ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL TEMA: APLICACIONES DEL BIOSURFACTANTE PRODUCIDO POR PSEUDOMONAS SPP. NOMBRE: SOFÍA MACÍAS CÓDIGO: 2733 ASIGNATURA: BIOTECNOLOGÌA AMBIENTAL NIVEL 7mo SEMESTRE FECHA DE ENTREGA: 21/01/2020 Riobamba-Ecuador ÍNDICE Págs. RESUMEN ...................................................................................................................................... 1 I. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1 II. REVISIÓN BILBIOGRÁFICA...................................................................................................... 2 II.I Biosurfactante ...................................................................................................................... 2 II.II Principales funciones de los biotensoactivos a nivel fisiológico ......................................... 4 II.III Respuesta de biosurfactantes producidos por Pseudomonas fluorescens para el control de la gota de la papa Phytophthora infestans........................................................................... 5 II.IV Isomerización y biodegradación de beta-cipermetrina por Pseudomonas aeruginosa CH7 ................................................................................................................................................... 6 II.V Remoción de metales pesados del ramnolípido producido por Pseudomonas aeruginosa PB 25....................................................................................................................... 7 II.VI Biosurfactantes en la industria petrolera .......................................................................... 9 III. CONCLUSIÓN ................................................................................................................... 10 IV. REFERENCIAS ................................................................................................................... 11 ÍNDICE DE FIGURAS Págs. Figura 1. Moléculas de dodecil éster sulfato de sodio.. ................................................... 3 Figura 2. Estructura básica de una micela de tensoactivo aniónico.. .............................. 4 Figura 3. Representación molecular de un mono-ramnolípido y un di-ramnolípido, por P. aeruginosa. . ..................................................................................................................... 7 ÍNDICE DE TABLAS Págs. Tabla 1. Cepas bacterianas seleccionadas para el estudio. .......................................................... 8 Tabla 2. Porcentaje de remoción de cadmio y plomo, por Pseudomonas aeruginosa PB25 al 0,1% p/v, frente a variaciones en el pH del medio. ............................................................................... 9 Tabla 3. Aplicaciones de los biosurfactantes en la industria del petróleo. ................................. 10 APLICACIONES DEL BIOSURFACTANTE PRODUCIDO POR PSEUDOMONAS SPP. RESUMEN El presente trabajo de revisión bibliográfica, busca dar una alternativa que sea mucho más amigable con el ambiente frente a los surfactantes de naturaleza química, implementado el uso de Biosurfactantes que son productos biológicos producidos mayormente por Pseudomonas spp, que ayudan reducir la tensión superficial del agua en la interface formando estructuras agregadas y de esta manera incrementar la solubilidad de compuestos hidrofóbicos. El campo de aplicación de estas moléculas es bastante amplio, siendo la biorremediación su fuerte, pues los biosurfactantes son capaces de actuar en diferentes zonas contaminadas, con hidrocarburos, metales pesados, plaguicidas y otros. Demostrándose su compatibilidad con el medio ambiente y una toxicidad casi nula representan una técnica compatible con el medio ambiente. I. INTRODUCCIÓN El tratamiento de zonas contaminadas por metales pesados, hidrocarburos de petróleo, uso excesivo de plaguicidas y otros contaminantes persistentes, requiere, generalmente del uso de sustancias sintéticas que si bien pueden ser altamente efectivas, poseen también un elevado grado de toxicidad, llegando incluso a ser destructivas para la estructura física, química o biológica de los suelos y aguas, por lo que en respuesta a esta problemática se ha optado por el uso de sustancias de origen biológico que ofrecen una nueva alternativa de solución amigable con el medio ambiente. Es así que los métodos biológicos están ganando importancia debido a su simplicidad, mayor eficiencia y rentabilidad en comparación con técnicas convencionales (Chandran & Das, 2011). Los biosurfactantes (BS) una buena alternativa, son un grupo de moléculas de origen biológico con propiedades similares a los surfactantes sintéticos, se caracterizan por ser anfipáticas, es decir que sus moléculas presentan dos partes diferentes una región hidrofílica formada por aminoácidos, péptidos (aniones o cationes), mono o polisacáridos, y una región hidrofóbica, que consiste de ácidos grasos saturados e insaturados, característica que les permite reducir la tensión superficial del agua en la interface formando estructuras agregadas denominadas micelas, entre dos líquidos 1 inmiscibles, incrementando la solubilidad de compuestos hidrofóbicos en un medio acuoso. Cabe destacar que los BS son un grupo estructuralmente diverso de moléculas tensoactivas, que presentan en general menor toxicidad y mayor biodegradabilidad que los surfactantes sintéticos (Jimenéz, Medina, & Gracida, 2010). Estas moléculas son producidas por diferentes microorganismos entre los que se destacan el géneros Pseudomonas, principalmente; por tener la capacidad de crecer en diferentes sustratos y nichos ecológicos, este grupo de bacterias tienen la capacidad de sintetizar mayormente glicolípidos especialmente ramnolípidos y lipopéptidos entre otros metabolitos secundarios que pueden ser secretados extracelularmente o estar unidos a la membrana celular, predominantemente durante la fase de crecimiento (Toribio, Velázquez, & Romero, 2014). Entre las aplicaciones más estudiadas de los BS están aquellas relacionadas con la industria del petróleo y la biorremediación de sitios o residuos contaminados con hidrocarburos y metales pesados. No obstante, los biosurfactantes pueden ser utilizados para otro tipo de compuestos xenobióticos, como es el caso de los plaguicidas. Estos compuestos permiten controlar la proliferación de plagas y enfermedades de los cultivos y del ganado, así como reducir o evitar las pérdidas en la producción de alimentos y contribuir al control de los vectores de diversas enfermedades (De la Rosa, Sánchez, & Ortiz, 2014). Gracias a sus características los biosurfactantes son una excelente alternativa para la remediación de sitios contaminados. Esta degradación se lleva a cabo por las reacciones mediante las cuales los microorganismos heterotróficos se nutren y captan la energía necesaria para satisfacer sus necesidades tomando como principal fuente de carbono al contaminante. II. REVISIÓN BILBIOGRÁFICA II.I Biosurfactante Los biotensoactivos llamados también biosurfactantes o agentes de superficie activa, son productos de origen biológico de naturaleza anfifílica. Con tenencia a localizarse en la interfase formando una capa monomolecular; lo cual provoca que la solución de BS este activa entre las fases hidrofóbica e hidrofílica. Esta ubicación impide el tráfico de 2 moléculas que van de la superficie al interior del líquido en busca de un estado de menor energía, disminuyendo así el fenómeno de tensión superficial (Martinez, 2011). Además, la presencia de tensoactivos en un medio acuoso incrementa la solubilidad en agua y disponibilidad de compuestos orgánicos, siendo ésta una de sus principales propiedades para su aplicación en el área de la biotecnología ambiental para la remoción y biodegradación de contaminantes (Jimenez, Medina, & Gracida, 2010). Según el tipo de disociación del grupo hidrofóbico, se denominan a los surfactantes como: catiónicos (amonio cuaternario), aniónicos (carboxilatos y sulfonatos), noaniónicos (polímero de óxido de etileno) y anfótericos (betainas y taurinas). Figura 1. Moléculas de dodecil éster sulfato de sodio. Fuente: (Martinez, 2011). Ademas de los surfactantes quimicos se encuentran los biosurfactantes, ambos compuestos comparten caracteristicas tensoactivas, sin embargo diferen en su estructura y en la forma de ser producidos. Los BS estan formados mayormente por azucares, peptidos y lipidos. Existen cuatro parámetros, la concentracion micelar critica (CMC), el número de agregación (na), el balance hidrofílico–lipofílico (HLB) y el punto de nube (PN), que caracterizan a los tensoactivos que se utilizan en la industria y el ambiente por sus capacidades para solubilizar compuestos poco solubles, formar emulsiones entre fases inmiscibles, humectar superficies hidrófobas y determinar la temperatura a la cual se da un cambio en las propiedades del tensoactivo. De esta manera, las características y capacidades para cada grupo de tensoactivos están directamente relacionadas con su estructura química, la cual le provee ventajas en un nicho industrial o ecológico particular (Ron & Rosenberg, 2011). 3 Figura 2. Estructura básica de una micela de tensoactivo aniónico. Fuente: (Jimenez, Medina, & Gracida, 2010). II.II Principales funciones de los biotensoactivos a nivel fisiológico Los microorganismos utilizan una amplia variedad de compuestos orgánicos como fuentes de carbono y energía para su crecimiento. Cuando estos sustratos son inaccesibles por su baja solubilidad, competencia con otros microorganismos u otro tipo de factor ambiental, utilizan a los biotensoactivos para disponer de la fuente de carbono. Las principales funciones de los biotensoactivos a nivel fisiológico son: • Capacidad para emulsificar y solubilizar compuestos insolubles en fases acuosas, como son los hidrocarburos, facilitando la disponibilidad de estos sustratos para el crecimiento y mantenimiento de los microorganismos. • Adherencia y liberación de células en superficies. Ésta es una de las más importantes estrategias de supervivencia de los microorganismos debido a la presencia de biotensoactivos en la parte externa de la membrana o pared celular. Estos biotensoactivos son responsables de regular las propiedades de la superficie celular, promoviendo la adherencia o liberación de las células de sitios específicos de acuerdo a sus necesidades nutricionales o para evadir ambientes desfavorables. • Facilitar el transporte de hidrocarburos a nivel de membrana, función atribuida a los biotensoactivos del tipo glicolipídico ligados a membrana celular. 4 • Actividad antibiótica, la que ha sido demostrada por varios biotensoactivos, principalmente los lipopéptidos y glicopéptidos. Ejemplos de éstos son los ramnolípidos de Pseudomonas aeruginosa y la surfactina de Bacillus subtilis, los cuales presentan actividad como antibióticos, lo que les permite solubilizar los principales componentes de las membranas celulares microbianas y les brinda una mayor oportunidad de supervivencia en nichos con una alta competitividad por nutrientes. II.III Respuesta de biosurfactantes producidos por Pseudomonas fluorescens para el control de la gota de la papa Phytophthora infestans. La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación (FAO) en 2002 define a un plaguicida como cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir, destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo los vectores de enfermedades humanas o de los animales, las especies de plantas o animales indeseables que causan perjuicio o que interfieren de cualquier otra forma en la producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, o que pueden administrarse a los animales para combatir insectos, arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos (De la Rosa, Sánchez, & Ortiz, 2014). El principal problema fitosanitario del cultivo de la papa en Colombia es la gota o Tizón tardío, causado por el Oomycete Phytophthora infestans de Bary por lo que es que es considerado un limitante en la producción de este; esta enfermedad es muy destructiva en épocas de alta humedad (superior al 90%) y en temperaturas entre los 12° C y 15° C, condiciones que permiten que el patógeno ocasione la muerte de hojas y tallos de la planta, y las infecciones de los tubérculos, logrando deteriorar la calidad y reducir su valor como producto final (Vaillant & Gómez, 2009). Por lo que se buscó una alternativa que permita controlar este patógeno y sea menos ofensiva con el medioambiente que los insecticidas convencionales, ya que le uso excesivo de estos afecta gravemente la salud humana y conjuntamente provoca el desarrollo de nuevos genotipos del patógeno con sensibilidad reducida a estos plaguicidas. Para los cual se aislaron dos cepas nativas de Psedomonas fluorescens (039T y 021V), provenientes de cultivos de papa, y se evaluó su reacción contra P. infestans. Las suspensiones bacterianas y los biosurfactantes parcialmente purificados (BPP), producidos por éstas (obtenidos en medio mínimo de sales con querosén), fueron 5 aplicados sobre foliolos desprendidos en ensayos in vitro y experimentos in vivo en plantas de papa, en condiciones controladas en casa de malla y los resultados demostraron la capacidad que tienen los biosurfactantes y las suspensiones bacterianas para controlar al patógeno, ya que el BPP 039T logró reducir el nivel de severidad de la enfermedad en 79,9% in vitro y 38,5% in vivo, mientras que el BPP 021V redujo en 78,7% in vitro y 30,2% in vivo. Las suspensiones bacterianas redujeron el nivel de severidad en 72,4% (039T) y 66,1% (021V) en las evaluaciones in vitro y 35% en los experimentos in vivo. Los resultados de esta investigación muestran el potencial que tienen los biosurfactantes para el control de la gota de la papa (Rivera, Martínez, Osorio, & Martínez, 2010). También se destacan en la agricultura, debido a su actividad insecticida y herbicida, los ramnolípidos producidos por Pseudomonas syringae son usados en el biocontrol de Canada thistle, y al trabajar junto con el hongo Myrothecium verrucaria también han sido empleados de manera simultánea como herbicidas en el control de Pueraria lobata un tipo de maleza o mala hierba (Hurrell, 2013) II.IV Isomerización y biodegradación de beta-cipermetrina por Pseudomonas aeruginosa CH7 Se aisló Pseudomonas aeruginosa CH7, del lodo activado, y se demostró que esta no solo fue capaz de isomerizar y degradar la beta-cipermetrina, sino también de utilizarla como la única fuente de carbono y energía para su crecimiento y producción de biosurfactantes. La cepa degradó efectivamente la beta-cipermetrina con una inocula de biomasa de 0.1–0.2 g L −1 a 25–35 ° C, pH 6–9, y una concentración final de beta cipermetrina 25–900 mg L −1. Mediante el análisis de la metodología de superficie de respuesta, se encontró que la condición óptima de temperatura era 29.4 ° C, pH 7.0 y una biomasa de inóculos de 0.15 g L −1. En estas condiciones, alrededor del 90% de la beta-cipermetrina logro degradarse en 12 días. Notablemente, se detectó biosurfactantes en el cultivo MSM de la cepa CH7, lo que sugiere que el biosurfactante (ramnolípido) podría potenciar en gran medida la degradación de beta-cipermetrina al promover la disolución, adsorción y absorción de los compuestos hidrófobos. Por lo tanto, CH7 puede servir como una cepa prometedora en la biorremediación de aguas residuales y suelos contaminados por beta-cipermetrina (Wang, Zhang, & Yan, 2011). 6 II.V Remoción de metales pesados del ramnolípido producido por Pseudomonas aeruginosa PB 25 Los ramnolípidos han sido ampliamente estudiados y cerca de 7 homólogos han sido identificados hasta el momento. Tensiones superficiales de 29 mN/m (mili Newtons/ metro) son características de este tipo de compuestos que pueden contener dos moléculas de ramnosa unidas al ácido α-hidroxidecanoico (di-ramnolípidos) o una sola molécula de ramnosa unida a un ácido graso idéntico (mono-ramnolípidos). Figura 3. Representación molecular de un mono-ramnolípido y un di-ramnolípido, por P. aeruginosa. Fuente: (Giraldo, Gutiérrez, & Merino, 2014). Dentro de la variedad de microorganismos productores de estas sustancias, los que mayor potencial aplicativo engloban son las especies pertenecientes al género Pseudomonas, las cuales típicamente producen biosurfactantes de naturaleza glicolipídica llamados ramnolípidos (Lovaglio, Dos Santos, Jafelicci, & Contiero, 2011). Los ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa pueden obtenerse a partir de diversos sustratos de bajo costo que van desde azúcares hasta hidrocarburos y pueden incluir compuestos tales como alcanos, piruvatos, citratos, fructosa, aceites vegetales, glicerol, glucosa, manitol e incluso mediante el uso de residuos agroindustriales o aceites vegetales reciclados usados como fuentes de carbono (Toribio, Velázquez, & Romero, 2014). Para el enfrentamiento entre El ramnolípido y los metales pesados, se utilizó concentraciones de 1000 ppm de plomo y 500 ppm de cadmio, en la forma de Pb(NO3)2 y 3(CdSO4).8H2O disueltas en agua bidestilada, y a una concentración del 0,1% (p/v) del 7 ramnolípido para cada caso. Posteriormente, dicha mezcla fue agitada durante 60 min a 120 rpm a temperatura ambiental para permitir la interacción entre las moléculas del ramnolípido y los iones metálicos. Luego del período de agitación, la mezcla fue filtrada a través de membranas de acetato de celulosa de 0,2 µm, luego de lo cual cada muestra fue enviada a analizar por espectroscopía de absorción atómica, para determinar la concentración final del metal removido en cada muestra. A continuación, las cepas bacterianas elegidas para evaluar su actividad emulsificante presentaron crecimiento en el medio Millis suplementado con crudo de petróleo, y su actividad emulsificante frente a crudo de petróleo, obteniéndose los siguientes resultados en la tabla 1: Tabla 1. Cepas bacterianas seleccionadas para el estudio. De acuerdo a los resultados obtenidos, se decidió utilizar la cepa Pseudomonas aeruginosa PB 25 para el resto del estudio, ya que esta fue la más eficiente. Los resultados de las pruebas para la evaluación de la capacidad de remoción de metales pesados en solución, muestran que valores elevados se obtienen con el uso de concentraciones del 0,1% p/v, motivo por el cual se utilizó esta concentración para las pruebas siguientes. Asimismo, es posible observar que las variaciones en el pH de la solución del metal favorecen la capacidad de remoción por parte del ramnolípido, consiguiéndose un valor máximo del 98% para el plomo a pH 9 y del 99% para el cadmio a pH 11. Con lo cual se demostró la eficiencia del ramnolípido producido por P. aeruginosa PB25 en la remoción de metales pesados como cadmio y plomo (Giraldo, Gutiérrez, & Merino, 2014). 8 Tabla 2. Porcentaje de remoción de cadmio y plomo, por Pseudomonas aeruginosa PB25 al 0,1% p/v, frente a variaciones en el pH del medio. II.VI Biosurfactantes en la industria petrolera Algunas de las tecnologías microbiológicas con aplicación en la industria del petróleo, incluyen la aplicación de bioproductos para la extracción y transporte de aceite, limpieza de tanques y tuberías; resaltando la importancia de los organismos que los producen, como posibles agentes a ser utilizados en protocolos de biorremediación o de recuperación del petróleo residual en los yacimientos (Jimenéz, Medina, & Gracida, 2010). Cuando el petróleo es derramado en sistemas acuosos, la solubilización y volatilización son mecanismos abióticos que actúan inicialmente, removiendo a los hidrocarburos polares y de bajo peso molecular. Sin embargo, la mayor parte de los hidrocarburos presentes en el petróleo son compuestos que, comparados con el agua, poseen una menor densidad, mayor peso molecular y una solubilidad baja. Por tal razón, después de un derrame, la mayoría de los hidrocarburos permanece en la superficie acuosa. Diversos microorganismos productores de biotensoactivos y degradadores de hidrocarburos se encuentran presentes en aguas marinas, por lo que la biodegradación resulta uno de los métodos más eficientes para la remoción de estos contaminantes (Raiger & López, 2009). Chakrabarty fue de los primeros en reportar como un microorganismo aislado de aguas marinas, una cepa de Pseudomonas aeruginosa (SB30), era capaz de producir un ramnolípido que dispersa rápidamente hidrocarburos en gotas muy pequeñas, lo que ha hecho de este microorganismo uno de los principales agentes bióticos para la remedición de costas contaminadas con hidrocarburos. 9 Tabla 3. Aplicaciones de los biosurfactantes en la industria del petróleo. III. CONCLUSIÓN Son varios las publicaciones científicas que afirman que los BS incrementan la biodisponibilidad mediante la solubilización de los compuestos orgánicos hidrofóbicos, con lo que además de no dañar el medio ambiente, representan un área de oportunidad para incrementar las posibilidades de éxito para la bioremediación de sitios contaminados, ya sea por hidrocarburos, metales pesados, plaguicidas u otros contaminantes persistentes. Por lo tanto, el uso de biotensoactivos muestran un mayor potencial frente los tensoactivos químicos para aplicaciones a nivel industrial y de Biotecnología Ambiental; gracias a sus características de Biodegradabilidad que les permiten tener propiedades emulsificantes y tensoactivas, su Baja Toxicidad que les permiten interactuar con el entorno sin alterar sus condiciones físicas, químicas y bilógicas, su Biocompatibilidad y Digestibilidad que les permiten ser fácilmente asimilables por otros organismos del sitio en que actúen, su gran Disponibilidad de Materias Primas ya que se pueden producir a 10 partir de materias primas baratas, renovables y fácilmente disponibles y por su alta Especificidad y Eficacia que les permiten actuar a temperaturas, PH y concentraciones de sal extremas, en las cuales fueron generados por microorganismos extremófilos que pueden actuar sin inconvenientes en el área que se desea Biorremediar. No obstante, la factibilidad en el uso práctico de los biotensoactivos está fuertemente limitada por sus altos costos de producción y purificación. En particular, la producción de biosurfactantes a partir de Pseudomonas y otras especies del mismo género está significativamente influenciada por el tipo y concentración de nutrientes como las fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y la presencia de ciertos elementos traza, así como de las condiciones de cultivo tales como pH, temperatura, agitación y tensión de oxígeno (Jimenez, Medina, & Gracida, 2010). IV. REFERENCIAS Bibliografía Chandran, P., & Das, N. (Mayo de 2011). Degradation of diesel oil by immobilized Candida tropicalis and biofilm formed on gravels. Biodegradation, 22(9), 1181-1189. Recuperado el 19 de Enero de 2020 De la Rosa, N., Sánchez, E., & Ortiz, L. (Octubre de 2014). Biosurfactantes y su papel en la biorremediación de suelos contaminados con plaguicidas. 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