. A més, aquesta divisió es dona a l’hora en totes les cèl·lules del cultiu, això vol dir que el cultiu s’ha sincronitzat bé i per això han començat el cicle de forma coordinada. Marta Boira Martí Paula Guillamón Gil L4 3ºBCB WESTERN BLOT Figura 2. Western Blot del grupo A. Dilució d’anticossos primaris 1:5000 (anti-HA) i 1:2000 (anti-myc); dilució anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa 1:20000 (anti-rat IgG) i 1:50000 (anti-mouse IgG). La quantitat de proteïna afegida és la corresponent a 2/A595 calculada després de la normalització amb Bradford. La tècnica del western s’ha fet amb l’objectiu d’analitzar la quantitat de proteïna clb2 i sic1 a diferents temps del cicle cel·lular. En el cas del nostre wester, la inmunodetecció de la proteïna per l’anticós myc no ha eixit de forma correcta i per això a soles es pot observar la variació dels nivells de clb2. Tal i com s’ha comentat als resultats esperats, trobem clb2 desde t = 0 (les cèl·lules estan bloquejades en telofase i en esta situació la ciclina mitótica està present a la cèl·lula) fins als 20-30 minuts. A partir d’aquest moment clb2 comença a desaparèixer, ja que la cèl·lula ha eixit de mitosis i el complexe de degradació de proteïnes APC-Cdh1 ha degradar a les ciclines mitòtiques per a tornar a fase G1. Després, i coincidint amb l'aparició de fenotip regemmat a les cèl·lules de recompte, es torna a fase S (on es duplica el DNA i teòricament Sic1 ha desaparegut) i finalment, cap als 70-80 minuts les cèl·lules tornen a mitosis, produint-se de nou la síntesis de ciclina mitòtica (ona transcripcional G2/M) i la seva acumulació en la fase de mitosis.
