Instituto Politécnico Nacional. Unidad Politécnica Interdisciplinaria de Ingenierías campus Guanajuato. Materia: Técnicas de Microbiología Grupo: 2BV2 Práctica 4. Preparación de medios de cultivo. No. Equipo: 1 Integrantes: Cervantes Martínez Ana Paula. Guzmán González Alejandro. Hernández Cuenca Rodrigo. Ortega Huerta Daniela Elizabeth. Rivera Meza Edith Cecilia Urieta Flores Michelle. Profesores: Karla Lizbeth Macías Sánchez. Díaz Sandoval Silvia . Aguilar Méndez Mario Josue Fecha: Miércoles 4 de Marzo del 2020 Práctica 4. Preparación de medios de Cultivo. Objetivos ● Desarrollar una metodología adecuada para 3 diferentes medios de cultivo (sólido, líquido y semisólido). ● Inocular un microorganismo que sea favorecido por los componentes del medio, revisar si hay crecimiento después de su incubación. Introducción. La supervivencia y reproducción de los microorganismos depende de los nutrientes y las condiciones ambientales en las que se encuentra. Estos nutrientes deben de ser una fuente de macroelementos como base para la estructura de las biomoléculas que lo constituyen, asimismo de vitaminas y elementos traza necesarios para su metabolismo y generalmente están contenido en un medio de cultivo. Un medio de cultivo es una solución acuosa, en las que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de los microorganismos. Las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio, mediante el uso de medios de cultivo artificiales, los cuales se encuentran disponibles en una gran variedad y los cuales en general aportan a los microorganismos: Tabla 1. Fuentes de nutrición en un medio de cultivo. Fuentes de nutrición en un medio de cultivo. Una fuente de carbono El carbono es un componente esencial para conformar la estructura celular. Según la fuente de carbono los microorganismos se encuentran en dos grupos: autótrofos y heterótrofos. Los organismos autótrofos pueden cultivarse en medios que contengan únicamente compuestos inorgánicos . Los heterótrofos necesitan un suministro de carbono orgánicos. Una fuente de Nitrógeno. Elemento esencial para que la célula construya macromoléculas como: proteínas y ácidos nucléicos. Algunos microorganismos usan nitrógeno atmosférico, sales de nitrato o de amonio. Elementos no metálicos Iones no metálicos como el azufre y fósforo. El azufre puede encontrarse en proteínas, sulfatos; mientras el que el fósforo puede encontrarse en sales. Elementos metálicos/micronutrientes (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2 y Fe+3). Encontrados en sales inorgánicas en bajas concentraciones por los microorganismos. Vitaminas. Los microorganismos puede tomarlas del medio ya elaboradas o iniciar procesos de síntesis de las mismas. Energía. Existen dos tipos bioenergéticos de microorganismos, los fotótrofos y los quimiótrofos. Los fotótrofos emplean la energía radiante (luz solar), como única fuente de energía; y los quimiótrofos obtienen la energía por oxidación de compuestos químicos orgánicos o inorgánicos. De manera general, los medios pueden ser artificiales o definidos. Para los definidos se conocen las cantidades exactas de compuestos químicos puros que los conforman, mientras que los medios artificiales están compuestos de un número limitado de sustancias complejas, cuya composición química exacta no se conoce. En la elaboración de un medio de cultivo se tiene que tener en cuenta diferentes factores, que aseguran que el medio de cultivo favorezca el crecimiento bacteriano, los cuales se pueden observar en la tabla 2. Tabla 2. Propiedades de los medios de cultivo. Propiedades de los medios de cultivo Humedad Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia puede llevar a la muerte del microorganismo. Fertilidad Se refieren a los elementos o compuestos básicos que permiten el crecimiento bacteriano pH Se refiere al pH óptimo para el desarrollo bacteriano; variaciones ácidas o alcalinas, pueden inhibir su crecimiento. Transparencia. Permite la observación bacteriológica y el crecimiento adecuado. La clasificación de los medio de cultivo se da según los nutrientes que se le proporcionan el microorganismo y determinan cómo o cuáles van a crecer. Tabla 3. Clasificación según su propósito. Clasificación según su función. Medios enriquecidos Con adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales o plantas al caldo o agar, proporcionando sustancias nutritivas complementarias para el crecimiento de microorganismos exigentes. Medios selectivos Con adición de algunas sustancias que no permiten el desarrollo de un grupo de microorganismos y sin afectar el desarrollo de los grupos de interés. En principio se pueden seleccionar los microorganismos que se desarrollan en medios orgánicos poco comunes, caso en el cual se omiten otros compuestos de carbono. Medios diferenciales Contienen reactivos químicos que traen como resultado, determinado tipo de crecimiento bacteriano después de la incubación (observación de hemólisis, coloraciones de las colonias y otras reacciones indicadoras). Medios para identificación Para determinar el tipo de crecimiento producido por los microorganismos, así como, la capacidad para producir cambios químicos. Resultados En esta práctica se realizaron 3 diferentes medios de cultivo uno sólido, líquido y semisólido, los cuales fueron inoculados con una muestra que contuviera un tipo de microorganismo que pudiera ser favorecido por el medio desarrollado. Medio Sólido. El medio sólido realizado fue un agar para estafilococos, el cual es un medio selectivo de aislamiento. Los insumos y cantidades ocupados para este medio fueron los siguientes: Tabla 5. Insumos y cantidades necesarias para el medio sólido. Insumo Cantidad g/L Extracto de Levadura 2.5 g/L Peptona de caseína 10 g/L Gelatina 30 g/L Lactosa 2 g/L D-Manitol 10 g/L7 Cloruro de sodio 75 g/L Fosfato dipotásico Agar 5 g/L 15 g/L Al realizar el agar este presentó un color amarillo claro, y al pasarlo a la caja de petri nos quedó una capa muy fina de agar, lo que produjo que se viera muy claro (imagen 1). Imagen 1. Medio sólido antes de ser inoculado e incubado. Este medio de cultivo fue inoculado con saliva de una compañera que estaba enferma de gripe. Se utilizó la técnica de estría por placa, y se dejó incubar por dos días a 35°C. En la imagen 2 se puede ver los resultados después del primer día de incubación, en la cual no se ve crecimiento del microorganismo, aunque sí se ve el estriado del cotonete con el cual se tomó la muestra. En la imagen 3 se puede observar la muestra después de 48 horas de incubación, la cual sigue sin presentar crecimiento bacteriano. Imagen 2. Muestra de saliva en agar sólido, después de 24hrs de incubación a 35°C. Imagen 3. Muestra de saliva en agar sólido después de 48 hrs de incubación a 35°C. Como este medio no presentó crecimiento, no se pudo extraer muestra para realizar la tinción de Gram. Medio Semisólido. El medio semisólido desarrollado fue el Agar de Hierro de Kligler, el cual es un medio usado para diferenciar bacilos entéricos Gram negativos presentes en la acidificación de la lactosa. Para la realización de este medio se tuvieron que hacer ciertas modificaciones, debido a que no se contaba con todos los insumos necesarios. Tabla 6. Insumos y cantidades necesarias para el medio semisólido. Insumos. Cantidades g/L Mezcla de peptonas 20 g/L Lactosa 10 g/L Dextrosa 1 g/L Cloruro de sodio 5 g/L Agar Rojo fenol 15 g/L 0.25 g/L Este medio presentó una coloración roja, pero al momento de enfriar no presentó la característica principal de este tipo de medios (ser semi sólidos) debido a que su consistencia fue muy líquida (imagen 4.) Imagen 4. Medio semi sólido con agar de Hierro de Klingler. Este medio fue inoculado con yogurt de fresa que estaba caducado. Se incubó por 48 horas a 35°C. En la imagen 5 se puede observar el resultado a las 24 horas de incubación, el medio presentó un ligero cambio de coloración en el que se ve un poco más naranja-amarillo, además de que se formó una masa turbia en el centro del mismo (imágen 6). Imagen 5. Muestra de yogurt en agar semisólido, después de 24 hrs de incubación a 35°C Imagen 6. Masa turbulenta presentada en el agar semisólido después de 24 hrs de incubación a 35°C Después de 48 horas de incubación el medio presentó una ligera nata en la parte superior que al momento de agitar se quebró y se esparció por agar (imagen 7), además de que tuvo sedimentación color claro en la parte inferior (imagen 8); no presentó cambios de color desde el día anterior. Imagen 7. Medio semisólido con muestra de yogurt después de 48 hrs de incubación a 35°C. Imagen 8. Sedimentación presentada en el agar semisólido después de 48 hrs de incubación a 35°C. Después de la incubación se realizó una tinción de Gram para obtener más información sobre los microorganismos incubados. En el resultado de esta tición obtuvimos que fueron bacilos Gram negativos (imagen 9). Imagen 9. Tinción de Gram de muestra de yogurt en medio semisólido. Microscopio óptico, en objetivo 100x. Medio líquido. El medio desarrollado fue el caldo nutritivo para Escherichia coli. Para la realización de este medio se utilizaron los siguientes insumos: Tabla 7. Insumos y cantidades necesarias para el medio líquido. Insumos. Cantidades g/L Peptona de caseína. 10 g/L Extracto de levaduras. 5 g/L Cloruro de sodio 10 g/L Este medio de cultivo presentó coloración amarilla (imagen 10), el cual fue dividido en 3 tubos de ensaye (imagen 11). Imagen 10. Medio de cultivo líquido con caldo de Escherichia coli. Imagen 11. Medio de cultivo líquido dividido en tubos de ensaye. Este medio fue inoculado con una muestra de carne de res cruda que se mantuvo fuera de refrigeración por 24 hrs. Se incubó por 48 hrs a 35°C, en la imagen 12 se puede observar que los tubos presentaron turbidez a las 24 horas de incubación, mientras que en la imagen 13 se puede observar que presentaron una turbidez aún mayor a las 48 horas de incubación; en la imagen 14 se puede observar la sedimentación que se formó a las 48 horas de incubación. Imagen 12. Medio de cultivo líquido después de 24 horas de incubación a 35°C. Imagen 13. Medio de cultivo líquido después de 48 hrs de incubación a 35°C. Imagen 14. Sedimentación presentada en el medio líquido, inoculado con carne de res, después de 48 horas de incubación. Se realizó la tinción de Gram de la muestra para obtener más información de la misma, y se obtuvo que son cocos Gram negativos. (imagen 15) Imagen 15. Tinción de Gram en muestra de carne de res en medio líquido. Microscopio óptico en objetivo 100x. Discusión. Se tomaron 3 muestras para observar el crecimiento microbiano, una de ellas fue la saliva de una compañera que presentaba síntomas de gripe, en el medio de cultivo sólido, sin embargo la muestra no se tomó correctamente, ya que ésta debió de ser tomada de la parte posterior de la garganta, no de las paredes de la boca, como nosotros lo hicimos. Si bien, “la saliva contiene bacterias, las proteínas contenidas en ella, modifican su adherencia, modulando a los microorganismos para que no se queden en la superficie de los tejidos orales, e inhiben el crecimiento y la viabilidad bacteriana” (Castañeda et al., 2012), lo cual provocó que no fuera posible observar el crecimiento de algún microorganismo en la preparación de nuestro cultivo, contrario a lo que esperábamos. En el cultivo semi-sólido, se utilizó como muestra yogurt. Al observar la morfología celular de la muestra se obtuvo que fueron bacilos los microorganismos que crecieron, esto lo comparamos con el artículo de Shihata, & Shah (2000), en el que se habla sobre el contenido bacteriano del yogurt, tales como Streptococcus thermophilus que actúa en una simbiosis con la bacteria Lactobacillus acidophilus, y coincidimos con que es la morfología celular esperada. Sin embargo, al comparar los resultados de la tinción de Gram no coincidimos, puesto que el artículo de Walter P. Hammes (1995) explica que los Lactobacillus son Gram positivos, y nuestros resultados indican que son Gram negativos. Por otra parte, para el cultivo líquido se tomó carne de res cruda como muestra, esperando obtener E. coli. Al observar la morfología celular de la muestra, se obtuvo que fueron cocos Gram negativo, concordando con los resultados de la investigación de Nataro J. et al. (1997), que muestra al microscopio los cocos Gram negativo contenidos en la carne de res cruda. Conclusiones. Concluimos que la correcta realización de los medios de cultivo es un factor importante para la posterior inoculación e incubación de microorganismos, ya que de esto depende que el microorganismo se pueda desarrollar. Además de que la toma de la muestra debe ser la adecuada, de lo contrario no crecerá la bacteria deseada. Cuestionario. 1.- Mencione el nombre, composición y función de 3 medios de cultivo diferentes a los utilizados en la práctica. ○ Agar CNA (colistina, ácido nalidíxico): agar base de Columbia adicionado de colistina y ácido nalidíxico que suprimen por completo el crecimiento de enterobacterias y de Pseudomonas, pero permiten el desarrollo de estafilococos, estreptococos, enterococos y levaduras. Ciertos microorganismos Gram negativos como Gardnerella vaginalis y algunas especies de Bacteroides pueden crecer muy bien en este medio. Se puede añadir 5% de sangre desfibrinada que proporciona más nutrientes y la capacidad de detectar reacciones hemolíticas. ○ Agar EMB (eosina, azul de metileno, “eosin-methylen blue”, Agar de Levine): Es un medio diferencial y selectivo para aislar y detectar enterobacterias en muestras mixtas. Los colorantes de anilina (eosina y azul de metileno) inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. También se combinan precipitando a pH ácido, actuando como indicadores de producción de ácidos. El medio incluye lactosa, lo que permite la diferenciación de los fermentadores de lactosa de los que no lo son. Los fermentadores fuertes de lactosa, sobre todo Escherichia coli, producen colonias de color negro verdoso con brillo metálico. Los productores más débiles de ácidos, forman colonias de color violeta. Los no fermentadores de lactosa forman colonias transparentes. ○ Agar selectivo para estreptococos: es una modificación del agar sangre de oveja, que contiene cristal violeta, trimetoprim~sulfametoxasol y colistina en concentraciones adecuadas para inhibir a la mayoría de los estreptococos excepto Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae. La beta hemólisis se observa fácilmente. El medio es efectivo para la siembra primaria de hisopos de garganta para la detección de estreptococos del grupo A. 2.- Defina y ejemplifique: ○ Medio selectivo: cualquier medio que es adecuado para el crecimiento de un organismo específico. ■ Agar Regan Lowe: Agar selectivo para el aislamiento de Bordetella pertussis. El medio contiene carbón, cefalexina y anfotericina B como sustancias inhibidoras. ○ Medio diferencial: P ermite distinguir diferencias metabólicas entre bacterias. ■ TSI (Triple Sugar Iron): Lactosa, sacarosa y glucosa. Tiosulfato sódico, peptona, citrato férrico amoniacal y extractos. En este medio se busca determinar la capacidad de la bacteria para degradar los azúcares, formación de gas y sulfuros de hidrógeno. La presencia de gas se debe al CO2 producto de la fermentación. La degradación de la lactosa ocurre en la parte superior, la de la sacarosa en la parte intermedia y de la glucosa en la parte profunda produciéndose un viraje de rojo a amarillo. 3.- Enuncia el nombre de dos medios de cultivos que permitan el crecimiento de bacterias Gram negativas. ○ Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos). ○ Agar CNA (colistina, ácido nalidíxico). 4.- Enuncia el nombre de dos medios de cultivos que permitan el crecimiento de bacterias Gram positivas ○ Agar chocolate con IsoVitaleX y vancomicina. ○ Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos). 5.- De acuerdo a la utilización de fuentes de carbono ¿Cómo se clasifican los microorganismos? ○ Autótrofo: obtienen la mayoría del carbono celular por fijación del anhídrido carbónico. Entre los organismos autótrofos más importantes y comunes encontramos a las plantas ya que las mismas realizan su propia síntesis alimentaria, utilizando elementos tales como el agua y la luz solar para elaborar su alimento. ○ Heterótrofo: extraen el carbono celular de sustancias orgánicas. Los animales, los protozoos, los hongos y gran parte de las bacterias y de las arqueas son organismos heterótrofos. 6.- Proporciona la definición de un factor de crecimiento (en el medio de cultivo) con ejemplos. Un factor de crecimiento son un conjunto de compuestos orgánicos necesarios, como precursores, que no pueden ser sintetizados por los microorganismos. ○ Indicadores de pH. i. Rojo de fenol. ii. Púrpura de bromocresol. ○ Indicadores de óxido-reducción i. Resazurina. 7.- ¿Qué es un medio mínimo? Un medio mínimo es un tipo de medio de cultivo que contiene los nutrientes mínimos indispensables para el crecimiento de una colonia, por lo general sin la presencia de aminoácidos. Referencias. ● Barrero Cuevas, L. (2016). “Microbiología clínica”. Editorial Síntesis., Madrid. Págs 39-65. ● Castañeda, A. A. H., & Moya, G. C. A. (2012). “Características y propiedades físico-químicas de la saliva: una revisión”. Ustasalud, 11(2), págs. 102-112. ● Klug S. W. (2010). “Conceptos de Genética”. Pearson Prentice Hall, (8va edición), USA. ● Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. Brock. (2004) “Biología de los microorganismos.” Prentice Hall, 10ª edición. USA. ● Méndez C., Vergaray G., Morante H. Y, Flores. P, & Gamboa R. (2013). “Aislamiento y caracterización de Escherichia coli O157:H7 a partir de carne molida de bovino en Lima-Perú.” Revista Peruana de Biología, 20(2), 159-164. Recuperado de ● ● ● ● http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1727-993320130 00200008&lng=es&tlng=es. Rodríguez-Angeles, G. (2002). “Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de Escherichia coli” . Salud Pública de México, 44(5), 464-475. Recuperado de http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0036-363420020 00500011&lng=es&tlng=es. Rojas Triviño A. (2011). “Preparación de medios de cultivo .Conceptos y práctica de Microbiología general” Universidad Nacional de Colombia, sede palmira Colombia, págs. 33-36. Shihata, A., & Shah, N. P. (2000). Proteolytic profiles of yogurt and probiotic bacteria. International Dairy Journal, 10(5-6), 401-408. P. Nataro, J. (n.d.). Diarrheagenic Escherichia coli. 2nd ed. 1997: James B Kaper, pp.142_201.
