UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS Universidad de Guadalajara Centro universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías diciembre 6 REPORTE DE PRÁCTICA 2019 DETECCIÓN DE ALIMENTOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS (GMOs) POR PCR Práctica No. 3 Biotecnología Sección: D01 Equipo 1 Dr. Josué Raymundo Solís Pacheco Alumnos: Baeza González Mayte Barrientos Olivares Elia Sofia Ceballos Candelario, Francisco Javier Chávez Ruiz Mónica Georgina Moreno Becerra César Ramón Ramírez Martínez Stephanie Tamara Rodríguez Negrete Deborah Yáñez Solís Luzmila Guadalupe BIOTECNOLOGÍA Página 1 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS PRÁCTICA 3 DETECCIÓN DE ALIMENTOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS (GMOs) POR PCR OBJETIVO. Determinar la presencia de secuencias específicas encontradas generalmente en organismos genéticamente modificados (GMOs) en muestras alimentarias de interés, a través del uso de la técnica de PCR. INTRODUCCIÓN Muchos alimentos que se adquieren en los supermercados contienen semillas que han sido genéticamente modificadas. Esta esta práctica fue diseñada para detectar este tipo de transgénicos en un alimento de consumo diario. Actualmente existen dos métodos para identificar semillas genéticamente modificadas: la técnica de ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) y la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Una prueba de ELISA está basada en el uso de anticuerpos que identifican específicamente a proteínas recombinantes del transgénico. Sólo puede realizarse en alimentos frescos y es específica solamente para una modificación genética. Un ejemplo de éste tipo de ensayos fue diseñado para detectar proteínas recombinantes específicas de Bacillus thuringiensis (Bt), que no podrá detectar otro tipo de modificación como lo es la resistencia a los herbicidas. La técnica de ELISA puede realizarse fuera de un laboratorio con un poco de experiencia. Por la otra parte las técnicas basadas en el uso de PCR generalmente deben realizarse en un laboratorio. La ventaja que presenta la la PCR es que puede detectar las modificaciones genéticas presentes en muchos alimentos procesados, ya que el ADN (ácido desoxiribonucleico) es más estable que las proteínas. Aproximadamente el 85% de las plantas y semillas transgénicas tienen las mismas secuencias promotoras y terminales. Durante el desarrollo de una reacción de PCR, es importante contar con controles para algunos pasos de la reacción, con el fin tener certidumbre en relación con el resultado final, entre las razones más importantes por las cuales se utilizan controles se encuentran: 1) Para checar que el ADN genómico fue correctamente extraído del alimento problema. 2) Confirmar que la reacción de la PCR no fue contaminada. BIOTECNOLOGÍA Página 2 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS 3) Validar que el termociclador y los reactivos están trabajando como se espera. Para verificar que la extracción de ADN genómico ha sido hecha correctamente se utiliza un conjunto de primers que pueden amplificar ADN genómico de cualquier planta. Como control para checar que los reactivos y el termociclador están funcionando correctamente, se utiliza ADN plasmídico que contiene las secuencias típicas de organismos transgénicos en plantas (promotor 35S del virus de la coliflor mosaico y el terminador nopalina sintasa del A. Tumefaciens). Por último, se extrae ADN genómico de un alimento control que se ha comprobado que no es transgénico, para verificar un resultado positivo para una modificación genética. - Los alimentos más comunes que presentan semillas genéticamente modificadas son los snacks que contienen maíz y soya o sus derivados. - El mortero y el pistilo utilizado para moler la muestra, es una fuente potencial de contaminación para la PCR, por eso se recomienda lavarlo primero con agua y jabón, enjuagar con un detergente al 10%, un nuevo enjuague con agua corriente y un último enjuague con agua destilada. - Usar demasiada muestra puede sobrecargar la matriz InstaGene, dejando exceso de magnesio que puede ser usado como cofactor para las DNAsas. - La PCR es muy sensible, es muy importante no contaminar los reactivos usados en la reacción. - Usar tubos con tapa para las reacciones de PCR para evitar la contaminación. - Mezclar perfectamente los reactivos de la PCR y asegurarse que las reacciones se mantienen en el fondo del tubo. Si es necesario usar una microcentrifuga para tubos de PCR y centrifugar de 5 a 10 segundos. BIOTECNOLOGÍA Página 3 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS MATERIAL Y REACTIVOS Material: Parte 1 Micropipeta de volumen ajustable Puntillas estériles de 1mL para micropipeta Mortero y pistilo Tubos con rosca que contengan 500 L de matriz InstaGene Parte 2 Micropipeta de volumen ajustable (2 a 20 L) Tubos para PCR Contenedor con hielo Parte 3 Micropipeta de volumen ajustable (2 a 20 L) Equipo: - Vortex - Incubadora a 95°C Microcentrífuga Termociclador. Cámara de electroforesis horizontal Reactivos: Parte 1 Agua destilada (25 mL) Matriz InstaGene Muestra de alimento (1 g) ADN control de alimento no transgénico certificado Parte 2 Mezcla maestra control de plantas (PMM) conservado en el contenedor con hielo Mezcla maestra para alimentos genéticamente modificados (GMM) conservado en el contenedor con hielo ADN de transgénico (Control positivo) ADN genómico de la muestra de alimento extraída en la Parte 1 ADN genómico del alimento no transgénico BIOTECNOLOGÍA Página 4 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS Parte 3 Reacciones de PCR obtenidas en la parte 2 Buffer de carga 5x Marcador de peso molecular 300 mL de buffer para electroforesis TAE 1X Syber safe como revelador de ADN Gel de agarosa en TAE 1X al 3% PROCEDIMIENTO Parte 1: Extracción del ADN 1. Pesar de 1 g del alimento problema y colocarlo en el mortero (a). 2. Agregar el alimento y 5 mL de agua destilada al mortero y moler con ayuda del pistilo por al menos dos minutos, hasta obtener una consistencia viscosa (b). 3. Agregar de nuevo 5 mL de agua destilada y continuar con la molienda hasta obtener una mezcla lo suficientemente suave para poderse tomar con la micropipeta. (a) (b) (c) 4. Agregar a un tubo con rosca 500 L de matrix InstaGene y rotular como Muestra Problema (MuP) y añadir 50 L del alimento homogeneizado (d). Tapar el tubo y mezclar con vortex por al menos 30 s. 5. Incubar el tubo MuP previamente mezclado, a 95°C por 5 minutos. 6. Colocar los tubos dentro de la microcentrifuga y centrifugar a 12,000 rpm por 10 min. (d) (e) (f) 7. Se puede continuar con la Parte 2 (PCR) o almacenar los tubos a 4°C hasta por un mes. No se deben congelar las muestras. Parte 2: Preparación de las reacciones de PCR 1. Centrifugar el tubo con la muestra MuP en la microcentrifuga por 10 min a 2,000 g (solamente si se han mantenido anteriormente en refrigeración). BIOTECNOLOGÍA Página 5 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS 2. Rotular seis tubos de PCR del 1 al 6 y añadir los volúmenes de la mezcla maestra de PCR y de los ADNs correspondientes como sigue: Tubo 1 2 3 4 5 6 Mezcla maestra PCR (g) 10 L Mezcla maestra control de plantas 10 L de ADN de alimento NO (PMM) TRANSGÉNICO 10 L Mezcla maestra para alimentos 10 L de ADN de alimento NO genéticamente modificados (GMM) TRANSGÉNICO 10 L Mezcla maestra control de plantas 10 L de ADN de muestra problema (PMM) (MuP) 10 L Mezcla maestra para alimentos 10 L de ADN de muestra problema genéticamente modificados (GMM) (MuP) 10 L Mezcla maestra control de plantas 10 L de ADN de alimento (PMM) TRANSGÉNICO (GMO-positivo) 10 L Mezcla maestra para alimentos 10 L de ADN de alimento genéticamente modificados (GMM) TRANSGÉNICO (GMO-positivo) (g) 3. ADN (h) (h) Usar una puntilla estéril por cada pipeteo. Mezclar las reacciones de PCR pipeteando suavemente de arriba abajo evitando generar burbujas, tapar los tubos inmediatamente. Mantener los tubos de PCR en un contenedor con hielo. Nota: Evitar transferir o mover el precipitado formado por la matriz InstaGene, el cual está en el fondo del tubo que contiene al ADN. La matriz InstaGene inhibiría la reacción del PCR. Si se transfiere el precipitado de la matriz, se debe de recentrifugar el tubo para formar de nuevo el precipitado. 4. 5. Colocar los tubos de PCR en el termociclador. Programar el termociclador como sigue: BIOTECNOLOGÍA Página 6 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS Inicio 94°C por 2 minutos 40 ciclos de 94°C por 1 minuto 59°C por 1 minuto 72°C por 2 minutos 72°C por 10 minutos 15°C por tiempo indefinido Extensión final Mantener a 6. Cuando todas las muestras estén en el termociclador, iniciar la reacción de PCR. Nota: El programa tardará de 3 a 4 horas en completarse. No es necesario esperar a que finalice, las reacciones pueden dejarse en el transcurso de la noche y continuar con la sección 3 en una sesión distinta. 7. Almacenar las muestras a 4°C en el refrigerador hasta que estén listas para correrse en el gel. Parte 3: Electroforesis en geles de agarosa 1. Si se refrigeraron las reacciones de PCR, centrifugar los tubos de 5 a 10 segundos para bajar el líquido hacia el fondo del tubo. 2. Usando una puntilla para cada muestra, cargar 4 L de buffer de carga en cada tubo de PCR. Mezclar por pipeteo de arriba abajo. 3. Colocar en la cámara de electroforesis un gel de agarosa TAE al 3% al que se le ha agregado anteriormente 1X de Syber safe como revelador. Llenar la cámara de electroforesis con suficiente buffer TAE 1X para cubrir el gel por 2 mm aproximadamente. 4. Checar que los pocillos del gel de agarosa están cerca del electrodo negro (-) o cátodo y que la orilla inferior del gel se encuentre cerca del cátodo rojo (+) o ánodo. 5. Usando una puntilla nueva para cada muestra, cargar 20 L de muestra en el gel de la siguiente manera: Carril 1 20 L del producto del tubo 1 Carril 2 Carril 3 Carril 4 Carril 5 Carril 6 Carril 7 BIOTECNOLOGÍA 20 L del producto del tubo 2 20 L del producto del tubo 3 20 L del producto del tubo 4 20 L del producto del tubo 5 20 L del producto del tubo 6 5 L de marcador de peso molecular para PCR Página 7 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS 6. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis. Conectar a la fuente de poder cuidando que los cátodos correspondan al color correcto. 7. Encender la fuente y correr el gel a 100V por 30 minutos. 8. Cuando la corrida este completa, apagar la fuente y remover la tapa de la cámara. Cuidadosamente remover el gel y colocarlos en la charola de un documentador de geles para visualizar las bandas de amplificadas y reportar los resultados. MUESTRA Harina de maíz. Marca: Aurrera. BIOTECNOLOGÍA Página 8 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS DIAGRAMA DE FLUJO Parte 1: Extracción del ADN Pesar 1gr de la muestra Incubar en Termoblock 95° por 5 minutos Pasar a un mortero y triturar con 10 ml de agua destilada Añadir 10 ml de agua destilada y homogenizar Añadiral tubo 500ul de instagen Tomar 50ul de la muestra y transferirlo a un tubo eppendorf de 1.5ml Centrifugar en microcentrifuga a 12,000rpm por 10 min. Parte 2: Preparación de las reacciones de PCR a) Pipetear 10ul de PMM en tubos para PCR de 0.2 ml + 10 ul de ADN no transgénico (C-) Parte 2 PCR c) Pipetear 10ul de PMM en tubos para PCR de 0.2 ml + 10ul de muestra problema BIOTECNOLOGÍA d) Pipetear 10ul de GMM en tubos para PCR de 0.2 ml + 10 ul de muestra problema Página 9 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS Parte 3: Electroforesis en geles de agarosa (realizada por personal del laboratorio) RESULTADOS 1. Se deberán de comparar el tamaño de los fragmentos amplificados de PCR en cada línea a el tamaño de las bandas en el estándar PCR MW y a las bandas de control positivas. Las bandas del estándar en el carril 7 van de la parte superior a la inferior de 1,000, 700, 500, 200, y los 100 pares de bases (pb). Resultado positivo para un alimento genéticamente modificado BIOTECNOLOGÍA Resultado negativo, alimento sin modificaciones genéticas Página 10 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS Carril 1 2 3 4 7 10 Muestra Control negativo con PMM Muestra con PMM Muestra con GMM Control negativo con GMM Control positivo con PMM Control positivo con GMM Muestra POSITIVA con PMM. Muestra POSITIVA con GMM CONCLUSIONES. Baeza González Mayte El resultado obtenido mediante la técnica PCR para la muestra de harina de maíz de marca Aurrera coincidió con las bandas observadas en los controles positivos para PMM y GMM, lo cual nos indica que el alimento tiene secuencias de ADN transgénico. En esta práctica pudimos observar que varias muestras de las analizadas en el salón son alimentos genéticamente modificados sin embargo esto no está indicado en la etiqueta de dichos productos ya que en México ninguna ley obliga a las empresas a informar a los consumidores si sus productos son transgénicos. BIOTECNOLOGÍA Página 11 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS Barrientos Olivares Elia Sofia Con el crecimiento y desarollo de productos genéticamente modificados, estas prácticas son de gran aprendizaje ya que nos ayudan a entender estos nuevos procesos. En la práctica se logró determinar la presencia de secuencias específicas de organismos genéticamente modificados (GMOs) en una muestra de Harina de Maíz de la marca Aurrera, en la cual después de la extracción de DNA y el análisis de los resultados obtenidos por medio de la técnica PCR, se encontró que un resultado positivo para PMM, lo cual es indicativo de una manipulación genética. Ceballos Candelario, Francisco Javier La muestra de harina de maíz presentó resultados positivos para PMM en base a la comparación con PCR para un control con PMM en donde nos indica que la planta, posiblemente fue genéticamente modificada antes de ser cosechada. La técnica, como muchas otras, presenta interferencias tales como la interpretación visual del resultado, el cual se ve alterado por la inyección de los controles y la muestra en el gel de agarosa. En el caso particular de esta práctica, varias de las muestras de los equipos del salón resultaron ser positivas tanto a GMM como PMM, lo que indica que los alimentos se encuentran genéticamente modificados y abre el camino de debate para las características éticas de cada una de las empresas implicadas en ello. Por último, se anexaron las evidencias fotográficas de importancia, en donde, el comparativo de la tabla y la fotografía respecto a las muestras y a los controles, evidencias los resultados obtenidos. Chavez Ruiz Mónica Georgina En esta práctica se obtuvo un resultado positivo en GMM y PMM, por lo que se concluye que la muestra de harina de maíz tuvo una modificación genética antes de su comercialización. Es sorprendente darnos cuenta que en el mercado los productos que utilizamos en nuestra vida diaria están modificados, y de aquí parte el debate entre que tan bueno es tenerlos por una parte se cree que pueden tener características negativas en la salud de la población y por otro lado el crecimiento exponencial de la misma hace que esta sea la alternativa más viable para alimentar a animales y humanos. Moreno Becerra César Ramón La muestra de harina marca “Ahurrera” obtuvo resultados positivos en las soluciones GMM y PMM lo que nos indica que fue modificado genéticamente lo que lo convierte en un alimento transgénico, se sabe que es positivo al compararlo con los controles positivos y negativos preparados por los equipos. BIOTECNOLOGÍA Página 12 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS Ramirez Martínez Stephanie Tamara Se pudo determinar que la muestra de harina utilizada presentaba las secuencias específicas que se encuentran generalmente en los organismos genéticamente modificados, ya que los resultados obtenidos fueron positivos para GMM y PMM, con esto se pudo llegar a la conclusión de que nuestra muestra de harina se produjo con un producto transgénico. Rodríguez Negrete Deborah La muestra de harina de maíz presenta resultado positivo para GMM y PMM, lo cual indica que contiene las secuencias promotoras y terminadoras que contienen los genes transgénicos. Yáñez Solís Luzmila Guadalupe En base a los controles utilizados se pueden observar secuencias específicas de organismos genéticamente modificados, puesto que se obtienen resultados positivos para PMM y GMM. Se concluye que el maíz que fue utilizado para la elaboración de la “harina de maíz” marca “Aurrera”, es un maíz transgénico. BIBLIOGRAFÍA. 1. Alejos,L. Aragón, M. Cornejo, A.. (2017). Extracción y purificación de ADN. Enero, 2018, de Unidad de Biotecnología y Prototipos. Universidad Nacional Autónoma de México. Sitio web: http://www.publicaciones.inecc.gob.mx/libros/710/extraccion.pdf 2. Anónimo. (2007). Génetica Humana. Guía de Prácticas. Enero, 2018, de Universidad pública en San Martín, Argentina Sitio web: http://genoma.unsam.edu.ar/cursos/genetica_humana/GH_Guia2007.pdf 3. Bermudez, I. (2016). Aplicaciones de la bioinformática en la medicina: El genoma humano. ¿Cómo podemos ver tanto detalle? Marzo 2018, Colombia Sitio web: file:///C:/Users/Usuario/Downloads/51233-285481-2-PB.pdf BIOTECNOLOGÍA Página 13
