TUTORIAL DE CÁLCULO DE VMÁX Y KM Profesora Fabiola Jamett Díaz Explicaré la manera de resolver los cálculos de Km y Vmáx. A través del siguiente ejercicio. Datos para la enzima fosfatasa ácida. [S] mM 0,50 0,75 2,00 4,00 6,00 8,20 10,0 V0 A405/min 0,075 0,090 0,152 0,196 0,210 0,214 0,230 El cálculo de Km y de Vmáx, según Michaelis Menten se realiza graficando los datos brutos de la tabla: en el eje x concentración de sustrato y el el eje Y Vo. Graficado la línea asíntota a la grafica corresponde a la Vmáx, que se extrae del eje Y. por lo tanto Vmax = 0,24 (A/min) y recuerden la Km será ½ Vmax, es decir aproximadamente. (Debe cortar en el eje X) Km = 1,2 mM Gráfica de Michaelis Menten 0,25 Vmáx Vo A/min 0,2 0,15 ½ Vmax 0,1 0,05 0 0 2 Km = 1,2 mM 4 6 8 10 12 mM [S] Ahora aplicando los dobles recíprocos, esto es Lineaweaver-Burk, Se debe graficar 1/[S] vs 1[Vo]. Generar la tabla y graficar. Sin necesidad de graficar se calcula la pendiente de la recta y el intercepto; esto lo hacen las calculadoras con regresión lineal; si no la tiene use las siguientes fórmulas: Pendiente: b = ( [(Xi –X )(Yi - Y)] / (Xi-X)2)1/2 ; Intercepto: a = Y - bX En este caso: a = 1 / V máx y b = Km/ Vmáx. Reemplazando los valores de a y b por los obtenidos y despejando, se obtiene Vmáx y Km. En el ejemplo: [S] mM 0,50 0,75 2,00 4,00 6,00 8,20 10,0 V0 A405/min 0,075 0,090 0,152 0,196 0,210 0,214 0,230 1/[S] 2 1,33 0,5 0,25 0,167 0,122 0,1 1/[Vo] 13,33 11,11 6,58 5,10 4,76 4,67 4,35 El intercepto a = 4,03 y la pendiente b= 4,86, por lo tanto Vmáx =0,248 y Km = 1,21; valores que concuerdan y se acercan a los calculados en la gráfica de Michaelis Menten. Ahora gráficamente, tal como se indica se sacan los valores que apuntan las flechas y se reemplazan: 3,9 = 1/ Vmáx , por lo tanto Vmáx = 0,256 y -0,70 = -1/Km, por lo tanto Km = 1,42. Gráficamente siempre existe menos precisión. LINEAWEAVER-BURK 14 12 10 1/[S] 8 6 1/Vmáx 4 2 0 -2 -1 -1/Km 0 1 2 3 1/Vo El intercepto a = 4,03 y la pendiente b= 4,86, por lo tanto Vmáx =0,248 y Km = 1,21; valores que concuerdan y se acercan a los calculados en la gráfica de Michaelis Menten. Ahora para el caso Eadie Hofstee; se gráfica Vo/[S] vs Vo. Generar la tabla y graficar. Sin necesidad de graficar se calcula la pendiente de la recta y el intercepto. En este caso a el intercepto será a = V máx. y la pendiente b = -Km [S] mM 0,50 0,75 2,00 4,00 6,00 8,20 10,0 V0 A405/min 0,075 0,090 0,152 0,196 0,210 0,214 0,230 Vo/[S] 0,15 0,12 0,076 0,049 0,035 0,026 0,023 V0 A405/min 0,075 0,090 0,152 0,196 0,210 0,214 0,230 La gráfica sería más o menos así: Eadie Hofstee 0,35 0,3 V máx Vo 0,25 -Km 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 Vo/[S] Por lo tanto la velocidad máx sería cercana a los 0,25 gráficamente y la Km = pendiente. Si los datos los ingresamos a una ecuación de la recta por análisis de regresión lineal. La pendiente sería b= 1, 25 y el intercepto a= 0,252, por lo tanto: V máx = 0, 25 y Km = 1,25 mM. Por lo tanto no es necesario realizar las gráficas, porque el recálculo de los valores es una recta con intercepto y pendiente. Ahora están en condiciones de hacer el mismo ejercicio para la gráfica Wong-Hanes [S]/Vo vs [S] , y Eisenthal and Cornish Bowden ( -[S] vs Vo ).
