Manual de Prácticas. Microbiología Industrial PRÁCTICA No. 1 Aislamiento y Selección de Microorganismos de Interés Industrial 1. OBJETIVO Desarrollar algunas técnicas de aislamiento y selección de microorganismos de interés industrial a partir de una muestra con población compleja de microorganismos. 2. FUNDAMENTOS Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. La más fundamental, el pequeño tamaño de la célula microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a volumen, lo que facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de la célula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de producción de proteína en las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que a su vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Se debe tomar en cuenta que la velocidad de biosíntesis microbiana es extremadamente alta, inclusive algunos microorganismos se reproducen en tan solo 20 min, tal es el caso de Escherichia coli. Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en presencia y ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes; en forma de esporas permanecen inactivos durante años, hasta que el medio ambiente más favorable, permita el desarrollo de las células. Los microorganismos son capaces de llevar a cabo una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de nutrición. Dicha versatilidad hace posible que las fermentaciones industriales puedan utilizar como base nutrientes de bajo costo. Sin embargo no todos los microorganismos pueden ser utilizados en la industria; para que un microorganismo sea considerado de uso industrial debe ser inocuo, capaz de producir sustancias de interés en cortos periodos de tiempo, estar disponible en cultivo puro, ser genéticamente estable y ser apto de crecer a gran escala y rápidamente. Además el microorganismo debe crecer en medios de cultivos de bajo costo y disponibles en grandes cantidades. Son pocos los microorganismos de uso industrial, inclusive se ha observado unos pocos centenares de especies de entre más de 100 000 descritas en la naturaleza, dentro de las cuales se encuentran las levaduras, los hongos filamentosos y las bacterias. Manual de Prácticas de Microbiología Industrial 2.1 Levaduras Las levaduras se han utilizado desde hace miles de años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidación de compuestos orgánicos, incluidos algunos que son tóxicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos. 2.2 Hongos filamentosos Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino también por el daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradación de gran parte de la materia orgánica de la tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales, pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre. Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su uso industrial, ya que son la base de muchas fermentaciones como la combinación de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales: miso, shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas y pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico y láctico), antibióticos (penicilina), quesos especiales (Camembert y Roquefort) y de las setas. 2.3 Bacterias Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas, del género Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando acetona y butanol. Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de los géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. El olor característico a tierra mojada se debe a los compuestos volátiles (geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia radica en la producción de antibióticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, entre otros. 2 Manual de Prácticas de Microbiología Industrial 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Materiales Material de Vidrio 12 Cajas Petri 6 Espátulas 6 Frascos de vidrio de 500 mL 6 Pipetas de 2 mL 6 Pipetas de 1 mL 6 Pipetas de 10 mL 36 Tubos de baquelita 16x150 mm Material Extra 6 Asas de nicromo 6 Asa de Digralski 6 Mecheros Fisher 6 Perillas 3.2 Reactivos y Medios de Cultivo Medios de Cultivo Reactivos y/o Soluciones Agar MRS 300 ml de agua peptonada al 0.1% Agar Saboraud 300ml de solución salina (2g/L) o diluyente Agar McConkey Kit para Tinción al Gram Agar EMB Peróxido de Hidrogeno (H2O2) al 30% (análisis catalasa) Clorhidrato de tetrametil-pfenilendiamina (análisis oxidasa) Extras Agua Destilada Alcohol al 80% Algodón 3.3 Equipos Agitador Vortex Estufa o incubadora Microscopio Óptico 3 Manual de Prácticas de Microbiología Industrial 4. PROCEDIMIENTO 4.1.-PREPARACION DE DILUCIONES 1. Preparar 6 cajas Petri con su duplicado con los siguientes medios de cultivo: a) Agar MRS b) Agar EMB c) Agar Saboraud d) Agar McConkey 2. Esterilizar tubos de baquelita de 15x150 conteniendo agua peptonada o sln. salina. 3. Pesar 10g ó 10mL de muestra. (La muestra a elegir puede ser suelo, residuos vegetales ó frutos en descomposición y residuos de los procesos de fermentación). 4. En condiciones asépticas incorporar la muestra al frasco de vidrio que contiene 90 mL de agua peptonada al 0.1%. 5. Homogeneizar las muestras durante 3 min manualmente o 1 min en el vortex. 6. En 6 tubos de baquelita que contienen 9 mL de diluyente, realizar diluciones de la muestra concentrada del frasco de vidrio, el cual contiene el caldo de microorganismos a aislar, tal y como se indica a continuación. Antes rotular los tubos de acuerdo a la dilución: 1/100, 1/1000, 1/10 000, 1/100 000, 1/1 000 000, 1/10 000 000 y 1/100 000 000. 7. Agitar manualmente cada tubo para homogenizar las diluciones y posteriormente tomar una alícuota de 0.1 mL de la muestra directa del tubo y colocarla en una caja de Petri. La cual contiene medio de agar nutritivo. 8. Extender la alícuota con la ayuda de un asa de Digralski. 9. Incubar a 30 y 37° C durante 48-72 h. 10. Realizar el recuento de colonias en UFC/g ó mL 4.2 AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS 11. Posteriormente, aislar las colonias con distinta morfología y purificar por resiembra en nuevas cajas Petri con agares selectivos según la morfología y características del microorganismo 12. Incubar de acuerdo a la morfología del microorganismo 4.3 PRUEBAS BIOQUIMICAS O PRUEBAS PRESUNTIVAS 13. Realizar las pruebas presuntivas: ü Tinción al Gram ü Catalasa ü Oxidasa 4 Manual de Prácticas de Microbiología Industrial 5. ACTIVIDAD 5.1. Realizar el diagrama de flujo del procedimiento con dibujos o texto de la metodología. 5 Manual de Prácticas de Microbiología Industrial 6. RESULTADOS 6.1.- Dibujar los resultados obtenidos de los microorganismos en las diluciones y anotar el recuento de estas en UFC/g 6 Manual de Prácticas de Microbiología Industrial 6.1. Tabla. Características morfológicas de las colonias aisladas Características Colonia Color Forma Elevación Bordes Superficie Tamaño 1 2 3 4 5 6.2. Tabla. Resultados de las pruebas presuntivas de las colonias aisladas Tinción de Gram Prueba Colonia Catalasa Morfología Agrupación Reacción 1 2 3 4 5 Prueba Oxidasa 6.3. Tabla. Recuento de colonias (UFC/g o mL) Dil: Colonia Recuento en caja No. de colonias Dil: Recuento en caja No. de colonias Dil: Recuento en caja No. de colonias UFC/mL 1 2 3 4 5 7 Manual de Prácticas de Microbiología Industrial 6.4. Dibuja la morfología de los microorganismos aislados, según como lo observaste en el microscopio. 7. CONCLUSIONES _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ 8 Manual de Prácticas de Microbiología Industrial 8. CUESTIONARIO 1.- ¿Para qué se realizan diluciones de la muestra a analizar? _________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ 2.- Menciona que tipo de microorganismo crecen en los siguientes Agares Agar Microorganismos Agar MRS Agar EMB Agar Saboraud Agar MacConkey 3.- Menciona la utilidad de las siguientes pruebas bioquímicas Pruebas Bioquímicas Utilidad Tinción Gram Catalasa Oxidasa NOMBRE DEL ALUMNO: FECHA DE ENTREGA: FIRMA DEL PROFESOR: CALIFICACIÓN: 9
