MODELAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE BIOPOLÍMERO TIPO PHA A PARTIR DE ACEITE VEGETAL EMPLEANDO UN MODELO CON PARÁMETROS VARIABLES D. A. MENDEZ1, I. O. CABEZA2, N.C. MORENO2, C. A. M. RIASCOS1 1 Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental 2 Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Instituto de Biotecnología E-mail para contacto: [email protected] RESUMEN – En este trabajo se presenta un modelo matemático con parámetros variables que predice el crecimiento de biomasa y la acumulación de polihidroxialcanoatos (PHAs) en una cepa mutante de Burkholderia cepacia. Las fermentaciones a 72 h utilizando una mezcla de aceite de maíz y soya como fuente de carbono, indican que la cepa mutante es capaz de producir 15 g/l de biomasa con porcentajes de acumulación de polímero de 86% base seca. Los ensayos en biorreactor se realizaron con un volumen de trabajo de 5 l a pH de 7.0 y temperatura de 32ºC. El desarrollo del modelo comprende los siguientes pasos: 1) Análisis del comportamiento cinético; 2) Formulación de ecuaciones; 3) Ajuste de los parámetros del modelo con solvers de Matlab®; 4) Validación del modelo. El modelo considera la relación C/N y su influencia sobre el rendimiento biomasa/nitrógeno, permitiendo predecir las velocidades de consumo de los sustratos y su efecto en la producción de biomasa y PHAs. La validación estadística del modelo confirma su confiabilidad y muestra que el modelo con factor de rendimiento variable genera mejores predicciones para condiciones de limitación y exceso de la fuente de carbono, lo que se deberá traducir en mejores simulaciones, en futuras aplicaciones de optimización. 1. INTRODUCCIÓN La problemática ambiental a nivel mundial, así como las diferentes políticas, normas y leyes promovidas por los gobiernos del mundo en pro de un medio ambiente limpio seguro y en el marco de un desarrollo sostenible; han fomentado la búsqueda por parte de la comunidad científica de polímeros biodegradables y otros materiales sostenibles que reemplacen materiales sintéticos de la industria petroquímica (Mendez et al., 2016; Shahzad et al., 2013). Los polihidroxialcanoatos son polímeros biodegradables comúnmente sintetizados por algunos microrganismos, como reserva energética bajo condiciones de limitación de nutrientes esenciales como nitrógeno, fosforo y magnesio, y en presencia de exceso de fuentes de carbono (Amache et al., 2013). El uso de polímeros del tipo PHAs se ha incrementado en varios campos tales como empaques, sector alimenticio, biomédico e industria agrícola debido a su biodegrabilidad, biocompatibilidad, reabsorción y propiedades piezoeléctricas (Rai et al., 2011). Otro factor importante a tener en cuenta en los procesos de producción de polímeros a través de microorganismos, es el posible uso, como fuente de carbono, de materias primas renovables como aceite vegetal (AV), jarabe de maíz, glicerol, dióxido de carbono y residuos orgánicos, etc., lo que conllevaría a favorecer el uso de materias primas de bajo costo (Hassan et al., 2013; Obruca et al., 2015). Sin embargo, actualmente el uso comercial de PHAs es limitado, principalmente por su alto costo de producción comparado con los plásticos derivados de procesos petroquímicos. A la fecha, la búsqueda de una producción de PHAs efectiva en términos de costos de proceso ha generado varios enfoques para afrontar el problema: algunos investigadores han buscado reducción de costos empleando sustratos con valor comercial bajo (Somleva et al., 2013), cepas de alto rendimiento (Suriyamongkol et al., 2007) y varias estrategias de optimización (Riascos y Pinto, 2004; Gahlawat y Srivastava, 2013). El desarrollo de modelos matemáticos no solo ayuda a entender el comportamiento del sistema si no también, permite predecir el efecto de las estrategias de cultivo, facilitando la optimización del proceso, y ahorrando tiempo y costos en la experimentación (Gahlawat y Srivastava, 2013). Algunos trabajos de investigación han demostrado que la modelización de las cinéticas de crecimiento de las bacterias y la optimización del proceso biológico debe ligarse a la calidad y disponibilidad de los sustratos empleados en la fermentación (Touratier et al., 1999). Dicha calidad puede asociarse con la relación C/N en el medio; de esa forma, la modelización y optimización se hace más exacta permitiendo la evaluación de la eficiencia de crecimiento en función de la relación C/N. Una vez se conoce dicha eficiencia, es posible estimar el porcentaje de consumo de carbono y nitrógeno utilizado por el microorganismo para los procesos de respiración y excreción, y el empleado para la producción de nueva biomasa (Goldman et al., 1987; Caron et al., 1988). En los casos en que la producción de biopolímero es proporcional a la generación de biomasa, la inclusión de la relación C/N en la construcción de los modelos matemáticos permitiría explicar de forma más exacta el comportamiento del microorganismo durante la fermentación (Yuan et al., 2008; Liew et al., 2013). El presente trabajo propone un modelo matemático con parámetros variables para el crecimiento y producción de PHAs utilizando la cepa modificada Burkholderia cepacia B27. Los parámetros dependen de condiciones del medio de cultivo que afectan la cinética para la generación de biomasa. El modelo mejora la predicción de los datos experimentales en función de la relación carbono nitrógeno (C/N) en el medio. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Condiciones de Cultivo La cepa Burkholderia cepacia B27 es un microorganismo modificado genéticamente en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. La cepa fue seleccionada por su capacidad de utilizar aceite vegetal (AV) como fuente de carbono para la producción PHAs intracelular. Ésta, fue mantenida en crioviales con medio L.B. y 40 % de glycerol como crioconservante a -22 ºC. Para el desarrollo del inóculo, se utilizó un volumen de 500 µL proveniente del criovial con y se inoculó en un erlenmeyer de 250 ml de volumen total que contenía 50 mL de medio L.B., esterilizado previamente. El erlenmeyer fue incubado empleando un shaker (SK-333-PRO SCILOGEX, United States) a una temperatura de 32 ºC y una velocidad de agitación de 200 rpm por 24 horas. Posteriormente, se transfirió el volumen de 50 mL del paso anterior en un erlenmeyer 2000 mL que contenía 450 mL de medio de cultivo estéril y se incubó a las mismas condiciones durante 24 horas. Finalmente, el inoculo fue sembrado en un fermentador BioFlo CelliGen 115 (Eppendorf, United States) de 7.5 L que contenía 5000 mL de medio de cultivo ésteril. El medio de cultivo estaba compuesto por (g/L) KH2PO4 2.65, Na2HPO4 (S.A.) 3.39, (NH4)2SO4 2.8, MgSO4 0.3, A.V. 20, tween 80 al 22.5% (v/v AV) y antiespumante al 5.5% (v/v tween 80). Los microelementos utilizados en la fermentación contenían (g/L) FeSO4 2, CaCl2 2, CoCl2·6H2O 0.2, CuCl2·2H2O 0.01, NiCl3·6H2O 0.2, MnCl2·4H2O 0.03, ZnSO4·7H2O2 0.1, H3BO3 0.3, NaMoO4.2H2O 0.03, disueltos en solución 1 N de HCl, estos microelementos fueron adicionados al 0.2% (v/v) en el medio de cultivo antes de la etapa de esterilización. Todos los medios de cultivo fueron ajustados a pH 7 (± 0.1) con solución de NaOH 3 N. La cuantificación de biomasa, AV, sulfato de amonio (SA) y PHAs se realizó utilizando los procedimientos descritos por Mendez et al. (2016). 2.2 Modelamiento del Proceso El desarrollo del modelo matemático para la producción de PHAs se basa en las siguientes suposiciones: 1) Las únicas fuentes de sustrato limitante en el medio de cultivo que pueden afectar el crecimiento de biomasa son el aceite vegetal (AV) y el sulfato de amonio (SA). Los demás componentes se encuentran en exceso. 2) La única fuente de carbono para crecimiento de biomasa, generación de producto y mantenimiento es el aceite vegetal. La formulación del modelo matemático se fundamenta en el estudio fenomenológico de la incidencia de las concentraciones de los sustratos en la velocidad específica de crecimiento en escala Erlenmeyer, descrito de forma detallada en Mendez et al. (2016). Los resultados de estos ensayos permitieron confirmar la existencia de fenómenos de limitación e inhibición provocados por ambos sustratos y obtener así una estimativa inicial para los parámetros respectivos. Resultados previos en biorreactor de 5 L, con diferentes concentraciones de AV (5 a 100 g/L), permitieron observar que el rendimiento biomasa/nitrógeno no es constante y que depende de la relación C/N presente en el medio. Para la estimación de los parámetros finales del modelo se resolvió el problema de minimización de la suma de los residuales cuadráticos (RSS: Residual Sum of Squares), ajustando los resultados experimentales obtenidos en biorreactor a escala de 5 L y considerando como valores iniciales los obtenidos del ajuste de los experimentos en erlenmeyer. Los experimentos en biorreactor, se realizaron con concentraciones constantes de los componentes del medio a excepción de los nutrientes principales, con lo que se varió la relación C/N generando condiciones de exceso de nitrógeno, concentraciones balanceadas y exceso de carbono (C/N =2.07, 8.77, 20.35). El ajuste de los parámetros fue realizado con un programa de optimización desarrollado en Matlab® donde el sistema de ecuaciones diferenciales es resuelto por integración numérica con el método Runge-Kutta de cuarto orden (Kaur et al., 2012). Por su parte, la selección y ajuste de la función para relacionar el factor de rendimiento con la relación C/N se realizó con el buscador de modelos matemáticos del programa CurveExpert Professional 2.3.0. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Modelo con Factor de Rendimiento Constante Con base en los resultados de los experimentos en erlenmeyer se seleccionaron los modelos de Monod y Luong (Luong, 1985) para limitación e inhibición por los sustratos. Así mismo, a partir de los resultados de fermentaciones previas se identificó la existencia de consumo de carbono y nitrógeno para mantenimiento, además de producción proporcional al crecimiento de biomasa. Con las anteriores consideraciones el modelo planteado es: 𝑑𝑋 𝑑𝑡 𝑆𝑐 𝑑𝑆𝑐 = − [(𝑌 𝑑𝑇 𝑑𝑃 𝑑𝑇 1 𝑥 𝑆𝑐 𝑑𝑆𝑛 𝑑𝑡 𝑆𝑛 𝑆𝑐 𝑎1 𝑆𝑛 𝑎2 = [𝜇max ∙ (𝐾sc+𝑆𝑐) ∙ (𝐾nc+𝑆𝑛) ∙ (1 − (𝑆𝑐𝑚) ) ∙ (1 − (𝑆𝑛𝑚) )] ∙ 𝑋 = − [(𝑌 1 𝑥 𝑆𝑛 (1) ∗ 𝜇) + 𝑚𝑐 ] ∗ 𝑋 (2) ∗ 𝜇) + 𝑚𝑛 ] ∗ 𝑋 (3) = [∝∗ 𝜇] ∗ 𝑋 (4) La definición de los parámetros se encuentra en la tabla 1 3.2. Modelo con Factor de Rendimiento Variable El análisis del rendimiento de los sustratos para la generación de biomasa permitió observar que el rendimiento de la fuente de carbono, prácticamente, no presenta diferencias cuando se modifica la relación carbono/nitrógeno: 0.86 gbio/gAV para C/N = 2.07, 0.83 gbio/gAV para C/N = 8.77, 0.83 gbio/gAV para C/N = 20.35. Estos valores son superiores a los presentados por otros autores (Gahlawat y Srivastava, 2013; Khanna y Srivastava, 2006; López-Cuellar et al., 2011), lo que sugiere que el proceso se encuentra en nivel avanzado de desarrollo. Por otra parte, el rendimiento de la fuente de nitrógeno presento diferencias significativas al variar la relación C/N: 1.91 gbio/gSA para C/N = 2.07, 7.61 gbio/gSA para C/N = 8.77 y 5.49 gbio/gSA para C/N = 20.35. Aunque las razones metabólicas para la diferencia en el rendimiento biomasa/nitrógeno no son aún claras y los factores que afectan el crecimiento bacteriano son numerosos y poco comprendidos (Franck et al., 1999), en el presente trabajo se formuló un modelo matemático que permite describir y simular este comportamiento, haciendo más confiable la predicción para etapas posteriores de optimización del proceso. Autores como Liew et al. (2013) han estudiado diferentes aproximaciones para modelar el efecto de la condiciones del proceso (agitación y aeración) sobre la cinética de crecimiento bacteriano, entre estas aproximaciones el concepto de cinética de Herbert donde los parámetros de los modelos para las velocidades de producción y consumo son variables, y se ajustan con ecuaciones lineales que modifican los parámetros dependiendo de las condiciones del proceso. Las anteriores observaciones, condujeron a buscar un modelo que se ajustara mejor a los cambios de la relación C/N, específicamente la influencia sobre el factor de rendimiento. En la Figura 1, se observa la tendencia del factor de rendimiento biomasa/nitrógeno con respecto a la relación C/N, la cual se ajustó con el modelo de saturación (Ecuación 5), este modelo se escogió por su simplicidad y buen ajuste (R2 = 0.82). 𝑌𝑥 = 𝑆𝑛 (𝑐∗𝐶/𝑁) (5) 𝑏+𝐶/𝑁 Figura 1 – Comportamiento del rendimiento biomasa/nitrógeno (𝑌𝑆𝑛𝑥 ) con respecto a la relación C/N. La línea continua representa la predicción del modelo propuesto. 3.2. Ajuste de los Modelos Los modelos fueron ajustados con datos obtenidos en fermentaciones batch de 5 L, con 5, 20 y 40 g/L de AV, y relaciones C/N de 2.07, 8.77 y 20.35, respectivamente. Los valores de los parámetros se encuentran en la Tabla 1, mientras que el ajuste obtenido puede ser observado cualitativamente en las Figura 2, y cuantitativamente en la Tabla 2, mediante los coeficientes de regresión (R2). Tabla 1 – Parámetros obtenidos para los modelos matemáticos con factor de rendimiento constante (FRC) y variable (FRV). Parámetro Valor 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑠𝑐 𝑆𝑐𝑚 𝑎1 𝐾𝑠𝑛 𝑆𝑛𝑚 𝑎2 𝑌𝑥 tasa específica máxima de crecimiento Constante de afinidad para AV Concentración inhibitoria de AV Parámetro cinético Constante de afinidad para SA Concentración inhibitoria de SA Parámetro de cinético Modelo FRC 0.35 h-1 4.19 g/L 199 g/L 1.23 2.23 g/L 15.60 g/L 0.314 Modelo FRV 0.35 h-1 4.19 g/L 199 g/L 1.23 2.23 g/L 15.60 g/L 0.314 Factor de rendimiento biomasa AV 0.88 gbio./gA.V. 0.88 gbio./gA.V. 𝑚𝑐 Coeficiente de mantenimiento AV 0.0016 gA.V./ gbio.h 𝑌𝑥 Factor de rendimiento biomasa SA 11.50 gbio./gS.A. 𝑚𝑛 ∝ 𝑐 𝑏 Coeficiente de mantenimiento SA Constante asociada a formación de PHAs Constante ecuación saturación Constante ecuación saturación 0.0035 gS.A./gbio.h 0.98 g/g NA NA 0.0016 gA.V./ gbio.h (𝑐 ∗ 𝐶/𝑁) 𝑏 + 𝐶/𝑁 0.0035 gS.A./gbio.h 0.98 g/g 12.9 1.27 𝑆𝑐 𝑆𝑛 A FRV A FRC B FRV B FRC C FRV C FRC Figura 2 – Ajuste para los modelos para fermentación con A) 20 g/L AV, B) 40 g/L AV y C) 5 g/L AV, para los modelos con rendimiento variable y constante. Datos experimentales: () SA, (•) AV, () PHAs, () biomasa. Predicciones del modelo: ( ) Biomasa, ( ) AV, ( ) SA, ( ) PHAs. La concentración de AV en las gráficas C se dividió en 10 para graficar. Tabla 2 – Coeficiente de determinación R2 entre los datos experimentales y las predicciones FRV FRC FRV FRC FRV FRC Aceite C/N 5 g/L 2.07 20 g/L 8.77 40 g/L 20.35 Biomasa Producto PHAs AV SA 0.92 0.89 0.98 0.98 0.95 0.84 0.80 0.81 0.98 0.98 0.98 0.91 0.94 0.93 0.98 0.98 0.94 0.84 0.96 0.91 0.91 0.93 0.82 0.56 FRV modelo con factor de rendimiento variable FRC modelo con factor de rendimiento constante Como resultado del ajuste, se observa que los modelos no muestran una diferencia apreciable en el ajuste para el experimento con relación C/N de 8.77 (20 g/L de AV). Sin embargo, para la relación C/N 20.35 se observó mejor ajuste para todas las variables con el modelo con factor de rendimiento variable (Figura 2B), y para la relación C/N 2.07 se observó un mejor ajuste solo para la concentración de SA. Estas observaciones permiten confirmar que el uso de una función para el factor de rendimiento biomasa/nitrógeno, en lugar de un valor fijo, puede mejorar la predicción de la dinámica de la fermentación; esta mejor predicción aumenta la confiabilidad del proceso de optimización y brinda mayor información de la cinética de la bacteria B. cepacia B27. Para la fermentación con relación C/N = 2.07, el ajuste solo difiere para la concentración de SA debido a que la concentración de AV es bastante baja (AV = 5 g/L y 𝐾𝑠𝑐 = 4.19 g/L) lo que hace que el proceso este fuertemente limitado por el sustrato AV y que el nitrógeno tenga un efecto de menor importancia; en consecuencia, la estimación errónea de la disponibilidad de nitrógeno no afecta de forma significativa la predicción de las otras concentraciones, durante la fermentación. 4. CONCLUSIONES Los resultados previos, presentaban un ajuste aceptable con el modelos con factor de rendimiento biomasa/nitrógeno constante, sin embargo, en la búsqueda de una simulación con mayor confiabilidad en la predicción del comportamiento de la B. cepacia B27 (mejor ajuste) se definió un factor de rendimiento variable con lo que se mejora la predicción del comportamiento para relaciones C/N altas y bajas. Lo anterior confirma que la incorporación de parámetros variables en función de las condiciones del cultivo (relación C/N), puede aumentar la fiabilidad de la optimización en sílico para la producción de PHAs, la cual es una herramienta clave para el escalado final de proceso. 5. REFERENCIAS AMACHE, R.; SUKAN, A.; SAFARI, M.; ROY, I.; KESHAVARZ, T. Advances in PHAs production. Chemical Engineering Transactions, v. 32, p. 931-936, 2013. CARON, D. A.; GOLDMAN, J. C.; DENNETT, M. R. Experimental demonstration of the roles of bacteria and bacterivorous protozoa in plankton nutrient cycles. Hydrobiologia, v. 159(1), p. 27-40, 1988. FRANCK, T.; LOUIS, L.; ALAIN, V. Â. Z. Model of bacterial growth influenced by substrate C:N ratio and concentration. Aquatic Microbial Ecology, v. 19(2), p. 105-118, 1999. GAHLAWAT, G.; SRIVASTAVA, A. K. Development of a mathematical model for the growth associated Polyhydroxybutyrate fermentation by Azohydromonas australica and its use for the design of fed-batch cultivation strategies. Bioresource Technology, v. 137, p. 98-105, 2013. GOLDMAN, J. C.; CARON, D. A.; DENNETT, M. R. Regulation of gross growth efficiency and ammonium regeneration in bacteria by substrate C:N ratio. Limnology & Oceanography, v. 32(6), p. 1239-1252, 1987. HASSAN, M. A.; YEE, L. N.; YEE, P. L.; ARIFFIN, H.; RAHA, A. R.; SHIRAI, Y.; SUDESH, K. Sustainable production of polyhydroxyalkanoates from renewable oilpalm biomass. Biomass and Bioenergy, v. 50, p. 1-9, 2013. KAUR, G.; SRIVASTAVA, A. K.; CHAND, S. Mathematical modelling approach for concentration and productivity enhancement of 1,3-propanediol using Clostridium diolis. Biochemical Engineering Journal, v. 68, p. 34-41, 2012. KHANNA, S.; SRIVASTAVA A.K. Optimization of nutrient feed concentration and addition time for production of poly(β-hydroxybutyrate), Enzyme and Microbial Technology, 39, 1145–1151, 2006. LIEW, E. W.-T.; NANDONG, J.; SAMYUDIA, Y. Multi-scale models for the optimization of batch bioreactors. Chemical Engineering Science, v. 95, p. 257-266, 2013. LÓPEZ-CUELLAR, M. R.; ALBA-FLORES, J.; RODRÍGUEZ, J.N.G.; PÉREZ-GUEVARA, F. Production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) with canola oil as carbon source, International Journal of Biological Macromolecules, 48, 74–80, 2011. MENDEZ, D. A.; CABEZA, I. O.; MORENO, N. C.; RIASCOS, C. A. M. Mathematical Modelling and Scale-up of Batch Fermentation with Burkholderia cepacia B27 Using Vegetal Oil as Carbon Source to Produce Polyhydroxyalkanoates. Chemical Engineering Transactions, v. 49, IN PRESS, 2016. OBRUCA, S.; BENESOVA, P.; KUCERA, D.; PETRIK, S.; MAROVA, I. Biotechnological conversion of spent coffee grounds into polyhydroxyalkanoates and carotenoids. New biotechnology, v. 32(6), p. 569-574, 2015 RAI, R.; KESHAVARZ, T.; ROETHER, J. A.; BOCCACCINI, A. R.; ROY, I. Medium chain length polyhydroxyalkanoates, promising new biomedical materials for the future. Materials Science and Engineering R: Reports, v. 72(3), p. 29-47, 2011. RIASCOS, C. A. M.; PINTO, J. M. Optimal control of bioreactors: A simultaneous approach for complex systems. Chemical Engineering Journal, v. 99(1), p. 23-34, 2004. SHAHZAD, K.; KETTL, K. H.; TITZ, M.; KOLLER, M.; SCHNITZER, H.; NARODOSLAWSKY, M. Comparison of ecological footprint for biobased PHA production from animal residues utilizing different energy resources. Clean Technologies and Environmental Policy, v. 15(3), p. 525-536, 2013. SOMLEVA, M. N.; PEOPLES, O. P.; SNELL, K. D. PHA Bioplastics, Biochemicals, and Energy from Crops. Plant Biotechnology Journal, v. 11(2), p. 233-252, 2013. SURIYAMONGKOL, P.; WESELAKE, R.; NARINE, S.; MOLONEY, M.; SHAH, S. Biotechnological approaches for the production of polyhydroxyalkanoates in microorganisms and plants - A review. Biotech. Advances, v. 25(2), p. 148-175, 2007. TOURATIER, F.; LEGENDRE, L.; VÉZINA, A. Model of bacterial growth influenced by substrate C:N ratio and concentration. Aquatic Microb. Ecology, v. 19(2), p. 105-118, 1999. YUAN, M. Q.; SHI, Z. Y.; WEI, X. X.; WU, Q.; CHEN, S. F.; CHEN, G. Q. Microbial production of medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids by recombinant Pseudomonas putida KT2442 harboring genes fadL, fadD and phaZ. FEMS Microbiology Letters, v. 283(2), p. 167-175, 2008.