Facultad de Ciencias Licenciaturas : Ciencias Biológicas y Bioquímica Taller 12: Replicación del ADN Objetivos: - Analizar las características de la replicación del ADN, del proceso de síntesis in vivo y resolver problemas vinculados. - Comprender el método de secuenciación de ADN (Sanger) y la PCR, dos metodologías basadas en la síntesis de ADN in vitro. 1) Escribir la ecuación de la reacción de síntesis del ADN. 2) En qué sentido se sintetiza el ADN: 3’→ 5’, 5’→ 3’? ¿Qué se entiende por síntesis bidireccional? Esquematice una burbuja de replicación que avanza en las dos direcciones, indicando las hebras de ADN en crecimiento y cada uno de los extremos 5' / 3'. 3) Para establecer el carácter unidireccional o bidireccional de la replicación, se puede tomar como referencia los sitios de corte de enzimas de restricción y analizar la evolución de la burbuja replicativa en el tiempo. Los resultados pueden visualizarse por microscopía electrónica. En relación a ello, a) interpretar el esquema siguiente, diciendo si corresponde a una replicación uni o bidirecional. b) esquematizar los resultados esperados en las etapas posteriores. 4) Nombrar al menos 8 proteínas de E. coli que estén involucradas en la replicación del ADN, e indicar cual es la función que cumple cada una de ellas. 5) Analizar las diferencias y semejanzas que presentan las ADN polimerasas desde el punto de vista de la estructura y de su actividad enzimática, de acuerdo a los valores mostrados en el cuadro. Discuta estas observaciones en relación a la función que cumplen estas enzimas. Pol I gen PM (kDa) moléculas / célula V max (nt / seg) actividad 3' exonucleasa actividad 5' exonucleasa procesividad pol A 103 400 20 si si 3-200 Pol II pol B 90 100 3 si no 10000 Pol III pol C ? 130 10 750 no no ? 500000 Obs: teniendo en cuenta que la ADN pol holoenzima es una enzima multimérica compleja formada por numerosas subunidades diferentes, hay varios genes que codifican para la holoenzima. 6) Analizar las diferencias y semejanzas en el inicio de la replicación del ADN in vivo y en la síntesis de ADN in vitro. Describa los reactivos necesarios para realizar una reacción de síntesis de ADN in vitro. 7) ¿Qué precursores pueden ser incluidos en una reacción de síntesis de ADN in vitro para obtener una cadena de ADN marcada radiactivamente? α32P-dATP β32P- dATP α32P- ATP 14C- ATP β32P- ATP γ32P- GTP γ32P-dTTP 35S - dCTP α32P-dGTP 8) En la siguiente figura se muestra el resultado de una autorradiografía correspondiente a una electroforesis en gel de poliacrilamida para la secuenciación de un fragmento de ADN. La secuencia fue realizada por el Método de Sanger. ¿Cuál es la secuencia que usted puede leer a partir de ese gel.? Siendo la tasa de error de la replicación en E. coli del orden de 10-8 a 10-10, ¿qué 9) porcentaje de bacterias tendrá una mutación en cada generación? ¿Que mecanismos contribuyen a asegurar la elevada fidelidad de la replicación? ¿Esperaría que la hebra rezagada sea sintetizada con la misma fidelidad que la hebra conductora? Ejercicios complementarios C1. ¿Qué son las topoisomerasas? ¿Cuál es el rol que cumplen en la replicación del ADN? C2. ¿En qué se diferencian las topoisomerasas de tipo I y las de tipo II? C3. ¿Qué reacción cataliza la ADN ligasa? ¿Qué función cumple en la replicación del ADN? C4. Esquematizar el avance de la horquilla de replicación próximo a los telómeros (o al final de genomas lineales). Analice posibles estrategias para completar la replicación del genoma en esas situaciones. C5 Decir si es Verdadero (V) o Falso (F) 1. La replicación está dirigida por el apareamiento de bases complementarias 2. Después de un ciclo de replicación de un ADN de cadena doble, algunas de las moléculas de ADN no contienen material parental 3. En E. coli, la velocidad de elongación de la cadena de ADN depende de las condiciones de cultivo. 4. En E. coli, la frecuencia de iniciación de la replicación del ADN depende de las condiciones de cultivo. 5. Un mutante de E. coli defectivo en la ADN girasa (topoisomerasa de tipo II) no tiene afectada su propagación. 6.Las topoisomerasas son enzimas capaces de cortar una o ambas cadenas del ADN y volver a formar el enlace fosfodiester, modificando el grado de superenrollamiento. 7. La ligasa de E. coli cataliza la formación de un enlace fosfodiester. 8. La ligasa y la ADN polimerasa cumplen la misma función. 9. Las ADN polimerasas carecen de actividad exonucleasa 10. Los retrovirus tienen una ADN polimerasa ARN dependiente 11. La inclusión de ddNTPs en el medio de reacción de síntesis de ADN inhibe la elongación de la cadena. 12. La inclusión de NTPs en el medio de reacción de síntesis de ADN inhibe la elongación. C6. a) El cromosoma de E.coli mide 1.28 mm. En condiciones optimas, el cromosoma se replica en 40 minutos. ¿Qué distancia recorre una horquilla de replicación en 1 minuto? b) Si el ADN que se replica está en la forma B (10.4 pares de bases por vuelta), ¿cuántos nucleótidos se incorporan en 1 minuto en una horquilla de replicación? Si las células humanas en cultivo (como las células HeLa) replican 1.2 m de ADN durante una fase S de 5 horas y a una velocidad de horquilla de una décima parte de la observada en E.coli ¿Cuántos orígenes de replicación deben contener las células? d) ¿Cuál es la distancia media en kb entre estos orígenes? C7. En el mapa genético de E. coli que aparece en la figura está señalada la ubicación de sitios y genes esenciales para la síntesis y reparación del ADN genómico. Ubique en el mapa el sitio de origen y el sitio de terminación de la replicación. ¿Le parece compatible con una forma de replicación bidireccional? ¿ Y unidireccional? C8. Los mutantes de E. coli “polA1” carecen de ADN pol I activa; estos mutantes se replican normalmente, y pueden ser infectados por varios bacteriófagos. Cuando se exponen a dosis suaves de radiación UV, dosis inocua para las bacterias de tipo salvaje, los mutantes polA1 mueren de inmediato. Cómo afecta la luz UV a las bacterias? ¿Porqué los mutantes polA1 son mas sensibles a esta radiación? C9. ¿Por qué un ADN doble hebra lineal no puede replicarse en su totalidad sólo con las proteínas codificadas por E. coli, como ocurre con el bacteriófago T7? ¿Que ocurre con la replicación de los extremos del bacteriofago λ?
