ANÁLISIS POR INSTRUMENTACIÓN EAP BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS, GRASAS Y MINERALES Docente: Mejía Domínguez Cecilia Alumna: Allinson Brighitte La Madrid Napuri 16 de Abril del 2018 BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS, GRASAS Y MINERALES I. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: Es necesario realizar un análisis para determinar proteínas, grasas y minerales en los alimentos para asegurar que sean aptos para el consumo y para asegurar que cumplen con las características y composición que se espera de ellos. II. PRINCIPALES METODOS PARA DETERMINAR PROTEINAS Método kjeldahl Método de Dumas Método de Kofranyi Método de Biuret Método de Bradfort Método de Lowry Método de Sorensen Método de Espectroscopia infrarroja Método de Espectrofotometría Métodos Turbidimetrico Método de Espectroscopia Electrónica 1. Método de Kjendahl En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína total que las proteínas o aminoácidos individuales. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no proteínas como las proteínas verdaderas (Aurand et al, 1987). El método se basa en la determinación de la cantidad de Nitrógeno orgánico contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos: a) La descomposición de la materia orgánica bajo calentamiento en presencia de ácido sulfúrico concentrado. b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra. Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y carbonización de la materia orgánica combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono. El nitrógeno orgánico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución como sulfato de amonio. La recuperación del nitrógeno y velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando sales que abaten la temperatura de descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de oxidantes (peróxido de hidrógeno, tetracloruro, per sulfatos o ácido crómico) y por la adición de un catalizador. (Nollet, 1996) BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN Dificultades químicas y prácticas Digestión prolongada. Conversión cuantitativa de nitrógeno a amoníaco. Espumosidad excesiva. Acción corrosiva de ácido sulfúrico sobre el sistema de extracción de humos. Consideraciones ambientales respecto a descarga de humos y contaminación de aguas con catalizadores metálicos. Soluciones Aumentar relación sulfato de potasio/ácido sulfúrico (1 g.l ml) t° 370-410°C. Uso de catalizadores metálicos. Uso de H202. Ventajas Apropiado para varios tipos de productos. Alta fiabilidad. Usado como método de referencia. Desventajas Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos. Uso de catalizadores tóxicos o caros. Elección del factor de conversión. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de ebullición y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el destilado se retiene o bien por un ácido normalizado y se valora por retroceso, o en ácido bórico y valora directamente. El método Kjeldahl no determina, sin embargo, todas las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pearson, 1993). Para convertir el nitrógeno a proteína se emplea el factor de 6.25 el cual proviene de la consideración de que la mayoría de las proteínas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrógeno. 2. Método de Dumas Se caracteriza por pirolisis completa de la muestra y medición del contenido de nitrógeno de los gases de combustión. El nitrógeno puede ser medido con manómetro después de absorber el dióxido de carbono en una solución alcalina o por conductividad térmica en métodos automatizados. Ventaja Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el método de Kjeldahl en análisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores. Desventajas Incluye nitrógeno inorgánico. Requiere pequeñas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y homogénea para minimizar el error de muestreo. Este método no puede aplicarse a material húmedo por lo que debe efectuarse un secado previo. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN 3. Determinación de Nitrógeno no proteico Pesar con exactitud 0,5-1 gr de muestra y dispersarla en 10 ml de agua destilada. Agregar 10 ml de ácido tricloroacético 24%, homogeneizar y centrifugar. Tomar una alícuota de sobrenadante límpido y determinar N por el método de Kjeldahl. 4. Determinación de Nitrógeno álcali lábil: Método de Determinación de proteínas en leche por destilación directa. Kofranyi Es un método rápido basado en la liberación de amoníaco cuando la leche es calentada a ebullición en solución alcalina. La mayor parte del amoníaco liberado proviene de la rápida hidrólisis de glutamina y asparagina. MÉTODOS EXTRACTIVOS COLORIMÉTRICOS a) Método de Biuret La reacción se caracteriza por una coloración púrpura cuando los iones cúpricos son complejados por los enlaces peptídicos a pH alcalino. El matiz del color depende del tipo de proteína y su intensidad depende del contenido de proteína presente. Reactivo utilizado Solución alcalina conteniendo iones cúpricos complejados con tartrato de sodio y potasio. Lectura: 550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces. Ventajas No hay interferencia de aminoácidos libres Pequeña influencia de la composición del aminoácido en el desarrollo de color. La operación es simple y se puede manejar números grandes de muestras. Desventajas Interferencia de amoniaco, buffer, detergentes, etc. Baja sensibilidad. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN b) Método "dye-binding" Se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína coloreado e insoluble producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido sulfónico a pH 2. El anión coloreado se une por asociaciones electrostáticas a los sitios básicos de la proteína, por ejemplo, a los grupos Mamino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y aminos terminales. Además, se producen atracciones intermoleculares por interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la mitad no iónica del anión y entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del anión en solución. El coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de proteína. Lectura A 595 nm Consideraciones El método es empírico por lo que se debe buscar la concentración de tintura ideal que sature la proteína y forme el coágulo pero que no pierda sensibilidad. Ventajas Útil en análisis de rutina de muestras similares. Económico y rápido. Preciso como el método de Kjeldahl. Usado como método de referencia. Desventajas Dificultad en encontrar tinturas puras. Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricación a otro, por lo que se requiere la calibración del método con cada lote. No es aplicable a alimentos que varíen su contenido en grupos aminos (proteólisis, pardeamiento). BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN c) Método de Bradford Rango: 0.01-0.5 mg/ml Reactivos: Solución colorante: Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o Coomassie Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de ácido fosfórico 85% y 50 ml de etanol 95%. Una vez que el colorante se disolvió completamente, llevar a 1 litro con agua destilada fría. NaOH 1M. Procedimiento: Prender el espectrofotómetro 15 min antes de usarlo. Poner 20l de muestra en un tubo de hemólisis. Agregar 50l de NaOH 1N (alternativamente, el NaOH puede agregarse al reactivo de color en la relación 50l/ml). Agregar 1 ml de reactivo de color e incubar 5 min. Medir la absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o poliestireno.El azul brillante G- 250 se adhiere a la proteína. El colorante se torna de rojizo a azulado y el máximo de absorción del colorante cambia de 465 nm a 595 nm. El cambio en la absorbancia a 595 nm es proporcional a la concentración de proteína en la muestra. d) Método de Lowry Se basa en la reacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con las proteínas. Si bien el mecanismo de reacción no está bien dilucidado, se sabe que la tirosina, y en menor extensión la cisteína, la cistina, la histidina y las uniones peptídicas, reaccionan reduciendo al molibdato a azul de molibdeno. La reacción también puede producirse en presencia de tungstato, para generar azul de molibdeno y tungsteno. El complejo da un color azul característico que se mide a 745-750 nm. Los iones Cu2+ en medio alcalino facilitan la reacción de reducción del reactivo de Folin formando un complejo con la unión peptídica a través del nitrógeno involucrado en el enlace y reduciéndose a Cu1+. El Cu1+ y los residuos involucrados reducen entonces al reactivo de Folin generando el color característico. Interferencias: Fenoles excepto nitrofenoles y otras sustancias reductoras (mercaptoetanol, ditiotreitol, etc.) por reducción del reactivo de Folin. Glicina: por disminuir la intensidad del color desarrollado. Sustancias o buffers que acidifiquen el medio. Agentes quelantes del cobre. Rango: 0.05-0.4 mg/ml BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN Reactivos: Na2CO3 2% en NaOH 0.1N: Solución A CuSO4.5H2O 1.0% Tartrato de Na y K 2% Solución de Folin: Reactivo de Folin Ciocalteau diluido con agua destilada 1:1 Ventajas Alta sensibilidad Fácil de operar Fácil de manejar un gran número de muestras Desventajas La respuesta del color varía de acuerdo al tipo o composición de la proteína. Interfieren muchos compuestos Inestabilidad del reactivo Folin Ciocalteau a pH alcalino. La curva estándar no es lineal para altas concentraciones de proteínas por lo tanto es necesario diluir mucho antes de medir. e) Determinación de Nitrógeno amínico: Método de Sorensen Sirve para determinar N amínico en muestras líquidas o extractos. La finalidad es poder determinar la concentración de amoníaco o grupos amino libre de aminoácidos, péptido y proteínas. Es útil para dosar aminoácidos libres en jugos de fruta, el grado de hidrólisis de una proteína, o amonio después de la destrucción de materia orgánica en el método de Kjeldahl, etc. Determinación: Neutralizar 10 ml de muestra con NaOH 0,1 N usando fenolftaleína como indicador. Es importante no excederse en el agregado de NaOH, detenerse en el punto en que aparece una débil coloración rosada que persiste por 30 seg. Otra posibilidad es utilizar un pH neutro y llegar a pH 8. Agregar 10 ml de formol neutralizado recientemente con fenolftaleína y titular de inmediato la acidez liberada con NaOH 0,1 N hasta ver el punto final. Tomar este último valor para el cálculo de N amínico y el primero para el cálculo de la acidez. Cálculo: g %N = VNaOH NNaOH 0,014 x 100/peso de muestra BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN MÉTODOS INSTRUMENTALES PARA DETERMINAR PROTEÍNA 1. Espectroscopia infrarroja La espectrofotometría en el IR es una valiosa técnica para la identificación y determinación de aminas primarias y secundarias en presencia de aminas terciarias en mezclas. Los análisis por lo general se llevan a cabo en disoluciones de tetracloruro de carbono y en celdas de 10 cm. Las aminas primarias se determinan directamente midiendo la absorbancia de una combinación de la banda de tensión N-H alrededor de 5000 cm-1 (2.0 μm); en esta región no absorben ni las aminas secundarias ni las terciarias, estas tienen varias bandas de absorción superpuestas en la zona de 3300 a 10 000 cm-1 (1 a 3 μm), debido a las vibraciones de tensión N-H y sus sobretonos, mientras que las aminas terciarias no pueden presentar estas bandas. De este modo, una de esas bandas permite hallar concentración de la amina secundaria después de corregir la absorción por la amina primaria. Ventajas Rápido, análisis de multicomponentes No destructivo. Desventajas Interferido por agua. Proceso de calibración complejo. 2. Espectroscopia infrarroja reflectante La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja (0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada. Consideración Es necesaria la calibración contra un conjunto de muestras estadísticamente significativas, analizadas por métodos de referencia tradicionales. Ventajas Rápido, análisis de multicomponentes. Aplicable a materiales sólidos. Cuantifica proteína en presencia de agua. Desventajas Interfieren almidones y lípidos. Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en las partículas. Proceso de calibración complejo. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN 3. Espectrofotometría ultravioleta Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los anillos aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm. Ventajas Rápido, no destructivo. Útil para monitorear eluentes en columnas cromatográficas. Desventaja Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos). 4. Métodos refractométricos Mide la refracción directa de la proteína en solución o el cambio de índice de refracción causado por la remoción de la proteína de la solución. 5. Método turbidimetrico La turbidez producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los precipitantes comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido sulfosalicílico y ferrocianuro de potasio en ácido acético) para proteínas en bajas concentraciones se puede utilizar como un índice de la concentración de proteínas. Las técnicas turbidimétricas son rápidas y convenientes, sin embargo las principales desventajas que presentan es que las proteínas difieren en la velocidad de precipitación así como no permiten diferenciar entre proteínas y compuestos insolubles en ácidos tales como ácidos nucleicos. (Layne, 1957) 6. Espectroscopia electrónica Irradiación del material con rayos X y cuantificación de los fotoelectrones liberados característicos al átomo de N del grupo amida de la proteína. Ventajas Buena correlación con contenido de N total. Pueden determinarse simultáneamente otros grupos de interés (grupos sulfuras de aminoácidos). BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN 7. Absorción a 280 nm. La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm., la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptófano. La cuantificación de proteínas basada en la absorción en la región de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la determinación. Se toma en cuenta la absorción del disolvente, ya que este puede absorber en la misma región. Este método sufre interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una comparación con una proteína estándar, de la que se debe conocer su composición. (Nollet, 1996) Ventajas Rápida y no destructiva Alta sensibilidad Baja dependencia de la respuesta de la señal a la composición del aminoácido. Baja interferencia de ácidos nucleicos y nucleótidos. Desventajas La interferencia de otros compuestos que absorben en UV. Se necesita usar muestras limpias y lámparas relativamente nuevas. III. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE LA PROTEINA Los resultados de la proteína se expresaron como porcentaje (%) de nitrógeno que contiene la muestra multiplicado por el factor proteínico BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN IV. PRINCIPALES MÉTODOS PARA DETERMINAR GRASAS Método de Extracción de Rose-Gottlieb Métodos butirométricos Método de Goldfish Método de Bligh – Dyer Método de Gerber Método de Mojonnier Índice De Refracción Índice De Acidez Índice de Peróxidos Índice de yodo Determinación del Contenido de Grasas Sólidas (SFC) en Grasas Comestibles utilizando el analizador de RMN Spin Track Espectroscopia de reflectancia en el Infrarrojo cercano 1. Método de extracción intermitente (método Soxhlet) En este procedimiento se emplea un equipo diseñado de modo que una porción fresca del solvente esté en contacto con la muestra por un tiempo relativamente largo. Uno de los aparatos más usualmente empleados para realizar esta determinación es el llamado equipo Soxhlet, el cual consta de un tubo extractor provisto de un sifón y una tabuladora lateral. Dicho extractor está conectado por su extremo inferior, a través de uniones esmeriladas a un balón en el cual se coloca el solvente (generalmente éter de petróleo o éter etílico); mientras que en el extremo superior se ajusta un condensador vertical que actúa como refrigerante. En el tubo extractor se coloca un dedal poroso que contiene la muestra y permite la entrada del éter al tiempo que un tapón de algodón impide la salida del sólido. El equipo se coloca en una fuente de calor a la temperatura de ebullición del solvente, el cual se evapora, asciende por la tabuladora lateral del extractor, se condensa en el refrigerante y cae sobre la muestra acumulándose en el tubo extractor y atravesando las paredes porosas del dedal para hacer contacto con la muestra y solubilizar las grasas presentes. Cuando el nivel del solvente en el tubo extractor sobrepasa el nivel del sifón, el extractor se descarga y pasa al balón el éter conteniendo la grasa extraída, para a partir de ese instante, dar comienzo nuevamente el ciclo de evaporación del solvente, condensación, caída sobre la muestra, acumulación en el aparato de extracción y descarga. Una vez que el equipo ha estado funcionando el tiempo especificado para cada tipo de alimento (nunca menor de 2 horas), el solvente se elimina del balón por evaporación, quedando entonces en este último el residuo lipídico extraído, el cual se determina por diferencia de pesada entre la masa del balón que contiene el residuo y la masa del balón vacío, previamente tarado. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN Los resultados se expresan en porciento según: % 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 = 𝐦(𝐠𝐫𝐚𝐬𝐚) 𝐦(𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚) % 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 = 𝐦(𝐛𝐚𝐥ó𝐧 𝐠𝐫𝐚𝐬𝐚) − 𝐦(𝐛𝐚𝐥ó𝐧 𝐯𝐚𝐜í𝐨) 𝒙𝟏𝟎𝟎 𝐦(𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚) El método Soxhlet se emplea para determinación de grasa cruda o extracto etéreo libre en productos sólidos, tales como cárnicos, cereales, frutas y vegetales y otros de naturaleza similar. 2. Método de Extracción de Rose-Gottlieb Este método se basa en la extracción de la grasa a partir de una solución alcohólico amoniacal con éter etílico y éter de petróleo, seguido de una evaporación del solvente y posterior pesada del residuo lipídico. En este procedimiento la muestra se coloca en un matraz de extracción provisto de un tapón de vidrio esmerilado, al cual se añade una mezcla alcohólico amoniacal y luego una cierta cantidad de éter etílico. Se cierra el extractor y se agita la mezcla durante un minuto para acelerar el proceso de solubilización de las grasas en el éter. Posteriormente el matraz se deja en reposo al menos por 2 horas o se centrifuga durante 5 minutos a 500-600 rpm hasta que la capa de éter etílico esté totalmente límpida y separada de la fase acuosa. Luego se trasvasa la fase etérea, por decantación a un erlenmeyer o matraz de fondo plano y se realiza una segunda extracción sobre la fase acuosa añadiendo éter de petróleo y siguiendo el procedimiento arriba indicado. La capa etérea se trasvasa al mismo erlenmeyer de la primera extracción y el solvente se elimina por destilación y posterior secado en estufa. Finalmente, el erlenmeyer conteniendo la grasa se pesa en balanza analítica y los resultados se expresan en porciento según: 𝐦(𝐠𝐫𝐚𝐬𝐚) % 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 = 𝐦(𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚) % 𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂 = 𝐦(𝐛𝐚𝐥ó𝐧 𝐠𝐫𝐚𝐬𝐚) − 𝐦(𝐛𝐚𝐥ó𝐧 𝐯𝐚𝐜í𝐨) 𝒙𝟏𝟎𝟎 𝐦(𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚) El método de extracción de Rose-Gottlieb se emplea para muestras líquidas y encuentra su mayor aplicación en la determinación de grasas en leches naturales, pasteurizadas, esterilizadas, evaporadas, condensadas, concentradas y leche en polvo. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN Los solventes utilizados y el número de extracción que se realiza pueden variar en función del tipo de producto. Así mismo en casi todos los casos suele realizarse un ensayo en blanco, cuya magnitud debe restarse al peso del residuo lipídico obtenido durante la extracción en la muestra. Las diferencias fundamentales entre este procedimiento y la extracción con el equipo Soxhlet radican en que aquí no se recircula el solvente de extracción y el tiempo de análisis se reduce considerablemente. 3. Métodos butirométricos Los métodos butirométricos se fundamentan en la liberación de la grasa presente en la muestra por adición de ácido sulfúrico que hidroliza las sustancias proteicas. La fracción lipídica así liberada se separa por centrifugación y se mide directamente la altura de la columna de grasa separada en la escala graduada de un instrumento. El procedimiento de determinación consiste en añadir al butirómetro, que contiene la muestra previamente medida, ácido sulfúrico concentrado y alcohol isoamílico. El butirómetro se cierra con un tapón de goma y se agita vigorosamente hasta la total disolución de la fase proteica. Se calienta entonces la mezcla en baño de agua (60-70ºC) durante 15-20 minutos y se centrifuga por espacio de 3-5 minutos a 8001000 rpm para separar la fase lipídica. Finalmente se coloca de nuevo el instrumento en baño de agua (60- 70ºC) durante 5 minutos y se lee directamente el porciento de grasa en la escala del butirómetro. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN 4. Método de Goldfish Es una extracción continua con un disolvente orgánico. Éste se calienta, volatiliza para posteriormente condensarse sobre la muestra. El disolvente gotea continuamente a través de la muestra para extraer la grasa. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso entre la muestra o la grasa removida (Nielsen, 2003). Colocar un vaso para Goldfisch en la estufa a 100ºC hasta peso constante, aproximadamente 2 horas. Pesar de 4 a 5 g de muestra sobre un papel, enrollarlo y colocarlo en un cartucho de celulosa, tapar con un algodón. Situar el cartucho en un recipiente con el fondo perforado y colocarlo en el sostenedor del equipo. Adicionar en el vaso para Goldfisch aproximadamente 40 mL del disolvente éter etílico) y colocarlo en el equipo mediante un anillo de hierro con empaque de hule. Subir la parrilla girando hacia un lado y al contrario. Calentar hasta la extracción completa de la grasa. Para verificar que se ha extraído toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el disolvente no debe dejar residuo de grasa Al finalizar, cambiar el sostenedor del cartucho por un recipiente sin perforación y calentar de nuevo para recuperar el disolvente del vaso. Quitar el vaso del equipo y secar el extracto en una estufa a 100ºC por 30 min., enfriar y pesar. Calcular el porcentaje de grasa. (Pomeranz, 2000) BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN 5. Método de Bligh – Dyer El método de Bligh – Dyer así como su modificación por Hanson y Olley proporciona un método rápido para la extracción de lípidos de tejidos y productos alimenticios que contienen una cantidad significativa de agua. El método se basa en la homogenización de la muestra con cloroformo, metanol y agua en proporciones tales que se forme una sola fase miscible con el agua de la muestra. Al añadir alícuotas de cloroformo y agua se logra la separación de fases. El material lipídico se encuentra en la fase no acuosa, mientras que el material no lipídico se encuentra en la fase acuosa. Los lípidos se pueden extraer de 2 gr de muestra seca hasta 20 gr de muestra húmeda. El contenido de agua de la muestra se ajusta a 16 ml para conservar la proporción de cloroformo, metanol y agua la cual es esencial si se pretende una separación de fases y una extracción cuantitativa de lípidos. La ventaja de este procedimiento es que las etapas de filtrado y lavado son eliminadas. Sin embargo no es un método muy cuantitativo y tiene un elevado margen de error para muestras secas de cereales. (Rossell y Pritard, 1991). 6. Método de Gerber Éste, así como los demás métodos volumétricos presentan un carácter un tanto cuanto empírico ya que varios factores afectan la gravedad específica de la grasa separada, variaciones propias de la grasa, ácidos grasos presentes, solubilidad de la grasa en los disolventes, etc. Con estos métodos volumétricos la muestra se sitúa en un butirómetro y se descompone utilizando ácidos o álcalis de manera que la grasa es liberada, esta se separa por métodos mecánicos (centrifuga) y se colecta en el cuello calibrado. (Boekenoogen, 1964) 7. Método de Mojonnier La grasa es extraída con una mezcla de éter etílico y éter de petróleo en un matraz de Mojonnier, la grasa extraída se pone a peso constante y es expresada en porcentaje de grasa por peso. La prueba de Mojonnier es un ejemplo de extracción discontinua con disolvente. Esta extracción no requiere remover previamente la humedad de la muestra. (Nielsen, 1998) BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN 8. Índice De Refracción Es el cambio de dirección que experimenta una onda al pasar de un medio a otro distinto. Es una constante que depende del carácter y del estado de la sustancia analizada. En general los Índices de refracción de las sustancias grasas oscilan entre 1.4600 y 1.5000 a más o menos 15 o 20 grados centígrados. Como es una constante es importante tanto para identificar como para el análisis cuantitativo. Además, está relacionado con el peso molecular y la instauración. Es un índice rápidamente determinable y es muy útil para seguir un proceso de hidrogenación y sirve para determinar el IY. El aumento de la temperatura y de los ácidos grasos libres baja el Índice de Refracción. Para los aceites la determinación se hace a 25 grados centígrados, para las grasas parcialmente hidrogenadas a 40, para grasas hidrogenadas a 60 y para ceras a 80. Se pueden hacer las determinaciones a otras temperaturas, pero se deben hacer las correcciones. Si es un aceite se suma si la temperatura es mayor de 25 grados y el factor es 0.000385, igualmente se resta si la temperatura es menor de 25 grados. Si es una grasa se emplea el factor 0.000365.y se suma o resta de igual forma. Para hacer esta medición se emplea el refractómetro de ABBE con escalas de 1.3 a 1.7. Si el equipo permite calibrar la temperatura se debe hacer antes de empezar el análisis. 9. Índice De Acidez El índice de acidez se define como los miligramos de NaOH o KOH necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en 1 gramo de aceite o grasa, y constituye una medida del grado de hidrólisis de una grasa. Todos los aceites y las grasas tienen ácidos grasos libres y algunos los tienen en grandes cantidades. La causa de la existencia de ácidos grasos libres es la actividad enzimática de las lipasas. Todas las semillas y los frutos oleaginosos tienen presentes algunas de estas enzimas lipolíticas que se encuentran tanto en el embrión como en el mesocarpio del fruto. Por este motivo, el aceite de arroz y el de palma, por lo general, tienen una acidez muy alta. Hidrolíticas. Los aceites extraídos de semillas descompuestas tienen acidez alta, al igual que los aceites almacenados durante mucho tiempo. El comportamiento del Índice de Acidez (expresado como % de Ácido Oleico) durante el almacenamiento en los aceites y grasas comestibles evidencia un incremento en una primera etapa, como resultado de la actividad enzimática de las lipasas, hasta alcanzar un valor máximo, a partir del cual comienza a disminuir. Esta disminución pudiera ser explicada por el hecho de que los ácidos grasos libres hayan comenzado a oxidarse a compuestos oxigenados, como por ejemplo los hidroperóxidos, por la acción de agentes químicos (oxígeno, temperatura, luz, trazas metálicas) o agentes bioquímicos (microorganismos, enzimas lipoideas) o la combinación de ambos, en función de las condiciones de almacenamiento y de la composición del aceite almacenado. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN Este comportamiento permite inferir que la determinación del Índice de Acidez no ofrece por sí sola información concluyente sobre el estado cualitativo de un aceite. Así, un valor bajo pudiera indicar: o bien que el producto está poco hidrolizado, o bien que el estado de deterioro es más avanzado y que parte de los ácidos grasos libres han comenzado a oxidarse. De ahí la necesidad de realizar otros análisis (Índices de Peróxidos, Yodo y Saponificación, entre otros), si se desea obtener información fidedigna del estado de un aceite o grasa 10. Índice de Peróxidos Se expresa como los mili equivalentes de oxigeno activo presentes en 1000 g de aceite o grasa, y nos proporciona información sobre el grado de oxidación de un aceite. En las primeras etapas de la rancidez oxidativa se producen diversos peróxidos que modifican las propiedades sensoriales de la grasa, por lo que la prueba del índice de peróxido sólo es representativa en las primeras etapas de la oxidación de grasas. 11. Índice de yodo El índice de yodo es una medida del grado de insaturación de los componentes de una grasa. Será tanto mayor cuanto mayor sea el número de dobles enlaces por unidad de grasa, utilizándose por ello para comprobar la pureza y la identidad de las grasas (p.e., el índice de yodo del ácido oleico es 90, del ácido linoleico es 181 y del ácido linolénico 274). A la vez que los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados se determinan también las sustancias acompañantes insaturadas, por ejemplo, los esteroles. El yodo por sí mismo no reacciona con los dobles enlaces. En su lugar se utilizan bromo o halogenuros mixtos como ICl o IBr. El método recibe distintos nombres dependiendo del reactivo empleado. La adición de halógenos a los dobles enlaces depende de la constitución y configuración de los compuestos insaturados, del tipo de halógeno y de disolvente, así como delas condiciones externas. La reacción no es cuantitativa. Por ello, para que los resultados sean repetibles, hay que establecer exactamente unas condiciones de trabajo estandarizadas e indicarla metodología utilizada. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN MÉTODOS INSTRUMENTALES PARA DETERMINAR GRASA 1. Determinación del Contenido de Grasas Sólidas (SFC) en Grasas Comestibles utilizando el analizador de RMN Spin Track La determinación del contenido de Grasas Sólidas por RMN se basa en la medición directa de la proporción entre las fases sólidas y líquidas de la muestra. Después de la excitación de la muestra al aplicar un pulso de RF de 90o una FID (Decaída de Inducción Libre) es generada. La FID es la señal que se forma durante el proceso de relajación de los protones (hidrógenos) al volver éstos a su estado de equilibrio. La FID contiene contribuciones de las dos fases (sólida y líquida). Los protones de la fase líquida son más rápidos que los protones de la fase sólida causando la caída de la señal de la fase sólida antes de la caída de la fase líquida. La información aportada por las dos fases de la FID es de gran importancia al calcular el contenido SFC. Fig. 1. Determinación del SFC usando el FID El valor SFC se determina mediante dos puntos de medida en la FID. La amplitud de la FID en el punto S corresponde a la totalidad de los protones en ambas fases, sólida y líquida, mientras el punto L corresponde a los protones de la fase líquida sola. La proporción específica se calcula utilizando la formula enseñada en Fig. 1. Esta proporción se considera como el valor SFC de la muestra. El factor-F (f) permite predecir el valor de la amplitud de la FID inmediatamente después del pulso RF de 90o que es imposible medir directamente debido al tiempo muerto. El factor-F aumenta la precisión de los análisis y se determina su valor durante el procedimiento de calibración. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN El volumen de la muestra es de 1-3 ml. El ciclo para el análisis SFC es de una curva de fundición de 6 puntos mediante el uso de contenedores especiales, controlados por termostatos, para las muestras: La muestra a analizar se funde a 80 – 100°C y mantenida durante 15 min. Se prepara 6 muestras. La temperatura de todas las muestras se mantiene a 60oC durante 5-15 min. La temperatura de todas las muestras se mantiene a 0oC durante 60 min. Cada muestra se mantiene a una temperatura requerida para el análisis (típicamente 10oC / 15oC / 20oC / 25oC / 30oC / 35oC) durante 30 - 35 min. Cada muestra se introduce en la sonda e inicia el proceso de su análisis. El ciclo completo requiere 110 minutos. El análisis del SFC por RMN no necesita más de 6 segundos. También es posible utilizar una sola muestra para todo el ciclo, pasando por las diferentes temperaturas, pero no es muy recomendable porque requiere casi doble el tiempo. 2. Espectroscopia de reflectancia en el Infrarrojo cercano La espectroscopia en el infrarrojo cercano se ha convertido en una técnica importante para la determinación rutinaria de los constituyentes en sólidos finamente divididos. De hecho, es ampliamente utilizada en la determinación de proteínas, humedad, almidón, aceites, lípidos y celulosa en productos agrícolas tales como granos y aceites de semillas. En la espectroscopia de reflectancia en el Infrarrojo cercano la muestra finamente pulverizada se irradia con una o más bandas de radiación de longitud de onda comprendida entre 1 y 2.5 μm, o 10 000 y 4000 cm-1. Se produce una reflectancia difusa, en la que la radiación penetra a través de la superficie de la capa de partículas, excita los modos de vibración de las moléculas del analito, y luego se dispersa en todas las direcciones. De este modo, se produce un efecto de reflectancia que depende de la composición de la muestra. V. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE LAS GRASAS Los resultados se informan en % de materia grasa en base seca o húmeda. Índice de Acidez (expresado como % de Ácido Oleico) BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN VI. PRINCIPALES METODOS PARA DETERMINAR MINERALES Determinación de cenizas en seco Determinación de cenizas en húmedo Método Mohr (Determinación de cloruros) Método AOAC 944.02 (Determinación de hierro) Determinación de calcio (Método AOAC 944.03). Titulación con permanganato Determinación de calcio (Método NOM-187-SSA1/SCFI-2002). Formación de complejo con EDTA. DETERMINACIÓN DE CENIZAS El valor principal de la determinación de cenizas (y también de las cenizas solubles en agua, la alcalinidad de las cenizas y las cenizas insolubles en ácido) es que supone un método sencillo para determinar la calidad de ciertos alimentos, por ejemplo en las especias y en la gelatina es un inconveniente un alto contenido en cenizas. Las cenizas de los alimentos deberán estar comprendidas entre ciertos valores, lo cual facilitará en parte su identificación. (Kirk et al, 1996) En los vegetales predominan los derivados de potasio y en las cenizas animales los del sodio. El carbonato potásico se volatiliza apreciablemente a 700°C y se pierde casi por completo a 900°C. El carbonato sódico permanece inalterado a 700°C, pero sufre pérdidas considerables a 900°C. Los fosfatos y carbonatos reaccionan además entre sí. (Hart, 1991) Para la determinación de cenizas se siguen principalmente 2 métodos, en seco y vía húmeda. 1. Determinación de cenizas en seco La determinación en seco es el método más común para cuantificar la totalidad de minerales en alimentos y se basa en la descomposición de la materia orgánica quedando solamente materia inorgánica en la muestra, es eficiente ya que determina tanto cenizas solubles en agua, insolubles y solubles en medio ácido. En este método toda la materia orgánica se oxida en ausencia de flama a una temperatura que fluctúa entre los 550 -600°C; el material inorgánico que no se volatiliza a esta temperatura se conoce como ceniza. (Nollet, 1996) Ventajas: Es simple No se requiere atención durante la generación de cenizas No se requieren reactivos Se pueden manejar muchas muestras es un método estándar para la determinación de cenizas. Se puede determinar cualquier tipo de materia inorgánica. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN Desventajas: Se requiere alta temperatura El equipo es caro Hay perdidas por volatilización Hay interacciones entre minerales y recipientes Hay absorción de elementos traza por recipientes de porcelana o sílice Poca utilidad para análisis de Hg, As, P y Se. Calentamiento excesivo puede hacer ciertos componentes insolubles Hay una dificultad de manejo de cenizas por ser higroscópicas, sensibles a la luz. 2. Determinación de cenizas en húmedo. La determinación húmeda se basa en la descomposición de la materia orgánica en medio ácido por lo que la materia inorgánica puede ser determinada por gravimetría de las sales que precipiten, y también por algún otro método analítico para las sales que permanezcan en disolución acuosa o ácida. Para la determinación húmeda se dan cenizas alcalinas, ácidas y neutras y esto se basa en el tipo de anión o catión ya sea metálico o complejo de tal forma hay minerales como tartratos, citratos que producirán cenizas con un carácter alcalino. Es necesario tomar en cuenta que también un índice de alcalinidad de cenizas es muestra del contenido de carbonatos en disolución acuosa. Las ventajas y desventajas de estos métodos se muestran en la tabla 2. (Nollet, 1996) Ventajas: Relativamente no se requiere alta temperatura El dispositivo es simple La oxidación es rápida Se mantiene la disolución acuosa lo cual es bueno para análisis mineral El equipo no es caro No hay volatilización de minerales Desventajas: Se requieren altas cantidades de materiales corrosivos Se requieren ácidos explosivos Se requiere estandarizar los reactivos Las reacciones son fumantes Manejar sistemáticamente varias muestras no es sencillo El procedimiento es tedioso y gasta mucho tiempo BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN 3. Método Mohr (Determinación de cloruros) El método se utiliza para determinar iones cloruro y bromuro de metales alcalinos, magnesio y amonio. La valoración se hace con solución patrón de nitrato de plata. El método se basa en la formación de un precipitado ladrillo proveniente del cromato de plata formado a partir del precipitado de cloruro de plata, una vez que todo el Cl- haya reaccionado con el nitrato de plata. (Nielsen, 1998) Cl-+ Ag+ AgCl (Precipitado blanco) + 2 Ag + CrO4= AgCrO4 (Precipitado rojo ladrillo) La solución debe tener un pH neutro o cercano a la neutralidad. Un pH de 8.3 es adecuado para la determinación. Medir 10 mL de una solución al 1% de su muestra en un matraz Erlenmeyer de 150 mL, adicionar 15 mL de agua destilada y 1 mL de cromato de potasio al 5%, posteriormente titular con una solución patrón de nitrato de plata 0.1N hasta que aparezca un precipitado seguido de un color rojo ladrillo que permanezca por lo menos 30 segundos. NOTA. En caso de que la solución problema presente sólidos en suspensión filtre antes de realizar la determinación. EN CENIZAS: Obtener por calcinación a 500-550°C las cenizas. En un matraz cónico o en crisol de porcelana blanca lavar las cenizas con un mínimo de agua. Agregar 1 mL de solución de cromato de potasio al 5% y titular con solución 0.1M de nitrato de plata hasta que aparezca un color naranja. 4. Método AOAC 944.02 (Determinación de hierro) La ortofenantrolina reacciona con el Fe2+ ,originando un complejo de color rojo característico (ferroína) que absorbe notablemente en las regiones del espectro visible de alrededor de 505 nm. El Fe 3+ no presenta absorción a esa longitud de onda y debe ser reducido a Fe 2+ mediante un agente reductor apropiado, como la hidroxilamina, (en forma de clorato para incrementar su solubilidad). (Boumans et al, 1997) La reducción cuantitativa de Fe3+ a Fe 2+ ocurre en pocos minutos en un medio ácido (pH 3-4) de acuerdo a la siguiente ecuación: 4 Fe 3+ + 2 NH2OH → 4 Fe 2+ +N2O + 4 H+ + H2O BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN Después de la reducción del Fe 3+ a Fe 2+ , se da la formación de un complejo con la adición de ortofenantrolina. En un medio acido la ortofenantrolina se encuentra en su forma protonada como ion 1,10-fenantrolin (FenH+). La reacción de complejación puede ser descrita por la siguiente ecuación: (La estructura química del complejo se muestra en la figura 2) Fe 2+ + 3 FenH+ → Fe(Fen)3 3+ + 3 H+ Fig. 2. Estructura química de la ferroína. Consiste en 3 moléculas de OP (ortofenantrolina) alrededor de un átomo central de Fe. Los átomos de carbono de la ferroína están representados con sombras grises. Los átomos de N están representados en blanco Dilución de las cenizas: Al crisol frío añadir con pipeta y en la campana 2mL de HCl concentrado para disolver las cenizas. Evaporar en la campana, enfriar añadir 1 mL de HCl conc. y 3.5 mL de agua destilada, con un agitador de vidrio tratar de disolver las cenizas en su totalidad. Pasar cuantitativamente el líquido en un matraz aforado de 50 mL. Volver a lavar el crisol con agua por dos o tres veces más, pasando los líquidos de lavado al matraz y después aforar. Cuantificación del fierro: Filtrar la solución de cenizas y tomar alícuotas de 10 mL. Desarrollar el color añadiendo en el siguiente orden: 1 mL de solución clorhidrato de hidroxilamina (al 10%) y agitar, 5 mL de buffer de acetatos (8.3 g de acetato de sodio anhidro y 12 mL de ácido acético en 100 mL) y agitar y 1 mL ortofenantrolina (0.1g en 80mL de agua destilada a 80°C, enfriar y aforar a 100 mL) y agitar. Dejar en reposo entre 10 y 15 min. Leer a 530 nm frente a un blanco preparado con agua tratada de la misma manera. Es muy importante añadir los reactivos en el orden descrito. La concentración de fierro se obtiene interpolando en una curva patrón preparada a partir de una solución de sulfato ferroso amoniacal (3.512 g de Fe(NH4)2(SO4)2*6H2O en agua con unas gotas de HCl y aforar a 500 mL, diluyendo 10 mL a 1 L) tratada de la misma forma, en concentraciones de 0.01 a 0.1 mg/mL de fierro. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN 5. Determinación de calcio (Método AOAC 944.03). Titulación con permanganato El Calcio se precipita a pH 4 como oxalato (si hay fosfato presente se puede eliminar con ácido acético), posteriormente el oxalato se disuelve en ácido sulfúrico liberando ácido oxálico el cual se titula con una solución valorada de permanganato de potasio. (James, 1999) Las reacciones involucradas son: 1. Precipitación del Calcio con Oxalato de Amonio. CaCl2 + (NH4)2C2O4 → 2NH4Cl + CaC2O4 2. Liberación del ácido oxálico por la acción del ácido sulfúrico sobre el oxalato de calcio CaC2O4 + H2SO4 → CaSO4 + H2C2O4 3. Titulación del ácido oxálico con permanganato de potasio 5H2C2O4 + 2KmnO4 + 3H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 10CO2 6. Determinación de calcio (Método NOM-187-SSA1/SCFI-2002). Formación de complejo con EDTA. Cuando se añade a una muestra conteniendo Calcio (o Magnesio), ácido etilendiaminotetracético (EDTA) o su sal, los iones se combinan con el EDTA. Se puede determinar Calcio en forma directa, añadiendo NaOH para elevar el pH de la muestra entre 12 y 13 unidades, para que el magnesio precipite como hidróxido y no interfiera, se usa además, un indicador que se combine solamente con el calcio (azul de hidroxinaftol). En el análisis de Calcio la muestra es tratada con NaOH 4N para obtener un pH de entre 12 y 13, lo que produce la precipitación del magnesio en forma de Mg(OH)2. Enseguida se agrega el indicador azul de hidroxinaftol que forma un complejo de color rosa con el ion calcio y se procede a titular con solución de EDTA hasta la aparición de un complejo color púrpura: Reacciones : Ca+2 + Mg+2 + NaOH (4N) --------->Mg (OH)2 + Ca+2 Ca+2 + Indicador (azul hidroxinaftol) ------> [azul hidroxinaftol- Ca++] (color rosa) [azul hidroxinaftol - Ca++] + EDTA --------> [ EDTA - Ca+2 ] + azul hidroxinaftol (color púrpura) A 50 mL de muestra se añaden 2 mL de solución de hidróxido de sodio 1N o un volumen suficiente para obtener un pH de 12-13 y una punta de espátula de indicador, y se valora con solución de EDTA 0,01M hasta viraje de rosa a púrpura. VII. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE LOS MINERALES Los minerales son expresados en mg; por ejemplo Calcio, Fosforo, Hierro etc. Y en ug o mcg como el Selenio, Manganeso, Cobre, Yodo, etc. BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN BIBLIOGRAFÍA García, N. Ramos y E. Ballesteros. (2005). Estudio comparativo de distintas técnicas analíticas (espectroscopía de NIR y RMN y extracción mediante Soxhlet) para la determinación del contenido graso y de humedad en aceitunas y orujo de Jaén. Grasas y Aceites, vol. 56, p. 220 - 227. H. fernandez. (2004|). Análisis Químico de los Alimentos. Métodos Clásicos. Universidad de La Habana Hart, Nolllet (2007 – 2008) .Laboratorio de alimentos departamento de alimentos facultad de quimica, UNAM. pág. 6 -39 file:///C:/Users/Mundo%20Pc/Desktop/NOVENO%20CICLO/ANALISIS%20POR%20INST RUMENTACION/FUNDAMENTOSYTECNICASDEANALISISDEALIMENTOS_12286.pdf M.Johnson. (2012). Cuantificación de proteínas. 2016-09-08, de Labome Sitio web: http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html N. Romero. (1997). Métodos de análisis para la determinación de nitrógeno y constituyentes nitrogenados en alimentos. En Producción y manejo de datos de composición química de alimentos en nutrición (p. 165 - 176). Santiago, Chile: FAO. Sitio web: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/ah833s/AH833S08.pdf Pearson, Nielsen ed. (2005).Analisis de alimentos fundamentos y tecnicas . pág. 7 - 26 file:///C:/Users/Mundo%20Pc/Desktop/NOVENO%20CICLO/ANALISIS%20POR%20INST RUMENTACION/METODOS/Analisis%20de%20Alimentos%20Fundamentos%20y%20Te cnicas-UNAM.pdf T. Groenewald, H. Köster. (2006). Espectroscopia de Infrarrojo Cercano (NIRs) - La técnica de análisis rápidos del futuro. 2006, de Balanceados - Piensos Sitio web: https://www.engormix.com/balanceados/articulos/espectroscopia-infrarrojo-cercanonirs-t26241.htm BROMATOLOGIA Y NUTRICIÓN
