337287368-Marcadores-Moleculares

Marcadores moleculares
Una definición
El genoma no solamente contiene genes, sino
también secuencias no codificantes que sin una
función específica definida, pueden ser utilizados
como puntos de marca o de anclaje (marcadores)
cuando éstas se encuentran unidas o cercanas a
las secuencias propias de los genes.
Un marcador es una entidad genética que
manifiesta polimorfismo y se hereda de
manera mendeliana, o es lo mismo decir, un
locus
con
una
variación
detectable
demostrada experimentalmente.
Marcadores Genéticos
Fenotípicos: los polimorfismos de los genes se detectan a
través de sus productos
- Morfológicos: por ejemplo, color de flor
- Bioquímicos: básicamente perfiles electroforéticos de
isoenzimas y de proteínas de reserva
Genotípicos o moleculares: Los polimorfismos de genes u
otras secuencias no codificantes se detectan a nivel del DNA
Marcadores morfológicos
Los primeros en usarse (1960).
Son características fenotípicas de fácil
identificación visual tales como forma, color,
tamaño o altura. Ejem. Hay alrededor de 50
caracteres de plántula, tallo, hoja, espiga,
espiguilla y cariopside, que se utilizan para
inscribir e identificar variedades de trigo en
México.
Los marcadores morfológicos presentan
algunas limitaciones (estado fisiológico,
condiciones ambientales, interacciones, etc.)
no obstante permanecen como caracteres
útiles en la identificación de materiales
evaluados con métodos sencillos y a bajo
costo.
Isoenzimas
Después se paso a los marcadores isoenzimáticos o marcadores de proteínas.
Ciertos cambios en la secuencia de DNA (mutaciones) que codifica para estas
enzimas pueden resultar en cambios en la composición de aminoácidos.
Si estos cambios se producen, las proteínas podrían tener la misma actividad
biológica, pero como su composición de aminoácidos varía, podrían tener diferente
carga neta y por tanto diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico
(electroforesis).
• Deshidrogenasas (alcohol deshidrogenasa ADH,
glutamato dehidrogenasa GDH),
• Oxidasas (peroxidasas PRX), hidrolasas
(fosfatasas ácidas ACP, esterasas EST),
• Isomerasas
(fosfoglucoisomerasa
PGI),
transferasas (fosfoglucomutasas PGM).
Las isoenzimas usadas en estudios de poblaciones vegetales para determinar
variabilidad y estructura genética, sistemática y biología evolutiva así como en
descripción de germoplasma e identificación de variedades.
Proteínas de reserva
El endospermo de los cereales es el principal
componente de la semilla, ya que representa
aproximadamente el 80-90% de su peso seco,
además que el almidón y proteínas son las dos
macromoléculas más importantes.
La clasificación según la proteínas del endospermo
se basa en la solubilidad relativa en diferentes
solventes: albúminas solubles en agua, globulinas
en solución salina, prolaminas en alcohol y
glutelinas en ácidos o álcalis.
El uso de proteínas de almacenamiento en estudios
de diversidad genética sistemática, se basa en el
hecho que las proteínas de diferentes individuos,
poblaciones y especies son homólogas, y que al
separarse en un gel producirán bandas similares o
diferentes.
Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en
la secuencia del DNA entre dos individuos, modifiquen estas o no su fenotipo. Esto
se debe a que los marcadores moleculares “señalan” tanto regiones codificantes
como no-codificantes del genoma.
Para que una porción de DNA ligada al carácter de interés sea considerado un
marcador genético debe mostrar una variación experimentalmente detectable entre
los individuos de la población, y una herencia predecible según las leyes de Mendel
Marcadores morfológicos
Influencia del ambiente
Bajo número
Baja cobertura del genoma
Bajo nivel de polimorfismo
Menos informativos (dominantes o recesivos)
Caracteres de madurez
Entrenamiento y subjetividad
Marcadores moleculares
Sin influencia ambiental y neutros
Cantidad ilimitada
Amplia cobertura del genoma
Alto nivel de polimorfismo
Más informativos (en general codominantes)
Análisis en fases tempranas
Sencillos, rápidos y objetivos
Polimorfismo de DNA
 Diversos sucesos pueden causar variantes, más o menos
complejas, en la secuencia de nucleótidos del DNA. Tales
variantes se describen, generalmente como polimorfismos.
 El polimorfismo se manifiesta en diferencias del genotipo - lo que
se demuestra en los diversos perfiles de bandas que se detectan
con un procedimiento apropiado - y quizás del fenotipo.
 Varios sucesos pueden producir polimorfismos:
• Mutaciones puntuales
• Inserciones o deleciones
• Rearreglos
“Polimorfismo de DNA es resultado de la acumulación de mutaciones”
Marcadores moleculares de DNA
Un marcador de DNA es simplemente un punto de referencia en un
cromosoma, que puede o no corresponder a un gen.
Existen diversas técnicas de biología molecular disponibles para
detectar variabilidad en la secuencia de DNA. La reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), las enzimas de restricción, la separación
electroforética de los fragmentos de DNA, las sondas marcadas y las
hibridizaciones.
Estas técnicas permiten obtener un número virtualmente ilimitado de
marcadores moleculares, para cubrir la totalidad del genoma de un
organismo.
Clasificacion: de acuerdo al tipo de técnica I
De acuerdo al tipo de técnica II
• Métodos sin el uso de PCR
• RFLP
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción/ Restriction
Fragment Length Polymorphism
• VNTR
Variable Number Tandem Repeat /minisatelites
• Métodos con el uso de PCR
– PCR con primers arbitrarios
• RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP
• AFLP
• ISSR
– PCR primers sitio-específico
• CAPS, SCAR
• SSRs (microsatélites)
• TGGE, SSCP, DGGE
De acuerdo al número de copias de la secuencia blanco
• Secuencia de pocas copias - codificante
• RFLP
• Secuencia con copias repetidas
• VNTR
• SSRs (microssatélites)
• ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)
• Secuencia con numero de copias indefinido
• RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP
• AFLP
• CAPS, SCAR
1,5%
8,5%
altamente
repetido
45%
moderadamente
repetido
45%
Segun la fuente de DNA
DNA nuclear (nDNA)
En eucariontes, la mayor parte de la información genética se
encuentra contenida en el núcleo de la célula.
El nDNA contiene regiones únicas −de una sola copia− y no
únicas −duplicadas o regiones repetitivas. Se considera que
los organismos diploides tienen dos copias de cada región
genética (locus) en los pares homólogos de los
cromosomas, llamadas alelos, sin tener en cuenta si
contienen regiones codificantes (exones) o no codificantes
(intrones o regiones intergénicas).
DNA de cloroplasto (clDNA)
En los organismos fotosintéticos con cloroplastos existe un
DNA típicamente bacteriano circular, de 120 a 200 kb (Brown
et al. 1979), con intrones y exones, muy conservado, ya que
se trata fundamentalmente del mismo genoma desde las
hepáticas hasta las plantas superiores.
Cada cloroplasto contiene varias regiones nucleotídicas, cada
una con 8 a 10 moléculas de DNA.
Un organismo unicelular como Euglena puede contener de 40
a 50 cloroplastos, por lo que la celula entera puede contener
más de 500 copias del genoma del cloroplasto (Stansfield,
1992).
DNA mitocondrial (mtDNA)
El genoma mitocondrial (mtDNA) tiene un tamaño de 15 a 17 kb (Brown et al.
1979) y su longitud varía considerablemente entre especies: 20 micrómetros
en Neurospora; 25 micrómetros en levaduras; 30 micrómetros en plantas
superiores; 5 micrómetros en algunos animales metazoarios (multicelulares).
Se considera que la mayoría del mtDNA de hongos y plantas no codifica, ya
que el mtRNA contiene intrones. El mtRNA de animales carece de intrones y
se transcribe como RNA policistrónico y se parte en RNA monocistronico
antes de la traducción (Stansfield, 1992).
Los polimorfismos del DNA mitocondrial (mtDNA) se han utilizado
ampliamente en análisis filogenéticos y de diversidad genética. Son
especialmente importantes para trazar historias filogeográficas y de
estructura poblacional genética estrechamente relacionada al linaje. También
nos permiten inferir cambios demográficos y de dispersión entre especies
(Dirienzo y Wilson, 1991).
DNA ribosomal (rDNA)
El rDNA puede encontrarse en mitocondrias, cloroplasto y núcleo. Contiene la información
para el RNA que conforma los ribosomas, por lo que es información que se transcribe pero
no se traduce. Útiles para relaciones filogenias.
El rDNA se presenta en repeticiones tándem y está formado por tres subunidades altamente
conservadas (18 rDNA, 5.8 rDNA y 28 rDNA), separadas por dos espaciadores con elevadas
tasas de sustitución (ITS1 e ITS2, marcadores moleculares).
Estas repeticiones en tandém
se encuentran conservadas a
lo largo de todo un genoma y
evolucionan concertadamente,
lo que se atribuye a eventos
recombinatorios
como
entrecruzamiento desigual y
conversión génica.
Descripción de los marcadores moleculares
Maheswaran M (Aug. 2004) Advanced Biotech
Importancia
relativa de los
marcadores
Marcadores basados en DNA
RFLP (Restriction fragment length polymorphism o Polimorfismo en la
longitud de fragmentos de restricción)
AFLP (Amplified fragment length polymorphism o Polimorfismos en la
longitud de fragmentos amplificados)
RAPD (Random amplification of polymorphic DNA o polimorfismos de
DNA amplificados al azar)
MINISATELITES
VNTR (Variable number tandem repeat o Número variable de repeticiones en tándem)
SSR - MICROSATELITES
SSR (Short Sequence repeats)
STR (Short Tandem repeats)
SNP (Single nucleotide polymorphism o polimorfismo de un solo nucleótido)
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs)
Compara el número y tamaño de fragmentos de DNA
producidos por digestión DNA con varias enzimas de
restricción
Cebadores unidos a varias posiciones del DNA.
La ubicación de los sitios de unión es aleatoria.
Se utiliza el DNA celular total
Requiere el DNA puro de alto peso molecular
Metodologia
1 . Digestion DNA en fragmentos pequeños
2. Separacion de los fragmentos en gel de
eletroforesis
3. Transferencia de fragmentos de DNA para
filtro Nylon o nitrocelulosa.
4. Visualizacion de los fragmentos de DNA
– sondas marcadas (32P) o quimioluminiscencia
5. Análisis de los resultados
– bandas analizadas para alelos en/o
presencia/ausencia
– Diferencias en el patron de bandas refleja la
diferencias genéticas.
La eleccion de la sonda y enzima de restriccion es crucial
(RFLP)
Interpretacion de resultados
1
1
2
3
4
5
6
2
3
4
5
6
Sitio objetivo de la sonda
Sitio de restriccion
Insercion
RFLP en Caña de Azúcar
Sorgo
Caña
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPDs)
Cebadores son cortos (10 bp) con una secuencia generada
aleatoriamente. Ademas puede contener >50% G+C.
Cebadores unidos a varias posiciones del DNA.
La ubicación de los sitios de unión es aleatoria.
Algunos fragmentos generados son parecidos y otros diferentes de
un individuo a otro.
Desventaja: Alta variabilidad, dificultad de reconstruir historias
evolucionarias
(RAPD)
RAPD
AA
AA Aa aa
Aa
aa
Heterocigoto/
Homocigoto
Interpretacion
•
•
•
•
Marcadores RAPD son anonimos
Son datos binarios (presencia x ausencia)
RAPD son dominantes (AA = Aa)
Problemas de co-migracion
– misma banda, mismo fragmento?
– una banda, un fragmento?
• Cuestionamiento para filogenia
– banda homólogas?
Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP
•
•
•
•
Combinacion de RFLP y PCR
Resulta en patrones bastante informativos
Marcador dominante
Método cada vez mas usado
DNA genomico
Digestion con dos enzimas
MseI
EcoRI
adaptadores
ligacion
pre-amplificacion
Amplificacion selectiva
MseI
EcoRI
DNA
digestion
ligacion
preamplificacion
primer +1
GAATTCCN
CTTAAGCN
EcoRI
NTTAA
NAATT
ATTCCN
GCN
ATTCCN
TAA GCN
NT
NAAT
NT TA
N AT
A
ATTCCN
TAAGCN
NTTA
NAAT
C
AAC
Amplificacion
primer +3
ATTCCA
TAAGCT
GTTA
CAAT
AAC
MseI
AFLP de frijol gel desnaturalizante
coloreado con plata
AFLP de caña con 33P
El análisis AFLP combina la digestión
con enzimas
de restricción con el PCR.
1) Digestión del DNA con dos ERs,
una de las cuales corta secuencias
precisas y la otra corta más
frecuentemente.
2) Se agregan adaptadores para que se
peguen en los
bordes de los fragmentos recién
formados y poder amplificar mediante
PCR.
DNA Repetitivo
Microsatélites o Secuencias Simples Repetidas
(Simple Sequence Repeats, SSRs)
- Mono-, di-, tri-, y tetra-nucleótidos
Minisatélites o Short Tandem Repeats (STRs)
- 5-10 bp
Variable Number of Tandem Repeats
- 14-100 bp
Microsatélites
– Secuencias cortas (1 a 6 bases) repetidas en tandem.
– Presentes en procariotos y eucariotos.
– Presentes en regiones codificantes y no codificantes.
– Mayoria de las repeticiones son dinucleotideos
• (AC) n (AG) n (AT)n
Los segmentos cortos DNA tienen secuencias repetidas como
CACACACA, y se presentan en el DNA no codificante.
La unidad repetida CA puede ocurrir 4 veces, o también 7 o 2 o 3.
Microsatélites (SSR)
ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG
GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG
TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC
ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG
AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG
Primer FOR
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Repeticion CA
Primer REV
Obtencion de secuencias:
• a partir del banco de datos de genoma se
busca un cDNA
• Hibridacion con biblioteca genomica,
identificacion de clones y secuenciamiento
• Construccion de biblioteca enriquecida
por afinidad con secuencia de la matriz
Digestion
DNA genômico total
Secuencia microsatélite
Ligacion
Adaptadores
Nicotiana tabacum
Adaptadores
Amplificacion
ssDNA
Sonda biotinilada
ssDNA
Bolilla magnéticaestratividina
Enriquecimento y
Seleccion
Columna
Amplificacion
despues del
enriquecimiento
Enriquecimiento y seleccion
95°C / 15 min
Sonda biotinilada
ssDNA
Biotina IIIII(CT)8
o
Biotina IIIII(GT)8
Temperatura ambiente / 20 min
Coluna
Magnética
água
• Deteccion del polimorfismo
– Geles de agarosa
– Geles de acrilamida (detecta diferencias
hasta de 2pb)
• Coloracion direta: nitrato de plata (barato)
• Coloracion indireta: marcacion radioativa o
fluorescente
Dna Total
Nicotiana ripanda
N. sylvestris
N. tabacum “Coker 176”
N. tabacum “Ky 14 RMI”
Digestion
con RsaI
Ligacion con
adaptadores
Amplificacion
Amplificacion despues
del enriquecimento
Todas las placas son evaluadas
N. tabacum “Coker 176”
N. sylvestris
• Problemas
– Costo y trabajo involucrados en el
desarrollo de los cebadores
• Construccion de bibliotecas genomicas
• Secuenciamiento
• Seleccion de los mejores cebadores
Posibilidad de utilizar secuencias
depositadas en la base de datos
EST – SSR funcional x SSR genomico
Una nueva generación: 2006 - 2012
Single Nucleotide Polymorphism: SNPs
•
•
•
Pueden representar hasta 90% de la variación genética humana
1.5 millones de posiciones presentan variabilidad
Puede ser la base de susceptibilidad a enfermedades comunes (cáncer, diabetes, etc)
•
Farmacogenética:
busca
identificar
la
posible
respuesta a las terapias con
drogas.
Metodos para identificar
depende si es un SNP
desconocido o conocido
•
The Next Generation of Molecular Markers From Massively Parallel
Sequencing of Pooled DNA Samples
1. Amplificar DNA por
PCR y sintetizar el
primer upstream de un
SNP conocido
2. Alinear primer a la
secuencia blanco
3. Primer
marcado
extendido y terminado
ddNTP
4. Separar fragmentos por
una plataforma
5. Analizar resultados
Insertion Site Based Polymorphism
Desarrollo de varios marcadores moleculares basados en elementos transponibles, tales como
S-SAP, IRAP, REMAP y RBIP.
trigo
Marcadores No Polimórficos
•
STSs (Sitio de secuencia especifica o
Sequence Tagged Sites)
Secuencia corta de DNA (200 – 500 bp) con
una ubicación cromosómica conocida que
ocurre una vez en el genoma. Se puede
amplificar por PCR y utilizar para construccion
de mapas físicos y genéticos.
•
ESTs (Marcador de Secuencia Expresada o
Expressed Sequence Tags)
Los EST son producidos por secuenciación
sobre un mRNA clonado de una biblioteca de
cDNA).
La secuencia resultante es un fragmento de
baja calidad, generalmente de 500 a 800
nucleotidos,
que
es
la
longitud
de
secuenciación
de
los
secuenciadores
automáticos.
Como esos clones consisten en DNA que es
complementario
al
mRNA,
los
ESTs
representan porciones de genes expresados.
Un marcador ideal debe ser: a) altamente polimórfico o variable dentro y entre
especies; b) con herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes); c)
insensible a los efectos ambientales; d) de rápida identificación y simple análisis.
Código de Barras de la Vida
Código de barras es una metodología estandarizada para
identificar plantas y animales mediante un número mínimo de
secuencias de DNA, llamado código de barras de ADN (código
de barras de la vida).
Código de barras de la vida se define como una secuencia corta de DNA de una región
estándar del genoma, usada en la identificación de especies (plantas y animales).
¿Por qué determinar el código de barras de la vida
de las especies?
Diversidad conocida
Aprox. 1.7 millones de especies
1 cuadro = 10,000 especies
Diversidad estimada
10 millones de especies
La región génica en animales, es 648 bp del gen mitocondrial COI.
Este gen ha demostrado ser altamente efectivo en la identificación de
aves, mariposas, peces, mosquitos y otros.
Mayor número de diferencias entre especies.
•Número de copias.
•En la mayoría de los casos, existen relativamente
pocas diferencias entre especies.
•Intrones, los cuales son regiones no-codificantes,
están ausentes en el ADN mitocondrial.
En plantas, 04 regiones de genes
codificantes de cloroplasto (rbcL; matK;
rpoB y rpoC1) y 03 espaciadores no
codificantes (atpF-atpH; trnH-psbA y
psbK-psbI).
La región del espaciador interno transcrito (ITS) tiene la mayor probabilidad
de identificación exitosa “barcode” para la más amplia variedad de hongos.
Tipificación de secuencia multilocus ribosomal (rMLST, por sus siglas en ingles):
Aprox. 53 genes codifican las subunidades
de proteinas ribosomales bacterianas
(genes rps). Los genes de la familia RPS,
dan las diferentes proteinas que son los
componentes de las estructuras celulares
llamadas ribosomas.
Las comparaciones muestran que entre humanos existen diferencias
de 1 a 2 nucleótidos de los 648 evaluados (COI), mientras que somos
diferentes de los chimpacés en 60 nucleótidos y de los gorilas en 70
posiciones.