1 Modelamiento de la producción de biopolímero tipo PHA a partir de aceite vegetal empleando un modelo con parámetros variables

MODELAMIENTO
DE
LA
PRODUCCIÓN
DE
BIOPOLÍMERO TIPO PHA A PARTIR DE ACEITE
VEGETAL EMPLEANDO UN MODELO CON PARÁMETROS
VARIABLES
D. A. MENDEZ1, I. O. CABEZA2, N.C. MORENO2, C. A. M. RIASCOS1
1
Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Departamento de Ingeniería Química y
Ambiental
2
Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Instituto de Biotecnología
E-mail para contacto: [email protected]
RESUMEN – En este trabajo se presenta un modelo matemático con parámetros
variables que predice el crecimiento de biomasa y la acumulación de
polihidroxialcanoatos (PHAs) en una cepa mutante de Burkholderia cepacia. Las
fermentaciones a 72 h utilizando una mezcla de aceite de maíz y soya como fuente
de carbono, indican que la cepa mutante es capaz de producir 15 g/l de biomasa
con porcentajes de acumulación de polímero de 86% base seca. Los ensayos en
biorreactor se realizaron con un volumen de trabajo de 5 l a pH de 7.0 y
temperatura de 32ºC. El desarrollo del modelo comprende los siguientes pasos:
1) Análisis del comportamiento cinético; 2) Formulación de ecuaciones; 3) Ajuste
de los parámetros del modelo con solvers de Matlab®; 4) Validación del modelo.
El modelo considera la relación C/N y su influencia sobre el rendimiento
biomasa/nitrógeno, permitiendo predecir las velocidades de consumo de los
sustratos y su efecto en la producción de biomasa y PHAs. La validación
estadística del modelo confirma su confiabilidad y muestra que el modelo con
factor de rendimiento variable genera mejores predicciones para condiciones de
limitación y exceso de la fuente de carbono, lo que se deberá traducir en mejores
simulaciones, en futuras aplicaciones de optimización.
1. INTRODUCCIÓN
La problemática ambiental a nivel mundial, así como las diferentes políticas, normas y
leyes promovidas por los gobiernos del mundo en pro de un medio ambiente limpio seguro y
en el marco de un desarrollo sostenible; han fomentado la búsqueda por parte de la comunidad
científica de polímeros biodegradables y otros materiales sostenibles que reemplacen
materiales sintéticos de la industria petroquímica (Mendez et al., 2016; Shahzad et al., 2013).
Los polihidroxialcanoatos son polímeros biodegradables comúnmente sintetizados por
algunos microrganismos, como reserva energética bajo condiciones de limitación de
nutrientes esenciales como nitrógeno, fosforo y magnesio, y en presencia de exceso de fuentes
de carbono (Amache et al., 2013). El uso de polímeros del tipo PHAs se ha incrementado en
varios campos tales como empaques, sector alimenticio, biomédico e industria agrícola debido
a su biodegrabilidad, biocompatibilidad, reabsorción y propiedades piezoeléctricas (Rai et al.,
2011). Otro factor importante a tener en cuenta en los procesos de producción de polímeros a
través de microorganismos, es el posible uso, como fuente de carbono, de materias primas
renovables como aceite vegetal (AV), jarabe de maíz, glicerol, dióxido de carbono y residuos
orgánicos, etc., lo que conllevaría a favorecer el uso de materias primas de bajo costo (Hassan
et al., 2013; Obruca et al., 2015). Sin embargo, actualmente el uso comercial de PHAs es
limitado, principalmente por su alto costo de producción comparado con los plásticos
derivados de procesos petroquímicos.
A la fecha, la búsqueda de una producción de PHAs efectiva en términos de costos de
proceso ha generado varios enfoques para afrontar el problema: algunos investigadores han
buscado reducción de costos empleando sustratos con valor comercial bajo (Somleva et al.,
2013), cepas de alto rendimiento (Suriyamongkol et al., 2007) y varias estrategias de
optimización (Riascos y Pinto, 2004; Gahlawat y Srivastava, 2013). El desarrollo de modelos
matemáticos no solo ayuda a entender el comportamiento del sistema si no también, permite
predecir el efecto de las estrategias de cultivo, facilitando la optimización del proceso, y
ahorrando tiempo y costos en la experimentación (Gahlawat y Srivastava, 2013). Algunos
trabajos de investigación han demostrado que la modelización de las cinéticas de crecimiento
de las bacterias y la optimización del proceso biológico debe ligarse a la calidad y
disponibilidad de los sustratos empleados en la fermentación (Touratier et al., 1999). Dicha
calidad puede asociarse con la relación C/N en el medio; de esa forma, la modelización y
optimización se hace más exacta permitiendo la evaluación de la eficiencia de crecimiento en
función de la relación C/N. Una vez se conoce dicha eficiencia, es posible estimar el
porcentaje de consumo de carbono y nitrógeno utilizado por el microorganismo para los
procesos de respiración y excreción, y el empleado para la producción de nueva biomasa
(Goldman et al., 1987; Caron et al., 1988). En los casos en que la producción de biopolímero
es proporcional a la generación de biomasa, la inclusión de la relación C/N en la construcción
de los modelos matemáticos permitiría explicar de forma más exacta el comportamiento del
microorganismo durante la fermentación (Yuan et al., 2008; Liew et al., 2013).
El presente trabajo propone un modelo matemático con parámetros variables para el
crecimiento y producción de PHAs utilizando la cepa modificada Burkholderia cepacia B27.
Los parámetros dependen de condiciones del medio de cultivo que afectan la cinética para la
generación de biomasa. El modelo mejora la predicción de los datos experimentales en
función de la relación carbono nitrógeno (C/N) en el medio.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Condiciones de Cultivo
La cepa Burkholderia cepacia B27 es un microorganismo modificado genéticamente en
el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. La cepa fue
seleccionada por su capacidad de utilizar aceite vegetal (AV) como fuente de carbono para la
producción PHAs intracelular. Ésta, fue mantenida en crioviales con medio L.B. y 40 % de
glycerol como crioconservante a -22 ºC. Para el desarrollo del inóculo, se utilizó un volumen
de 500 µL proveniente del criovial con y se inoculó en un erlenmeyer de 250 ml de volumen
total que contenía 50 mL de medio L.B., esterilizado previamente. El erlenmeyer fue
incubado empleando un shaker (SK-333-PRO SCILOGEX, United States) a una temperatura
de 32 ºC y una velocidad de agitación de 200 rpm por 24 horas. Posteriormente, se transfirió
el volumen de 50 mL del paso anterior en un erlenmeyer 2000 mL que contenía 450 mL de
medio de cultivo estéril y se incubó a las mismas condiciones durante 24 horas. Finalmente, el
inoculo fue sembrado en un fermentador BioFlo CelliGen 115 (Eppendorf, United States) de
7.5 L que contenía 5000 mL de medio de cultivo ésteril. El medio de cultivo estaba
compuesto por (g/L) KH2PO4 2.65, Na2HPO4 (S.A.) 3.39, (NH4)2SO4 2.8, MgSO4 0.3, A.V.
20, tween 80 al 22.5% (v/v AV) y antiespumante al 5.5% (v/v tween 80). Los microelementos
utilizados en la fermentación contenían (g/L) FeSO4 2, CaCl2 2, CoCl2·6H2O 0.2,
CuCl2·2H2O 0.01, NiCl3·6H2O 0.2, MnCl2·4H2O 0.03, ZnSO4·7H2O2 0.1, H3BO3 0.3,
NaMoO4.2H2O 0.03, disueltos en solución 1 N de HCl, estos microelementos fueron
adicionados al 0.2% (v/v) en el medio de cultivo antes de la etapa de esterilización. Todos los
medios de cultivo fueron ajustados a pH 7 (± 0.1) con solución de NaOH 3 N. La
cuantificación de biomasa, AV, sulfato de amonio (SA) y PHAs se realizó utilizando los
procedimientos descritos por Mendez et al. (2016).
2.2 Modelamiento del Proceso
El desarrollo del modelo matemático para la producción de PHAs se basa en las
siguientes suposiciones: 1) Las únicas fuentes de sustrato limitante en el medio de cultivo que
pueden afectar el crecimiento de biomasa son el aceite vegetal (AV) y el sulfato de amonio
(SA). Los demás componentes se encuentran en exceso. 2) La única fuente de carbono para
crecimiento de biomasa, generación de producto y mantenimiento es el aceite vegetal.
La formulación del modelo matemático se fundamenta en el estudio fenomenológico de
la incidencia de las concentraciones de los sustratos en la velocidad específica de crecimiento
en escala Erlenmeyer, descrito de forma detallada en Mendez et al. (2016). Los resultados de
estos ensayos permitieron confirmar la existencia de fenómenos de limitación e inhibición
provocados por ambos sustratos y obtener así una estimativa inicial para los parámetros
respectivos. Resultados previos en biorreactor de 5 L, con diferentes concentraciones de AV
(5 a 100 g/L), permitieron observar que el rendimiento biomasa/nitrógeno no es constante y
que depende de la relación C/N presente en el medio.
Para la estimación de los parámetros finales del modelo se resolvió el problema de
minimización de la suma de los residuales cuadráticos (RSS: Residual Sum of Squares),
ajustando los resultados experimentales obtenidos en biorreactor a escala de 5 L y
considerando como valores iniciales los obtenidos del ajuste de los experimentos en
erlenmeyer. Los experimentos en biorreactor, se realizaron con concentraciones constantes de
los componentes del medio a excepción de los nutrientes principales, con lo que se varió la
relación C/N generando condiciones de exceso de nitrógeno, concentraciones balanceadas y
exceso de carbono (C/N =2.07, 8.77, 20.35). El ajuste de los parámetros fue realizado con un
programa de optimización desarrollado en Matlab® donde el sistema de ecuaciones
diferenciales es resuelto por integración numérica con el método Runge-Kutta de cuarto orden
(Kaur et al., 2012). Por su parte, la selección y ajuste de la función para relacionar el factor de
rendimiento con la relación C/N se realizó con el buscador de modelos matemáticos del
programa CurveExpert Professional 2.3.0.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Modelo con Factor de Rendimiento Constante
Con base en los resultados de los experimentos en erlenmeyer se seleccionaron los
modelos de Monod y Luong (Luong, 1985) para limitación e inhibición por los sustratos. Así
mismo, a partir de los resultados de fermentaciones previas se identificó la existencia de
consumo de carbono y nitrógeno para mantenimiento, además de producción proporcional al
crecimiento de biomasa. Con las anteriores consideraciones el modelo planteado es:
𝑑𝑋
𝑑𝑡
𝑆𝑐
𝑑𝑆𝑐
= − [(𝑌
𝑑𝑇
𝑑𝑃
𝑑𝑇
1
𝑥
𝑆𝑐
𝑑𝑆𝑛
𝑑𝑡
𝑆𝑛
𝑆𝑐
𝑎1
𝑆𝑛
𝑎2
= [𝜇max ∙ (𝐾sc+𝑆𝑐) ∙ (𝐾nc+𝑆𝑛) ∙ (1 − (𝑆𝑐𝑚) ) ∙ (1 − (𝑆𝑛𝑚) )] ∙ 𝑋
= − [(𝑌
1
𝑥
𝑆𝑛
(1)
∗ 𝜇) + 𝑚𝑐 ] ∗ 𝑋
(2)
∗ 𝜇) + 𝑚𝑛 ] ∗ 𝑋
(3)
= [∝∗ 𝜇] ∗ 𝑋
(4)
La definición de los parámetros se encuentra en la tabla 1
3.2. Modelo con Factor de Rendimiento Variable
El análisis del rendimiento de los sustratos para la generación de biomasa permitió
observar que el rendimiento de la fuente de carbono, prácticamente, no presenta diferencias
cuando se modifica la relación carbono/nitrógeno: 0.86 gbio/gAV para C/N = 2.07, 0.83 gbio/gAV
para C/N = 8.77, 0.83 gbio/gAV para C/N = 20.35. Estos valores son superiores a los
presentados por otros autores (Gahlawat y Srivastava, 2013; Khanna y Srivastava, 2006;
López-Cuellar et al., 2011), lo que sugiere que el proceso se encuentra en nivel avanzado de
desarrollo. Por otra parte, el rendimiento de la fuente de nitrógeno presento diferencias
significativas al variar la relación C/N: 1.91 gbio/gSA para C/N = 2.07, 7.61 gbio/gSA para
C/N = 8.77 y 5.49 gbio/gSA para C/N = 20.35.
Aunque las razones metabólicas para la diferencia en el rendimiento biomasa/nitrógeno
no son aún claras y los factores que afectan el crecimiento bacteriano son numerosos y poco
comprendidos (Franck et al., 1999), en el presente trabajo se formuló un modelo matemático
que permite describir y simular este comportamiento, haciendo más confiable la predicción
para etapas posteriores de optimización del proceso. Autores como Liew et al. (2013) han
estudiado diferentes aproximaciones para modelar el efecto de la condiciones del proceso
(agitación y aeración) sobre la cinética de crecimiento bacteriano, entre estas aproximaciones
el concepto de cinética de Herbert donde los parámetros de los modelos para las velocidades
de producción y consumo son variables, y se ajustan con ecuaciones lineales que modifican
los parámetros dependiendo de las condiciones del proceso. Las anteriores observaciones,
condujeron a buscar un modelo que se ajustara mejor a los cambios de la relación C/N,
específicamente la influencia sobre el factor de rendimiento. En la Figura 1, se observa la
tendencia del factor de rendimiento biomasa/nitrógeno con respecto a la relación C/N, la cual
se ajustó con el modelo de saturación (Ecuación 5), este modelo se escogió por su simplicidad
y buen ajuste (R2 = 0.82).
𝑌𝑥 =
𝑆𝑛
(𝑐∗𝐶/𝑁)
(5)
𝑏+𝐶/𝑁
Figura 1 – Comportamiento del rendimiento biomasa/nitrógeno (𝑌𝑆𝑛𝑥 ) con respecto a la relación
C/N. La línea continua representa la predicción del modelo propuesto.
3.2. Ajuste de los Modelos
Los modelos fueron ajustados con datos obtenidos en fermentaciones batch de 5 L, con
5, 20 y 40 g/L de AV, y relaciones C/N de 2.07, 8.77 y 20.35, respectivamente. Los valores de
los parámetros se encuentran en la Tabla 1, mientras que el ajuste obtenido puede ser
observado cualitativamente en las Figura 2, y cuantitativamente en la Tabla 2, mediante los
coeficientes de regresión (R2).
Tabla 1 – Parámetros obtenidos para los modelos matemáticos con factor de rendimiento
constante (FRC) y variable (FRV).
Parámetro
Valor
𝜇𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑠𝑐
𝑆𝑐𝑚
𝑎1
𝐾𝑠𝑛
𝑆𝑛𝑚
𝑎2
𝑌𝑥
tasa específica máxima de crecimiento
Constante de afinidad para AV
Concentración inhibitoria de AV
Parámetro cinético
Constante de afinidad para SA
Concentración inhibitoria de SA
Parámetro de cinético
Modelo FRC
0.35 h-1
4.19 g/L
199 g/L
1.23
2.23 g/L
15.60 g/L
0.314
Modelo FRV
0.35 h-1
4.19 g/L
199 g/L
1.23
2.23 g/L
15.60 g/L
0.314
Factor de rendimiento biomasa AV
0.88 gbio./gA.V.
0.88 gbio./gA.V.
𝑚𝑐
Coeficiente de mantenimiento AV
0.0016 gA.V./ gbio.h
𝑌𝑥
Factor de rendimiento biomasa SA
11.50 gbio./gS.A.
𝑚𝑛
∝
𝑐
𝑏
Coeficiente de mantenimiento SA
Constante asociada a formación de PHAs
Constante ecuación saturación
Constante ecuación saturación
0.0035 gS.A./gbio.h
0.98 g/g
NA
NA
0.0016 gA.V./ gbio.h
(𝑐 ∗ 𝐶/𝑁)
𝑏 + 𝐶/𝑁
0.0035 gS.A./gbio.h
0.98 g/g
12.9
1.27
𝑆𝑐
𝑆𝑛
A FRV
A FRC
B FRV
B FRC
C FRV
C FRC
Figura 2 – Ajuste para los modelos para fermentación con A) 20 g/L AV, B) 40 g/L AV y C)
5 g/L AV, para los modelos con rendimiento variable y constante. Datos experimentales: ()
SA, (•) AV, () PHAs, () biomasa. Predicciones del modelo: (
) Biomasa, ( ) AV, ( )
SA, ( ) PHAs. La concentración de AV en las gráficas C se dividió en 10 para graficar.
Tabla 2 – Coeficiente de determinación R2 entre los datos experimentales y las predicciones
FRV
FRC
FRV
FRC
FRV
FRC
Aceite
C/N
5 g/L
2.07
20 g/L
8.77
40 g/L 20.35
Biomasa
Producto PHAs
AV
SA
0.92
0.89
0.98
0.98
0.95
0.84
0.80
0.81
0.98
0.98
0.98
0.91
0.94
0.93
0.98
0.98
0.94
0.84
0.96
0.91
0.91
0.93
0.82
0.56
FRV modelo con factor de rendimiento variable
FRC modelo con factor de rendimiento constante
Como resultado del ajuste, se observa que los modelos no muestran una diferencia
apreciable en el ajuste para el experimento con relación C/N de 8.77 (20 g/L de AV). Sin
embargo, para la relación C/N 20.35 se observó mejor ajuste para todas las variables con el
modelo con factor de rendimiento variable (Figura 2B), y para la relación C/N 2.07 se observó
un mejor ajuste solo para la concentración de SA. Estas observaciones permiten confirmar
que el uso de una función para el factor de rendimiento biomasa/nitrógeno, en lugar de un
valor fijo, puede mejorar la predicción de la dinámica de la fermentación; esta mejor
predicción aumenta la confiabilidad del proceso de optimización y brinda mayor información
de la cinética de la bacteria B. cepacia B27. Para la fermentación con relación C/N = 2.07, el
ajuste solo difiere para la concentración de SA debido a que la concentración de AV es
bastante baja (AV = 5 g/L y 𝐾𝑠𝑐 = 4.19 g/L) lo que hace que el proceso este fuertemente
limitado por el sustrato AV y que el nitrógeno tenga un efecto de menor importancia; en
consecuencia, la estimación errónea de la disponibilidad de nitrógeno no afecta de forma
significativa la predicción de las otras concentraciones, durante la fermentación.
4. CONCLUSIONES
Los resultados previos, presentaban un ajuste aceptable con el modelos con factor de
rendimiento biomasa/nitrógeno constante, sin embargo, en la búsqueda de una simulación con
mayor confiabilidad en la predicción del comportamiento de la B. cepacia B27 (mejor ajuste)
se definió un factor de rendimiento variable con lo que se mejora la predicción del
comportamiento para relaciones C/N altas y bajas. Lo anterior confirma que la incorporación
de parámetros variables en función de las condiciones del cultivo (relación C/N), puede
aumentar la fiabilidad de la optimización en sílico para la producción de PHAs, la cual es una
herramienta clave para el escalado final de proceso.
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