Gordillo 2012-Introducción a la ingeniería biomédica-128-159

ingeniería tisular
Imelda Olivas Armendariz*1y Carlos Alberto Martínez Pérez**
El presente capítulo cubre los aspectos básicos de la ingeniería tisular, los biomateriales y las principales técnicas de fabricación, la interacción biomaterialcélula, el cultivo celular y otros.
E
5.1. Introducción
n la actualidad la ingeniería tisular o ingeniería de tejidos es un
área en la cual converge el trabajo multidisciplinario e interdisciplinario. A nivel mundial, esta área de investigación está jugando un rol muy importante en la medicina regenerativa, para
tal efecto se han formado redes de investigación, como La Red
de la Unión Europea de Excelencia en Ingeniería Tisular de Hueso y Cartílago,
que abarca a 20 instituciones de 13 países europeos, así como la Sociedad Internacional de Ingeniería Tisular y Medicina Regenerativa. Estas redes se han
creado con la intención de conjuntar esfuerzos de diferentes investigadores de
distintas áreas y diferentes países para acelerar los avances que puedan llevar al
completo éxito de poder regenerar un tejido u órgano.
*1Doctora en Ciencias de los Materiales por el Centro de Investigación en Materiales
Avanzados. Profesora del departamento de Física y Matemáticas e investigadora del
Cuerpo Académico de Ingeniería Tisular y Medicina Regenerativa de la Universidad
Autónoma de Ciudad Juárez.
**1Doctor en Ciencias de los Materiales por el Centro de Investigación en Materiales
Avanzados. Profesor investigador en el departamento de Física y Matemática de la
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (UACJ), líder del Cuerpo Académico de Ingeniería Tisular y Medicina Regenerativa de la UACJ. Investigador asociado del programa de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Texas, en El Paso.
127
Capítulo 5
En los últimos años, el desarrollo de biomateriales se ha enfocado a la
ingeniería tisular, o como varios investigadores prefieren llamarla, medicina regenerativa. Ésta busca cubrir la necesidad de establecer terapias alternativas para
el tratamiento de la pérdida o falla de un tejido u órgano. La ingeniería tisular
llevará a un gran impacto en el sector salud dentro de las próximas décadas,
debido a que el trasplante frecuentemente está limitado por la insuficiencia del
donador; también está asociado al alto riesgo de rechazo y transferencia de alguna infección o enfermedad. En el pasado, los biomateriales convencionales han
sido muy útiles y han mejorado la calidad de vida de muchos pacientes, ejemplo
de esto son las diferentes prótesis para cadera y rodilla. Sin embargo, todavía
no existen materiales disponibles que puedan reemplazar de manera adecuada y
funcional varios tejidos, tales como cartílago y grandes segmentos de huesos, sin
mencionar órganos con mayor complejidad. A manera de ejemplo, el mercado
mundial para injerto de hueso con materiales sintéticos representa tan solo el
10%, mientras que el auto-injerto representa alrededor del 50%.
La ingeniería tisular ha sido definida como el uso de procesos de ingeniería, química, biología y física para controlar y dirigir el comportamiento celular.
Otra definición dada por Langer y Vacanti (Langer, 1993), la describe como
“un campo interdisciplinario de investigación que aplica los principios de ingeniería y ciencias biológicas hacia el desarrollo de tejido sustituto, que restaure,
mantenga o mejore la función del tejido”. En contraste con los biomateriales
tradicionales, ésta se basa en el entendimiento de la regeneración y formación
de tejido que tiene como meta la inducción de tejido nuevo funcional, más
que sólo un implante inerte de repuesto. Existen tres elementos claves en la
ingeniería tisular:
128
• El biomaterial.
• Las células.
• Los factores de crecimiento.
El primero de ellos, el biomaterial, tiene la función de soporte o portador y juega un papel clave en la mayoría de las estrategias para la ingeniería
tisular. Por ejemplo, los biomateriales pueden servir como un substrato sobre
el cual la población de células pueda adherirse y emigrar, ser implantado con
una combinación de células específicas, así como un vehículo de liberación de
células. También puede ser utilizado como un portador de drogas para activar
funciones celulares específicas en una región localizada. Referente a los factores de crecimiento, tienen la función de facilitar y ayudar en la proliferación
celular.
En general, el reto para la elaboración de biomateriales para soporte en
la ingeniería tisular es construir replicas biológicas in vitro, de tal forma que el
material compuesto elaborado pueda ser integrado y trasplantado in vivo para
la recuperación de tejidos u órganos perdidos o con un mal funcionamiento.
Subsecuentemente, el composito debe funcionar coordinadamente con el resto
del cuerpo sin riesgo de rechazo o complicaciones.
Estos materiales deben tener ciertos requerimientos generales que harán
que tenga éxito o no. Deben poseer gran porosidad, los poros deben tener un
rango desde 20 hasta 300 µm, el cual varía de acuerdo con el tejido que se desea regenerar. Esta misma porosidad debe ser interconectada de tal forma que
permita la vascularización y la infiltración celular. En cuanto a las propiedades
mecánicas, deben de ser lo más similar posible al tejido circundante del órgano
o tejido natural a ser reemplazado. La velocidad de degradación debe controlarse de acuerdo a la localización y función específicas, y no debe presentar
toxicidad. Otros aspectos, como la morfología, topología y la funcionalidad en
la superficie también se deben de evaluar.
Existe una gran variedad de materiales biocompatibles entre los metales,
cerámicas y polímeros, pero la restricción de biodegradabilidad y la naturaleza
no quebradiza excluyen a los metales y a la mayoría de los cerámicos como
biomaterial de soporte, dejando como más adecuados a los polímeros.
5.2. Matriz extracelular
La matriz extracelular (MEC) es un sistema dinámico integrado por
una mezcla compleja de moléculas secretadas por las células en cada órgano y
tejido, las cuales se encuentran organizadas en una estructura tridimensional
específica para cada tejido (Olsen, 2000). Las principales moléculas son las
proteínas fibrosas, como colágenos, elastina, fibrina y laminina, y los heteropolisacáridos hidrófilos, como las cadenas de glicosaminoglicanos en ácido
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129
Capítulo 5
130
hialurónico y proteoglicanos. Esta combinación de moléculas proporciona el
soporte estructural y resistencia a la tracción, sitios de unión para receptores
de la superficie celular y para el correcto funcionamiento de cada tejido. Proveen la señalización adecuada entre células adyacentes y células-MEC, contribuyendo esta interacción (bidireccional y dinámica) a la migración, proliferación, diferenciación, forma, metabolismo y la consecuente muerte celular, así
como a la modulación de la angiogénesis, vasculogénesis, respuesta inmune,
inflamación y la cicatrización de heridas (Badylak, 2002). Dicho de otra manera, la MEC es un componente indispensable de todos los órganos y tejidos, y
un soporte natural para la morfogénesis, mantenimiento y reconstrucción de
órganos y tejidos después de una lesión. Su presencia en los diferentes órganos es muy variable, así en la piel, cartílago, tendón y hueso es un componente
muy abundante, mientras que en el cerebro y la médula espinal es más escaso.
La MEC también forma parte de una serie de pequeñas estructuras, como
ligamentos elásticos, la córnea, el revestimiento trasparente del globo ocular,
membranas como las que están en la base de los epitelios y endotelios, redes
reticulares en los órganos, vasos sanguíneos y paredes intestinales, láminas
asociadas con los músculos y nervios. Además, la matriz puede calcificarse,
formando estructuras sólidas, como el hueso o los dientes, o puede adoptar
una organización parecida a cordones, como en el tendón, al cual le confiere
su enorme fuerza mecánica (Jiménez, 2003).
Por lo tanto, el diseño de la MEC artificial es muy importante para la
ingeniería de tejidos, ya que regula comportamientos celulares, como proliferación, migración y diferenciación, además de ser un sustrato adhesivo, proveer la
estructura, entrega y mantenimiento de factores de crecimiento y señalización.
Por lo anterior, constituye un gran reto para la ingeniería tisular la fabricación
de estructuras artificiales que conduzcan a la reconstrucción de tejidos u órganos dañados o perdidos. Es necesario el uso de una MEC en, o sobre la cual
las células se desarrollen, organicen y se comporten como si estuvieran en sus
tejidos nativos.
5.3. Interacciones celulares
La ingeniería de tejido, en analogía con el desarrollo y la cicatrización
de heridas, es un proceso dinámico en el que el tipo correcto de célula debe
estar en el lugar y momento indicado para constituir un tejido que funcione
normalmente, al ser la comunicación entre las células y el resto del cuerpo muy
importante en la coordinación del número, posición y función celular. Las células están provistas de mecanismos de señalamientos que les permiten recibir
estímulos ambientales y responder adecuadamente a ellos; el éxito de estos mecanismos asegura que el organismo sobreviva a sus cambiantes circunstancias
ambientales. Estos mecanismos forman redes de comunicación más complejas,
que garantizan que cada célula funcione y responda a una diversidad aún mayor
de estímulos y que lo haga coordinadamente con las otras células del organismo.
Gracias a esta comunicación entre células el organismo mantiene una funcionalidad como entidad unitaria, a pesar de estar constituido por millones de células
de muy diverso linaje. De esta red de comunicación dependen funciones tan
importantes como el desarrollo embrionario, la proliferación y diferenciación
celular, las respuestas al estrés, la percepción sensorial, el movimiento, la respuesta inmune y la regulación metabólica, entre otras (Jiménez, 2003).
Por lo tanto, las células deben poseer un sistema de generación, transmisión, recepción y respuesta de una multitud de señales que las comunican
e interrelacionan funcionalmente entre sí. La señalización celular se inicia por
la generación de un ligando, es decir, una entidad molecular generada por el
envío de una célula que envía mensajes a otras células del cuerpo. Las células
sólo pueden responder a un mensaje extracelular si expresan receptores que
reconozcan y se unan de modo específico al ligando en particular. En la mayor
parte de los casos, el ligando se une con un receptor en la superficie extracelular. Esta interacción determina que una señal se revele a través de la membrana hasta el dominio citoplasmático del receptor (Karp, 2005). Un ejemplo
de la señalización es la contracción de las células musculares provocado por la
liberación de acetilcolina de las neuronas motoras a las células musculares. Las
proteínas expresadas por la célula determinan si responde y como responde
a una señal determinada. Dado que el perfil de expresión génica es diferente
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para cada tipo de células, las células responden de manera diferente a ciertas
señales. Un ejemplo es la hormona glucorticoide, que desencadena la muerte
celular de linfocitos, pero estimula la diferenciación osteogénica de las células
madre mesenquimales. Por otra parte, las células responden de manera diferente a ligandos con diferentes concentraciones y las células en el cuerpo por lo
general no están expuestas a una sola señal de una sola concentración, sino a
una mezcla de hormonas, citocinas y factores de crecimiento. La señalización
celular puede considerarse en tres etapas.
1. Inicio de la señal: un ligando extracelular se une al receptor en la superficie de la célula. El ligando produce cambios en la actividad del
receptor, lo que genera la señal.
2. Traducción de la señal: el receptor activado desencadena una cascada
de transducción de señales en las que se activan las proteínas intracelulares, conduciendo a la activación de un factor de transcripción en
el núcleo celular.
3. La activación de genes: el factor de transcripción se une a secuencias
reguladoras de genes, resultando en la activación de genes, la síntesis
de proteínas y el cambio en la fisiología celular.
Capítulo 5
Los cambios en la expresión genética usualmente incluyen la producción
de otras señales, que a su vez modificarán la actividad de otras células, por lo
que la traducción de señales se ha convertido en una de las áreas de investigación más activas en ingeniería de tejido, ya que el conocimiento detallado de la
señalización puede ayudar en el diseño racional del enfoque de ingeniería de
tejido.
132
5.4. Interacción célula-MEC
Muchas de las actividades en las cuales la MEC ejerce una función moduladora están reguladas por un conjunto de señales que se registran directamente
a través de receptores a las moléculas de la MEC, como las integrinas. Además,
la MEC sirve como sitio de almacenamiento para factores de crecimiento que se
asocian con el heparán-sulfato extracelular, tales como la familia de los factores
de crecimiento de fibroblastos y factores que se unen a proteínas de la MEC, entre los que destacan el factor de necrosis tumoral alfa y el factor de crecimiento
transformante beta (TNFα y TGFβ1). Como ya ha sido mencionado, la MEC
se conforma de una gran variedad de moléculas, las cuales interaccionan entre
sí, generando la estructura tridimensional a la cual las células se adhieren, ya sea
por receptores específicos o ligandos (Petreaca, 2007).
Entre las moléculas que constituyen la MEC se encuentra el colágeno (la
proteína más abundante en la MEC, más del 90%), que es el responsable de
la resistencia mecánica de los tejidos conjuntivos. Han sido identificados más
de 20 diferentes tipos de colágeno, cada uno con una función biológica única.
El colágeno tipo I es la principal proteína estructural presente en tendones y
ligamentos, es una fuente de colágeno para muchas aplicaciones de dispositivos
médicos debido a su abundancia, a sus propiedades físicas y biológicas (Pachence, 2000). El colágeno tipo I de bovino obtenido del tendón de Aquiles es el
componente más utilizado en MEC xenogénicas para aplicaciones terapéuticas. Otros tipos de colágenos de la MEC proporcionan diferentes propiedades
mecánicas y físicas a la MEC, y al mismo tiempo contribuyen a la población
de ligandos que interactúan con las poblaciones celulares residentes. Por ejemplo el colágeno tipo IV, presente en la membrana basal de la mayoría de las
estructuras vasculares y dentro de los tejidos que contienen un componente
de las células epiteliales, es utilizado como recubrimiento biocompatible para
dispositivos biomédicos. Por otro lado, el colágeno tipo III se encuentra dentro
del tejido submucoso de ciertos órganos, como la vejiga urinaria, ubicación en
la que se requiere flexibilidad para una apropiada función. El colágeno tipo
VI es una molécula que actúa como una unidad de conexión entre glicosaminoglicanos y proteínas estructurales de gran tamaño, como el colágeno tipo
I, proporcionando así una consistencia gelatinosa a la MEC. El colágeno tipo
IV es encontrado dentro de la membrana basal de la epidermis y funciona
como fibrilla de anclaje para proteger a los queratocinocitos de los esfuerzos
residuales. Cada tipo de colágeno es el resultado de determinados patrones de
expresión génica y en la naturaleza están íntimamente asociados con proteínas
glicosiladas, factores de crecimiento y otras proteínas estructurales, como la
elastina y laminina, proporcionando características únicas al tejido.
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Capítulo 5
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Por otro lado, la elastina le confiere a la MEC cualidades de flexibilidad
y elasticidad, y la fibronectina, molécula dimérica, proporciona ligandos para la
adhesión de muchos tipos de células. Se sintetiza principalmente en los fibroblastos y marca las vías migratorias de las células embrionarias, de modo que las
células del organismo en desarrollo que están migrando puedan llegar a su destino. Las características de las células-fibronectina lo han hecho un sustrato atractivo para el cultivo celular in vitro y para su uso como recubrimiento de soportes
de materiales sintéticos para promover la biocompatibilidad del huésped.
La laminina es una proteína compleja encontrada en la MEC, que desempeña un papel importante en el desarrollo embrionario y en la estimulación
de la proliferación de una gran variedad de linajes celulares. Se localiza en la
lámina basal, tiene sitios de fijación para heparan sulfato, colágeno tipo IV,
ectactina y membrana celular.
La MEC contiene una mezcla de glicosaminoglicanos dependiendo de
la ubicación del tejido de la MEC del huésped, la edad y el microambiente. Los
glicosaminoglicanos unen a factores de crecimiento y citocinas, promueven
la captura de agua y contribuyen a las propiedades de gel de la MEC. Junto
con la viscosidad que brindan los glicosaminoglicanos, también se observa una
compresibilidad baja, la cual hace que estas moléculas sean ideales como líquido lubricante en articulaciones. Al mismo tiempo, su rigidez brinda integridad
estructural a las células y provee vías entre las células, permitiendo la migración
celular, por lo que se ha propuesto a este mecanismo como una de las formas
de control de retención y flujo de agua, difusión de solutos y migración celular
(Martins-Green, 2000).
Los factores de crecimiento, a pesar de estar presentes en pequeñas cantidades en la MEC, actúan como moduladores potentes del comportamiento
celular. Éstos pueden estimular o inhibir la división celular, la diferenciación y
la migración. Regulan procesos celulares, como la expresión de genes, la síntesis de proteínas y ADN, y liberan el factor autocrino y paracrino (Gook, 1998).
Se han dado varios enfoques al uso de factores de crecimiento (purificados)
en ingeniería de tejido, como métodos terapéuticos en la formación de vasos sanguíneos (Zeng, 2010), estimulando el depósito de tejido de granulación
(Zeamari, 2004) y hueso (Patel, 2008), y fomentando la formación del epitelio
en las heridas (Bao, 2009). Sin embargo, este enfoque terapéutico ha tenido
problemas debido a la dificultad en determinar la dosis óptima y los métodos
de liberación, la habilidad de mantener y colocar la liberación del factor de crecimiento en el sitio deseado y la inhabilidad para activar o desactivar, cuando
sea necesario, el factor durante el tiempo de regeneración del tejido. La ventaja
de utilizar la MEC como sustrato o soporte para el crecimiento celular y la diferenciación es la presencia de todos los factores de crecimiento que conlleva
(y sus inhibidores) en la misma cantidad relativa que existe en la naturaleza, y
tal vez lo más importante, en su estructura tridimensional. La MEC presenta
estos factores eficientemente a residentes o receptores de la migración celular,
protege a los factores de la degradación y modula su síntesis.
Por ello, es importante la compresión molecular adecuada de la MEC
para entender el comportamiento celular en el contexto del desarrollo y función de órganos y tejidos. La alteración de la MEC implicaría la pérdida de
nutrición, eliminación y denervación celular, regeneración, cicatrización, transmisión mecánica y la pérdida de una correcta respuesta inmune ante agentes
infecciosos, tumorales y tóxicos.
5.5. Abastecimiento de la célula
Las células son los elementos funcionales de la reconstrucción y regeneración. El éxito de la ingeniería de tejido se encuentra en la capacidad de
predecir con precisión la respuesta celular, adquirir las células adecuadas y en
cultivar las células para una proliferación y diferenciación para la función o
fenotipo apropiados. Las opciones disponibles, dependiendo de la aplicación,
para el abastecimiento celular, son: las células autólogas (tomar células del mismo huésped), las células alogénicas (tomar células de un donante) y las células
xenogénicas (McIntire, 2003). Cada una de estas categorías se puede subdividir
dependiendo del estado de diferenciación celular.
Hay tres grupos de células no alteradas genéticamente y utilizadas en
ingeniería tisular. En primer lugar están las células indiferenciadas de origen
embrionario o umbilical, frente a las células diferenciadas, las que caracterizan a
cada tejido del organismo, como pueden ser los osteoblastos, condrocitos, hepatocitos, neuronas, etcétera. Entre ambos tipos disponemos de un tercer grupo de células intermedio, sin diferenciar, conocidas como células madre (stem
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cells), que pueden dirigirse hacia líneas celulares muy distintas. Según la capacidad de diferenciación, hay tres grupos de células: células sin restricción (capaces de
diferenciarse en cualquier línea), células multipotenciales y células determinadas.
El uso de células autólogas en ingeniería de tejido tiene la ventaja de evitar
una respuesta inmunológica y rechazo del tejido artificial, ya que es su propio
tejido y no se tendrá que tomar fármacos inmunosupresores. La mejor fuente
de células autólogas es el órgano a ser reparado o reemplazado por contar con
el código genético compatible con el órgano. Sin embargo, las células autólogas
saludables en cantidades suficientes no siempre pueden ser cultivadas en un
órgano dañado o enfermo. Las células utilizadas en ingeniería tisular no deben
contar con defectos genéticos, ya que no podrían proliferar o se producirían
tejidos genéticamente defectuosos. Por otro lado, el uso de células autólogas
es a menudo el camino más obvio y conveniente a la aplicación clínica de un
producto fabricado mediante ingeniería de tejido, debido a la reducción de las
necesidades de reglamentación y seguridad en comparación con la utilización
de células alogénicas o xenogénicas.
Por otro lado, se han obtenido buenos resultados en investigaciones en
las cuales han sido utilizadas células somáticas alógenas, dando lugar a la aprobación del uso de productos alogénicos de ingeniería tisular. Sin embargo, el uso
de células alógenas para la reconstrucción fisiológica a corto plazo, o la estimulación de la regeneración tisular es más complicado, debido a la posibilidad de
rechazo inmunológico a las células donadas. Por lo tanto, para una terapia celular exitosa se debe tomar en cuenta el componente inmunológico, la función
biológica y la estructura física.
Capítulo 5
5.6. Células madre
136
Las células madre se han definido como células clonogénicas, con un
amplio potencial de auto renovación (definida como la capacidad de generar
al menos una célula hija con características similares a la célula de origen,
manteniéndose al mismo tiempo en un estado indiferenciado), así como la
elevada capacidad de proliferación (posibilidad de la célula para dividirse sin
cambiar su fenotipo celular indiferenciado) y su potencial de diferenciación (potencial para modificar el fenotipo de la célula de origen en distintos tipos
celulares, diferentes al tejido embrionario original en varias líneas celulares
como médula ósea, sangre periférica, cerebro, piel, pulpa dental y ligamento
periodontal, entre otros (Estrada, 2006).
Las células madre se pueden dividir en dos grandes grupos: las células
madre embrionarias y adultas o somáticas. Las células madre embrionarias son
responsables del desarrollo y crecimiento embrionario y fetal, mientras que las
células madre adultas son responsables del crecimiento, mantenimiento, regeneración y reparación de tejidos u órganos dañados o enfermos (tabla 5.1). Lo
anterior ha generado un gran interés por las células madre, pero a pesar de las
ventajas que presentan, su utilización se ve muy limitada por los problemas de
tipo ético y metodológico que las rodean. Las células madre de individuos adultos han mostrado la capacidad de formar algunos tipos de tejidos y actualmente
es la fuente celular más utilizada en la ingeniería de tejido óseo (Wu, 2007; Esparza, 2008; Siepe, 2008), ya que su obtención es relativamente fácil y pueden
ser encontradas en la médula ósea y el tejido adiposo. Estos experimentos han
comprobado que células madre de individuos adultos, cultivadas y sometidas
a ambientes distintos a los habituales, pueden transdiferenciarse y dar lugar a
otros tipos celulares que hasta ahora se pensaba que eran incapaces de generar.
Tabla 5.1. Tipos de células madres adultas (modificada de Virchow, 2008).
Tejido de origen
Tipo de célula
Especie
Tejido in vitro
formado in vivo
Músculo
Piel
Sistema nervioso
Hígado
Riñón
Células satelitales
Células madre epiteliales
Células madre neurales
Hepatocitos, células ovales
Células madre renales,
Células madre mesenquimales
Células madre pancreáticas
−
−
Ratón
Rata
Humano
−
−
−
Páncreas
Hígado
−
−
Músculo
Páncreas
−
Rata
Hígado
−
Páncreas
Continúa...
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Tejido de origen
Corazón
Tipo de célula
-Células madre cardiacas
-Células progenitoras adultas
multipotentes
-Células madre mesenquimales
Médula ósea
No fraccionadas
Especie
Ratón
Ratón,
rata,
humano
Ratón,
rata,
humano
Ratón
Rata
Humano
Canina
Tejido in vitro
−
Múltiples tejidos
de las 3 capas
germinales
Cardiomiocitos
Músculo
esquelético
Osteoblastos
Condroblastos
Adipocitos
Células
neuronales
−
formado in vivo
Endotelio
Múltiples tejidos
de las 3 capas
germinales
Cardiomiocitos
Músculo
esquelético
Osteoblastos
Condroblastos
Adipocitos
Células
neuronales
Páncreas
Hígado
Piel
Intestino
Epitelio
Músculo
esquelético
Músculo
cardiaco
Capítulo 5
5.7. Diseño y fabricación de soportes
138
Los soportes y conceptos en los cuales se basa la ingeniería tisular implican la combinación de células viables, indiferenciadas o no, biomoléculas (factores que aceleren su proliferación y diferenciación) y un soporte estructural que
combinados sean capaces de promover la reparación y regeneración de tejidos
(figura 5.1). Esta combinación tiene como objetivo apoyar la migración, crecimiento y diferenciación celular y guiar el desarrollo y la organización del tejido
a un estado maduro y saludable.
Los requerimientos de los materiales de soporte para ingeniería tisular
son numerosos y extremadamente desafiantes. Primero, el material no debe ser
mutagénico, cancerígeno, tóxico, y debe tener una degradación controlada, debe
ser biocompatible, no debe provocar una respuesta inflamatoria ni mostrar respuesta inmune o de citotoxicidad. Entendiendo por degradación controlada,
aquélla en la cual el soporte tenga una velocidad de degradación que permita
Figura 5.1. Diagrama mostrando el enfoque de la ingeniería de tejido en la reparación y
regeneración de tejidos. La formación de tejido es un cultivo dinámico en un biorreactor,
que permite la estimulación mecánica, el mejoramiento génico y mejorar las condiciones
de cultivo como: mayor intercambio de nutrientes, oxígeno y productos de desecho celular
(adaptado de Puppi, 2010).
Estímulo
mecánico
Soporte
Formación de tejido
Biorreactor
Cultivo
Biomoléculas
Terapia génica
Células
Cultivo
celular
Biorreactor
la formación del nuevo tejido, y al mismo tiempo mantenga suficiente integridad física para continuar ejerciendo su función de soporte. Además, debe estar
acompañada por un pH bajo en el medio in vitro o en el sitio del cuerpo deseado del paciente y no liberar productos tóxicos. El tiempo en el cual el soporte
deberá mantener su integridad física dependerá del grado de remodelación de
cada tejido (piel 4 a 6 semanas, hueso 4 a 6 meses) y de la anatomía y fisiología
del huésped. La arquitectura del soporte debe permitir la adhesión inicial de la
célula y su posterior proliferación en y a través de la matriz, la transferencia de
masa de metabolitos y nutrientes, y el espacio suficiente para el desarrollo y posterior remodelación del tejido organizado, por lo cual la degradación y la cinética
de reabsorción del soporte necesitan ser diseñados en base a las relaciones de
las propiedades mecánicas, el peso molecular, pérdida de masa y desarrollo del
tejido (figura. 5.2).
Por otro lado, las propiedades mecánicas del soporte deben ser las adecuadas a la aplicación deseada (alta resistencia y rigidez inicial para sustituir la
función mecánica del tejido dañado) y no colapsarse durante el tratamiento ni
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139
Figura 5.2. Ilustración gráfica de la interdependencia compleja de la pérdida de peso molecular y la pérdida de masa de un soporte tridimensional contra tiempo de un trasplante de
hueso en la ingeniería de tejidos.
Erosión
Erosión
pérdida de masa metabolización
Hidratación
degradación
Hidratación
Metabolización
100%
Remodelación de constucción in vivo
50%
Pérdida de
peso molecular
Pérdida tridimensional
de masa en el soporte
Ingeniería de construcción in vivo
0%
0
3
6
12
24
Número de semanas
A
B
C
E
Capítulo 5
D
140
durante las actividades normales del paciente (Wang, 2005; Wong, 2006). Los
soportes no necesariamente deben proveer una equivalencia mecánica completa del tejido sano, pero la resistencia y rigidez deben ser suficientes para al
menos soportar y transmitir fuerzas al sitio deseado del tejido del huésped. Por
ejemplo, en ingeniería de tejido de piel, el soporte debe ser capaz de resistir las
fuerzas de contracción de la herida. En el caso de la ingeniería de tejido óseo
y cartílago, deberá tener esfuerzo suficiente para resistir el ambiente mecánico
fisiológico en la regeneración de tejidos sujetos a carga en el sitio deseado de la
implantación (Hutmacher, 2008).
Tanto el tamaño y forma de poro, como la porosidad, son parámetros
muy importantes de los soportes. Los macroporos (arriba de 50 µm) influyen
en la función tisular, mientras que los microporos (debajo de 50 µm) están en la
Figura 5.3. Imágenes del microscopio electrónico de barrido mostrando ejemplos de soportes producidos por diferentes técnicas de procesamiento: a) malla de microfibras de ácido
poliláctico producida por electrohilado, b) quitosana preparada por la técnica de separación
de fases inducida térmicamente y de liofilización, y c) deposición de fibras tridimensional.
escala que influye con la función celular (adhesión celular), dado que el tamaño
de células de los mamíferos se encuentra entre 10 y 20 µm. Una porosidad típica de 90%, así como un diámetro de poro de 100 a 200 µm, son los indicados
para la osteoconducción celular y apropiada vascularización del tejido óseo en
crecimiento (Boccaccini, 2003; Marsavina, 2008). Por otro lado, algunas investigaciones han encontrado una relación entre la porosidad y las propiedades
mecánicas (Olivas, 2009). Una alta porosidad (90%) facilita la infiltración celular y formación de la MEC, pero al mismo tiempo reduce el esfuerzo mecánico.
Como se puede observar en la figura 5.3, los poros pueden ser introducidos
en el soporte de una forma aislada o interconectada. La ventaja de los poros
interconectados, como ya ha sido mencionado, es que se mejora el suministro
nutricional en áreas profundas del soporte, permitiendo con ello que las células
sobrevivan en esas regiones.
Como todo material en contacto con el cuerpo humano, el soporte del
tejido debe ser esterilizado con facilidad para prevenir una infección (Zhu,
2006). Finalmente, otras características deseables son aquéllas concernientes al
procesamiento del biomaterial para su producción en forma masiva, y que se
pueda escalar a un nivel de producción industrial rentable.
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141
Capítulo 5
5.8. Material utilizado
en la fabricación de soportes
142
En la actualidad, los componentes de los soportes utilizados por la
ingeniería tisular son producidos a base de polímeros naturales o sintéticos,
como los polisacáridos, poliésteres, hidrogeles y elastómeros termoplásticos,
o de cerámicos activos, como los fosfatos de calcio, vidrios bioactivos y cerámicos vítreos (Rosa, 2005; Cho, 2006; Ziegler, 2009). Recientemente se han
desarrollado copolímeros, compositos de polímeros-cerámicos y compositos
de polímeros-nanotubos de carbono con el objetivo de incrementar la estabilidad mecánica del soporte y mejorar la interacción con el tejido (Balani, 2007;
Bernardo, 2009). Ya que los soportes producidos de polímeros sintéticos y
naturales pueden tener una amplia gama de propiedades fisicoquímicas y técnicas de procesamiento similarea a las de los polímeros sintéticos, así como biocompatibilidad e interacciones biológicas de los polímeros naturales. Además,
también se han estado invirtiendo esfuerzos en el desarrollo de soportes que
conjuntamente tengan la capacidad de liberación controlada de fármacos. Estos soportes pueden liberar localmente factores de crecimiento o antibióticos e
incrementar el tejido en crecimiento para tratar defectos, e incluso como apoyo
a la cicatrización y combate de heridas (Fan, 2009). Como ya se ha mencionado, los requisitos para el desarrollo de materiales de soportes en ingeniería de
tejido son múltiples, y además muy estrictos para poder cubrir con el mayor
número de requisitos posibles. Los sistemas compuestos y copolímeros que
combinan las ventajas de polímeros parecen ser una elección viable, como lo
demuestra el incremento de investigaciones sobre el tema a nivel mundial (Liu,
1995, Xue, 2009).
Entre los materiales que han sido utilizados en la fabricación de soportes
se encuentran los vidrios bioactivos, los cuales cumplen con los criterios de los
soportes utilizados en ingeniería tisular, como son: excelente osteoconductividad y bioactividad (Zhang, 2009), apoyan la actividad enzimática (Chen, 2006),
la vazcularización (Lu, 2009), fomentan la adhesión, crecimiento y la diferenciación celular (Rezwan, 2006) y la biodegradabilidad controlables (Xin, 2009).
Sin embargo, un inconveniente de los vidrios bioactivos es su baja resistencia
a la fractura y resistencia mecánica, especialmente en forma porosa, que aun
no han sido satisfechas (Chen, 2006). Por lo tanto, los vidrios bioactivos sólo
tienen una aplicación limitada en situaciones de carga.
Cerca del 60% en peso del hueso está compuesto por hidroxiapatita
[Ca10(PO4)6(OH)2] por lo tanto, es evidente por qué la hidroxiapatita y los fosfatos de calcio relacionados (α-trifosfato de calcio, β-trifosfato de calcio, tetrafosfato de calcio) han sido investigados como el principal componente de los
materiales de soporte para ingeniería de tejido óseo (Hassna, 2004; Kessler,
2004; Quan, 2008). Como era de esperar, los fosfatos de calcio tienen una
excelente biocompatibilidad debido a su composición química y la estrecha
semejanza de cristal con el mineral óseo (Rezwan, 2006). Mientras que el excelente comportamiento biológico de la hidroxiapatita y los fosfatos de calcio ha
sido bien documentado, su biodegradación relativamente lenta, y en particular
su baja resistencia mecánica limitan su aplicación en la ingeniería de tejido óseo
(Hassna, 2004; Öztürk, 2006).
Entre los polímeros utilizados en aplicaciones biomédicas, como ya se ha
mencionado, se encuentran los de origen natural, como los polisacáridos o proteínas, ya que presentan diversas propiedades adecuadas para ingeniería tisular (Brandt, 2008; Martino, 2005). El colágeno como biomaterial de origen natural (sección
5.4) es el principal componente del tejido conectivo de mamíferos y proteínas de
origen animal, representando cerca del 30% de todas las proteínas del cuerpo humano. También han sido utilizadas laminina, fibronectina, mezcla de colágeno-glicosaminoglicanos, entre otros componentes (Gómez-Guillén, 2011; Jurga, 2011;
Kievit, 2010). Las ventajas de utilizar un material de origen natural se derivan de
su biocompatibilidad y el reconocimiento biológico intrínseco. Se han fabricado
soportes con colágeno tipo I y glicosaminoglicanos (Byrne, 2008), encontrándose efectos significativos del tamaño de poro en la migración de las células
sembradas en el soporte. El soporte apoyó la expresión de colágeno tipo I,
un marcador inicial de la osteogénesis, la deposición de fosfato de calcio y la
producción de osteocalcina, marcador tardío asociado con la mineralización.
También encontraron que la expresión de genes relacionada con el tejido se ve
afectada por el tamaño de poro, la restricción mecánica y la tensión cíclica uniaxial
del soporte, sugiriendo los resultados que los soportes con mayor tamaño de poro
pueden proporcionar un entorno más propicio para la osteogénesis que los soportes
Ingeniería Tisular
Imelda Olivas Armendariz y Carlos Alberto Martínez Pérez
143
Capítulo 5
144
con menor tamaño de poro. Por otra parte, se han estudiado las propiedades de la
quitosana en la formación de piel artificial, compuesta por diferentes materiales,
obteniendo que la adición de la quitosana aumenta la adhesión celular, favoreciendo la proliferación de fibroblastos y queratinocitos, sin causar respuesta
inmune y permitiendo una vascularización adecuada, obteniéndose así una matriz organizada con poca formación de granulación y tejido cicatrizado (Mao,
2003). También se ha utilizado la quitosana como recubrimiento de otras matrices poliméricas biodegradables (regeneración de cartílago), que no promueven
la adhesión y proliferación celular por la superficie hidrofóbica (Bumgardner,
2003). Los investigadores han encontrado que los soportes base de quitosana son
osteoconductores y pueden aumentar la formación de hueso, tanto in vitro como
in vivo (Muzzarelli, 1994). Sin embargo, a pesar de su aceptación en general como
un material biocompatible, los soportes de quitosana son mecánicamente débiles e
inestables, e incapaces de mantener una forma predefinida para el trasplante óseo
como resultado del hinchamiento (Li, 2005).
Un soporte más fue preparado a partir de espuma-cerámicos de óxido
no reabsorbente de un sistema de óxido de circonio-óxido de aluminio. Los
compositos de estos compuestos se caracterizaron por una alta biocompatibilidad (Quan, 2008), ausencia de actividad antigénica y resistencia mecánica
(Walsh, 2000). Los soportes no tuvieron actividad citotóxica y se caracterizaron
por una alta capilaridad y adhesividad. Estas características proporcionaron
efectividad a la inoculación celular y a la proliferación de células estromales
multipotenciales en la superficie del soporte, permitiendo la obtención de una
construcción de ingeniería de tejidos en un período de tiempo corto (7 días).
Los polímeros sintéticos frecuentemente utilizados para la construcción
de soportes tridimensionales en ingeniería de tejido son: α-polihidroxiesteres
saturados, incluidos la policaprolactona (PCL), el ácido poliláctico (PLA) y el
ácido poliglicólico (PGA), así como sus copolímeros (Coh, 2005; Källrot, 2006;
Zhao, 2006; Zhu, 2006; Huimin, 2006; Yu, 2006; Wong, 2007; Guarino, 2008).
Se encontró que el PLA y el PGA se pueden procesar con facilidad y sus velocidades de degradación, propiedades físicas y mecánicas son ajustables en un
amplio rango mediante el uso de copolímeros y diferentes pesos moleculares.
Sin embargo, la lisis de estos polímeros es seguida por una disminución del pH
del medio y daños a los tejidos circundantes (Martin, 1996), experimentando
un proceso de erosión masiva, que puede causar una falla prematura del soporte. Además, la liberación abrupta de productos de degradación ácida puede
causar una fuerte respuesta inflamatoria (Wong, 2007, Jiang, 2006). Para contrarrestar la degradación ácida de los polímeros biodegradables, varios grupos
han fabricado compositos, incorporado compuestos básicos para estabilizar el
pH del medio ambiente que rodea el polímero y para el control de su degradación. Por ello han sido utilizados los vidrios bioactivos y fosfatos de calcio
(Adrew, 2001). Además de su alta estabilidad mecánica (Huimin, 2006), el PDLLA también muestra una excelente biocompatibilidad in vivo y un alto potencial osteoconductivo (Schmidmaier, 2001). Recientemente el cultivo de células
en ácido poliláctico, ácido poliglicólico, o soportes de ácido poli-DL-láctico-coglicólico ha resultado en el desarrollo de sustitutos in vivo para huesos y cartílago (Tiedeman, 1995; Wu, 2006). Aunque estos soportes parecen ser adecuados
para ingeniería tisular (para regeneración de hueso y cartílago), su resistencia
mecánica, su tamaño de poro pequeño y las propiedades hidrofóbicas de la
superficie han limitado su uso (Wu, 2006). Sin embargo, se han encontrado
que los soportes de PDLLA-sulfato de condroitina-quitosana son útiles para
reparar nervios dañados, ya que aunado a sus buenas propiedades mecánicas
y la no toxicidad de sus productos de degradación, este material promueve la
regeneración de defectos de nervios periféricos.
Por otro lado, la PCL ha sido utilizada en la regeneración de tejidos
como piel, hueso, nervio y retina, encontrándose que este material es biocompatible, de bajo costo y fácil de procesar (Ghasemi-Mobarakeh, 2010). En los
resultados reportados por Guarino et al. (2008), encontraron que el composito
de ácido poliláctico y policaprolactona presentaba una porosidad interconectada, degradabilidad controlada e interacciones dirigidas entre el material y la
célula. Un soporte más, involucrando a copolímeros de alto peso molecular
de la ε-caprolactona y L-lactida ha sido investigado por Groot et al. (1997).
Estos copolímeros de alto peso molecular presentaban buenas propiedades
mecánicas, y se observó una curación rápida y completa de las lesiones óseas,
probablemente causado por la buena adhesión entre el tejido óseo y el soporte.
Sin embargo, los inconvenientes fueron los módulos de compresión y la rápida
velocidad de degradación de los soportes. Se ha sugerido el fumarato de polipropileno, un poliéster insaturado lineal, para ser utilizado como soporte que
Ingeniería Tisular
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145
guie la regeneración tisular, a menudo como parte de un composito inyectable
en reemplazo tisular (Rezwan, 2006). Se han desarrollado compositos, combinando fumarato de polipropileno y partículas inorgánicas, como la hidroxiapatita y vidrios bioactivos, ya que los productos de degradación del fumarato de
polipropileno son biocompatibles y son fácilmente removidos del cuerpo; el
doble enlace a lo largo de la estructura polimérica permite el entrecruzamiento in situ, lo que causa un composito moldeable y capaz de endurecerse entre
10 y 15 minutos. Las propiedades mecánicas y el tiempo de degradación del
composito pueden ser controladas al variar el peso molecular de fumarato de
polipropileno, siendo fundamentales la preservación de los dobles enlaces y el
control de su peso molecular durante la síntesis.
5.9. Métodos de fabricación de soportes
Se han desarrollado y aplicado varios métodos de fabricación de soportes
porosos de polímeros biodegradables. Entre ellos, la combinación de técnicas y
de materiales para adaptarse mejor a las demandas mecánicas y fisiológicas del
tejido del huésped. Algunas de las técnicas para la síntesis de polímeros se resumen en la tabla 5.2, donde se hace una comparación de las principales ventajas
y desventajas de las diferentes técnicas.
Tabla 5.2. Técnicas de fabricación para soportes 3D (fuente modificada: Rezwan, 2006).
Procesamiento
Propiedad
de los materiales
Diseño de soporte y reproducibilidad
Tamaño
de poro
(µm)
Porosidad
Aquitectura
(%)
Disolución
Soluble
Manual, material y
técnica inestable
30-300
20-50
Poros esféricos,
permanecen
partículas
salinas en la
matriz
Laminación de Enlace de
membranas
solvente
Soluble
Manual, material y
técnica inestable
30-300
<85
Estructura de
poros irregular
Fabricación no
entrelazados
Fibras
Controlado por
maquinaria
20-100
<95
Propiedades
mecánicas
insuficientes
Técnica
Capítulo 5
Disolución de
partículas/
lixiviación
146
Continúa...
Procesamiento
Propiedad
de los materiales
Diseño de soporte y reproducibilidad
Tamaño
de poro
(µm)
Porosidad
Aquitectura
(%)
Moldeo a alta
temperatura
Moldeo
Termoplástico
Controlado por
maquinaria
50-500
<80
Extrusiónlixiviación
Extrusión
Termoplástico
Controlado por
maquinaria
<100
<84
Poros esféricos,
permanecen
partículas salinas
en la matriz
Liofilización
por emulsión
Disolución
Soluble
Manual, material y
técnica inestable
<200
<97
Alto volumen
de estructura
microporosa
interconectada
Separación de Disolución
fases inducida
térmicamente
Soluble
Manual, material y
técnica inestable
<200
<97
Alto volumen
de estructura
microporosa
interconectada
Tecnología
de fluido
supercrítica
Disolución
Amorfo
Material técnica
inestable
<100
10-30
Alto volumen
estructura
microporosa no
interconectada
Tecnología
de fluido
supercríticalixiviación
Disolución
Amorfo
Material y técnica
inestable
Microporos
<50
Macroporos
<400
<97
Bajo volumen
de estructura
microporosa no
interconectada
Soluble
Controlado por
maquinaria y
computadora
45-150
<60
Macroporo
interconectado
100% (triángulos,
pentágonos,
estructura de
panal ), diseño
y fabricación
capa por capa,
por el uso de
ligantes en baseagua, posible
incorporación
de agentes
biológicos en la
matriz
Controlado por
maquinaria y
computadora
>150
<80
Macroporo
interconectado
100% (triángulos,
pentágonos,
estructura de
panal), diseño y
fabricación capa
por capa
Técnica
Impresión
3-D con o sin
combinación
de lixiviación
de partículas
Modelado
de fusión por
deposición
Fabricación Termoplástico
de forma
libre de
sólido
Ingeniería Tisular
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147
Capítulo 5
148
Las técnicas involucradas son: lixiviación de partículas (Wu, 2006), liofilización (Hokugo, 2006), tecnología de fluido supercrítica, laminación de membranas, sol-gel (Lee, 2005), electrospinning (Caracciolo, 2009), forma libre sólida (Sachlos y Czemuszka, 2003), disolución de partículas-lixiviación de la sal
(Thomson, 1998), inversión de fase (Kowligi, 1988), cristalización eutéctica
(Zwiers, 1983), láser excimer (Doi, 1996), separación de fases inducida térmicamente (Martínez-Pérez, 2003), entre otras.
Los soportes fabricados utilizando la técnica electrospinning han dado lugar
a fibras de diámetro pequeño, mejorando sus propiedades mecánicas, las cuales continúan siendo inadecuadas para una serie de aplicaciones en ingeniería
tisular. Sin embargo, es difícil hacer un soporte que posea tamaños de poros lo
suficientemente grandes. El método de lixiviación de partículas tiene la ventaja de
controlar el tamaño de poro mediante la manipulación del tamaño de las partículas salinas. Sin embargo, el soporte resultante puede tener la interconexión
limitada, lo que impacta negativamente a los cultivos celulares y el crecimiento
celular. Los soportes fabricados utilizando el método de inversión de fase pueden
mostrar una baja interconectividad y es difícil controlar el tamaño del poro. El
uso de láser puede producir soportes con poros ordenados, pero aun el logro de
la conectividad sigue siendo un reto. Las técnicas de sol-gel y liofilización proporcionan estructuras porosas con un tamaño razonable de poro controlado, geometría del poro y los poros en relación al volumen. Las técnicas de fabricación
de forma libre para la preparación de soportes para ingeniería tisular, aunque
se dice están libres de las limitaciones de otros procesos, tampoco son óptimas,
ya que permiten la producción de soportes con tamaños de poro o porosidad
por debajo de cierto límite. El método de separación de fases inducida térmicamente
ofrece la capacidad de controlar el tamaño de poro del soporte, variando las
condiciones de preparación y también proporciona los medios para controlar
la estructura de poro.
5.10. Modificación de la superficie del soporte
La mayor parte de las propiedades del soporte son determinantes críticos
del comportamiento biológico del material. Sin embargo, la respuesta biológica
a un biomaterial se rige por las propiedades de la superficie de los materiales,
sobre todo, la estructura y química de la superficie. La adsorción-activación de
proteínas y la adhesión celular son eventos que regulan la respuesta del huésped a los materiales, se producen en la interfaz material-tejido y las propiedades
físico-químicas de la superficie del material modulan estos eventos biológicos
(García, 2007).
Para modular la respuesta biológica y mejorar el rendimiento del soporte,
se han llevado a cabo diversas modificaciones a la superficie para toda clase de
materiales. Las aplicaciones incluyen la reducción de la adsorción de proteínas
y trombogenicidad, el control de adhesión, el crecimiento y la diferenciación
celular, la modulación de la encapsulación fibrosa y la osteointegración. Las
modificaciones a la superficie pueden ser:
• Modificaciones físico-químicas, las cuales implican alteraciones de los
átomos, compuestos o moléculas de la superficie. Incluyen reacciones químicas (oxidación, reducción, silanización, acetilación, etcétera), grabado y rugosidad-pulido y patrones mecánicos.
• Recubrimiento de la superficie, el cual consiste en un material diferente. Incluyen la inmovilización de biomoléculas, recubrimientos
covalentes y no covalentes y la deposición de una película delgada.
Un ejemplo de lo anterior son los resultados obtenidos en diversas investigaciones (Bonzani, 2007; Anselme, 2000; Jiang, 2006), en las cuales, la
biocompatibilidad se atribuyó en parte a características como la superficie hidrófila de los polímeros y la presencia de topografías heterogéneas, así como
a la energía de la superficie; concluyendo que estas características determinan
como las moléculas biológicas se adsorben a la superficie, y en particular determinan la orientación de las moléculas adsorbidas, demostrándose con ello que
las células en contacto con una superficie primeramente se fijan, se adhieren
y se propagan, dependiendo esta primera fase de las proteínas de adhesión. A
partir de entonces, la calidad de esta adhesión influye en su morfología, y en su
capacidad de proliferación y diferenciación. Por lo tanto, la modificación de la
superficie del material representa una vía prometedora para la biofuncionalidad
de la interfaz material-tejido con el fin de modular la respuesta biológica sin
alterar las propiedades del soporte (figura 5.4).
Ingeniería Tisular
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149
Figura 5.4. Representación esquemática del proceso de una modificación físicoquímica de una superficie de un material (adaptado de Sabino, 2008).
Superficie
hidrófoba
Superficie
modificada
(grafting)
Superficie
cubierta por
una matriz extracelular
Capítulo 5
5.11. Cultivo celular: aislamiento, selección,
expansión y diferenciación
150
Como ya se ha mencionado, la ingeniería tisular ofrece una técnica novedosa y poco invasiva para la regeneración de tejido. La ingeniería tisular se
fundamenta en la manipulación de la MEC de células vivas con el fin de crear
sustitutos biológicos que se puedan implantar en el paciente.
La utilización de las células es para que funcionen como productoras
continuas de los componentes que faltan, restaurando así el mal funcionamiento del tejido. Las células implantadas también podrían tomar parte activa en la
restauración de la función de las células propias del tejido u órgano dañado.
Las células pueden ser aisladas por diferentes metodologías, ya sea del
paciente (autólogo) o de órganos o tejidos donados (alogénico). En algunas
metodologías, las células se implantan en el paciente después de ser aisladas,
pero comúnmente son transportadas a un laboratorio especializado para su
posterior procesamiento. Una vez en el laboratorio, las células pueden ser purificadas o expandidas (o ambas cosas), antes de su implantación. En algunos
casos, las células (de interés) son aisladas del tejido tomado del paciente por
medio de una biopsia. Tras el aislamiento, el número de células puede multiplicarse in vitro, aunque es de suma importancia que las células sean tratadas de
manera adecuada a fin de mantener su potencial terapéutico.
Una fuente común de células para aplicaciones de ingeniería tisular es
la médula ósea. Esto se debe a que la médula es de fácil acceso, puede aplicársele el aislamiento autólogo y contiene varios tipos celulares de interés para la
ingeniería de tejido, incluidas las células madre mesenquimales. Estas células
tienen la capacidad de diferenciarse en la mayoría de los tejidos (Tallheden,
2008). Una fuente más es el aislamiento de células uroepiteliales de la vejiga.
Este método es útil para el aislamiento de células de niños, ya que no requiere
anestesia. Por otro lado, la obtención de células viables para regeneración de
piel, cartílago, pulmón, corazón y riñón se hace a través de biopsias de los
mismos tejidos. Una vez aisladas las células se recuperan en suspensión, lo
cual facilitará su procesamiento.
En ingeniería de tejido es necesaria una gran cantidad de células, por lo
que comúnmente se ve en la necesidad de expandir las células in vitro antes de
su uso clínico. La expansión se realiza en frascos de cultivo en presencia de
un medio de cultivo suplementado con factores de crecimiento, suero y otros
aditivos específicos.
5.12. Cultivo celular
Para poder realizar el concepto de ingeniería tisular es necesario realizar
pruebas de biocompatibilidad al soporte diseñado que se planea utilizar como
implante; esto y la necesidad de expandir las células in vitro antes de su uso
clínico amerita la necesidad de una técnica in vitro que permita la obtención
cuantiosa de células del tejido que se desea regenerar, y que facilite el estudio
de fenómenos in vitro, como la proliferación, diferenciación y supervivencia de
las mismas.
Las células representan la unidad morfológica y funcional de todo ser
vivo. Para su desarrollo el organismo tiene que mantener condiciones específicas óptimas que le permitan su crecimiento y supervivencia; con lo anterior,
decimos que un cultivo celular es un sistema biológico que logra la supervivencia fuera del organismo manteniendo su capacidad de división y diferenciación,
así como también sus funciones in vitro (Black, 2006).
Conforme fue avanzando el conocimiento de cultivos celulares se comprendió la importancia de reproducir y mantener la célula, sin importar de que
tipo es, bajo un entorno físico-químico y nutritivo con valores similares a los
que le proporciona el organismo. Por ello es esencial mantener el cultivo celular
bajo ciertas condiciones de temperatura (37 °C), oxígeno, CO2 (5%), pH (7.0Ingeniería Tisular
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151
Capítulo 5
152
7.7), entre otras, puesto que favorecen el crecimiento de las células. Además,
mantener constante la temperatura y la entrada de oxígeno ayuda a evitar posibles contaminaciones con una amplia gama de microorganismos presentes en el
ambiente. Asimismo, es necesario mantener condiciones estrictas de esterilidad
y añadir antibióticos al medio de cultivo, con lo que se garantiza, si se cumplen
las condiciones, la supervivencia del cultivo (Scheper, 2006).
Cada célula presenta requerimientos diferentes, es por ello que hay diversos medios de cultivo según las necesidades de cada tipo celular. Además de
agregar medio al cultivo, también se adicionan diversos aditivos, como: extractos embrionarios, hormonas (corticoides, insulina) y factores de crecimiento
que modifican las características de reproducción y facilitan su diferenciación.
Con el fin de satisfacer las necesidades de las células, se comenzó a cultivarlas en presencia de sueros, que representan una compleja mezcla de macromoléculas, que tienen como función, de forma general, la nutrición y protección de la célula, además de su adhesión. El suero posee cuatro proteínas
que específicamente facilitan este tipo de interacción, que son la fibronectina,
vitronectina, laminina y thrompospondin (Yildrim, 1998). El suero fetal bovino (SFB) es el más utilizado en proporciones de 5-10%, le suple a la célula
hormonas y factores de crecimiento ligados con el transporte de nutrientes, de
modo que al usar SFB se mantiene el balance de energía en la célula y además
se estimula la rápida formación de las mismas.
Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un
tejido original tomado de un órgano de un animal recién sacrificado, reciben
el nombre de cultivo primario, figura 5.5 (Cooper y Hausman, 2004); cuando
este cultivo primario es sometido a procesos de transformación mediante
transfección de oncogenes o con tratamiento con carcinogenéticos que le
confieren capacidad ilimitada de multliplicación, reciben el nombre de líneas
celulares. Resulta de gran beneficio tener en cuenta las diferencias entre el
cultivo primario y la línea celular al escoger un modelo de cultivo, puesto
que se debe ajustar a las necesidades de cada investigación (tabla 5.3). Como
se puede ver, los cultivos primarios tienen características que los difieren de
las líneas celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que
fueron aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide, su crecimiento
in vitro es limitado y hay inhibición por contacto. El estar más cercanas a las
Figura 5.5. Diagrama del cultivo celular primario (adaptado de Segretin, 2003).
Tejido
Animal
Disgregación Células en
mecánica suspensión
Cultivo primario
células que las originaron se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural. Sin embargo, existe una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes. Por otro lado, las líneas celulares están formadas por células que difieren genética y morfológicamente
de las células de las cuales se originaron, tienen la característica de no tener
inhibición por contacto y de crecer indefinidamente. Los cultivos celulares se
dividen principalmente en:
• Medios semisólidos.
• Monocapa.
• En suspensión.
La técnica de cultivo en monocapa es usada para la mayoría de las células, ya que facilita el anclaje de la célula al sustrato, la cual es una condición importante para que comience la proliferación celular. Una vez que se multiplican,
comienzan a establecer conexiones entre sí, lo que permite la formación de una
monocapa que protege la superficie de crecimiento. Las células que proliferan
en este tipo de cultivo son fibroblastos, miocitos esqueléticos, condrocitos,
etcétera (células dependientes de anclaje).
La técnica de cultivo estacionario o en suspensión es adecuada para aquellas células que tienen la capacidad de proliferar sin necesidad de adherirse al
sustrato, y por lo tanto, son independientes al anclaje, propiedades encontradas
en células no diferenciadas. Los soportes usados para la técnica en suspensión
Ingeniería Tisular
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153
requieren de matrices de macromoléculas que protegen a la superficie celular,
los cuales deben de ser adicionados en el suero y en el medio de cultivo. El
cultivo estacionario es indicado para células con problemas de anclaje y cuando
los factores económicos son muy importantes. Entre sus ventajas está la facilidad con la que se puede retirar el medio de cultivo gastado sin infectar o perder
células, lo que resulta en una alta concentración de producto.
Tabla 5.3: Diferencias más significativas entre un cultivo primario y una línea celular.
Contenido celular de ADN
(ploidía)
Transformación
Tumorogeneidad
Dependencia de anclaje
Inhibición por contacto
Limitación de crecimiento por
densidad
Mantenimiento
Requerimientos de sueros
Eficiencia de clonaje
Marcadores
Funciones especializadas
Tasa de crecimiento
Capítulo 5
Rendimiento en cultivo
154
Diploide-euploide
Heroteploide-aneuploide
Normal
No-tumorogénica
Sí
Sí
Sí
Transformada
Tumorogénica
No
No
No
Cíclico
Elevados
Baja
Pueden expresar marcadores
específicos
Se mantienen
Baja (tiempo de replicación
de 24 a 96 h)
Bajo (<106 células/mL; <105
células/cm2)
Posible mantenerlas quiescentes
Bajos
Elevada
Cromosomales, enzimáticos…, se
pierden
Se suelen perder
Rápida (12 a 24 h)
Alto (>106 células/mL; > 105 células/
cm2)
5.13. Fuentes de información
Tabla 5.4. Fuentes de información para ingeniería tisular.
Fuentes
Sitio web
Biomaterials
Tissue Engineering
Journal of Biomedical Materials
Research
Acta Biomaterialia
Materials and Engineering Science C
Bone
Journal of Materials Science:
Materials in Medicine
Progress in Polymer Science
Journal of Surgical Research
Polymer International
www.elsevier.com/locate/biomaterials
www.liebertpub.com/products/product.aspx?pid = 315
http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/(ISSN)15524965
www.sciencedirect.com/science/journal/17427061
www.sciencedirect.com/science/journal/09284931
www.sciencedirect.com/science/journal/87563282
Seminars in Cell and Developmental
Biology
Frontiers in Tissue Engineering
Archives of Orthopaedic and Trauma
Surgery
Macromolecular Materials and
Engineering
Ageing Research Reviews
Composite Science and Technology
Tissue Engineering and Renerative
Medicine Society
Society of Biomaterials
The Biomaterials Network
www.springer.com/materials/biomaterials/journal/10856
www.sciencedirect.com/science/journal/00796700
www.journalofsurgicalresearch.com/
http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/(ISSN)10970126
www.sciencedirect.com/science/journal/10849521
www.sciencedirect.com/science/book/9780080426891
www.springerlink.com/content/101491/
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mame.v296.3/4/
issuetoc
www.sciencedirect.com/science/journal/15681637
www.sciencedirect.com/science/journal/02663538
www.termis.org
www.biomaterials.org
www.biomat.net
Ingeniería Tisular
Imelda Olivas Armendariz y Carlos Alberto Martínez Pérez
155
Capítulo 5
Bibliografía
156
Andrew, S. (2001). The influence of polymer blend composition on the degradation of polymer/hydroxyapatite biomaterials. Journal of Materials
Science: Mater Med. 12. 673-677.
Bao, P. (2009). The role of vascular endothelial growth factor in wound
healing. Journal of Surgical Research.
153. 347-358.
Badylak, S. (2002). The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell and Developmental Biology. 13. 377-383.
Boccaccini, A. (2003). Bioresorbable
and bioactive polymer/bioglass
composite with tailored pore structure for tissue engineering applications. Composites Science and Technology. 63. 2417-2429.
Boer, J. (2008). Cellular signaling. Engineering Tissue. San Diego, Calif., E. U.A.:
Elsevier Academic Press. 89-120.
Balani, K. (2007). Plasma-sprayed carbon nanotube reinforced hydroxyapatite coatings and their interaction
with human osteoblasts in vitro.
Biomaterials, 28. 618-624.
Bernardo, E. (2009). Development of
multiphase bioceramics from a filler-containing preceramic polymer.
Ceramics international, 35, 1415-1421.
Byrne, E. (2008). Gene expression
by marrow stromal cells in a porous collagen-glycosaminoglycan
scaffold is affected by pore size
and mechanical stimulation. Journal
of Materials Science: Matter Med., 19.
3455-3463.
Brandt H. (2008). Bioactivation of knitted cellulose scaffolds by strontium.
Cellulose, 15. 275-283.
Blanck, J. (2006). In vitro test methods.
Taylor and Francis. Biological performance of materials, fundamentals of biocompatibility. CRC Press.
United State of America. 337-353.
Caracciolo, P. (2009). Electrospinning
of novel biodegradable poly(ester
urethane)s and poly(ester urethane
urea)s for soft tissue-engineering
applications. Journal of Materials
Science: Mater Med., 20. 2129-2137.
Chen, Q. (2006). 45S5 derived glass-ceramic scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials, 27. 2414-2425.
Cho, H. (2006). The effect of ε-caprol.
(D, L-lactyl unit composition on the
hydrolytic degradation of poly. (D,
L-lactide-ran-ε-caprolactone). poly.
(ethylene glycol). poly(D, L-lactideran-ε-caprolactone).
Biomaterials,
27. 544-552.
Cohn, D. (2005). Designing biodegradable multiblock PCL/PLA thermoplastic elastomers. Biomaterials,
26. 2297-2305.
Cooper, G. (2004). An overview of cells
and cell research. SINAUER. The
cell a molecular approach. ASM
PRESS. Sunderland, U.S.A. 3-40.
Doi, K. (1996). Novel compliant and
tissue permeable microporous polyurethane vascular protesis fabricated using an excimer laser ablation
technique. Journal of Biomedical Materials Research, 31. 27-33.
Esparza, F. (2008). Tissue engineering:
application of pluripotent stem
cells in traumatology and orthopedic surgery. Trauma Fund MAPFRE,
19. 88-101.
Estrada, C. (2006). Ingeniería de tejido
óseo: consideraciones básicas. Revista EIA, 5. 93-100.
Fan, L. (2009). pH-sensitive podophyllotoxin carrier for cancer cells specific
delivery. Polymer composites, 31. 51-59.
García, A. (2007). Surface Modification
of Biomaterials. En Principles of Regenerative Medicine. Elsevier Academic Press. 656-665.
Ghasemi-Mobarakeh, L. (2010). Materials science and engineering C.
Materials Science and Engieering C., 30.
1129-1136.
Gómez-Guillén, M. (2011). Functional
and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative
sources: A review. Food Hydrocolloids.
Recuperado de: doi:10.1016/j.foodhyd.2011.02.007.
Gooch, K. (1998). Mechanical forces
and growth factors utilized in tissue engineering. En Frontiers in Tissue Engineering. N.Y., U.S.A. Elsevier
Science Ltd. 61-82.
Groot, J. (1997). Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction
and meniscal protheses. Biomaterials.
17. 163-173.
Guarino, V. (2008). Polylactic acid fibre-reinforced
polycaprolactone
scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials, 29. 3662-3670.
Hassna, R. (2004). Biphasic calcium
phosphate nanocomposite porous
scaffolds for load-bearing bone
tissue engineering. Biomaterials, 25.
5171-5180.
Hokugo, A. (2006). Preparation of hybrid scaffold from fibrin and biodegradable polymer fiber. Biomaterials,
27. 61-67.
Huimin, Y. (2006). Proliferation and differentiation into endothelial cells of
human bone marrow mesenchymal
stem cells. (MSCs). on poly DL-lactic-co-glycolic acid. (PLGA). films.
Chinese Science Bulletin, 51. 1328-1333.
Hutmacher, D. (2008). Scaffold design
and fabrication. En Tissue Engineering. San Diego, Calif., E.U.A.: Elsevier Academic Press. 403-454.
Hutmacher, D. (2000). Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.
Biomaterials, 21. 2529-2543.
Hutmacher, D. (2008). Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.
Biomaterials, 21. 2529-2543.
Jiang, T. (2006). In vitro evaluation of
chitosan/poly. (lactic acid-glycolic
acid). sintered microsphere scaffolds
for bone tissue engineering. Biomaterials, 27. 4894-4903.
Jiménez, F. (2003). Traducción de señales. En Biología celular y molecular. ).
Estado de México: Pearson Education. 197-231.
Jimenez, L. (2003). Matriz extracellular.
En Biología celular y molecular. Naucalpan, Estado dde México: Pearson
Education. 515-541.
Ingeniería Tisular
Imelda Olivas Armendariz y Carlos Alberto Martínez Pérez
157
Capítulo 5
158
Jurga, M. (2011). The performance of
laminin-containing cryogel scaffolds
in neural tissue regeneration. Biomaterials, 32. 3423-3434.
Källrot, M. (2006). Surface functionalization of degradable polymers by
covalent grafting. Biomaterials, 27.
1788-1796.
Karp, G. (2005). Señalización celular y
transducción de señales: comunicación entre las células. En Biología
Celular y molecular. Colombia: McGraw-Hill. 671-674.
Kessler, S. (2004). Bone morphogenetic protein 2 accelerates osteointegration and remodeling of solventdehydrated bone sustitutes. Arch
Orthop Trauma Surg., 124. 410-414.
Kievit, F. (2010). Chitosan-alginate 3D
scaffolds as a mimic of the glioma
tumor microenviroment. Biomaterials, 31. 5903-5910.
Kowligi, R. (1988). Fabrication and characterization of small-diameter vascular protheses. Journal of Biomedical
Materials Research, 22. 245-256.
Lee, K. (2006). Scaffold systems for tissue engineering. En Tissue engineering
I. Nueva York, U.S.A.: Springer. 154.
Li, S. (2005). Preparation and properties
of poly. (L-lactic acid). scaffolds bt
thermally induced phase separation
from a ternary polymer-solvent system. Polymer International, 53. 20792085.
Liu, K. (1995). Shear strength of polymers and fibre composites: 2 carbon/epoxy pultrusions. Composites,
26. 841-848.
Marsavina, L. (2008). Dynamic fracture
toughness of polyurethane foam.
Polymer Testing, 27. 941-944.
Martin, C. (1996). Acidity near eroding
polylactide-polyglycolide in vitro and
in vivo in rabbit tibial bone chambers. Biomaterial, 17. 2373-2380.
Martínez-Pérez C. (2003). Hydroxyapatite coating on porous polyurethane
facilitated by tetraethoxysilane. Silicon Chemistry. 2. 179-184.
Martino, A. (2005). Chitosan: a versatile
biopolymer for orthopaedic tissueengineering. Biomaterials, 26. 59835990.
Martins-Green, M. (2000). Dynamics of
Cell-ECM Interactions. En Principles
of Tissue Engineering. California, U.S.A.:
Elsevier Academic Press. 33-55.
Nori, A. (2008). Cell-Substrate interactions. En Principles of Regenerative
medicine. Madison, U.S.A.: Elsevier
academic Press. 666-685.
Olivas, I. (2009). Synthesis and characterization of porous polyurethanechitosan blends. Cellular Polymers,
28. 179-191.
Olsen, B. (2000). Matrix molecules and
their ligands. En Principles of Tissue Engineering. Elsevier Academic
Press. 57-71.
Pachence, J. (2000). Biodegradable polymers. En Principles of Tissue Engineering.
Elsevier Academic Press. 263-277.
Patel, Z. (2008). Dual delivery of angiogenic and an osteogenic growth
factor for bone regeneration. Bone,
43. 931-940.