Separación.- Se omitieron las moléculas de gas acarreador para no confundirlas con las de la muestra vaporizada. Cada color corresponde a una molécula diferente. Cada molécula se disolverá o repartirá de manera distinta en dicho líquido; las que más interaccionen con él se van quedando atrás, y las que no, avanzan con mayor rapidez. Consecuentemente, ocurre la separación de las moléculas, tal y como se aprecia con los puntos coloridos. Se dice entonces que los puntos o moléculas morados eludirán primero, mientras que los azules, saldrán de último. Así, se puede identificar cuáles son esas moléculas mediante la comparación directa de sus TR. La eficiencia de la columna es directamente proporcional a su capacidad de separar moléculas con afinidades similares por la fase estacionaria. Detección.- Finalizada la separación tal y como se observa en la imagen, los puntos eludirán y serán detectados. Para ello, el detector debe ser sensible a la perturbación o cambios físicos o químicos que ocasionen estas moléculas; y tras esto, responderá con una señal la cual se amplifica y representa a través de un cromatograma. Carbofurán, endosulfán, malatión y metamidofos El proceso de extracción usualmente involucra la homogenización de la muestra con un disolvente orgánico, solo o en mezcla, usando un homogenizador, mezclador o sonicador, conocida como extracción líquido-líquido o extracción sólido-líquido, dependiendo de la naturaleza de la muestra. Extracción con disolventes orgánicos. El proceso de extracción varía ligeramente dependiendo si la muestra es líquida o sólida. Las muestras sólidas se homogenizan antes de la extracción mediante la molienda, mezclado, agitado, aplastado, macerado, presurizado y pulverizado. Después, una porción se licúa o agita con un disolvente orgánico o con una mezcla de diferentes disolventes orgánicos. Después de agitar correctamente, puede centrifugarse y la fase orgánica se evapora para obtener un volumen pequeño, o a la fase orgánica se le agrega sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) para eliminar el agua presente en la muestra. En el primer caso, el residuo se re-disuelve en una mezcla de disolventes orgánicos y, posteriormente se inyecta en el sistema de GC. En el segundo caso, el Na2SO4 se separa, mediante la centrifugación o filtración, y el sobrenadante se concentra o inyecta directamente en el cromatógrafo de gases. El acetonitrilo es un disolvente polar, miscible en agua pero con suficientes propiedades dispersivas (hidrofóbicas) para extraer eficientemente tanto residuos de pesticidas polares como no polares desde alimentos no grasos. Los extractos de acetonitrilo contienen usualmente co-extraídos (pigmentos principalmente). Generalmente es necesario evaporar o concentrar el extracto para disminuir el volumen del disolvente. La concentración ayuda a reducir los límites de detección. Una vez obtenido el extracto orgánico, la mezcla de pesticidas se separa mediante técnicas instrumentales como cromatografía de gases (GC) o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La identificación y cuantificación de los pesticidas se realiza con detectores selectivos que se encuentran acoplados al equipo de GC ó HPLC. Las técnicas cromatográficas permiten una aproximación eficiente en el análisis de pesticidas. La espectrometría de masa (MS) generalmente se prefiere como detector y sus resultados típicamente son incuestionables. Las gambiertoxinas La extracción de los pescados para la determinación de CTXs mediante CBA se realizó de acuerdo con el protocolo de Lewis, 2003 (Lewis, 2003). Brevemente, 10 gramos de pescado, previamente homogenizados, eran cocinados a 70ºC, 10 minutos y extraídos en 30 mL de acetona mediante un ultraturrax. El homogenizado se centrifugaba (3000 g, 10 minutos) y, acto seguido, el sobrenadante se reservaba. El precipitado era extraído con acetona una vez más, tras lo cual ambos sobrenadantes se mezclaban y filtraban con filtros de Nylon de 0,45 μm. Para la extracción de lípidos se realizaba una doble partición con solventes orgánicos. Para ello el extracto en acetona era evaporado y al extracto seco se le añadía iguales volúmenes (5 mL) de una disolución acuosa de metanol (9:1 metanol: agua, v:v) y n-hexano. Después de 24 horas la fracción de hexano se descartaba y la partición se repetía. Después de ésta, las fracciones metanólicas se mezclaban y evaporaban. El residuo seco era otra vez sometido a una partición liquido: líquido con 5 mL de etanol: agua (1:3, v:v) y dietiléter, procediendo de manera similar a la anterior. En este caso, las fracciones éter eran reservadas, mezcladas y evaporadas. El residuo seco de las fracciones éter era entonces resuspendido en metanol 100% y guardado a 20ºC hasta su utilización. Para las extracciones y fraccionamientos todas las soluciones fueron previamente filtradas por 0,2 μm (incluido el agua miliQ) y aquellas empleadas en los HPLC, previamente desgasificadas en baño de ultrasonido. Para la determinación de la presencia de residuos de sulfametoxazol, norfloxacino, ciprofloxacino y lincomicina en pechuga de pollo se utilizó la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), fundamentado en que estudios realizados en todo el mundo (Izquierdo et al., 2010; Molero-Saras et al., 2006; Pérez et al., 2001; San Martín et al., 2000) reportan que esta técnica es uno de los instrumentos con la más alta eficiencia y sensibilidad en la detección de estos residuos en tejidos de pollos. Molero-Saras et al., (2006), menciona que el HPLC es el instrumento con mayor versatilidad, y esto es debido a su alta aplicabilidad, sensibilidad y eficiencia en una gran gama de análisis cuantitativos, en los que refiere a las sustancias farmacológicas (antibióticos). De esta manera, las condiciones cromatográficas y preparación de estándares y muestras fue de acuerdo a metodología propuesta por Guzmán et al., (2012). Preparación de la muestra 10 gramos de carne de pollo adicionadas con metanol al 5% fueron sometidas por 30 min a microfiltración para asegurar la completa dilución del antibiótico (Baño de ultrasonido Cole Parner 8853). A continuación, fue centrifugada (Centrifuga BectonDickinson, USA) por 10 min a 5000 rpm. Se toma el líquido sobrenadante y se pasa a un beaker que contiene 1 mL de solución Carrez I y solución Carrez II. Esta mezcla se agitó y centrifugó por 10 minutos, el sobrenadante se pasó por un cartucho de extracción de fase solida C-18, previamente acondicionada. La extracción del analito en el cartucho fue realizada por elución con 5 mL de metanol. La solución de metanol fue filtrada e inyectada en el equipo de cromatografía. Todas las muestras fueron preparadas por triplicado. Condiciones cromatografías Las separaciones fueron desarrolladas en una columna de 250X4.6 mm Phenomenex Synergi Polar-RP Column (Phenomenex, USA). La fase móvil consistió en una mezcla de 85% de fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4) 20 mM, 15% de acetonitrilo (ACN) a un flujo de 1,5 mL/min y una longitud de onda de detección de 210 nm. El volumen de inyección de la muestra fue de 20 μL. El equipo utilizado fue un cromatógrafo líquido (BAS SS60) equipado con una bomba ternaria e inyección manual y un detector UV-VIS (BAS) de longitud de onda variable. Validación metodológica-Técnicas de HPLC El coeficiente de correlación lineal fue de 0,985 para sulfametoxazol, 0,986 para norfloxaciono, 0,985 para ciprofloxacino y 0,988 para lincomicina. El límite de cuantificación en el músculo de pollo fue de 0,0120 mg/g para sulfametoxazol, 0,0445 mg/g para norfloxaciono, 0,0567 mg/g para ciprofloxaciono y 0,0472 para lincomicina. Los límites de detección en el músculo de pollo fue de 0,0036 g/g para sulfametoxazol 0,0109 g/g para norfloxaciono, 0,0182 g/g para ciprofloxacino y 0,0168 g/g para lincomicina. Los promedios de recuperación obtenidos fueron para sulfametoxazol: 74-85% RSD 5,86%; norfloxaciono: 67-85% RSD 5,82%; ciprofloxacino 69-89% RSD 8.66% y 78 -90% RSD 6,66% para lincomicina.
