elusion

INMUNOFLUORESCENCIA
 Identificar y localizar Ag en el interior o
superficie de la célula
 Fluoresceina fijado a una molécula de Ac
 Métodos directos e indirectos
 Actualmente :CMF:cuantificar hemorragia
maternofetal,identificar cél transfundidas y
seguimiento de la supervivencia
ENZIMOINMUNOANÁLISIS
 Medir Ag o Ac
 Fosfatasa alcalina puede unirse a moleculas de Ac
sin destruir su especificidad
 Utilizada para unir Ig unida a GR y demostrar
hemorragia fetomaterna
PRUEBA DE ADHERENCIA DE
GR EN FASE SÓLIDA




PRUEBA DIRECTA:
Ac fijado a la microplaca y se agregan GR
(+) GR se adhieren a los bordes
(-) GR se asientan en los bordes
 PRUEBA INDIRECTA
 GR con Ag conocido unidos a una placa pretratada con
glutaraldehido y poli-lisina, Ac especifico
 Se agrega suero ,incubar,lavar proteinas remanentes
 Indicador para el Ac fijado GR recubiertos con IG
 Interpretación : Idem
PRUEBA DE ADHERENCIA DE
GR EN FASE SÓLIDA
PRUEBA DE GEL
 Utiliza microtubos contenidos en una tarjeta de
gel.Este formato permite la centrifugación simultánea
de los tubos(6) en equipos especialmente diseñados
 La incubación del Ac con los GR en suspención se
realiza en la parte superior del tubo ,luego se
centrifuga para que los GR entren en contacto con el
As que baña el gel
 Los geles actúan como filtro,reteniendo los aglutinados
y dejando pasar los GR libres que se depositan en el
fondo
EXISTEN 3 FORMULACIONES BÁSICAS
DEL GEL
 Gel neutro:
 Solo contiene la matriz del gel-sephadex
para
detección deaglutinados producidos por Ac
aglutinantes
 Prueba inversa ABO,investigación de Ac frios y
pruebas enzimáticas
 Gel especifico:
 Mezcla de gel-sephadex contra un Ag de gr
sanguineo
 Determinación de Gr sanguineo
 Gel antiglobulina:
 Se usa en la P de Coombs para identificar Ac
antieritrocitarios incapaces de producir
aglutinación directa
 Puede ser utilizado para detectar e identificar
Ags y Ac,pruebas de compatibilidad
pretransfusional
 En los tubos que contiene el panel ABO,el gel
está en medio salino,mientras que en los del
panel selector está en reactivo de Coombs
 VENTAJAS:
 Puede efectuarse técnicas en ½ salino,
enzimático,antiglobulinico
 Es automatizable
 DESVENTAJAS:
 Costo y equipamiento
Partículas de gel :filtros que atrapan los
aglutinados
 Aglutinados grandes:Parte superior
 Aglutinados pequeños: Parte Inferior
 No aglutinados :extremos en pico
 APLICACIONES:
 Detectar e identificar Ac o Ag
 Pruebas de compatibilidad
Prueba Funcional: ERITROFAGOCITOSIS
En 3 portaobjetos colocar 1,5 ml. de sangre del
paciente recién extraída e incubar durante 60 minutos a
37C en cámara húmeda. Retirar el coágulo formado y lavar
las células obtenidas por su capacidad de adherirse al
vidrio con una solución de Hanks a 37C.
Preparar las siguientes suspensiones al 5% en
solución fisiológica:
a) Hematíes Propios (HP)
b) Hematíes Normales (HN)
d) Hematíes Normales Sensibilizados (HNS) con anti-D
(clase IgG) diluido convenientemente.
A 2,5 ml de las mismas agregar 1 ml de suero humano
fresco compatible y 1,5 ml de solución de Hanks.
Incubar los portaobjetos con 1 ml de cada una
de estas mezclas durante 3 hs. a 37C en cámara
húmeda. Posteriormente lavar con solución de Hanks a
37C.
Fijar las células mononucleares obtenidas con
metanol durante 1 minuto y colorear con la tinción de
May Grunwald Giemsa.
Realizar la observación microscópica de los
preparados contando 200 elementos y calcular los
porcentajes de células fagocíticas activas (CFA).
Valor normal < 4%.
Imágenes de
eritrofagocitosis
CFA
GRs
adheridos
GR
fagocitado
 -INHIBICIÒN DE LA HEMAGLUTINACIÒN:
 Neutraliza un Ac especìfico con su sustancia soluble






correspondiente en las pruebas de identificaciòn de Ac (
ùtil cuando se trabaja con muestras sèricas que contienen
mùltiples especificidades)
TRATAMIENTO ENZIMÀTICO:
Se utilizan para tratar Gr con el fin de potenciar cierta
reactividad de Ac o proporcionar una mas efectiva
adhesiòn de Ac en los procedimientos de autoadsorciòn
POTENCIACIÒN DE LA REACTIVIDAD
La potenciciòn de la reactividad Ac con cèlulas tratadas
enzimàticamente se demuestra en los sistemas: Rh, Kidd;
Lewis, Ii, P
DESTRUCCIÒN DE LA REACTIVIDAD:
El tratamiento Ez puede tambien usarse par destruir la
reactividad de los Ag: M, N, Fya, Fyb, Pr, Cha, Rga
 ADSORCIÒN:
 Proceso utilizado para eliminar Ac del suero, se pueden
utilizar Gr lavados, tratados enzimàticamete,o estromas
eritrocitario
 *Eliminaciòn de auto Ac frios o calientes: generalmente se
utilizan Gr autòlogos para la adsorciòn
*Eliminaciòn de Aglutininas ABO no necesarias: esto puede
hacerse en la preparaciòn de antisueros puros
 ELUCIÒN:
 Proceso utilizado para la eliminaciòn de Ac unidos a





hematies:
1º se lavan las cèlulas con SF,para eliminar cualquier Ac no
unido.
Mètodos: *Por calor( disocia el Ac de los Ag eritrocitarios
:56-60ºC durante 10 min efectivo para los Ac IgM
*Congelaciòn /descongelaciòn: bueno para la disociaciòn de
las IgM
*Solventes orgànicos: Eter ,etanol , cloroformo, xileno :
Para la IgG
*Eluciòn àcida con Digitonina y Glicina: (por alteraciòn del
Ph)
 -TITULACIÒN DE Ac:
 Es un mètodo para determinar semicuatitativamente la cantidad






de Ac presente en un suero determinado
El tìtulo se expresa como la recìproca de la diluciòn sèrica mas
alta que provoca la aglutinaciòn macroscòpica
Aplicaciones :en estudios prenatales
UTILIZACIÒN DE REACTIVOS SULFHIDRILOS:
El 2ME rompe los enlaces disulfuros y son utilizados para
inactivar la capacidad de aglutinaciòn de las IgM, destruyendo la
estructura pentamèrica de la IgM .Son ùtiles para investigar las
IgG clìncamente significativa en presencia de un autoAc y para la
deteminaciòn de ABO y Rh en presencia de un autoAc frìo
PRUEBAS PARA Ag ERITROCITARIOS
Cuando el paciente tiene un Ac complicado a veces es ùtil tipificar
los Gr del paciente para los otros Ag de grupo sanguineo
frecuentes para determinar de que Ag carece el paciente y tener
informaciòn sobre que Ac podrìa formar el paciente
 -FUENTE DE REACTIVOS : Antisueros :Plasmas extraido de
donates que fueron inmunizados por transfusiòn o embarazo o
animales inmunizados con Ag purificados .
 Se debe ensayar el antisuero para especificidad , avidez y tìtulo
 ANTICUERPOS MONOCLONALES ; Son sintetizados por
Hibridomas linfocitarios (fusiòn de celulas productoras de AC de
animales y cèlulas neoplasicas)
 Los Ac monoclonales se diferencian de los Ac convencionales por
la especificidad ( reaccionan con uno en vez de con mùltiples
determinantes
antigènicos.)
el
grado
de
pureza
y
reproductibilidad
 Algunos reactivos derivados de Ac monoclonales murinos:anti A,
anti B, antiH, Anti M, anti N, anti Lewis , anti P y los de origen
humano:antiD, anti C, anti E , antic
 LECTINAS: contiene proteinas receptoras que reaccionan con
carbohidratos de la membrana del Gr para causar
hemaglutinaciòn
¡GRACIAS!