CFGS: LABORATORIO DE ANALISIS Y CONTROL DE CALIDAD PRÁCTICAS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS PRÁCTICA 1: OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL SUELO 1.-INTRODUCCIÓN TEÓRICA En todos los tipos de suelos nos podemos encontrar microorganismos. Veremos bacterias, hongos, protozoos, levaduras,..., en mayor o menor cantidad dependiendo de las características de cada suelo y del ambiente en el que se encuentre. HONGOS En los suelos bien aireados y cultivados, los hongos llegan a constituir la mayor parte de la microflora total, debido no a su mayor numero, sino a su mayor diámetro y extensión de sus hifas. Dominan sobre todo, en las capas orgánicas de los bosques y en los ambientes ácidos. Para su recuento, al medio se le da un pH de 4 que impide que se desarrollen las bacterias y actinomicetos que inhibirían el desarrollo de los hongos. También pueden emplearse agentes bacteriostáticos como penicilina o novobiocina, aunque el sistema habitual es el uso del- Rojo de bengala y estreptomicina. Cada hifa, trozo de hifa o espora que estuviera en el suelo, activa o inactiva, aparecerá como una colonia en el agar. Se han hallado desde 20.000 a 1.000.000 de unidades fúngicas por gramo de suelo, entendiendo que se toma cono unidad, toda espora, hifa o trozo de ella que es capaz de dar una colonia. Encontramos hongos parásitos facultativos de los vegetales, que según la ocasión pueden llevar indistintamente vida saprofita y a los hongos saprofitos obligados. Estos últimos son los que desempeñan un papel preponderante en los procesos que acompañan a la formación y a la evolución de un suelo. Hongos saprófitos Hongo simbionte La abundancia de la actividad fisiológica de la flora fúngica varía mucho en el espacio y en el tiempo, dentro del límite de un solo sitio. La materia orgánica, pH, 1 CFGS: LABORATORIO DE ANALISIS Y CONTROL DE CALIDAD PRÁCTICAS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS fertilizantes orgánicos e inorgánicos, la humedad, aireación, temperatura, posición en el perfil, estación del año, la composición de la vegetación, son los factores que condicionan la existencia y distribución de los hongos debido a su heterotrofismo que les impide sacar de la luz o de la oxidación de sustancias inorgánicas la energía necesaria. Existen numerosas especies típicamente zimogenas que se desarrollan en gran cantidad después de la adición de un material descomponible. Otras especies sin embargo pueden considerarse autóctonas. El agua es necesaria para todos los organismos vivientes, pero los hongos perviven en regiones semiáridas y sin embargo sufren más cuando la humedad es de un grado tal que el oxigeno es escaso y existe competición por él. De lo que se deduce que la aireación es un factor esencial. Hongo parásito Hay pocas especies que puedan considerarse termófilas, siendo la mayor parte mesófilas. En las primeras capas de suelos recalentados por el sol abundan mas Aspergillus y Trichoderma, mientras que a 60 cm por ejemplo, los cultivos muestran preponderancia de Penicillium, Mucor y Chlamidosporium. Los hongos, gracias a la estructura filamentosa de su micelio, desempeñan cierto papel en la constitución y en la conservación de la estructura del suelo. Las hifas, al retener solidamente a las partículas minerales, contribuyen bastante a la formación y a la estabilidad de los agregados del suelo. Como no poseen clorofila, deben obtener el carbono de moléculas orgánicas preformadas, como exosas, pentosas, disacáridos, pectina, almidón, celulosa, hemicelulosas, grasas y lignina. El nitrógeno les llega sobre todo del amoniaco o de los nitratos, pero también les sirven las proteínas, ácidos nucleicos u otros compuestos orgánicos completos. Mientras unas especies necesitan factores de crecimiento, como las vitaminas B, otras se desarrollan sobre azúcar y sales inorgánicas solamente e incluso algunas son parásitos obligados de plantas superiores. Su acción principal es la descomposición de los materiales vegetales como celulosa, hemicelulosas, pectina, lignina y almidón, que no son atacados por bacterias. Con el nitrógeno suelen dar amoniaco y compuestos simples por descomposición del material proteico. En ciertas condiciones pueden llegar a competir con las plantas superiores por los nitratos o por el amoniaco, rebajando el nitrógeno soluble del suelo. 2 CFGS: LABORATORIO DE ANALISIS Y CONTROL DE CALIDAD PRÁCTICAS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS PROTOZOOS Russell y Hutchinson fueron los primeros en sugerir que los protozoos tomaban parte activa en la vida microbiana del suelo, pues supusieron que su actividad podría explicar alguna de las consecuencias de !a esterilización parcial del mismo. Bonnet y Thomas hicieron una lista de 100 especies de testáceos, consideradas corro formadoras de la fauna endógena del suelo. Eran especies propias de suelos minerales, si se hubieran incluido suelos de bosque o turberas, el número seria mucho mayor. Los protozoos son muy selectivos en su alimentación bacteriana. Además de algas y otros protozoos, se alimentan sobre todo de Aerobacter, Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Micrococus y Pseudomonas. Las levaduras y Actinomicetos se escapan de esta acción. Hay especies de bacterias que son rápidamente digeridas por determinados protozoos y no digeribles por otros. Otras son probablemente atacadas y otras no lo son en absoluto. Aunque el fundamento científico aun no es conocido, resulta que las bacterias pigmentadas de rojo, verde o violeta, no son digeridas por los protozoos. Los protozoos resisten condiciones ambientales adversas, como la falta de alimento o de oxígeno, enquistándose. Los quistes son mas resistentes a los agentes químicos, ácidos, germicidas y altas temperaturas, que las formas vegetativas y no se les puede achacar una misión reproductora sino simplemente protectora. La población de protozoos es rica y heterogénea. Lo mas típico es encontrar entre 10 y 100 mil células por gramo, puede llegarse hasta 300.000. Sin embargo el numero de bacterias, es varias veces mayor, aunque el peso anda mas equilibrado debido a que las células de los protozoos son casi siempre mas pesadas que las de las bacterias. Es curioso que para su cultivo "in vitro" sobre medios de agar o líquidos se requiere, además de extracto de suelo, un cultivo bacteriano comestible por el protozoo en cuestión que suele ser una bacteria gram negativa, corta y no formadora 3 CFGS: LABORATORIO DE ANALISIS Y CONTROL DE CALIDAD PRÁCTICAS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS de esporas, por ejemplo especies de Aerobacter vivos o muertos que pueden servir de alimento a flagelados, rizópodos y ciliados. El numero de protozoos varia extraordinariamente de un día a otro, parece ser que como consecuencia de la población bacteriana e inversamente a ella, como en un intento de establecer un equilibrio. También se han observado fluctuaciones estacionales con incrementos en otoño y disminuciones durante el verano. Los protozoos se hallan concentrados en los horizontes orgánicos o como mucho en los primeros 15 cm de la capa mineral y raramente se encuentran a profundidades superiores al metro. A veces, pueden mantener su actividad en profundidad, por debajo de una capa helada. de la que huyen. Su presencia y distribución puede variar en los suelos que han sufrido una compactación o en aquellos que están sometidos a un manto de agua fluctuante. Lo mismo que ocurre con las fluctuaciones de agua, sucede con las variaciones de oxígeno, aunque algunos pueden vivir en anaerobiosis; también los cambios de pH les afectan aunque su adaptabilidad es grande, pudiendo vivir en la zona comprendida entre valores de pH comprendidos entre 3.5 y 9. Prefieren sitios húmedos y fríos y el calentamiento les es muy nocivo, aunque ello no impide que se encuentren flagelados en el desierto del Sahara. BACTERIAS Las bacterias son organismos unicelulares de un tamaño del orden de la micra. Su número, en los diversos suelos, es muy variable pero en los suelos cultivados supera con mucho al de los otros seres vivos. En un gramo de suelo se ha calculado que viven de unos pocos centenares de millares a algunas decenas de millones de unidades y su actividad metabólica es tan grande que pueden desprender en una hora, a través del proceso respiratorio, varios kilos de dióxido de carbono por hectárea. Las bacterias se pueden dividir en dos grandes grupos con respecto a su nutrición: autótrofas y heterótrofas; las primeras utilizan como fuente de carbono al dióxido de carbono y como fuente de nitrógeno a los nitratos y a los compuestos de amonio; las heterótrofas, que representan la gran mayoría, extraen ambos elementos del material orgánico existente en el suelo. Dentro de las bacterias autótrofas y dependiendo de la fuente de energía, podemos considerar otros dos grupos: quimiosintéticas, que obtienen la energía mediante la descomposición de sustratos inorgánicos y fotosintéticas, cuya energía la obtienen del sol como los vegetales superiores. 4 CFGS: LABORATORIO DE ANALISIS Y CONTROL DE CALIDAD PRÁCTICAS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS Las condiciones ambientales que afectan a la existencia de las bacterias son lógicamente: humedad, aireación, temperatura, acidez, materia orgánica y sustancias minerales. El cultivo, estación y profundidad, afectan por modificar alguno de los factores citados. Los suelos húmedos son desfavorables para muchas bacterias, simplemente porque llenan los espacios porosos con agua, disminuyendo la aireación. El factor restrictivo es el oxigeno y no el exceso de agua. Las temperaturas optimas para el desarrollo bacteriano se encuentran situadas entre los 25-35º C, si bien una gran mayoría crece en buenas condiciones entre 10 y 40º C. En el campo, las altas temperaturas rara vez son un fenómeno limitante pues solo se dan valores altos en la superficie de los suelos secos y yermos, lugares en los cuales la falta de agua es el factor primario limitante. La escala de pH que normalmente toleran las bacterias es la comprendida entre los valores de 4 y 10. El optimo se encuentra normalmente cercano a la neutralidad por el lado alcalino. Las bacterias mas abundantes en el suelo son pequeños bacilos cocoides de morfología variable, que dan lugar a pequeñas colonias en medios con agar. En los cultivos jóvenes predominan los bacilos Gram (-), mientras que en cultivos viejos sobre sustrato favorable, el predominio es de cocos Gram (+). Frecuencia de bacterias Gram (-) en el suelo % de bacterias Tipo Suelo sin vegetación Rizosfera Con glucosa añadida Pseudomonas 5.53 13.6 12.4 Xanthomonas 0.28 1.2 - Chromobacterium 0.28 0.2 - Flavobacterium - - 1.0 Achromobacter 0.49 0.8 4.5 Cytophaga 0.42 - - Agrobacterium - 1.4 - Alcaligenes - 1.0 2.0 7.0 20.0 20.0 Todos los Gram(-) 5 CFGS: LABORATORIO DE ANALISIS Y CONTROL DE CALIDAD PRÁCTICAS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS 2.-OBJETIVO Observar microorganismos en una muestra de suelo. Dibujar y clasificar los microorganismos observados. 3.-MATERIALES y REACTIVOS Tubos de ensayo / tubos de incubación Pipetas de 5 ml Estufa de incubación Glucosa al 1% Agua de Peptona Agua destilada y agua del grifo. 4.-PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Se coge una muestra de suelo, en este caso del patio del propio instituto, y se toman 4 porciones de 1 g cada una para estudiarlas con distintos medios de cultivo. Se preparan 4 tubos de incubación de la siguiente forma: Tubo 1: 1g de suelo + 5 ml de agua del grifo Tubo 2: 1g de suelo + 5 ml de glucosa al 1% Tubo 3: 1g de suelo + 5 ml de agua de peptona Tubo 4: 1g de suelo + materia orgánica (una hoja) + 5 ml de agua destilada Una vez preparadas y debidamente identificadas las muestras, las ponemos en la estufa de incubación a unos 30 ºC durante al menos 72 horas. 6 CFGS: LABORATORIO DE ANALISIS Y CONTROL DE CALIDAD PRÁCTICAS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS Pasado el tiempo de incubación de las muestras, las preparamos para un examen en fresco. – Se deposita una gotita de líquido, con asa o pipeta, en el centro del portaobjetos. – Formando un ángulo de 45º deslizamos un cubreobjetos sobre el portaobjetos hasta que toque la gota, dejándolo caer sobre la misma. – La lámina de líquido que queda entre el cubre y el porta será lo más fina posible, sin llegar a rebosar los bordes del cubre. – Se observa cada preparación directamente con el microscopio, siempre comenzando con la lente de aumento más bajo hasta que quede bien enfocado. 5.-PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Se dibujan los microorganismos observados en cada muestra y se identifican. 7
