Practica 8 Antibiograma

1.4. Practica No. 008 – Prueba de sensibilidad antimicrobianos (Método de
Kirby Bauer) – No. Sesiones 02
1.4.1. Tema a desarrollar
El descubrimiento de sustancias para controlar el crecimiento y
reproducción bacteriana fue un evento revolucionario para la terapéutica
médica. Sin embargo, el uso de agentes antimicrobianos promovió la selección
de aquellas poblaciones bacterianas que lograron desarrollar mecanismos para
evitar los efectos nocivos que estas sustancias provocan (6).
Los mecanismos de resistencia a los antibióticos están determinados
por cambios genéticos que se transmiten entre las poblaciones bacterianas de
forma vertical (a las siguientes generaciones) y de forma horizontal (entre
poblaciones de la misma generación a través, principalmente, de la
conjugación). (7). Es así que, la resistencia a antibióticos es uno de los
principales problemas a los que se enfrentan los sistemas de salud a nivel
mundial. Los médicos tienen la responsabilidad de seleccionar y usar los
medicamentos antibióticos más apropiados basando su decisión en el
conocimiento integral de la problemática.
Por esto, es fundamental que el estudiante de medicina conozca los
principios y técnicas que permiten determinar si una población bacteriana es
sensible o resistente a los antibióticos. Estas técnicas se conocen como
pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y serán el tema de estudio de esta
práctica.
1.4.2. Objetivos de la práctica
1. Conocer el procedimiento para realizar una prueba de difusión por disco.
2. Identificar las variables que pueden influir en los resultados de una prueba de
difusión por disco.
3. Basado en las recomendaciones de CLSI, interpretar los diámetros de la zona
de inhibición como sensible, intermedio o resistente para cada bacteria.
1.4.3. Alcance
Esta práctica cubre desde la preparación del inóculo hasta la interpretación de los
resultados obtenidos en el antibiograma, caracterizando a las poblaciones bacterianas
analizadas como susceptibles o resistentes a los diferentes antibióticos probados.
1.4.4. Requisitos previos a la realización de la práctica
Previo a la realización de la práctica el estudiante deberá:
1. Revisar la guía de la práctica y recursos que se encuentran en aula virtual.
1
2. Consultar y leer al menos 2 fuentes bibliográficas indexadas sobre el tema de
la práctica de no más de 5 años de antigüedad.
1.4.5. Aparatos, equipos e instrumentos
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Turbidímetro calibrado
Incubadora 37ºC
Mechero Bunsen
Microscopio binocular
1.4.6. Parámetros, magnitudes y rangos a ser determinados
Los resultados del test de susceptibilidad a antibióticos son medidas en milímetros
(datos cuantitativos) de los halos de inhibición de crecimiento bacteriano. Estos datos
cuantitativos permiten categorizar las bacterias estudiadas como sensibles,
intermedias o resistentes. Los rangos referenciales (CLSI) que permiten establecer
esta categorización son específicos para cada bacteria y antibiótico
1.4.7. Materiales y reactivos
Materiales
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Tubos de ensayo
Cajas de fósforos
Guantes de manejo S/M/L
Marcador
Escala McFarland 0.5
Hisopos
Mascarillas desechables
Pinzas quirúrgicas
Gradillas plásticas
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Müeller-Hinton
Antibióticos
Enterobacteriaceae
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Ampicilina/sulbactan.
Ampicilina/penicilina
Cefazolina
Gentamicina.
Ciprofloxacina/levofloxacina
Reactivos
Staphylococcus aureus
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Etanol 70%
Solución salina
Medios de cultivo
Eritromicina.
Clindamicina.
Doxicilina.
Trimetoprim/sulfametoxazol.
Oxacilina/cefoxitina
1.4.8. Recursos adicionales
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Cultivos bacterianos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus).
Cultivo Mueller Hinton con Klebsiella productora de BLEE con discos de
amoxicilina/ácido clavulánico, ceftazidime, cefepime, ceftriaxona, cefotaxima.
Cultivo Mueller Hinton con Staphylococcus aureus meticilina resistente y
resistencia inducible a macrólidos, con discos de cefoxitina, eritromicina y
clindamicina.
1.4.9. Descripción del procedimiento
2
SESIÓN 1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
De cada cultivo bacteriano (2 cultivos por grupo), seleccionar 1 colonia, con el
asa bacteriológica y con mucho cuidado tomamos la colonia y la disolvemos en un
tubo que contenga 2mL con solución salina al 0.9%.
Ajustar la turbidez al estándar McFarland 0.5 medido en Turbidímetro. Si la
turbidez del cultivo sobrepasa a la del estándar diluir con solución salina al 0.9% a
la concentración deseada (0.5 McFarland). Caso de no contar con turbidímetro,
ajustar la concentración del cultivo comparando con un estándar preparado y
observarlo con una tarjeta con rayas negras y fondo blanco (Tarjeta Wickerham).
Introducir un hisopo estéril en el tubo con solución salina previamente inoculado,
se debe eliminar el exceso del hisopo por rotación en las paredes del tubo,
posterior a lo cual debe inocular la superficie seca de una placa de agar rayando
el hisopo tres veces sobre toda la superficie de agar; gire la placa
aproximadamente 60 grados cada vez para garantizar una distribución uniforme
del inóculo.
Para finalizar la inoculación pasar el aplicador por la periferia del medio de cultivo.
Permitir secar mediante el reposo por un lapso de 3 a 5 minutos y no más allá de
15 minutos.
Coloque los discos con los antibióticos sobre el agar mediante pinzas estériles o
usando un aplicador de discos. Oprima los discos suavemente con una pinza para
asegurar un buen contacto con el medio de cultivo. Los discos deben estar
espaciados de manera que su distancia a la pared de la placa sea de 15 mm y
entre ellos de 20 a 30 mm.
Incube a 35 – 37°C hasta el siguiente día.
SESIÓN 2
1.
2.
3.
4.
Realice meticulosamente la medición en milímetros de los halos de inhibición de
los diferentes antibióticos. Para ello coloque la regla sobre cada uno de los discos
por el reverso de la placa, determinando en cada caso el tamaño del diámetro del
halo.
Identifique el antibiótico y su concentración y escriba en su cuaderno la medida en
mm obtenida para cada uno.
Compare los resultados por usted obtenidos con los datos que se ofrecen en las
tablas de referencia para la determinación de las categorías de susceptibilidad por
métodos de difusión y determine la categoría de susceptibilidad correspondiente a
cada antibiótico.
Informe, analice e interprete los resultados.
4.4.1. Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación de
resultados.
3
El estudiante obtendrá datos cuantitativos (longitud en mm de halos de inhibición de
crecimiento bacteriano) los cuales serán traducidos a valores cualitativos (sensible,
intermedio, resistente), caracterizando a la población bacteriana. Estos resultados
deberán ser presentados en una tabla que deberá ser debidamente confrontada con
información estandarizada para cada antibiótico y para cada bacteria. La información
previa está basada en el manual del CLSI. Además, deben analizar e interpretar los
resultados.
Tabla 1. Registro de Antibiograma
Microorganismo aislado:
Disco de antibiótico
Diámetro en milímetros
Interpretación (S, I, R)
Observaciones:
La interpretación se expresa en sensible (S), sensibilidad intermedia (I) o resistente
(R).
4.4.2. Referencias cruzadas
Refiérase a las prácticas 001
4.4.3. Referencias normativas
No aplicables
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