ANÁLISIS CUANTITATIVO DE CANNABINOIDES A PARTIR DE CANNABIS SATIVA UTILIZANDO 1HNMR Integrantes Viviana Elizabeth Gutiérrez Rangel Ali Giese Guzmán Ramos Melissa Romero Vargas Gabriela Xicotencatl Sarmiento Introducción La planta de cannabis ha sido de interés medicinal durante siglos. Entre los componentes de Cannabis sativa, los cannabinoides han sido reconocidos como los componentes activos para la mayoría de las actividades clínicas Cannabinoides disponibles comercialmente como normas de referencia certificadas: • • • • delta-9-tetrahidrocannabinol ( D 9-THC o THC) delta-8-tetrahidrocannabinol ( D 8- THC) cannabidiol (CBD) cannabinol (CBN: Las actividades farmacológicas de los cannabinoides son muy diversas, que van desde analgésico y antieméticos hasta el tratamiento de glaucoma y esclerosis múltiple. Material vegetal • El material vegetal de cannabis sativa se obtuvo del Instituto Stichting para la marihuana medicinal (SIMM) en Rotterdam, Países Bajos, y de Bedrocan BV, Países Bajos. • Se utilizaron cuatro variedades diferentes de cannabis. • Después de la cosecha, el material vegetal se secó al aire en la oscuridad a temperatura y humedad constantes durante 4 semanas. • Solo se usaron flowertops de plantas femeninas. Estos se manicuraron para eliminar otro material vegetal como hojas y tallos, y se almacenaron a 20 ° C. Extracción y cuantificación de cannabinoides Para cada análisis de material vegetal (350 mg de peso seco) o control de recuperación se extrajeron dos veces durante 10 min con 15 ml de metanol / cloroformo (9: 1, v / v). Para evaluar la linealidad entre el tamaño de la muestra del material vegetal y el resultado de la cuantificación, se extrajeron y cuantificaron diferentes cantidades de material vegetal (100, 300, 500 mg, todas por triplicado). Extracciones se iniciaron con 2 minutos de ultrasonidos y se realizaron a 4 ° C. Ambos extractos se combinaron y el volumen se llevó a 50 ml con disolvente de extracción. Todos los experimentos se basaron en triplicados. Para los materiales vegetales, solo se determinó la cantidad de THCA. Luego se mezclaron 0,5 ml de extracto con 1,00 mg de antraceno como patrón interno. Estas muestras se evaporaron usando una centrífuga de vacío y se redisolvieron en 1 ml de CDCl3 para análisis de 1 H-NMR. Solventes y productos químicos • El antraceno se adquirió de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Se obtuvo cloroformo desuterizado (CDCl3, 99,8%) de Eurisotop (Gif-sur-Yvette, Francia). Todos los solventes orgánicos fueron de grado analítico y se obtuvieron de Merck Biosolve Ltd. Valkenswaard, Países Bajos. Cannabinoide s puros fueron previamente aislados e identificados Se almacenaron como soluciones etanólicas a 20 ° C. Los siguientes cannabinoides aislados se usaron para la cuantificación: • delta-9-tetrahidrocannabinolic acid A (THCA) • cannabidiol (CBD) • ácido cannabidiólico (CBDA) • cannabinol (CBN) • delta-9 tetrahidrocannabinol (THC), Los espectros de H-NMR • Se registraron en CDCl3 usando un espectrómetro Bruker DPX 300, equipado con una computadora Indy Silicon Graphics. Para cada muestra se registraron. 64 escaneos con los siguientes parámetros: puntos de datos de 32 K ancho de pulso de 4.0 ms retraso de relajación de 1 segundo. Los FID fueron transformados de Fourier con LB de 0.5 Hz. Para el análisis cuantitativo, se usó el área de pico después de la corrección de la línea de base. Determinación de precisión Se utilizaron estándares de cannabinoides certificados para evaluar la precisión del método desarrollado. De los viales recién abiertos que contenían THC (1,0 mg / ml), CBD (0,99 mg / ml) y CBN (0,98 mg / ml) se mezclaron 100 ml con 1,00 mg de antraceno como patrón interno (todo por triplicado). Se evaporaron usando una centrífuga de vacío y se redisolvieron en 1 ml de CDCl3 para análisis de RMN. Una parte alícuota de las soluciones etanólicas de los patrones de cannabinoides, se diluyeron en etanol a una concentración de aproximadamente 0,5 mg / ml Cuantificaron como se describió anteriormente. Evaluación de la recuperación de cannabinoides • Quinientos miligramos de papel de filtro de celulosa (Schleicher & schuell, GmbH, Cassel, Alemania) Se cortaron en trozos de aprox. 0,5 cm de diametro Se coloca en el recipiente de extracción. Cada cannabinoide aislado (1,0 mg en etanol) se añadió a los discos de papel de filtro. Las muestras añadidas se secaron a temperatura ambiente durante 24 h antes de la extracción. Resultados y discusión ■ Se realizo el método de H-NMR para el análisis cuantitativo de cannabinoides y cannabinoides puros presente en el material vegetal Cannabis sativa, para realizar un análisis cuantitativo de cannabinoides sin la necesidad de separación cromatográfica Tabla 1. Cuantificación de cantidades conocidas de patrones de cannabinoides obtenidos comercialmente CBN Espectros de RMN obtenidos en estos experimentos THCA-A Fig. 2. Espectros de RMN H de 0,5 mg (en peso) de cada cannabinoide junto con 1 mg de antraceno como patrón interno THC CBDA Fig. 2. Espectros de RMN H de 0,5 mg (en peso) de cada cannabinoide junto con 1 mg de antraceno como patrón interno CBD Fig. 2. Espectros de RMN H de 0,5 mg (en peso) de cada cannabinoide junto con 1 mg de antraceno como patrón interno Tabla 2. Linealidad de las curvas de calibración de los cannabinoides ■ 𝑟 2 = mayor 0.99 (valores precisos) La recuperación de cada cannabinoide con el método utilizado fue más de 92% Tabla 3. Recuperación de los cannabinoides (%) después de la extracción del papel de filtro con metanol / cloroformo, 9: 1 (v: v) Los extractos de cuatro cultivos diferentes de Cannabis sativa fueron analizados por su contenido de THCA utilizando el H-RMN Casi no contenían THCA pero si un alto valor de CBDA Fig. 3 Espectro H-NMR de un extracto de cannabis tipo droga junto con 1 mg de antraceno como patrón interno Tabla 4. Cuantificación de la cantidad de THCA en cuatro tipos diferentes de cannabis (mg / g de material vegetal de peso seco), calculada a partir de la cantidad de THCA en los extractos con RMN y GC La fig. 4 muestra la alta linealidad entre la cantidad de cannabis utilizado para la extracción y los resultados de cuantificación de THCA (no realizado para CBDA). Fig. 4 Linealidad entre la cantidad de material vegetal extraído de cannabis y la cantidad de THCA (en unidades arbitrarias) después de la cuantificación Conclusión ■ El contenido del cannabinoide principal del material vegetal de Cannabis sativa y en las preparaciones de cannabinoides aisladas se pudo analizar con un método simple y en poco tiempo de solo 5 minutos. ■ El método de 1H-NMR tiene la ventaja de obtener un perfil general del extracto y se puede determinar la pureza de un cannabinoide aislado, así como la identidad de las impurezas
