21.03.2018 Separación de biomoléculas Cromatografía. Aspectos generales, técnicas involucradas. FPLC, HPLC. Electroforesis. Conceptos generales y aplicaciones. Geles de poliacrilamida y agarosa. Isoelectroenfoque. Bibliografía Voet • Voet • Pratt Fundamentos de Bioquímica La vida a nivel molecular 2ª edición Ed. Panamericana Lubert Stryer • Jeremy M. Berg • John L. Tymoczko Bioquimica (5. ed) Ed. Reverte Cox, M.M. • Nelson, D.L. • Lehinger A. Principios De Bioquímica 4ta o 5ta Edición Editorial Omega Métodos de ruptura celular (lisis) Métodos físico – químicos Shock osmótico Detergentes Solventes Enzimas (lisozima) Métodos físicos Molino French Press Vibraciones ultrasónicas 1 21.03.2018 Métodos de ruptura celular Homogeneizador (Potter) Sonicador French Press generador de ultrasonido punta suspensión celular Licuadora Molino Polytron Mortero y pilón bolitas collar células Estrategias de purificación (se basan en propiedades diferenciales) Solubilidad Fraccionamiento con sulfato de amonio Fraccionamiento con solventes Fraccionamiento con polietilenglicol Precipitación isoeléctrica Tamaño Molecular Diálisis Electroforesis en gel Cromatografía de filtración por geles Ultracentrifugación Carga Iónica Cromatografía de Intercambio Iónico Electroforesis Isoelectroenfoque Polaridad Cromatografía de adsorción Cromatografía en papel Cromatografía de interacción hidrofóbica Especificidad de unión Cromatografía de afinidad 2 21.03.2018 Cromatografía Los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (FASE ESTACIONARIA ) mientras que la otra (FASE MÓVIL) se mueve en una dirección definida. La mezcla de sustancias a separar se disuelven en la FASE MÓVIL La solución resultante atraviesa una matriz sólida porosa, la FASE ESTACIONARIA La fase móvil puede ser líquida o gaseosa CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA CROMATOGRAFÍA GASEOSA La fase estacionaria puede estar dispuestos en forma plana CROMATOGRAFÍA PLANA CROMATOGRAFÍA en COLUMNA Cromatografía en columna 3 21.03.2018 1 2 3 4 5 6 La muestra es depositada sobre el lecho cromatográfico La muestra penetra en el lecho Se añade fase móvil Comienza la separación de los componentes de la muestra Eluye el primer componente Eluye el segundo componente Cromatografía en columna Soportes Son muy variados, sobre ellos se da la interacción que resulta en la separación ( grupos unidos ‐ su misma estructura) Celulosa : fácilmente hidratable, es compresible (no permite flujos elevados, es incompatible con algunos solventes (álcalis) Derivados de polisacáridos: Microesferas porosas que se presentan con distinto tamaño y poro Sephadex : dextranos entrecruzados, sensible a pHs extremos Sepharosa : agarosa Sephacryl : resistentes a la compresión y a pH extremos Cromatografía en columna 4 21.03.2018 Detección Los componentes de la muestra separados se detectan en el eluyente mediante su análisis continuo o mediante el análisis de las fracciones una vez recogidas Métodos midiendo absorbancia a 280 nm (para proteínas) midiendo absorbancia a 260 nm (para ácidos nucleicos) midiendo radioactividad ensayo enzimático (específicos) ensayo biológico reacciones coloreadas (Bradford, Lowry) reacciones fluorescentes reacciones inmunoquímicas (western, ELISA, RIA) Etc, etc….. Cromatografía en columna Cromatografía plana descendente ascendente 5 21.03.2018 Electroforesis Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. La migración es proporcional a su densidad de carga fricción tamaño forma µ= V = q E f Las matrices más comunes son: agarosa poliacrilamida Métodos de separación que se basan en diferencias de solubilidad La solubilidad de las proteínas depende de la concentración de sales disueltas, la polaridad del solvente, el pH y la temperatura Fraccionamiento con sulfato de amonio Fraccionamiento con solventes Fraccionamiento con polietilenglicol Precipitación isoeléctrica 6 21.03.2018 Salting in – Salting out 7 21.03.2018 Fraccionamiento con sulfato de amonio sulfato de amonio sulfato de amonio sulfato de amonio 40 al 70% 70 al 100% + + Fracción 0 al 40% Fracción 40% al 70% 0 al 40% Fracción 70% al 100% Métodos de separación basados en el Tamaño Molecular Diálisis Cromatografía de filtración por geles Electroforesis en gel Ultracentrifugación 8 21.03.2018 Diálisis Cromatografía de exclusión molecular Filtración Molecular La separación se basa en diferencia de tamaño Matriz porosa – distintos tamaños de poros No hay interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria. Columnas esbeltas, volumen de siembra 10 % del volumen de columna Proteínas, ácidos nucleícos, hidratos de carbono 9 21.03.2018 Cromatografía de exclusión molecular Cromatografía de exclusión molecular 10 21.03.2018 Se puede usar como método de determinación de PM Cromatograma Kav = Ve – Vo Vt - Vo Ve volumen de elución Vt volumen total Vo volumen vacío Cromatografía de exclusión molecular Electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS‐PAGE) 11 21.03.2018 Na+ Na+ H-(CH2)12-SO4− dodecil sulfato de sodio (SDS) SDS‐PAGE BME o DTT SDS‐PAGE 12 21.03.2018 SDS‐PAGE SDS‐PAGE 13 21.03.2018 Tinción con Coomassie Blue SDS‐PAGE Variando la concentración de poliacrilamida se puede obtener distinto grado de separación Tinción con Plata SDS‐PAGE 14 21.03.2018 Relación de frente o migración relativa X R= X Xf Xf SDS‐PAGE SDS‐PAGE 15 21.03.2018 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa Se emplea para ácidos nucleicos Electroforesis en geles de agarosa 16 21.03.2018 Cuba de electroforesis ADN, ARN Tinción: Bromuro etidio (UV) SYBR green Electroforesis en geles de agarosa Centrifugación Se emplea para separar partículas o macromoléculas: Células Componentes sub‐celulares Proteínas Ácidos nucleicos Bases de separación Tamaño Forma Densidad Metodología: Empleo de gradientes de densidad (viscocidad del medio) Velocidad del rotor (centrifugación – ultracentrifugación) 17 21.03.2018 Centrifugación Diferencial El tubo se llena con muestra Técnica poco resolutiva La velocidad de sedimentación depende principalmente del tamaño y forma No emplea gradiente de densidad Se obtienen dos fracciones: sobrenadante y sedimento (pellet) CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE Centrifugación Zonal Centrifugación Isopícnica Gradiente de sacarosa preformado Gradiente de Cloruro de Cesio Se siembra la muestra en la parte sup. Muestra disuelta en ClCs Baja velocidad Alta velocidad Velocidad de sedimentación (no se logra la sedimentación completa, se detiene) Equilibrio de sedimentación (se logra la sedimentación completa, tiempos largos) Muestras: densidad semejante, distinto peso molecular Muestras: peso molecular semejante, distinta densidad ácidos nucleicos y organelas proteínas 18 21.03.2018 CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE Métodos de separación basados en la Carga Iónica Cromatografía de Intercambio Iónico Electroforesis (nativa) Isoelectroenfoque 19 21.03.2018 Cromatografía de intercambio iónico La separación ocurre en base de interacciones iónicas entre la superficie de la proteína y grupos de la fase estacionaria Intercambio aniónico: La matriz cargada positivamente se une a proteínas cargadas negativamente Intercambio catiónico: La matriz cargada negativamente se une a proteínas cargadas positivamente Los grupos más comunes son: Elución: con fuerza iónica Cromatografía de intercambio iónico 20 21.03.2018 Cromatografía de intercambio iónico Cromatograma Cromatografía de intercambio iónico 21 21.03.2018 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas No se usan agentes desnaturalizantes (SDS, BME, DTT) Las proteínas migran de acuerdo a su relación q/m Las interacciones entre subunidades de las proteinas oligoméricas se conservan: se puede obtener información acerca de al estructura cuaternaria Se pueden hacer determinaciones de actividad en gel Isoelectroenfoque 22 21.03.2018 Isoelectroenfoque Electroforesis bidimensional Separación basada en PI y tamaño 23 21.03.2018 Electroforesis bidimensional Métodos de separación basados en la polaridad Cromatografía de interacción hidrofóbica Cromatografía en papel y de capa fina (plana) Cromatografía de adsorción 24 21.03.2018 Cromatografía de interacción hidrofóbica Se basa en interacciones hidrofóbicas entre la fase estacionaria y las moléculas a separar. Salting out La fase estacionaria consiste en un grupo no polar pequeño unido a una matriz La muestra se siembra disuelta en un buffer que contiene alta concentración de una sal (sulfato de amonio, cloruro de sodio) La elución se realiza bajando la concentración de la sal. Las proteínas eluyen en orden creciente de hidrofobicidad Soporte Sepharosa Sephadex Cromatografía de interacción hidrofóbica 25 21.03.2018 Cromatografía de interacción hidrofóbica Cromatograma Cromatografía de interacción hidrofóbica 26 21.03.2018 Cromatogafía en papel y silica‐gel 1 2 3 4 5 6 7 1: aplicación de la muestra 2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil 3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los componentes 6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa 7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance Soporte : papel, silca gel (TLC) Usos: lípidos, aminoácidos, pigmentos, etc Cromatogafía en silicagel ‐ TLC 27 21.03.2018 Cromatogafía de adsorción La separación se basa en diferencias de adsorción a la superficie de la fase estacionaria La fase estacionaria es polar La fase móvil es apolar Soporte: alúmina, sílica‐gel Cromatografía de afinidad Se basa en la interacción reversible entre la proteína a purificar y un ligando inmovilizado sobre la matriz Es muy específica Ligandos: anticuerpos, inhibidores, sustratos, cofactores La elución se realiza con el ligando o un análogo, cambio de fuerza iónica o pH 28 21.03.2018 Cromatografía de afinidad Cromatografía de afinidad 29 21.03.2018 Cromatografía de afinidad Cromatografia de líquidos de alta resolución (HPLC) El material de las columnas está muy finamente dividido (2,5 a 5 micrones) lo que incrementa la posibilidad de interacción y el poder resolutivo. Para obtener flujos adecuados es necesario emplear presiones elevadas. Posee alta resolución por lo que se emplea para determinaciones cuantitativas exactas Se emplea en la industria y en la ciencia para la determinación de plaguicidas, hidrocarburos, aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, azucares, drogas, terpenoides UPLC (partícula menor de 2 micrones – mayor presión) FPLC se emplea para biomoléculas de varios kDa. Se usan otras matrices y menor presión 30 21.03.2018 HPLC Cuando las biomoléculas no se hallan e su entorno natural se vuelven inestables y es necesario controlar: pH buffers Temperatura lo más baja posible , 0 ºC Enzimas degradativas Proteasas, DNasas y Rnasas inhibidores guantes Desnaturalización por elevada actividad de agua Almacenamiento por largos períodos (crecimiento de microorganismos y oxidación) glicerol, ABS bajas temperaturas (-80 ºC, -196 ºC) 31 21.03.2018 Pasos generales empleados para realizar una purificación FUENTE NATURAL Ruptura celular Centrifugación EXTRACTO CRUDO Fraccionamiento Cromatografías Electroforesis PURIFICACIÓN DE LA MOLÉCULA DE INTERÉS PRODUCTO PURIFICADO Rendimiemto Purificación Actividad Biológica Tabla de Purificación 32
