Genética Molecular. Biología. UB. Curso 2007-08.

Genética
Molecular.
Biología. UB. Curso 2007-08.
Carlos F. R.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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ÍNDICE
Tema 1: La Transcripción Procariota.
Tema 2: La Transcripción Procariota: Regulación.
Problemas.
Tema 3: La Transcripción Eucariota I.
Problemas.
Tema 4: La Transcripción Eucariota II.
Problemas.
Tema 5: La Transcripción Eucariota III.
Extra Tema 5: Técnicas.
Problemas.
Tema 6: La Transcripción Eucariota IV.
Problemas.
Tema 7: La Traducción.
Tema 8: La Replicación Procariota.
Problemas.
Tema 9: La Replicación Eucariota.
Tema 10: Reparación de las Mutaciones en Procariotas I.
Tema 11: Reparación de las Mutaciones en Procariotas II.
Problemas.
Tema 12: Reparación de las Mutaciones en Eucariotas.
Problemas.
Tema 13: Recombinación General: Introducción.
Tema 14: Recombinación General: Mecanismo Enzimático.
Problemas.
Tema 15: Recombinación de Sitio Específico.
Tema 16: Transposición Procariota.
Problemas.
Tema 17: Transposición Eucariota.
Tema 18: Biología de los Retrovirus.
Tema 19: Retrotransposones y Retrogenes.
Problemas.
Tema 20: Inmunoglobulinas.
Problemas.
Exámenes.
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TEMA 1: LA TRANSCRIPCIÓN PROCARIOTA.
La transcripción consiste en sintetizar RNA a partir de
DNA. El dsDNA es el DNA de doble cadena (y el ssDNA, el DNA
de cadena simple). Por consenso, siempre nos dan el extremo
5’-P arriba a la izquierda. Abajo suyo hay un 3’-OH.
La cadena “sense” del DNA es la que NO contiene la
información, es decir, la que no lee la RNA Polimerasa. La
cadena “antisense” es la que tiene la información para
pasar a gen, es leída por la RNA Polimerasa.
La transcripción siempre es en 5’3’ de la cadena que se
sintetiza.
Hay 3 etapas en la Transcripción:
- Iniciación: La RNA Polimerasa se une al promotor, abre la
burbuja e inicia la transcripción.
- Elongación: La RNA Polimerasa se desplaza elongando el
RNA.
- Terminación: La RNA Polimerasa, el RNA y el DNA se
separan.
1. La Iniciación.
El promotor es la secuencia de bases a la cual se une la
RNA polimerasa. Forma parte del gen, en la región
“upstream” del gen (no se transcribe, regula, está a 5’).
El “downstream” es desde el inicio de la transcripción
hasta el final.
La base “+1” en el DNA se asigna al primer nt que se
encuentra en el RNA, es decir, es el primer nt que se
transcribe. La numeración de las bases del promotor, por
tanto, será negativa.
El promotor tiene una secuencia de bases hacia la cual la
RNA polimerasa tiene mayor o menor afinidad. Pero siempre
tiene
unas
cajas
de
secuencia
“consenso”,
que
es
invariable, en la misma posición. A saber:
Caja “-35”. Dominio
de reconocimiento.
“TATA box” ó caja“-10”
ó Pribnow Box ó
Dominio de desenrollamiento.
Caja “CAT”. En el 90% de los
casos, la base “+1” (la primera
en el RNA) es una A.
No se procesará el RNA.
Las distancias entre la caja “-35” y la “tata box”, y entre
la “tata box” y la caja “CAT” son de 16 a 19 pb y de 5 a 9
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pb respectivamente. Siempre se debe mantener éste número de
bases que las separe. Lo que se puede variar es la
secuencia de bases que contienen. Así, si mutamos éstas
bases podemos obtener mutaciones “UP” si son bases hacia
las cuales la RNA Polimerasa tiene alta afinidad:
incrementa la tasa de transcripción (DOMINANTE, promotor
fuerte); mientras que serán mutaciones “DOWN” si son bases
hacia las cuales la RNA Polimerasa tiene poca afinidad:
baja tasa de transcripción (RECESIVO, promotor débil).
De éste modo, la RNA Polimerasa se une a la caja “-35” y a
la “tata box”, desenrolla desde la “tata box”, se mueve
sobre el DNA sintetizando RNA complementario al DNA, en
5’3’. Estrictamente, en la iniciación se sintetizan unos
pequeños tránscritos abortivos (oligos de RNA no unido)
desde antes de -10, pero el RNA definitivo siempre se
sintetiza a partir de la base +1. Los promotores fuertes
tienen una durada pequeña de la fase abortiva, al revés que
los débiles. Así se forma el “complejo de transcripción
cerrado” (dsDNA + RNA polimerasa). A partir del inicio de
la transcripción se forma el “complejo ternario” (dsDNA +
RNA polimerasa + RNA). Una vez hechas las transcripciones
abortivas e iniciada la elongación, se pueden separar
subunidades de la RNA polimerasa que ya no sean necesarias
para elongar.
La RNA polimerasa Procariota (sólo hay 1 tipo):
- Subunidades α: Ensamblan. Interaccionan con prots. reguladoras.
Reconocen a las secuencias “UP
ELEMENTS”(están en el promotor,
aumentan la tasa de transcripción).
- Subunidades β y β’: Reclutan
rNTP.
Son
el
verdadero
centro
catalítico,
forman
enlaces
fosfodiéster.
- Subunidad σ: reconoce a la caja “-35” con su dominio σ4 y
a la “tata box” con su dominio σ6. Las subunidades σ son
intercambiables, hay una diferente para cada gen.
2. La Elongación.
Se añaden los rNTP complementarios al DNA antisense, en
5’3’. Llega un momento en el que se pierde la subunidad
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“σ”, y más adelante también se pierden las dos α. Sólo
queda el centro catalítico.
3. La Terminación.
En Procariotas depende de secuencia señal. Se clasifican
según si interviene cierta proteína o no (Rho).
3.1. Terminación Rho-Independiente ó Intrínseca: sólo
necesita secuencias en el DNA, no interviene Rho. Cuando se
ha transcrito la secuencia en el RNA se para la
transcripción, porque primero se forma un “hairpin” (o
loop) debido a una región de bases complementarias entre
ellas, rica en GC (esto hace que “pese” más el RNA).
Después se transcribe una región con muchos U, los cuales
tienen sólo 2 enlaces con la A del DNA (la tensión que hace
el “hairpin” es suficiente) y se arranca el RNA.
3.2. Terminación Rho-Dependiente ó Extrínseca: se
transcribe una secuencia llamada RUT (en el RNA) a la cual
se le une Rho. Está a 50-70 nt del codón STOP, en el 3’UTR.
Rho es un hexámero que se desplaza 5’3’ gastando ATP, a
una velocidad muy rápida. Así llega a “chocar” con la RNA
polimerasa, haciéndola saltar. Se rompen los enlaces de H2
entre el RNA y el DNA molde porque también tiene actividad
helicasa.
También se forma en éste caso un “hairpin” rico en GC, pero
es insuficiente para hacer saltar el RNA. No hay cola de U.
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TEMA 2: LA TRANSCRIPCIÓN PROCARIOTA:
REGULACIÓN.
Los genes Procariotas se organizan en operones, ya que el
mRNA que producen es policistrónico (= tiene varios lugares
de inicio de la traducción, cada uno con su STOP, y
codifica para varias proteínas diferentes). A la región
reguladora (en el Operador) se unen proteínas represoras,
para hacer como un “muro” que impiden que físicamente
avance la RNA Polimerasa (repasar ésto de Genética
General).
Así, en Procariotas, el modelo típico de regulación es
mediante el Control Negativo (C-) de la transcripción, en
el que por defecto las proteínas represoras se unen a la
región reguladora, ya que basalmente hay transcripción. En
Eucariotas, sin embargo, es al revés: hay un Control
Positivo (C+) de la transcripción, en el cual es necesario
activar
a
una
serie
de
moléculas
(Factores
de
Transcripción) para que pueda iniciarse la transcripción,
ya que basalmente es inactiva.
También encontramos en Procariotas (aparte de las proteínas
represoras):
-el inductor: induce la transcripción porque bloquea a la
proteína represora. Lo es, por ejemplo, la lactosa y la
proteína CAP (Catabolic-gene Activation Protein) activada.
Permiten un sistema de C- inducible por lactosa (bloquea al
represor y permite la transcripción) y un sistema de C+
inducido por CAP (estimula a la RNA Polimerasa).
-el
correpresor:
estimula
a
la
proteína
represora
bloqueando la transcripción. Lo es, por ejemplo, el
triptófano. Permite un sistema de C- reprimible por
triptófano.
Por tanto:
Op. Lactosa: C- inducible por lac: Inductor + represor =
transcripción. C+ inducido por CAP: Inductor + represor +
activador (CAP) = Mucha transcripción.
Op. Trp: C- reprimible por trp: represor + correpresor = no
transcripción.
No se conoce ningún operón donde haya un C+ reprimible, ya
que sería absurdo metabólicamente.
Se comentarán a continuación 4 ejemplos en los que la
regulación de los genes Procariotas se lleva a cabo en
diferentes situaciones, usando diferentes estrategias.
Nota: Por una vía metabólica que no se comenta aquí, cuando hay mucha glucosa
= poco AMPc = poco CAP activado. Y al revés: poca glucosa = mucho AMPc = mucho
CAP activo. CAP + AMPc = CAP activado (= CRP según algunos).
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1. EL OPERÓN ARABINOSA.
Contiene los genes (B, A y D) que metabolizan la arabinosa
para obtener energía. Se activa en presencia de arabinosa
(similar al operón lactosa: sistema de C- inducible por
arabinosa).
La proteína C es la represora, y la proteína CAP (con AMPc)
es la proteína activadora. Basalmente, la proteína C es
represor, pero al unirse a la arabinosa, no solo deja de
reprimir sinó que se convierte en un activador de la
transcripción y actúa sinérgicamente a CRP (el CAP activado
se une a la región “CRP Binding Site”, al lado del OI).
Para que haya transcripción se necesita que no tengamos
glucosa en el medio (mucho CRP) y que haya arabinosa (se
inhibe la represión de la proteína C). Si hay glucosa y
arabinosa no hay transcripción porque falta el CRP (no hay
activador); y si no hay ni glucosa ni arabinosa tampoco hay
transcripción porque la proteína C está reprimiendo.
Las dianas de la proteína C son AraI (con I1 y I2), AraO1
(con O1L y O1R) y AraO2.
Debido a que el Promotor de la proteína C solapa con el
AraO1, se dice que la proteína C regula su propia síntesis.
Basalmente se sintetiza proteína C, y cuando su [ ] es
alta, se une a sus 3 dianas bloqueando la transcripción;
mientras que si su [ ] es baja, se desengancha y se produce
más proteína C. Es un feedback -. Para regular la
transcripción de AraC, la región AraO2 es optativa.
La verdadera función de AraO2 es regular la transcripción
de los genes BAD:
- cuando hay poca arabinosa y mucha glucosa, la proteína
C se une a AraO1 y simultáneamente a AraO2 y AraI, haciendo
un “loop” en el DNA. No funciona ningún promotor, porque se
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tapa físicamente el contacto de CRP con la RNA Polimerasa
(la activaría). Tampoco se sintetiza más proteína C.
Las 3 dianas de AraC son
AraO2, AraI (tiene I1 e
I2, la proteína C se une
a I1) y AraO1 (tiene O1L
y O1R, la proteína C se
una a ambos).
- cuando hay mucha arabinosa y sin glucosa, sucede que
la arabinosa se une a la proteína C haciendo que no inhiba
y se vuelva activadora; no se puede unir a AraO2 ni a
AraO1, con lo cual hay más proteína C que hace de activador
(porque hay arabinosa). Sí que se puede unir a AraI (a sus
dos subregiones, I1 y I2), y actúa sinérgicamente a CRP
(porque
no
hay
glucosa)
y
se
estimula
mucho
la
transcripción de los genes BAD.
Se deshace el loop en el DNA, las subunidades α de la RNA
polimerasa tocan a el CRP que
está unido al CRP Binding Site (un UP ELEMENT)y a la vez la
proteína C unida a arabinosa es activador, hay mucha
transcripción.
Molecularmente, la proteína C es un homodímero. Por el
dominio C’terminal se une al DNA y por el dominio
N’terminal se une a la arabinosa y a otro monómero de
proteína C.
Así, cuando se forma el loop hay 4 monómeros de proteína C
(=2 homodímeros); y cuando se deshace el loop hay 2
monómeros de proteína C (=1 homodímero) unidos cada uno a
arabinosa.
2. LA RESPUESTA SOS EN E.COLI.
Sirve para detectar si hay mutaciones en el DNA, generando
masivamente enzimas que reparan el DNA. Basalmente esto
está reprimido y se activa sólo con daños en el DNA.
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Implica a las proteínas LexA y RecA (ésta última es muy
importante, siempre tiene un pool basal en la célula).
Debido a que cuando hay lesiones en el DNA y se realiza la
reparación (en muchos de los sistemas de reparación, ver
Tema 11 y Tema 12), en un momento dado hay un fragmento de
ssDNA que es el sustrato de RecA. Unida así al ssDNA, RecA
empieza a moverse por todo el DNA en busca de la proteína
LexA, la cual de manera constitutiva se ha expresado y está
unida a las cajas SOS (= operadores de LexA = dianas de
LexA dentro de los promotores de los genes SOS, está allí
bloqueando la transcripción). Una vez que RecA toca a LexA,
hace que LexA se separe del promotor y se autoproteolice.
Los genes que tenían LexA en el promotor bloqueando su
expresión eran UVR-A, UVR-B, RecA, LexA (reprime su propia
síntesis), los genes SOS. Así toda la proteína LexA
desaparece autoproteolizándose, ya sea la que había
reprimiendo como la que aparece de nueva síntesis.
3. LA ESPORULACIÓN EN Bacillus subtilis.
Es muy similar a la de Bacillus antraci. La bact. se divide
por bipartición mitótica, si las condiciones son óptimas.
Pero si las condiciones del medio son desfavorables,
entonces la bact. inicia el proceso de esporulación. En él,
la bact. no se divide, sino que replica su DNA y forma una
pared ó “séctum” que separa dos compartimentos internos
cada uno de los cuales tiene un genoma. El compartimento
grande es la madre y el pequeño es la proespora (espora
incipiente que aún no se ha separado).
Finalmente, la proespora se separa y se vuelve espora,
queda en estado de quiescencia y la madre se autolisa.
Todo ello se regula genéticamente y el proceso lo empezamos
a estudiar cuando se ha formado la proespora incipiente,
con el séctum. El objetivo final del proceso es conseguir
que en la célula madre se activen los genes de autolisis y
la proespora active los genes para definir el séctum en
pared y así separarse.
A medida que se va avanzando por la cascada de señalización
se van cambiando las subunidades σ. De hecho, los genes que
se activan mientras avanza el proceso son los genes que
codifican para las subunidades σ específicas del siguiente
gen. Es la transcripción diferencial, la RNA polimerasa
tiene diferentes σ en función del momento.
Las diferentes σ que aparecen son:
- σA, σE, σK: han de quedar en la madre.
- σH, σF, σG: han de quedar en la proespora.
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OJO: Las subunidades σ están presentes por todos los
compartimentos,
pero
sólo
son
funcionales
en
el
compartimento correspondiente gracias a la acción de
proteínas secuestradoras que atrapan a la subunidad σ que
no corresponde al compartimiento.
Éstas proteínas secuestradoras son:
-AA: basalmente fosforilada (inactiva) en la madre y en
la proespora. Se activa desfosforilándose cuando pasa
al compartimento de la hija.
-AB: basalmente activa en la madre y en la proespora.
Secuestra a la subunidad σF en ambos compartimientos.
En la proespora, AB es secuestrada por AA y σF queda
libre.
-Proteínas del séptum:
Fosfatasa 2A.
Proteasa transmembrana activada por “2r”.
Proteasa transmembrana activada por “4b”.
(Ver esquema del funcionamiento en la siguiente página).
Hay dos puntos de control en todo el proceso para mantener
los ritmos de transcripción de los genes de las subunidades
σ al ritmo correcto:
- Para que σE se active al mismo tiempo que σF, σF en la
proespora transcribe para “2r”, proteasa transmembrana
con dominio catalítico en la madre que activa a σE.
- σG en la proespora transcribe para “4b”, que activa a
la proteasa del séptum que activa a σK en la madre.
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CONDICIONES ADVERSAS (MUCHA Tª, CO2…)
(extracelular)
SÉPTUM
MADRE
Quinasa
Termosensible
OFF
Quinasa
Termosensible
ON
Quinasa
Termosensible
OFF
SpoA-P ON (prot.
Master)
SpoA OFF
σH
PROESPORA
σA
σF
σE
Quinasa
Termosensible
ON
SpoA-P ON (prot.
Master)
SpoA OFF
σH
σA
σF
σE
inact
inact
AB
AB-σF
AB
AB-σF
AA
AA-P
Dom. P’asa
AA-AB
act
inact
Pi
σF
act
Transcribe
para “2r”
2r
σE
act
Transcribe
para…
Dom.
proteasa
Transcribe
para…
σG
act
Transcribe
para “4b”
σK
inact
4b
σK
act
Dom.
proteasa
GENES
QUE
DETERMINAN LA
FORMACIÓN DE
LA PARED.
GENES QUE INICIAN
LA AUTOLISIS EN
LA MADRE.
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4. EL FAGO λ.
El fago lambda (λ) es un virus atemperado, es decir, que
puede hacer el ciclo lítico (lisis) si decide matar a su
huésped cuando se divide y así infectar a las células
vecinas, o bien puede hacer el ciclo lisogénico (lisogenia)
cuando integra su genoma en el del huésped (siempre en el
mismo sitio) cuando no se divide. El genoma de un virus
integrado en el genoma del huésped recibe el nombre de
profago (fago = virus; bacteriógafo = tipo de virus cuyo
huésped es una bacteria).
Su genoma es lineal pero dentro del huésped se circulariza
por los extremos cos. Necesita usar la maquinaria del
huésped para realizar sus funciones (es decir, los
promotores de sus genes son bacterianos). Se replica por el
modelo del círculo rodante.
La integración de λ en el genoma de E.Coli siempre es en el
mismo
lugar
(mediante
una
recombinación
de
sitio
específico, ver tema 15) y queda en estado de provirus.
Organización:
- Operón Izquierdo (OL): sib-attP-Int-Xis-abc-CIII-N
- CI: no es un operón, es un gen. Tiene 2 promotores.
- Operón Derecho (OR): Cro-CII-O-P-Q-S-R-cos
- Operón Tardano (OR’): S-R-cos-Cápside-Cola. Solapa
parcialmente con OR. Lleva a la lisis.
Cuando el fago λ entra en E.Coli, se circulariza y sus
promotores PR (del operón derecho) y PL (del operón
izquierdo) se comienzan a transcribir inmediatamente con la
RNA polimerasa procariota. Se codifican las proteínas N
(antiterminadora de la transcripción) y Cro (represora de
la transcripción, lleva a la lisis). Se mantiene así un
rato, haciendo el pool de N y Cro. Se cree que la
terminación de la transcripción es dependiente de Rho.
Cuando N tiene [ ] suficiente, se une a las secuencias RUT
en el RNA (eran las cajas NUT del DNA). Las cajas NUT
estaban en el DNA después de PL y después de Cro. N compite
con la afinidad de Rho para unirse al RNA, y N tiene más
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afinidad, así se llega a unir a la RNA Polimerasa y hace
que no salte, permitiendo que se pueda saltar la señal de
terminación de la transcripción que había (= tR ó tL).
nutL
CI
nutR
N y Cro son las proteínas primerencas, que vienen de los
genes primerencos. Los genes primerencos tardanos son de
CII hasta Int (para OL) y de CIII hasta Q (para OR). Los
genes tardanos son de S hasta la cola (para OR).
De momento ésto lo hace siempre: se transcribe el operón
izquierdo todo y el derecho hasta Q. Así hace la lisogenia
por defecto, porque al final del OL está la integrasa que
lo integra en el genoma del huésped (ya veremos cómo se
expresa).
Si queremos hacer lisis, la célula se tiene que dividir,
hemos de pasar de Q en la transcripción y llegar a activar
al promotor del OR’ (el PR’) para hacer los genes de lisis
(ver esquema completo en página 19).
Si pasamos de Q, se hace la lisis. Al final de Q, hay tR3
(=tR’). Gracias a la proteína Q, se puede saltar ésta señal
de terminación, ya que Q actúa uniéndose a las cajas QUT
(que se transcriben en el RNA) y hace la misma función que
N. Tanto N como Q son proteínas antiterminadoras de la
transcripción. Q nos lleva a los genes de la lisis. Si Q se
acumula hay transcripción de todos los promotores del OR
hasta el final.
La señal de terminación tR3 afecta a dos tránscritos: el
que viene desde PR y el que viene de PR’. En éste último
caso, el tránscrito es muy pequeño, sin información. PR’
siempre funciona, es un promotor constitutivo, pero como
tiene tR3 al lado, salta la polimerasa enseguida. Necesita
a Q para saltar el tR3 y llegar a la lisis.
En el caso de Cro, es una proteína represora de la
transcripción. Reprime a PR y PL. En principio, Cro tiene
baja afinidad por su diana (que reprime a los promotores) y
por tanto para poder actuar debe estar a alta [ ]. Ello
requiere tiempo, que es el tiempo que tarda en decidirse si
hace lisis o lisogenia. Cuando la [ ] es alta, se une a los
promotores y los bloquea, haciendo que se vaya hacia la
lisis. Si PL y PR no paran de funcionar, llevan hacia la
lisis (considerando que la célula se divide). Si PL y PR
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son reprimidos por Cro, hará ciclo lítico si la bacteria se
divide pero lo hará lisogénico si no se divide.
Cro también se une a un promotor de CI para bloquearlo, ya
que CI es lisogénico. Concretamente, Cro bloquea a PRM de
CI a baja [ ] porque le tiene mucha afinidad.
PRE
PL
PRM
PR
Con lisis (la célula se divide): se transcriben N y Cro; N
permite que se transcriba todo OL y OR; se degrada
CII/CIII; se bloquea CI por Cro rápidamente; se produce Q;
se acumula Cro. Cuando hay Q, ya hay suficiente Cro y Cro
bloquea a PR y PL (ahorro). Q hace su función: transcribir
genes lisis. Cuando la célula se divide, tiene unas
proteínas (HflA y HflB) que se cargan a CII/CIII.
Con lisogenia (la célula no se divide): se transcriben N y
Cro, N permite que se transcriba todo OL y OR, no se
degrada CII/CIII, hay CI; se expresa el PantiQ, no hay Q,
no hay Cro, se llegan a bloquear PR y PL por CI, se expresa
Pint y se integra. En lisogenia la clave son CII/CIII, un
heterodímero. Las dianas de CII/CIII son:
- El promotor AntiQ (PantiQ) es estimulado por CII/CIII,
en lisogenia. Se encuentra entre Q y qut. Está en
dirección opuesta a PR. Produce un RNA que es
complementario al 3’ del RNA que produce PR, sobretodo
en la región de Q. Así los RNA son complementarios e
hibridan, forman un dsRNA y no se puede traducir la Q
y no hay lisis. Es parecido a la técnica del miRNA.
- El promotor de la Integrasa se debe expresar en
lisogenia. La integrasa y escicionasa se transcriben
desde PL, y pero la célula se carga Int en lisis (por
la región sib). En lisis, también se carga a CII/CIII
pero por mecanismo distinto.
- El promotor de CI: PRE. Se activa por CII/CIII y lleva
a la lisogenia.
En cuanto al gen CI, es un gen lisogénica. Tiene 2
promotores que apuntan en la misma dirección, uno de los
cuales solapa parcialmente con Cro (para hacer lo parecido
al miRNA que hibrida con Cro y no expresar Cro, ya que Cro
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y CI tienen funciones
respectivamente).
opuestas;
lítica
y
lisogénica
La organización de los promotores PR y PL de λ es:
PR: Tiene 3 operadores. OR3-OR2-OR1.
PL: Tiene 3 operadores. OL1-OL2-OL3.
Éstos operadores del promotor son dianas de las mismas
proteínas pero con diferentes afinidades:
- PR solapa con OR2 y OR1.
- PL solapa con OL1 y OL2.
- PRM solapa con OR3.
PE
PRM
Cro
PR
CI es una proteína lisogénica. Se expresa gracias a
CII/CIII desde PRE. Sus dianas son PR y PL (reprimirlos,
igual que Cro pero a muy baja [ ] porque les tiene mucha
afinidad) y estimular su propia síntesis desde PRM (después
de que CII/CIII la haya estimulado para que empiece a
concentrarse).
Cro y CI tienen acciones opuestas sobre PRM pero iguales
sobre PM y PR.
CII/CIII:PantiQ
LISOGENIA
PRE
Pint
Cro: bloq. PR y PL a mucha [ ]
bloq. PM a poca [ ]
CI: bloq. PR y PL a poca [ ]
bloq. PM a mucha [ ]
estim. PM a poca [ ]
LISIS
LISOGENIA
Molecularmente, la proteína CI presenta un dominio de unión
al DNA hélix-loop-hélix básico, por lo cual, dimeriza.
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También tiene dominios de unión a la RNA Polimerasa y a
otras CI dimerizadas. En principio, es un homodímero pero
según la situación puede llegar a ser un homotetrámero.
Presenta
diferentes
afinidades
por
los
diferentes
operadores. Todo lo que hace en el OR también lo hace en el
OL: inmediatamente, un dímero de CI se une a OR1 y recluta
a otro dímero de CI que se une a OR2. Se bloquea el PR con
éste homotetrámero. Así lleva a la lisogenia. A la vez,
éste homotetrámero estimula a la RNA Polimerasa para que se
una al PRM y regula así su propia síntesis. Cuando hay [ ]
muy alta de CI, también se une a OR3 y bloquea su síntesis,
quedando todo bloqueado. Por tanto, las afinidades de CI
son OR1 = OR2 > OR3. En cuanto a la proteína Cro, es la
primera en sintetizarse; tiene una elevada afinidad hacia
OR3, se une a él y bloquea momentáneamente la síntesis de
CI. Nos lleva hacia la lisis. A la larga, si llega a tener
la [ ] suficientemente alta, se une a OR2 y OR1 bloqueando
la transcripción desde PR (ahorradora). Por tanto, las
afinidades de Cro hacia los operadores son OR1 = OR2 < OR3.
Recordemos que el PRE, que es estimulado por CII/CIII,
transcribe para CI (lisogénica), pero el RNA que se produce
solapa parcialmente con Cro, hibridan y no hay Cro
(lítica).
La proteína CI a la larga lo llega a bloquear todo (PR, PL
y PRM), formando loops en el DNA. Hay lisogenia. Si tiene
poca [ ] estimula su propia síntesis.
Dcha: CI con poca [ ]. Izq: CI con mucha [ ]. Nótense los
homotetrámeros de CI.
La proteína CII/CIII es clave en todo el proceso: si está,
nos lleva a la lisogenia; y si no está, hacia la lisis.
¿Cómo puede estar o no estar? Cuando la bacteria se divide,
expresa unas proteasas llamadas HflA y HflB, que degradan
CII/CIII (lisogénicas). Así, el fago sabe cuándo se divide
el huésped y va hacia la lisis porque no tiene CII/CIII.
Si queremos la lisogenia, debemos tener CII/CIII, PL activo
y estimular al Pint para hacer Integrasa. Pero PL se
bloquea por CI, entonces, para hacer la Integrasa, el Pint
Genética Molecular.
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debe activarse por CII/CIII. EL Pint está dentro de Xis
(escicionasa).
Cuando el fago se ha integrado, sólo puede producir
proteína CI. La proteína CI bloquea los PR y PL, no se
transcribe nada (lisogenia avanzada); CI estimula su propia
síntesis. Así, si una bacteria ya ha sido infectada
previamente con un fago, no puede volver a ser infectada
por otro fago lisogénico ya que la proteína CI que espresa
cuando está infectada también se une a los PR y PL del
nuevo fago que entra, impidiendo que exprese sus PR y PL
desde el principio. Así, no hay más infección que la
primera. Éste fenómeno se da gracias a la Región Inmune del
fago λ, la cual es el gen CI con sus dos promotores.
Sobre la secuencia sib del fago λ: Si hay mucha Xis y poca
Int, se entrará en fase de lisis. Esto podrá estar
ocasionado por niveles bajos de CII/CIII, con lo que la
transcripción desde Pint será baja y la mayor parte de la
transcripción se hará a partir del PL. En este caso
deberíamos tener igual cantidad de Xis que de Int. Pero
después de transcribir int, existe la secuencia sib, que
también se transcribe. Esta secuencia formará un bucle que
atraerá la RNAasa III, con lo que se degradará. Se
degradará también en parte int, pero el daño al RNA no
llegará a xis, con lo que se podrá transcribir la proteína
Xis. Este tipo de regulación se llama retroregulación. No
se trata de regulación a nivel de transcripción, sino que
afecta a la estabilidad del transcrito.
Y si hay lisogenia, pues como CII/CIII estimulan al Pint,
se transcribe la integrasa hasta el tL’que hay detrás de
ella, y no se forma ni bucle ni se degrada nada. Hay
integrasa para consumar la lisogenia.
Genética Molecular.
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Sobre la inducción de λ, consiste en la desinserción del
genoma de λ del genoma de E.coli. Se hace mediante luz UVA,
produce daños en el DNA, cuando se repara por recombinación
se genera ssDNA que es sustrato de RecA, RecA unido al DNA
se mueve buscando a LexA. Cuando LexA es tocada por RecA,
aparte de autoproteolizarse, busca a CI y la degrada. Así,
si no hay CI, se llega a expresar Q y hay lisis. También se
transcribe para la escisionasa (Xis) que desintegra (lo
separa) el genoma de λ de el de E.coli.
Una bacteria con λ integrado es lisogénica siempre excepto
si se induce la escisión con luz UVA y se vuelve lítico.
Genética Molecular.
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Página 19
TEMA 3: LA TRANSCRIPCIÓN EUCARIOTA I.
En Eucariotas, la transcripción se da en el núcleo y la
traducción en el citoplasma, es una separación espacial y
también temporal.
El mRNA Eucariota sufre una serie de modificaciones posttranscripcionales: capping en el 5’, adición de una cola de
poliadenina (PolyA) en 3’, Splicing y recientemente se ha
descubierto una nueva modificación, llamada edición del
RNA. Gracias a éstos procesos, la vida media del mRNA
Eucariota es mayor que la vida media del mRNA Procariota.
En Eucariotas se realiza un Control + de la transcripción,
se necesitan a los Factores de Transcripción (TF) para
poder activar a la RNA Polimerasa. Los TF pueden ser:
- Basales = Generales = GTF. Están por todo. Son
imprescindibles. TF2D, etc … Se explican en éste tema.
- Constitutivos = No Inducibles. Son accesorios, sólo
están
en
algunos
tejidos,
pero
siempre
están
activados. SP1, etc … Se explican en el Tema 5.
- Inducibles. Son accesorios, sólo están en algunos
tejidos. Necesitan activarse porque basalmente están
inactivos. HR, etc … Se explican en el Tema 6.
Además, aquí hay 3 RNA Polimerasas diferentes, cada una de
las cuales transcribe para un grupo de genes concreto.
El mRNA Eucariota es monocistrónico, es decir, contiene
información para codificar una proteína (con un inicio de
traducción AUG y un final STOP de traducción).
Ésto es el pre-mRNA ó hnRNA ó
mensajero primario. Una vez
se le hace el Splicing (ver
Tema 4), pierde los intrones
y se vuelve un mRNA maduro ó
mensajero secundario.
Corresponde al ppal. tipo de
tránscrito de los genes de
tipo 2.
Pero no todos los RNA son así, depende el tipo de gen.
Tipos de RNA Polimerasas Eucariotas:
- RNA Polimerasa I: Transcribe los genes de la clase I.
Está en el nucléolo. Insensible a la α-amanitina.
- RNA Polimerasa II: La principal. Transcribe los genes
de la clase II. Está en el nucleoplasma. Sensible a la
α-amanitina.
- RNA Polimerasa III: Transcribe los genes de la clase
III. Está en el nucleoplasma. La sensibilidad a la αamanitina es específica de cada especie.
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- mtRNA Polimerasa: es
amanitina. Similar a
- cpRNA Polimerasa: es
α-amanitina, similar
mitocondrial. Resistente a la αla Procariota.
cloroplastídica. Resistente a la
a la Procariota.
Todas las RNA polimerasas Eucariotas tienen estructura
similar, tomaremos como ejemplo la de la RNA Polimerasa II.
Tiene diversas subunidades, es una holoenzima como la RNA
Polimerasa Procariota y las polimerasas de DNA.
1. Subunidad de unión al DNA: Tiene el dominio
C’Terminal, que corresponde a la cola. Se llama CTD
(Carboxi-Terminal Domain) y se activa cuando se
fosforila. Recluta enzimas. El CTD tiene secuancia de
AA repetida (YSPTSPS). Equivale a la β Procariota.
2. Núcleo catalítico. Equivale a la β’ Procariota.
3. Subunidades que equivalen a las 2 α Procariotas.
Genes de Clase I.
Son los que forman el RNA ribosómico (rRNA). No sufren
capping ni poliadenilación, aunque son cortados (pero no es
Splicing porque lo que se corta no son intrones). El
ribosoma Eucariota tiene:
- Subunidad Grande: 28s-rRNA, 5’8s-rRNA, 5s-rRNA (éste
lo hace un gen de la clase III) y proteínas.
- Subunidad Pequeña: 18s-rRNA y proteínas.
Los genes de la clase I codifican para 28s-rRNA, 18s-rRNA y
5,8s-rRNA. Tienen promotores fuertes, están repetidos a lo
largo del genoma, en “cluster”.
El rRNA que genera los genes de la clase I es:
Un cluster es una unidad de “x” genes que se van repitiendo
en tándem (uno tras otro) por el genoma. Se encuentran en
el brazo corto de los cromosomas, en el nucléolo. En éste
caso corresponde a la unidad de transcripción del pre-rRNA.
A partir de un promotor, se obtiene un RNA que genera
varios productos (18S, 5.8S y 28S-RNA). NO se traduce.
El final de la transcripción, de manera excepcional en
Eucariotas, consiste en unas pequeñas secuencias (8) que
agotan químicamente a la RNA Polimerasa I, que se
encuentran una tras otra a 3’ del 3’ETS, dentro de la
unidad de transcripción.
La IGS es la InterGenic Sequence. Es lo que hay entre dos
clusters. Se transcriben parcialmente porque tienen un
promotor a 3’.
Genética Molecular.
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El ITS/ETS son los Internal Spaciator y External Spaciator.
Están en el pre-rRNA.
Se transcriben en forma de cromosoma plumoso/árbol de
Miller.
Parece
un
árbol
de
Navidad.
En el proceso de cortar los ETS/ITS, que no tienen
información génica, actúa una endorribonucleasa (snoRNA).
No es Splicing porque los ETS/ITS no son intrones. Sucede:
1º: se corta a 5’ del 18S.
2º, se corta a 5’ del 5’8S (por dentro del 5’ITS) y a dos
productos:
3º, se aparean por complementariedad el 5’8S y el 28S,
quedando así:
4º, se corta el 3’ETS del 28S y el rabito 5’ITS de 5’8S,
quedando el rRNA maduro.
El promotor de los genes de clase I se encuentra dentro de
la IGS. Tiene entre -150pb y -100pb el Up-stream Promotor
Element (UCE ó UPE). Es accesorio. Entre -45 y +20pb hay el
Core Promotor (CP). Es parcialmente interno, porque se
transcribe 20pb.
No tiene “tata box”. A éste promotor se unen los siguientes
factores de Transcripción Generales/basales:
- UBF1: Se une a UCE. Dobla el DNA haciendo un loop.
Interactúa con…
- SL1: se une al CP (según algunos, al UCE). Tiene 4
factores, uno de los cuales es la TBP (tata binding
protein), una proteína posicionadora que interactúa
con la RNA Polimerasa I. SL1 se une a su región en el
DNA por dos factores que NO son TBP (porque no hay
“tata box”). La TBP mira hacie fuera y posiciona a la
RNA Polimerasa I.
UCE
C.P.
Sobre la región IGS, tiene:
- 2 promotores que transcriben para RNA abortivo, sin
función. Tienen el objetico de traer a la RNA
Polimerasa I para que se acerque al promotor del
cluster.
- Promotor del clúster: tiene lo que hemos visto arriba.
Genética Molecular.
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La región IGS se transcribe parcialmente, ya que el
promotor de los genes de clase I es parcialmente interno.
Genes de Clase II.
Son los que transcriben para el mRNA y todos los snRNP
(excepto snRNP-U6). Su promotor presenta variabilidad de
secuencias.
- Promotor con “tata box” mRNA
- Promotor sin “tata box” (genes “tata-less”) snRNP y
mRNA de genes “house- keeping”, vitales en el
metabolismo celular.
Dentro del promotor también hay las secuencias InR
(Iniciation Region), con las cajas CAT (en el 50-60% de los
casos, el 1er nt transcrito es una A).
La “tata box”, si está, tiene función posicionadora. Es un
elemento “upstream”. Los que no la tienen, la transcripción
comienza dentro del leader (5’UTR) gracias a secuencias
llamadas
DPE
(Downstream
Promotor
Element,
promotor
interno).
Pero lo más frecuente es que el promotor tenga la “tata
box” en upstream y la secuencia InR (secuencia específica =
caja). Si sólo tiene “tata box” e InR, es el promotor
basal. Pero suele tener secuencias diana de múltiples
factores de transcripción (caja BREdiana de TF2B, etc),
elementos downstream, enhancers (¡no forman parte del
promotor!)…
InR
La caja InR es reconocida por el GTF llamado TF2D, que
contiene entre otras, a la TBP (tata Binding Protein).
Aquí, la TBP se une a la “tata box”, produciendo un efecto
posicionador de la RNA Polimerasa II. Si el promotor del
gen de tipo II no tenía “tata box”, entonces el TF2D
también se une a InR, pero NO usa la TBP, sino a las otras
proteínas, las TAF (TBP aditional factor), que se unen a
las cajas DPE en downsteam.
Factores implicados en la transcripción de los genes de
tipo II (son los GTF):
- TF2D: Contiene a TBP (se une a “tata box”) y TAF (se
une a DPE). Usa a una de las 2.
Genética Molecular.
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Página 23
- TF2A: se une a TF2D estabilizándolo. Si es un gen que
transcribe para mRNA, el TF2A hace saltar a TAF porque
entorpece a TBP
- TF2B: No está siempre (es constitutivo), se une a caja
BRE si está. Tiene efecto de helicasa y marca como
molde a la cadena de ssDNA que será transcrita.
- TF2F: Formado por 2 subunidades, a saber: Rap54
(helicasa que puede ayudar a TF2B) y Rap38(captura a
la RNA Polimerasa II).
Hasta aquí se ha formado el complejo de iniciación de la
transcripción: todos los TF que se unen al DNA antes de que
llegue la RNA Polimerasa II (TF2D, A, B, F).
La cola CTD de la RNA Polimerasa II reconoce a TF2D.
- TF2E: Se une a la RNA Polimerasa II y recluta a …
- TF2H:
Tiene
múltiples
efectos;
es
quinasa
que
fosforila a la cola CTD, es ATP’asa que hace saltar a
todos los TF y es helicasa. También, TF2H contiene a
XPB y XPD (helicasas) para participar en la reparación
por NER en Eucariotas.
La RNA Polimerasa II está fosforilada y libre, empieza a
transcribir.
Hay
TF
no
basales/accesorios
(los
constitutivos
e
inducibles) que se unen a cajas accesorias en el promotor,
o a elementos muy lejanos al promotor que también afectan a
la tasa de transcripción de un gen (los enhancers ó
silencers).
Éstos TF no basales/accesorios tienen un dominio de
interacción con la secuencia del DNA que reconocen y un
dominio de interacción con el complejo iniciador de la
transcripción ó con el complejo mediador (proteínas que
actúan entre el TF y el complejo inic. de la transcr.).
También pueden interaccionar con proteínas que acetilan
histonas (HAT) ó con proteínas de remodelan la cromatina.
Pueden suceder las 3 cosas a la vez (lo veremos con mas
detalle más adelante). Hacen loops en el DNA.
Los genes de clase II sufren una serie de modificaciones
post-transcripcionales (nunca en Procariotas):
Genética Molecular.
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Página 24
1) Capping: consiste en añadir un nt nuevo al 5’ del RNA
que antes no estaba, llamado CAP (es una 7-metil-guanina).
Se consigue mediante un enlace 5’5’ trifosfato. Los
enzimas que actúan son reclutados por la cola CTD. Éstos
enzimas son una fosfatasa que quita el fosfato en 5’ del
RNA, luego una transferasa que une una Guanina con el
enlace 5’5’ trifosfato y una metilasa que añade el metil
a la guanina.
A veces se metilan los 3 siguientes nt del RNA.
Ésto sucede en el núcleo. El CAP
tiene
función
de
atraer
al
ribosoma y proteger el mRNA de
las exorribonucleasas que actúan
en 5’.
2) Poliadenilación: consiste en añadir una serie de
adeninas, aproximadamente 200, en el extremo 3’ del mRNA.
Los enzimas necesarios para ello también son reclutados por
la cola CTD. Todos los señales necesarios para la
poliadenilación
vienen
después
del
codón
de
STOP
traducción.
En orden, están(en el RNA):
…ÚLTIMO EXÓN CON STOP-(…)-AAUAAA-(20-30nt)-CA-(10nt)-GUbox-(…)-3’.
La caja AAUAAA es reconocida por CPSF (Cleavage &
Polyadenilation Specific factor). La caja GU es reconocida
por CStF (Cleavage & Stimulation Factor). Se unen las dos.
No cortan. Reclutan a CF1 y CF2 (Cleavage Factor 1 & 2) que
corta
al
RNA
en
la
caja
CA.
Se
recluta
a
PAP
(PolyAdenilation
polymerase)
que
añade
los
200
nt
aproximadamente de Adenina en el 3’ del corte. Se recluta a
PAB II (PolyA Bonding II) que se une a la cola de PoliA que
se está elongando y hace saltar a PAP, por lo cual, es
PABII que determina la longitud de la cola de PoliA. Debido
a que se corta para poner la cola de PoliA antes de que
pare la transcripción, hay un pequeño trozo de mRNA que
queda en la polimerasa. Función: ¿terminar de transcribir?
no se sabe. Si se sabe que la función de la cola de
PoliAdenina que se añade es atraer al Splicesome.
3) Splicing: Ver el Tema 4.
4) Edición del RNA: Ver el Tema 4.
Genes de Clase III.
Transcriben para el tRNA, 5S-rRNA, snRNP-U6, snoRNA, scRNA,
7SL-RNA (Alu)… Son RNA no traducibles. No sufren ningún
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procesamiento, excepto el tRNA que sufre “modificaciones” y
un Splicing diferente al de los RNA de genes de tipo II.
Tienen señales de terminación de la transcripción que son
ricas en G-C y en secuencias con muchas T.
Tienen un promotor con 2 regiones: una externa y una
interna
(=ICR,
Internal
Control
Region),
con
dos
subregiones. La mayoría no tienen “tata box”. Los casos más
típicos son (ver dibujo en la siguiente página):
- El 5S-RNA: Secuencias muy conservadas. Tiene 2 cajas
que constituyen la región interna (=ICR) del promotor:
la caja A y la caja C. Están a 3’ del inicio de
transcripción, a +55 pb. La región externa la
constituye la secuencia de unión de TF3B (es TF3B
quien tiene la TBP.
A la caja A se une TF3A, recluta a TF3C que se une a
la caja C (son GTF). TF3C hace saltar a TF3A y avanza
en dirección 5’ (al inicio de la transcripción),
seriándose (=polimerizándose sobre el DNA, muchos TF3C
uno tras otro en dccion 5’).
Cuando llega a -30pb aprox, se encuentra con la caja
de unión de TF3B, lo recluta y puede iniciarse la
transcripción (la TBP hace posicionar a la RNA
Polimerasa III, aunque no haya “tata box”).
El inicio de la transcripción, por tanto, está entre
+55nt y +80 antes de la caja A.
- El tRNA: La ICR la constituyen las cajas A y B. Ambas
cajas son reconocidas por TF3C. No interviene TF3A. va
seriándose en 5’ hasta llegar a la caja externa de
unión a TF3B (el que tiene TBP), éste se une y recluta
a la RNA Polierasa III. Las distancias son parecidas.
- snRNP-U6, otros RNA pequeños: es parecido a los genes
de clase II porque hay un promotor que tiene la “tata
box”. Pero aquí quien tiene TBP es TF3B.
Genética Molecular.
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Página 26
RESUMEN: LA TBP…
- En genes de clase I, está en SL1. Atrae, posiciona y
toca a la RNA polimerasa I. No hay “tata box”.
- En los genes de clase II, que tienen “tata box”, TBP
está en TF2D pero toca a la caja tata. Si no hay “tata
box”, la TBP tiene poca importancia porque la TAF se
une a DPE y hace la función de posicionar a la RNA
polimerasa II.
- En los genes de clase III, que no tienen “tata box”,
la TBP forma parte del TF3B. Tiene efecto posicionador
de la RNA polimerasa III.
Genética Molecular.
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TEMA 4: LA TRANSCRIPCIÓN EUCARIOTA II.
Estudiaremos el splicing en detalle. El splicing es el
proceso por el cual se cortan todos los intrones de un premRNA y se vuelve mRNA maduro. Sucede en el núcleo. Gracias
a la cola de poliadeninas, se puede dar. Si se deja algún
intrón en el RNA ó se corta algún exón (o ambos) se trata
de splicing alternativo o diferencial.
Existen varios grupos de intrones que sufren splicing: el
grupo principal (mRNA) el tRNA, el grupo I, el grupo II y
el grupo AU-AC. Se sospecha que puede haber más. Se pueden
clasificar en autocatalíticos (ribozimas) o no.
Los intrones no-autocatalíticos.
Son el tRNA, el mRNA y los del grupo AUAC.
autocatalíticos porque requieren de proteínas o
accesorias que catalizan la reacción.
No son
enzimas
1- El tRNA: viene codificado por genes de clase III. Se
considera que los tRNA inmaduros tienen un único intrón (en
levaduras, aunque hay algunos que no tienen intrón). Los
enzimas que actúan son los siguientes: endorribonucleasa
que reconoce la estructura con hairpins y secuencias
palindrómicas del tRNA inmaduro, corta el intrón y deja
extremos 5’-OH y 2’-3’ P, no aptos para ligar. A
continuación actúa una fosfodiesterasa que deja 5’OH y 2’P3’OH. Después actúa una quinasa que fosforila dejando un
5’P y finalmente una ligasa que une el 5’P con el 3’OH.
2- El mRNA: son la mayoría de los intrones. No depende de
estructuras como el tRNA, sinó de secuencias específicas
conservadas el 100% de las veces dentro del intrón (GU-AG).
Se pasa de un pre-mRNA inmaduro (hnRNA ó mensajero 1ª) a un
mRNA maduro ó secundario. El splicing de la mayoría de los
intrones sigue la regla del “GU-AG” (porque el GU-AG está
100% conservado).
Para eliminar los intrones se dan 2 transesterificaciones
seguidas: son enlaces entre el 5’P de un nt y el 3’OH del
nt no contiguo (lejano). La 1ª se da debido a que la A del
Genética Molecular.
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branchpoint tiene un 2’OH que ataca nucleofílicamente al
5’P de la G del 5’ del intrón. Éste enlace 5’2’ forma un
“lairat”
o
lazo,,
1
lairat
=
1
intrón.
La
2ª
transesterificación se produce cuando el 3’OH de la G del
exón que ha quedado libre ataca nucleofílicamente al 5’P de
la G del siguiente exón formando un enlace normal en
5’3’. El lairat queda separado, se linealiza y es
degradado por nucleasas.
Éstas dos transesterificaciones las realizan unas proteínas
llamadas snRNP. Las snRNP constituyen el “splicesome”
(pseudo-orgánulo que cataliza el splicing). Una snRNP=
proteinas + snRNA.
Las snRNP vienen de los genes de tipo II, por tanto tienen
CAP en el extremo 5’. Excepto snRNP-U6 que viene de un gen
del tipo III y no tiene CAP. No hay cola de poliadenina.
Estructura de la snRNP:
proteina
proteina
Modelo
válido
para
snRNP-U2 y snRNP-U5.
snRNP-U1,
Modelo válido para la snRNP(U4-U6). Basalmente es así.
snRNA de U4 y de U6, unidos,
pero comparten proteína.
Los snRNA de las snRNP son complementarios a regiones
específicas del intrón del RNA. Considerar siempre la
orientación de las cadenas del RNA (debajo de un 5’ siempre
va un 3’, etc…).
Para referirnos a las snRNP, usaremos la terminología “Ux”
para abreviar, donde x es el número de la snRNP.
Hay que saber qué hace cada Ux, si se une por
complementariedad de bases en el RNA ó por afinidad de las
proteínas, o por unión de proteína con RNA, en qué momento
del splicing entra y dónde entra.
Mecanismo de splicing del mRNA:
- U1 se une al 5’GU del intrón (unión RNA-RNA).
- U2AF35 se une al 3’AG del intrón. U2AF65 se une al
(Py)n (uniones proteína-RNA). BBP (Branchpoint Binding
Protein = SF1) se une al Branchpoint (unión proteínaRNA).
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- U2 se une al Branchpoint haciendo saltar a BBP (=SF1).
Es una unión RNA-RNA.
- Llega el complejo (U4-U6)+U5. Unidas por afinidad de
proteínas. U5 se une al exón en 5’, dando estabilidad
al complejo; hace saltar a las U2AF; unión proteínaRNA. U4-U6 basalmente unidas por RNA-RNA, U6 se une a
U2 (RNA-RNA) y salta U4 (mantenía estable a U6).
U1 se acerca a U2-U6 sin llegar a tocarlas, pero
formando una pequeña protuberancia en el intrón que
acerca el 5’GU al branchpoint, lo que permitirá que se
dé la 1ª transesterificación.
- Se ha formado el núcleo catalítico del splicesome
(U2+U6). Se da la 1ª transesterificación.
- Como consecuencia de ello, U1 llega a tocar a U2
(proteína-proteína) y U1 salta. Su lugar (5’GU) queda
ocupado por U6 (RNA-RNA), unida así al 5’GU.
- Se da la 2ª transesterificación, juntándose los dos
exones, salta el lairat con U2 y U6. Salta U5. Se
separan los U2 y U6 del lairat y éste es linealizado y
degradado en el núcleo.
Así,
los
intrones
del
tRNA
y
del
mRNA
no
son
autocatalíticos y la mayoría de ellos siguen la regla del
GU-AG.
3- Grupo AU-AC de Intrones: También necesitan a Splicesome,
porque no son autocatalíticos. Participan otras snRNP. Al
5’AU se une la U11 y al 3’AC y al Branchpoint se une la
U12. El resto del proceso es igual. Sólo coinciden en la
U5.
Los Intrones autocatalíticos.
Son aquellos intrones que no precisan de snRNP (no
requieren splicesome) para eliminarse, sino que ellos solos
pueden hacerlo.
- Grupo I de Intrones: son ribozimas autocatalíticos. No
interviene la A del Branchpoint, sinó un nt libre que suele
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ser una G que ataca el enlace entre el Exón y el Intrón 1.
Se da en los intrones de orgánulos.
Grupo
II
de
Intrones:
también
son
ribozimas
autocatalíticos. La A del branchpoint hace toda la primera
transesterificación, el resto lo hace el propio intrón.
También se da en los intrones de los orgánulos.
Recientemente se han descubierto las proteínas SR (ricas en
Serina-Arginina, a veces llamadas SF2). Se unen al dominio
de unión a SR en el pre-mRNA. Éstos dominios pueden ser
zonas de activación ESE (Exon Splicing Enhancer) o ISE
(Intron Splicing Enhancer), o zonas de silenciamiento de
splicing ESS (Exon Splicing Silencer) o ISS (Intron
Splicing Silencer). Los ESS, ESE, ISS, ISE están sobre un
exón o un intrón respectivamente, y si son los activadores,
estimulan el splicing en lugares crípticos (débiles,
basalmente ocultos, no se usan en principio) o lo bloquean
en los lugares normales si son silenciadores. Los dominios
que activan el Splicing, ISE y ESE, se unen a SR y atraen a
ésa región a U1 y a U2AF35, estabilizándolas . De manera
opuesta, ISS y ESS atraen a sus SR y desestabilizan a las
snRNP o compiten con ellas por su afinidad al RNA, todo
para silenciar el splicing y que no se dé en las regiones
adyacentes (las que se dá normalmente).
Así, gracias a las proteínas SR que se expresan en tejidos
específicos, se da el Splicing Alternativo, en el cual se
cortan algunos exones y/o algunos intrones se dejan. A
partir de un mismo pre-mRNA se pueden obtener diferentes
mRNA maduros. Se cree que mas de la mitad de nuestros genes
hacen splicing alternativo. Consideremos un gen que produce
el siguiente pre-mRNA:
Se le pueden dar diferentes tipos de splicing alternativo
al mismo pre-mRNA:
- splicing normal: deja los exones 1-2-3 unidos, sin
intrones.
- exon skipped: se unen los exones 1-3 y se pierde el 2 y
los intrones.
- exon extension: se dejan los exones unidos y un poco de
algún intrón. Si son 3 bases (o múltiplo de 3), no pasa
nada. Si no, hay corrimiento de la pauta de lectura y
dependiendo de lo avanzado en la traducción que esté el
intrón añadido, puede hacer más o menos efecto.
- retención de intrones si hay ISS.
- coexistencia de 2 transctitos maduros a la vez (raro en
una misma célula).
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Página 31
Es frecuente que dentro de un intrón haya un final de
traducción de una proteína, y que debido a secuencias
flanqueantes dentro del intrón (ISS), no se corte el intrón
y al traducirse, produzca una proteína mas corta porque al
leerse el RNA, se topa con el STOP del intrón que
normalmente no está. Puede ser también que las ISS hagan
que el Splicesome se vaya a cortar a un lugar críptico, que
se usa porque los otros están bloqueados.
O al revés, que haya un final de la traducción en un exón y
que debido a secuencias ESE se activen lugares crípticos de
splicing que atraen hacia sí el Splicesome y se corte el
exón, perdiéndose el STOP prematuro y produciéndose
proteína más larga.
Depende de qué proteínas SR exprese el tejido y en qué
momentoSplicing Alternativo
La determinación del sexo en Drosophila melanogaster:
Es un caso típico de splicing alternativo. En primera
instancia, la determinación de sexo es cromosómica; ya que
si el “nº de cromosomas X/nº de juegos de autosomas” es
mayor a 1, sale hembra, mientras que si es menor a 1 sale
macho. Esto se debe a que en el cromosoma X hay los genes
que codifican para unas SR (=SF2) que hacen el splicing
alternativo, y si es hembra tiene 2 cromosomas X: mucha [ ]
de SR (o almenos más que el macho).
Hay 4 genes implicados en determinar el sexo, que son
SexLethal (SL ó SXL), Transformer (TRA), Transformer2
(TRA2) y DoubleSeX (DBX). Son miembros de la familia de las
SR (excepto DBX, que es un TF). Interaccionan con ellas.
- Basalmente, se transcribe el gen de SXL en machos y en
hembras. Si es hembra, hay las SR y se hace splicing
alternativo.Se hace Exon skipped y se produce una
proteína larga, mientras que en los machos no se hace
el splicing alternativo y en el exón que la hembra
eliminaba, hay un STOP de la traducción prematuro, por
lo que produce una SL demasiado corta.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 32
- La proteína SL es un represor de splicing normal y
activadora del Splicing alternativo. Actúa sobre el
mRNA de la proteína TRA. Se une a secuencias (ISS) en
el 3’ del intrón que impiden que entre la maquinaria
normal de Splicing (impide que U2AF65 entre a unirse a
(Py)n), así que la maquinaria de splicing se va a
cortar a un lugar críptico de splicing que está dentro
del exón, produciendo que se pierda un trozo del exón
que justamente contenía un STOP de la traducción
prematuro (HEMBRAS).
Los
machos
al
no
tener SL funcional,
hacen
splicing
normal
y
la
traducción se para
en el STOP prematuro
del exón, ese trozo
de
exón
que
se
perdía en la hembra.
Se
produce
en
el
macho proteína TRA
demasiado corta.
- La proteína TRA hace lo mismo que TRA2, funcionan
igual. Ambas son estimuladoras del splicing normal,
sobre el mRNA de DSX. TRA y TRA2 son SR. Actúan
uniéndose a un exón en la hembra (ESE), se solvatan
(envuelven) de todas las SR y evitan que se corte el
exón donde está TRA2. Así, se estimula que se corte el
exón posterior porque se activa el lugar de splicing
críptico.
En machos se realiza un splicing que elimina los
intrones y el exón en el cual se une TRA2 en las
hembras, dejando intacto el exón posterior.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 33
- Finalmente, en ambos casos se genera la proteína DSX,
que es un factor de transcripción, pero en machos es
más corta (estimula a los genes de desarrollar macho y
bloquea a los de desarrollar hembra); y en hembras es
más larga (estimula los genes de desarrollar hembra y
bloquea a los genes de desarrollar macho).
La Edición del RNA: Mecanismo recientemente descubierto,
consiste en modificar el mRNA maduro para obtener proteínas
diferentes en tejidos específicos, ya que en cada tejido se
expresan los enzimas que lo modifican. Es el cuarto
mecanismo de modificación del RNA. Ejemplo: el caso de la
ApoB.
En el intestino, el pre-mRNA de la ApoB hace su splicing y
se eliminan sus intrones. En el mRNA hay el codón
CAAglutamina, pero se expresa independientemente una
enzima “desaminasa”, que edita el mRNA, cambiando una “C”
por una “U”: se produce un codón STOP prematuro y se genera
una proteína corta. Mientras que en el hígado, no se
expresa la enzima “desaminasa” y cuando el mRNA de la ApoB
aparece, se traduce normalmente sin que haya ningún STOP
prematuro, dando lugar a una proteína larga.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 34
TEMA 5: LA TRANSCRIPCIÓN EUCARIOTA III.
Para estudiar la regulación en Eucariotas, se usa al
organismo modelo S.cerevisiae. Es un Eucariota muy simple,
unicelular. Tiene forma esférica para incrementar la
superficie de absorción de nutrientes, estímulos…
En él, los genes GAL son modelo para explicar la regulación
de la expresión génica en Eucariotas. Están implicados en
el metabolismo de la galactosa, codifican para permeasas,
quinasas, etc. El objetivo de la ruta metabólica es
convertir la galactosa en glucosa-1-P. No son operones
porque un mRNA codifica para una única proteína.
Los promotores tienen secuencias similares, en todos hay
“tata box”.
-Las secuencias UAS (Upstream Activation Secuence) no son
enhancers. Siempre están antes de la “tata box” y de MIG.
Siempre hay almenos 1. Son secuencias palindrómicas (se
leen igual en los dos sentidos). Son la diana de GAL4.
-GAL4 es un activador de la transcripción. Es un
homodímero. Por un dominio, se une al DNA en UAS y por el
otro dominio toca a la RNA Polimerasa II y al complejo de
inicio de la transcripción. Éste dominio de unión a la RNA
Polimerasa II solapa parcialmente con un dominio de unión a
GAL80 (represor). De manera basal, GAL4 está unida al DNA
en UAS y a GAL80.
-GAL80 es el represor de GAL4. Basalmente está unida a él,
reprimiendo.
Gal4
La galactosa se une a GAL80 haciendo que se separe de GAL4
y permitiendo que GAL4 active la transcripción porque tiene
el dominio de unión al complejo de inicio de la
transcripción libre,, la galactosa activa la transcripción.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 35
Si hay glucosa, quiero bloquear la transcripción, aunque de
manera basal ya lo esté.
-La proteína MIG1, con glucosa (= poco AMPcno se activan
ciertas quinasas) no está fosforilada y se une a la
proteína TUP1 formando un heterodímero. Juntas se unen a la
secuencia Mig1 en el DNA bloqueando la transcripción. Si no
hay glucosa (= mucho AMPcse activan ciertas quinasas) se
fosforila MIG1, no puede unirse a TUP1 y no se une al DNA,
por lo tanto no se reprime y hay transcripción.
-La secuencia Mig1 en el DNA está entre la “tata box” y la
secuencia UAS. Es la diana del heterodímero MIG1+TUP1.
Para transcribir: poca glucosa y mucha galactosa se
activa GAL4 y se bloquea MIG1,, para no transcribir: mucha
glucosa y mucha galactosa se activa GAL4 pero MIG está
entorpeciendo
la
activación,,
mucha
glucosa
y
poca
galacosa: GAL4 está bloqueada y MIG1 está activada
entorpeciendo la transcripción,, poca glucosa y poca
galactosa: GAL4 está bloqueada y no activa la transcripción
aunque MIG1 no esté activada.
Se demostró que en GAL4 el dominio de unión al DNA y el
dominio de activación de la transcripción son partes
diferentes de la misma proteína, mediante el uso de
proteínas recombinantes que tenían el dominio de unión al
DNA que tiene la proteína LexA. A continuación se mezclaron
in-vitro con sus secuencias diana y se observó que
efectivamente, cada dominio se une a regiones diferentes
del DNA,y el dominio de activación de la transcripción, se
une a la RNA Polimerasa II activándola sólo si su otro
dominio está unido a UAS. Así nació la Ingeniería Genética.
En Eucariotas, los promotores tienen (la mayoría) una “tata
box” y la caja InR. Pero aparte, pueden tener muchas
secuencias(cajas) diana de varios factores de transcripción
no basales. Así, los Eucariotas presentan promotores
modulares, es decir, que tienen muchas cajas de unión a TF
no basales. Sirve de ejemplo ilustrativo el gen de las
metalotioneias (proteínas que capturan metales), que
contiene algunas de las cajas más frecuentes:
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 36
Recordemos
la
clasificación
de
los
Factores
de
Transcripción (TF) en Eucariotas:
- GTF: generales/basales. Están por todo, activos. Ej:
TF2Dtata box.
- TF no basal constitutivo: Sólo en algunos tejidos,
ativos. Ej: SP1caja GC.
- TF no basales inducibles: Sólo en algunos tejidos,
basalmente inactivos. Ej: AP2, HR…
Los no basales tienen dominio de unión al DNA y dominio de
unión al GTF o al complejo mediador (formado por otros TF
no basales, entre el TF unido al DNA y el complejo de
inicio de la transcripción). El DNA se dobla para poder
hacer todos éstos contactos.
Los enhancers son exclusivos de Eucariotas. Son secuencias
que no forman parte del promotor, se encuentran alejadas de
él en upstream o downstream, y tienen la función de unirse
a TF no basales a fin de incrementar la tasa de
transcripción de un gen estimulando a la RNA Polimerasa II.
El TF no basal se une por un dominio al enhancer y por otro
al GTF (raro) o al complejo mediador, curvando el DNA.
Los silencers funcionan igual pero con función opuesta, es
decir, reducir la tasa de transcripción de un gen.
Los insulators son secuencias fuera del promotor, diana de
proteínas que se unen y bloquean la acción del enhancer
fuera de su dominio de transcripción; es decir: los
insulators separan dominios de transcripción (que contiene
el/los enhancers y el gen). Todo lo que hay entre dos
insulators puede interaccionar. Actúan impidiendo que un
enhancer específico de un gen, active a otro gen que no le
corresponde,
ya
que
al
estar
tan
lejos,
podrían
interaccionar. Así se consigue que el enhancer active
únicamente al promotor de su gen diana.
Los TF no basales se clasifican según la estructura de sus
dos dominios, recordemos: un dominio de unión al DNA y un
dominio activador de la transcripción (estimula al complejo
iniciador de la transcripción). Entre ambos dominios puede
existir un dominio conector (o de dimerización si es el
caso).
Genética Molecular.
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Página 37
TF según el dominio de unión al DNA:
- Dedos de Zinc: Son proteínas en forma de dedo, las
cuales tienen un átomo de Zn en el centro. La
estructura con forma de dedo se repite 2 o 3 veces
para formar UN factor, que NUNCA dimeriza. Ej: TF3A,
GAL4, SP1 (se une a la caja GC)…
Ésto es el dominio de unión al DNA de SP1, un factor
no basal constitutivo. No dimeriza nunca.
- Receptor de Hormonas Esteroideas: Es un TF inducible.
Tiene un dominio de unión al DNA con 2 dedos de Zn;
por uno se une al DNA y por el otro dimerizan. SIEMPRE
dimerizan.
La hormona esteroide (glucocorticoide ó estrógeno) se
une al Receptor de Hormona, haciendo que se active y
dimerice. Así se une a la caja diana en el DNA: la
caja GRE ó la caja ERE (sólo 2 AA hacen que reconozca
a una o a la otra). Se explica con más detalle en el
Tema 6.
- Hélice-vuelta-hélice: Son 3 hélices α que dan dos
vueltas. Es el dominio de unión al DNA llamado
“homeodominio” presente en los TF de los genes Hox
(implicados
en
el
desarrollo).
NUNCA
dimeriza.
Presente también en la proteína Cro, CI del fago λ.
Genética Molecular.
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Página 38
- Hélice-bucle-hélice: Tiene muchos AA básicos. Para que
el dominio de unión al DNA funcione, ha de dimerizar
por el dominio de dimerización. Por tanto, el dominio
de unión al DNA será homodimérico. Son moléculas
anfipáticas, SIEMPRE dimerizan, tienen una secuencia
diana invertida y sin el dominio de unión al DNA
pueden dimerizar pero no unirse. Ejemplo: Myo-D, E12,
da/ACS…
- Cremalleras
de
Leucina:
Muy
similares
a
los
anteriores, SIEMPRE dimerizan y són básicas. La
diferencia es que en el dominio de dimerización, cada
monómero tiene una única hélice α anfipática con
leucinas. Las leucinas están mirando hacia dentro,
formando la región hidrofóbica, hacia el exterior está
la región hidrofílica y el dominio de unión al DNA
tiene los AA básicos. Lo tienen, por ejemplo,
CEBP(=EBP) que se une a la caja CAAT, AP1 (=Jun+Fos)…
OJO: la TBP no tiene ninguno de éstos dominios, es una
estructura rica en láminas β la que se une a la “tata box”.
TF según el dominio activador de la transcripción: Está
poco estudiado porque hay poco consenso en cuanto a
composición y funcionamiento. Éste dominio interactúa con
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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el complejo de iniciación de la transcripción si son TF
fuertes ó interactúa con un TF mediador (también es un no
basal) si son débiles. Es el mismo efecto. Tipos de
dominios:
- Acídicos: tienen carga negativa. Con hélice α.
Ejemplo: GAL4.
- Basídico: mucha cantidad de glutamina, con carga
positiva. No se conoce como van (?). Ej: SP1.
- Prolínicos: Mucha prolina, forma ángulos en la
proteína. Tampoco se conoce como van (?). Ej: CTF
(=NF1) que se une a la caja CAAT.
En Eucariotas, en contra de toda regla, también se han
encontrado mecanismos de represión de la transcripción.
Tipos:
- Competición por dominio: hay un dominio de unión a
proteína activadora y un dominio de unión a proteína
represora. Solapan parcialmente. Lo que decide quien
gana es la [ ] de cada proteína, o quien llega
priemro.
- Inhibición: el dominio activador y el dominio represor
están separados, pero cuando la proteína represora se
une al dominio represor, tapa físicamente el acceso de
la proteína activadora al dominio activador.
- Represión directa: La proteína represora unida al
dominio represor, interactúa de manera directa o
indirecta (a través de otros factores) con la RNA
Polimerasa para reducir la tasa de transcripción.
Ejemplo: la proteína CDP se une a caja CAAT y bloquea
la unión de otros activadores (CFT-NF1, CEBP…). Si CDP
se une a OCT1, no hay trancripción porque no está CTFNF1,, mientras que si CTF-NF1 se une a OCT1, hay
transcripción
porque
no
está
el
represor
CDP
(considerar que OCT1 se une a la caja OCT, que está al
lado de la caja CAAT y estimula la transcripción).
- Las Histonas: pueden modificar la entrada de la
Polimerasa si se altera su estado. Pueden estar
abiertas (mucha transcripción) o cerradas (poca
transcripción).
Ésto se regula por los TF no basales que se unen al
DNA y reclutan enzimas que acetilan y desacetilan
histonas:
Un TF activador se une a secuancia activadora, recluta
a HAT (Histone Acetil Transferase), que acetila las
histonas, se abren y hay mas transcripción. Por el
contrario, un TF represor se une a secuencia
represora, recluta a HDAC (Histone DeAcetilation
Complex), que desacetila las histonas, se cierran y
hay menos transcripción.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 40
Es muy frecuente que los dominios en el DNA que son
diana de TF que reclutan a HAT o a HDAC sean enhancers
o silencers.
También se pueden reclutar a proteínas que remodelan
la cromatina (la posición de los nucleosomas), o que
metilan las bases del DNA para silenciarlas.
Y todo se puede dar a la vez.
Algunos elementos de los promotores Eucariotas (repaso):
No se conocen todos. Consideramos que son genes de tipo II.
Como que hay miles de genes, estas cajas pueden solapar en
algunos genes, es decir, que en el gen A a -20 haya caja GC
y en el gen B a -20 haya la caja OCT. Pero como cada tejido
espresa sus TF no basales concretos, sólo se expresa un gen
concreto.
Genética Molecular.
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Página 41
EXTRA TEMA 5: TÉCNICAS
REGULACIÓN GÉNICA.
DE
ESTUDIO
DE
LOS
ELEMENTOS
DE
Son válidas tanto para Procariotas como para Eucariotas.
1. Retardo en gel: Para determinar promotores. Estudia si
en una región se unen proteínas o no. Tomo una secuencia
conocida de DNA sospechosa de ser diana de TF, marcada en
5’ con flourescencia o radioactividad. Se mezcla el
extracto de proteínas sospechosas de unirse (se mira en
bases de datos para tener una idea de cuales) y se hace una
electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los carriles que pongo han de ser (no en éste orden):
- Secuencia de DNA para estudiar, sola (control -)
- Secuencia de DNA para estudiar + DNA igual pero no
marcado en 5’ es el competidor específico + proteína
sospechosa de unirse. Hago varios carriles con ésta
mezcla, poniendo en cada uno concentración diferente
de proteína.
- Secuencia de DNA para estudiar + DNA diferente pero no
marcado en 5’ es el competidor inespecífico + proteína
sospechosa de unirse. Hago varios carriles en ésta
mezcla, poniendo en cada uno concentración diferente
de proteína.
DNA CON PROTEINA UNIDAPESA MÁSAVANZA MENOSMOVIMINETO
RETARDADO.
En los carriles de competidor
específico se va atenuando la
banda en la región de proteína +
DNA porque la proteína se va
uniendo tanto al DNA marcado como
al no marcado, que tienen la
misma secuencia. Pero como cada
vez hay más proteína, cada vez se
une más tanto al marcaco como al
no marcado y por eso no veo
apenas la banda, porque allí hay
DNA
no
marcado
unido
a
la
proteína.
En los carriles de competidor no
específico,
la
banda
tiene
siempre
la
misma
intensidad,
porque la proteína siempre se une
a la secuencia marcada y no al
competidor inespecífico. Ésto se
debe
a
que
la
proteína
es
específica de mi secuencia.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 42
Si en los carriles con la proteínas pongo un anticuerpo
marcado contra la proteína, sería confirmatoriosuperretardo en gel.
2. DNasaI footprinting: Sirve para saber a qué secuencia se
une la proteína sospechosa. Si la secuencia de DNA es diana
de la proteína, entonces al unirse, la proteína “tapa” las
bases a las que se une, no son bases degradables, dejando
“destapadas” el resto de bases a las que no se une, las
cuales sí que son degradables.
Se pone a digerir con la DNasaI (sólo degrada DNA libre, no
la proteína ni el DNA que está tapado por la proteína). Se
hace una electroforesis en gel de agarosa.
En los carriles hay que poner:
- DNA conocido digerido con DNasaI, que deje bandas a
una altura conocida, nos servirán para comparar con el
carril con la muestra a estudiar. Es el control.
- DNA a estudiar + proteína + DNasaI. Hay que considerar
que las digestiones nunca son 100% eficientes. Se
hacen diferentes bandas. Degrada en orden los nt. La
región que no tenga banda es la región unida a la
proteína. Es muy preciso.
3. Gene Reporter: Sirve para determinar si una proteína que
yo sospecho que activa o inhibe la transcripción de un gen
determinado, se une a alguna secuencia reguladora de la
expresión de ese gen, ya sea un enhancer o un silencer.
Debo tomar mi gen (enhancers y/o silencers + promotor +
secuencia codificante), elimino la secuencia codificante y
la sustituyo por la de un gen reportero, como por ejemplo
la luciferasa o CAT (son unos genes cuyo producto es
detectable cuanti y cualitativamente, es decir, podemos
detectar que se expresa mucho o poco, o que no se expresa).
Genética Molecular.
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Página 43
También puedo utilizar unos vectores ya preparados con el
gen de la luciferasa (o de CAT) y que debo insertar,
mediante enzimas de restricción, la región reguladora a 5’.
Ahora hay que ir haciendo diferentes experimentos en los
que se ponen la construcción de “región reguladora +
luciferasa
+
proteína
sospechosa”
de
modificar
la
transcripción. La diferencia es que en cada experimento voy
haciendo deleciones seriadas de la región reguladora, desde
el 5’3’. En cada deleción que hago, miro con un
luminómetro la intensidad de la luz emitida por la
luciferasa. Debo hacer el control sin deleciones y a
continuación las deleciones seriadas, mirando la intensidad
de la luz en cada caso.
Si veo que en algún punto llega a haber más luz que en el
control, significa que en esa región reguladora que he
delecionado había un silencer. Si por el contrario veo que
a partir de un punto hay menos luz que en el control,
significa que la región que he delecionado tiene un
enhancer.
Si
observo
la
misma
intensidad
lumínica,
significa que el la región delecionada no había nada
relacionado con la regulación de la expresión de ese gen.
Que haya más o menos luz equivale a decir que se transcribe
más o menos el gen reportero, siempre gracias a la proteína
sospechosa de regular la transcripción.
Obviamente, si observo diferencias de intensidad lumínica
respecto del original, sean las que sean, significa que la
proteína se une.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 44
TEMA 6: LA TRANSCRIPCIÓN EUCARIOTA IV.
Estudiaremos
ejemplos.
los
TF
no
basales
inducibles,
mediante
3
Ejemplo 1. CREM (o CREB, a nivel funcional es igual).
Basalmente inactiva, se activa con AMPc (poca glucosa =
mucho APMc). Se sintetiza constitutivamente.
La diana de CREM activado es la caja CRE (Ciclic-AMP
Response EleMent) en el DNA. Las isoformas de CREM formadas
por splicing alternativo son CREMa (predominante, es
activador, con dominio de unión al DNA y dominio activador
de la transcripción) y CREMi (represor, sólo tiene dominio
de unión al DNA). El dominio de unión al DNA tiene
cremalleras de leucina, por tanto, dimeriza.
Se regula: la poca glucosa regula al AMPc, que activa a
ciertas quinasas que tienen como diana a CREM. Una vez
activado (por fosforilación), CREM-P se une a la caja CRE
en el DNA. La caja CRE está, por ejemplo, en el gen de la
cadena α de las gonadotrofinas. Una de las cajas CRE está
al lado del promotor de ICER, que se estimula y transcribe
para ICER. ICER tiene como objetivo bloquear a CRE para que
separar CREM y que no se una más. Además se para la
transcripción de CREM porque el promotor de ICER (al lado
de caja CRE, diana de CREM fosforilado)está a 3’ del
promotor de CREM. Y también se deja de transcribir ICER. La
afinidad de ICER por CRE es mayor que la de CREM
fosforilado por CRE. Así se queda CRE bloqueado.
Genética Molecular.
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Página 45
Por tanto, la respuesta de CREM es rápida y transitoria.
Ejemplo 2. Genes Heat-Shock (HS). Son genes que se
transcriben cuando incrementa ligeramente la temperatura.
Los Heat Shock Factors (=HSF ó HStF) son TF inducibles que
se activan cuando sube la temperatura, sufriendo un cambio
conformacional. Activados, su diana en el DNA es Heat Shock
Element (HSE).
Se regula: HSF inactivo tiene enlaces intramoleculares que
se rompen con el calor y “abren” la molécula, que al tener
cremalleras de leucina, puede dimerizar. No es obligatorio
que lo haga, pero si lo hace sube mas la tasa de
transcripción. Una vez activado (dimerizado o no), una
quinasa reconoce su estructura y lo fosforila en el dominio
de unión al DNA, dándole así cargas negativas que estimulan
a TF2D. Estando fosforilado, se une a la proteína GAGA que
le permite unirse a las secuencias GAGA en el DNA, que se
encuentran entre los nucleosomas (fuera de las histonas).
Cuando la proteína GAGA se une a la secuencia GAGA, GAGA
“aparta” las histonas del nucleosoma, descondensando el DNA
y permitiendo que HSF fosforilado se una a HSE (estaba
envuelto por las histonas), estimule a TF2D y se transcriba
el gen HS.
Ejemplo 3. El receptor de hormonas (HR). La hormona se une
al receptor específico basalmente inactivo y dimeriza,
activándose. Así inicia la transcripción de genes.
Las hormonas que se captan son:
Todas ellas tienen en común que derivan del metabolismo del
colesterol, por lo cual tienen una naturaleza lipófila que
les permite atravesar las bicapas lipídicas de las células
y unirse a su receptor que es citoplasmático (o incluso a
veces es nuclear). ¡El receptor es el TF!
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 46
El
tipo
de
HR
que
usaremos
de
ejemplo:
GR,
el
“Glucocorticoid Receptor”. Capta glucocorticoides, un tipo
de hormonas esteroides. Dentro de la familia de los
receptores esteroides, muestran un grado de homología del
50% aprox por lo que se refleja la especificidad del
receptor por la hormona individual (Genes VII ed).
El TF inducible que las capta tiene 3 dominios:
- N’Terminal:
activador
de
la
transcripción,
sin
consenso.
- C’Terminal: unión a la hormona y dimerización.
Homología aprox. de 50%, por lo tanto los receptores
de esteroides tiene especificidad infividual por cada
hormona esteroide (Genes VII ed). Tiene dedos de Zn.
- Unión al DNA: 42-90% de homología en todas las dianas
de los receptores de hormonas esteroides. Significa
que la mayoría de HR reconocen secuencia muy parecidas
o algo parecidas, en el DNA. Tiene dedos de Zn.
De manera basal, es una proteína secuestradora (Hsp90,
chaperona que mantiene plegado al receptor) que retiene a
los monómeros de GR en el citosol evitando que dimericen.
Cuando la hormona se une al GR, Hsp90 salta y los
receptores pueden dimerizar en el citosol.
Cuando GR ha dimerizado, y estando unido a la hormona, se
transloca al núcleo y se une a su caja diana: las
secuencias HRE (Hormone Response Element). Hay dos tipos de
HRE: GRE (Glucocorticoid Response Element) que es un
enhancer y nGRE que es un silencer.
La hormona sobre el GR hace el mismo efecto que el calor
sobre HSF. Pero los dímeros de GR pueden desplazar a los
nucleosomas por sí solos, mientras que los de HSF
necesitaban a GAGA.
Lo más frecuente es que GR dimerizado con la hormona se una
a GRE y active la transcripción, pero a veces, las hormonas
bloquean la transcripción en lugar de estimularla, es raro
pero sucede. Involucra a la caja nGRE, un silencer.
Basalmente, nGRE está unida a una proteína “A” que permite
que sí que se transcriba el gen, pero al unirse GR activado
a nGRE, salta “A” porque GR es más afín y se bloquea la
transcripción del gen.
El GR activado y unido a GRE (o a nGRE) puede desplazar a
las histonas sin ninguna ayuda, así, remodela la cromatina
del DNA. Para ello reclutan al Complejo Remodelador de la
Cromatina (CRC). El CRC contiene enzimas que actúan en
diferentes procesos:
Genética Molecular.
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Página 47
- Sobre el DNA, se metila la Adenina por MECP2+Sin3.
Metilado, atrae a HDAC para bloquear la transcripción.
Desmetilando la Adenina, no vienen más proteínas
desacetiladoras y se estimula la transcripción.
- Sobre las histonas, HAT acetila las histonas para
separarlas e incrementar la transcripción y HDAC
desacetila las histonas para que se unan bien al DNA,
lo compacten y no haya transcripción.
Los procesos son reversibles.
Así, el DNA se puede metilar en las A para silenciar la
transcripción, la cromatina se puede remodelar para cambiar
la posición de los nucleosomas, y las histonas se pueden
acetilar para saltar y que se transcriba más.
El GR unido a GRE (enhancer) recluta 1º a CRC, después
quedan
expuestas
las
secuencias
dianas
de
los
TF
constitutivos que entran a HAT y de los TF constitutivos
(unidos
a
enhancer?)
y
basales
que
activan
la
transcripción, y si se requiere silenciar, saltan los TF y
se metila en las A. ¡Todo sucede a la vez!
Así, el DNA metilado con histonas desacetiladas tiene muy
poca transcripción, mientras que un DNA no metilado con las
histonas acetiladas tiene una conformación más laxa y la
transcripción de genes se ve estimulada.
El RNA de Interferencia. Recientemente descubierto también,
inactica genes de manera selectiva, se usa para estudiar
enfermedades. Hay dos tipos:
siRNA (small interference RNA): la célula Eucariota se
defiende de los virus de dsRNA mediante 2 proteinas: DICER,
que corta el dsRNA vírico en trozos pequeños de dsRNA con
extremos protuberantes de ssRNA. Son el siRNA. Son
reconocidos por RISC que desnaturaliza en ssRNA, se une a
él y deja un extremo libre de ssRNA (gasta ATP). Éste
trocito de ssRNA con RISC puede: ser degradado por RISC, ó
se une a otros RNA víricos por complementariedad de bases y
bloquea la traducción parando al ribosoma, ó activa a DICER
que le dá más trabajo a RISC.
Genética Molecular.
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Página 48
RISC con el ssRNA también puede traslocarse al núcleo y
bloquear a otros RNA que se expresan en el huésped que
proceden de DNA integrado en el genoma.
miRNA (microRNA): Se produce dentro del núcleo de la
célula. Regulan la producción de proteínas concretas porque
se unen por complementariedad al mRNA de ésas proteínas. Es
un mecanismo de regulación de la expresión génica muy
nuevo, en estudio. Viene de un promotor que mira en
dirección opuesta al gen que quiero regular, por eso los
tránscritos son complementarios.
Genética Molecular.
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Página 49
Cómo
-
se activan los TF inducibles:
Sintesis de TF lento.
Fosforilación HSF.
Desfosforilación.
Unión a ligando HR.
Corte Hidrolítico.
Separación de proteína inhibidora NF-kD.
Change of Friend: En un heterodímero, cambiamos un
miembro por otro que tenga más afinidad por el DNA y
se une.
Genética Molecular.
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TEMA 7: LA TRADUCCIÓN.
Consiste en sintetizar proteína a partir de mRNA. No se
puede regular tanto como la transcripción.
La estructura de los ribosomas es:
- Procariotas: Subunidad grande (5S-rRNA, 23S-rRNA, 30
proteinas)
y
Subunidad
pequeña
(16S-rRNA,
20
proteinas). Coef. de sedimentación: 70S.
- Eucariotas: Subunidad grande (5S-rRNA, 5’8S-rRNA, 28SrRNA, 50 proteinas) y Subunidad pequeña (18S-rRNA, 30
proteinas). Coef. de sedimentación: 80S.
La “S” indica la velocidad a la que va sedimentanto la
estructura. Es directamente proporcional a la masa (mucha
masa = tarda poco tiempo en caer = mucha “S”).
En el ribosoma Procariota, la catálisis del enlace
peptídico (actividad peptidil transferasa) está catalizada
por el 23S-rRNA de la subunidad grande. En Eucariotas, ésta
actividad la realiza la subunidad grande al completo (rRNA
y las proteínas asociadas).
Los AA los aporta el tRNA. En Procariotas, la transcripción
y traducción se dan en el mismo compartimento (protoplasma)
y casi al instante, mientras que en Eucariotas, la
transcripción se da en el núcleo y la traducción en el
citoplasma, en momentos separados si hace falta.
El 16S-rRNA Procariótico, de la subunidad pequeña, se une
al mRNA gracias a 6 nt conservados el 100% de las veces,
que están a 3’ del 16S-rRNA en el dominio 3’ menor. En el
dominio 3’ mayor hay la región de unión al tRNA y al EF-G.
Por el dominio 5’ o central se une a la subunidad mayor.
Tiene muchas secuencias palindrómicas, lo que le da una
complejidad elevada.
El 16S-rRNA puede unirse al mRNA gracias a los 6 nt
conservados el 100% de las veces, que son complementarios a
una región del mRNA llamada “Shine-Dalgarno”. El S-D se
encuentra a 5’ del mRNA.
S-D = RBS (Ribosome Binding Site) = Leader = 5’UTR.
El tRNA, como mínimo hay 20 tipos, uno para cada AA. Pero
debido que cada AA puede venir transportado por diferentes
tRNA, hay más. Estructura en forma de trébol.
La unión de AA al tRNA se realiza en el extremo 3’ del
tRNA, mediante un enlace covalente de tipo éster. El grupo
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3’OH de la A del tRNA y el grupo COOH del AA se unen
mediente éste enlace éster gracias a la AminoAcil-tRNAsintasa.
Hay 1 enzima para cada tipo de AA, por tanto hay 20.
Primero debe gastar ATP para activar al AA, formando AA-AMP
(=AA*) + PPi. Ahora lo puede cargar en el tRNA liberando el
AMP y produciendo AA-tRNA.
Todo ésto sucede dentro del enzima gracias a que tiene
diferentes dominios: unión al ATP, al AA, al tRNA y centro
catalítico.
Ésto
es
válido
para
Procariotas
como
Eucariotas.
La
estructura
del
ribosoma
(también
válido
para
ambos)consiste en un orgánulo formado por el ensamblaje de
la subunidad grande y la subunidad pequeña, las cuales
tienen los sitios P(peptidil, hace la cadena polipeptídica)
y A(aminoacil, lugar aceptor de AA).
El enlace éster que une el tRNA al AA en sitio P, tiene que
pasar al sitio A formando el enlace peptídico propio de las
proteínas. Se produce un ataque nucleofílico entre el NH3
del AA en el sitio A y el COOH del AA en el sitio P. Ya que
es el NH3 quien roba los electrones, se dice que la cadena
polipeptídica crece en NH3COOH. Éste proceso (actividad
peptidil transferasa),en Procariotas, lo cataliza el 23SGenética Molecular.
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rRNA, y en Eucariotas lo cataliza la subunidad grande del
ribosoma.
El NH3 queda mirando hacia el exterior del polipéptido
naciente. La traducción tiene 3 fases: Iniciación (la
subunidad pequeña se une al 5’), Elongación (entra la
subunidad grande y comienza a formar enlaces peptídicos
entre los AA) y Terminación (cuando se lee el codón STOP,
en el último exón siempre, se desmonta el ribosoma y salta
la proteína). Se necesitan los Factores Iniciadores (IF),
Factores Elongadores (EF) y Factores de Liberación (Release
Factors RF), cada uno para su respectiva fase.
Específicamente en Procariotas, se encontró una secuencia
conservada el 100% de las veces a 5’ del mRNA, en el
Leader. Se trata del “Shine-Dalgarno”. Está a 10nt del AUG
(primer codón, indica el principio del primer exón,
codifica para metionina), y es complementaria a la
secuencia en 3’ del 16S-rRNA.
Ésto vale para Procariotas, pero en Eucariotas no es
cierto: el ribosoma reconoce al CAP en 5’, que hace la
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misma función que S-D en Procariotas; y hay una secuencia
llamada “kozak” en el leader, que frena al ribosoma cuando
hace “screening” (ahora lo veremos). Kozak no se parece en
nada a Shine-Dalgarno, sólo se parece en que ambas están en
el leader.
1A. Iniciación en Procariotas: Se necesita un tRNA especial
para poder empezar. El primer codón siempre es AUG, por
tanto se trata de una metionina, pero la del primer codón
es una metionina formilada el tRNA iniciador en
Procariotas tiene una N-formil-Metionina.
Primero la AminoAcil-tRNA-sintasa sintetiza el Met-tRNA
(enlace covalente tipo éster). A continuación, una formiltransferasa le transfiere un formil al N’terminal de la
metionina, produciéndose un N’fMet–tRNA (su estructura es
como el tRNA de la pág. 52 pero con Metionina formilada en
el 3’) Éste es el tRNA iniciador, el único que puede entrar
en el sitip P del ribosoma ensamblado sobre el mRNA. Una
vez liberado el polipéptido, una formilasa puede eliminar
el formil (o no).
Para ensamblar el ribosoma, se necesitan los IF.
- Basalmente, la subunidad pequeña del ribosoma está
unida a IF1, IF2, IF3.
IF3 es el encargado de mantenerlo separado de la
subunidad grande, ayudar al 16S-rRNA a unirse al S-D y
atrae el GTP, pero no es para él.
- El IF2 capta al GTP y forma IF2-GTP. Así, sin
hidrolizarlo, puede unirse al mRNA por 16S-rRNAS-D.
IF1 da estabilidad al complejo. Gracia a IF3, lo hace
justo en la zona de S-D y queda en la posición
correcta para que puede entrar el tRNA iniciador, el
cual queda en el sitio P sobre AUG.
- Se produce un cambio conformacional el IF2 debido a
que el fMet-tRNA se une a AUG. IF2 hidroliza ahora el
GTP y saltan IF1, IF2, IF3.
- Sin IF3, se une la subunidad grande a la pequeña, que
ya tiene el tRNA iniciador bien situado, ocupando el
lugar P.
La unión tRNAiniAUG se da cuando la subunidad pequeña se
ha unido al mRNA.
1B. Iniciación en Eucariotas: El tRNA iniciador es normal,
no está formilado en la metionina. Es el CAP 5’ que atrae a
la subunidad pequeña del ribosoma, la cual se empieza a
mover sobre el mRNA haciendo “screening” en 5’3’, hasta
que encuentra a la secuencia “Kozak” en el leader. Ahora se
une al tRNA inicidor. En Eucariotas, la unión tRNA
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iniciador subunidad pequeña se hace siempre antes de
tocar el AUG.
Debido a que el CAP 5’ hace que el mRNA tenga una vida más
larga que el Procariota, se pueden ir uniendo varios
ribosomas, uno tras otro, al mismo mRNA para traducir mucha
cantidad de proteína. Son los polisomas ó polirribosomas.
En Eucariotas, el tRNAini ya estaba en la subunidad pequeña
antes de que ésta entrara al mRNA.
Para
ensamblar
el
ribosoma,
se
necesitan
los
IF
eucarióticos (eIF).
- En el citosol hay eIF4-F, que tiene varios dominios:
eIF4-E (es el primero en actuar, reconoce y se une al
CAP en 5’), eIF4-G (interactúa con eIF3, con PABII
circularizando el mRNA y permitiendo que aparezcan los
polirribosomas, y da estabilidad al complejo), eIF4-AB
(heterodímero de eIF4-A + eIF4-B, evita la formación
de hairpins). Se queda el mRNA con el eIF4-F y todos
sus dominios en 5’.
- Al mismo tiempo, la subunidad pequeña tiene eIF3, que
la mantiene separada de la grande (como antes). A la
subunidad pequeña se une eIF2. eIF2 captura GTP. Así,
eIF2-GTP puede capturar al tRNA iniciador (¡que no
tiene formil!). Se ha formado el complejo ternario:
tRNAini+eIF2+GTP.
- Ahora, eIF4-G unido en 5’ del mRNA reconoce a eIF3 de
la subunidad pequeña (que tiene el complejo ternario)
y permite que se una al mRNA.
- La subunidad pequeña con el complejo ternario y el
eIF4-F se empieza a mover en 5’3’ del mRNA. Éste
movimiento se llama “screening”, gasta ATP. Cuando se
detecta la secuencia “kozak”, que es adyacente al AUG,
se para de mover y el tRNAini, que ya estaba de antes,
encaja bien sobre el AUG.
- Una vez quieto y con el tRNA unido a AUG, se recluta a
eIF5, “una GTP’asa” que hace que el GTP de eIF2 se
hidrolice. Cuando salta eIF2, conserva el GDP unido.
- Con la energía liberada de la hidrólisis, saltan todos
los eIF. eIF2 puede reactivarse por eIF2-B, una
quinasa que fosforilaría a GDPGTP.
- La subunidad grande, que ya estaba rondando cerca,
tenía unida basalmente a eIF6, que la mantenía
separada de la pequeña. Con la energía de la
hidrólisis del GTP, también salta eIF6 de la subunidad
grande.
- Se pueden unir las subunidades, con el tRNAini ya en
su posición, que ocupa el lugar P.
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2A. Elongación en Procariotas: Intervienen los EF, se
forman los enlaces peptídicos.
- Con el ribosoma ensamblado, con fMet-tRNA en AUG
ocupando el sitio P, ha entrado gracias a IF2+GTP. Hay
el sitio A libre. En el sitio A sólo pueden entrar los
tRNA con AA mediante EF-TU (GTP’asa). Cuando ha dejado
el tRNA unido a su codón, se hidroliza el GTP y salta
EF-TU.
- Con tRNA en ambos lugares, el 23s-rRNA de la subunidad
grande cataliza la actividad peptidil transferasa y
forma el enlace peptídico como antes se ha explicado.
- El sitio P queda con un tRNA sin AA, y el sitio A con
un tRNA que carga la cadena polipeptídica naciente,
con el NH3 apuntando siempre hacia fuera. El ribosoma
se mueve 3nt en 5’3’ gracias a EF-G, otra GTP’asa y
sucede que el tRNA sin AA pasa al “sitio E”
(compartimento virtual que expulsa inmediatamente al
tRNA vacio), el sitio P pasa a estar ocupado por el
tRNA con la cadena polipeptídica y el sitio A vacia,
listo para volver a empezar de nuevo con EF-TU que
entra al tRNA.
Para que se desplace el ribosoma, hace falta GTP que es
aportado por EF-G. Entra en el sitio A cuando el tRNA con
la cola polipeptídica está allí, hidroliza el GTP y salta
él y el ribosoma se mueve 3nt.
Atención: EF-TU es una GTP’asa que hidroliza GTP cuando
deja el tRNA en el sitio A, con el objetivo de salir ella y
reciclarse. Al hidrolizarlo, se queda unida al GDP. Afuera
le espera EF-TS, el intercambiador de nt: quita el GDP y
pone un GTP, con lo cual EF-TU puede volver a entrar en el
siguiente.
EF-G, que también es una GTP’asa, hidroliza el GTP para que
se mueva el ribosoma, pero de manera que se separa todo y
al salir EF-G sin nada, es ella misma que capta a un nuevo
GTP, tal cual. Así puede volver a entrar en el sitio A.
Las actividades GTP’asa se activan en contacto con el rRNA,
con sus dominios de contacto para cada molécula. EF-TU es
diana de muchos antibióticos, como la kirromicina.
2B. Elongación en Eucariotas: El proceso es el mismo, pero
los factores tienen el nombre cambiado:
EF-TUeEF1-α , EF-TSeEF1-βγ , EF-GeEF-2.
Recordar que para formar el enlace peptídico hay que romper
el enlace éster, por un ataque nucleofílico en NH3COOH
catalizado por la actividad peptidil transferasa de la
subunidad grande.
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3A. Terminación en Procariotas: Intervienen los RF1, RF2 y
RF3, que se unen al sitio A cuando aparece un codón STOP
(también entran EF-G y EF-TU):
RF1 reconoce los codones UAA, UAG.
FR2 reconoce los codones UAA, UGA.
RF3 se une RF1 o a RF2 activándolos, cuando se han
unido al codón STOP.
Es debido a él que salta todo: el polipéptido, el mRNA, las
subunidades del ribosoma, los RF. Cuando salta, la
subunidad pequeña se une de inmediato a IF3.
3B. Terminación en Eucariotas: Es más fácil que en
Procariotas (cosa rara). Sólo hay un factor implicado, el
eRF1, que hace la misma función que los RF Procariotas.
_________________________________________________________
La Pauta de Lectura Abierta (Open Reading Frame, ORF):
(¿porqué no lo explican en clase?) En Eucariotas, no hay
operones. El mRNA sólo codifica para una única proteína.
Los codones (3 nt) se leen linealmente.
A veces se da que en un mismo mRNA hay dos AUG, cada uno de
ellos con su secuencia STOP. Vienen uno tras otro,
linealmente. Es como tener 2 genes diferentes en un mRNA.
Wikipedia
“...se llama
marco abierto de lectura (siglas
ORF del inglés Open reading frame) a cada una de las
secuencias de ADN comprendida entre un codón de inicio
(ATG) de la traducción y un codón de terminación,
descontando las secuencias que corresponden a los intrones
en caso de haberlas. Se encuentra acotado por los UTRs, o
secuencias no traducidas.
En una secuencia de ADN cualquiera hay, a priori, 6
posibles sentidos en los que pueden aparecer marcos
abiertos
de
lectura;
dado
que
cada
codón
toma
3
nucleótidos, existen 3 posibles lugares de inicio para
tomar los nucleótidos de 3 en 3, si se tomara un cuarto
nucleótido como lugar de inicio, haría coincidir el marco
abierto de lectura con el mismo que si se toma el primer
nucleótido. A lo que hay que sumar los otros 3 posibles
marcos abiertos de lectura si el ADN es traducido tomando
como molde la hebra complementaria, dando el sentido de
lectura opuesto. Estos marcos abiertos de lectura se
denominan +1, +2, +3, -1, -2 y -3.
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Página 57
En un ejemplo con la secuencia 5' aactgcagtacgtaacgtca 3'
+3
+2
+1
-1
-2
-3
5'
a act gca gta
5' aa ctg cag tac
5' aac tgc agt acg
3' ttg acg tca tgc
3' tt gac gtc atg
3'
t tga cgt cat
cgt
gta
taa
att
cat
gca
aac
acg
cgt
gca
tgc
ttg
gtc a 3'
tca
3'
ca
3'
gt
5'
agt
5'
cag t 5'
Cada uno de los 6 posibles marcos abiertos de lectura dará
lugar a una secuencia proteica absolutamente diferente.
En inglés el marco abierto de lectura se denomina ORF (open
reading frame).”
_______________________________________________________
Genética Molecular.
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TEMA 8: LA REPLICACIÓN PROCARIOTA.
Es una replicación simple. Se da mediante un único
Replicón: toda la longitud de un DNA que se replica a
partir de un único origen de replicación (el concepto de
Replicón es válido para Procariotas y Eucariotas).
La síntesis de DNA es semiconservativa, lo catalizan las
DNA Polimerasas, que dependen de un molde de DNA que
contiene la información original. Necesitan un extremo 3’OH
libre a partir del cual empezar a elongar en 5’3’.
Siempre se elonga en 5’3. También necesita cationes
divalentes y dNTP (cuando entran en el DNA, pierden el P en
βγ, quedando el P en α unido al DNA).
En una burbuja de replicación hay 2 horquillas de
replicación, cada una de las cuales avanza en la dirección
contraria a la otra.
El DNA de nueva síntesis, mientras se replica, recibe el
nombre de cadena “leading”(5’3’) si está sobre el molde
en sentido 3’5’. No da problemas. La cadena “lagging”
está sobre el molde en 5’3’, y también se elonga en
5’3’, pero para poder ir en el mismo sentido, va lenta y
necesita los Fragmentos de Okazaky (FO).
Las etapas de la Replicación son:
1. Iniciación: La secuencia OriC es el punto de origen de
la replicación único en el cromosoma circular de E.Coli.
Tiene 245pb y 2 subregiones:
- 3 cajas de 13pb (unos 13 mer cada una), ricas en A-T,
en repetición directa.
- 4 cajas de 9pb (unos 9 mer cada una), con
orientaciones invertidas de la misma secuencia.
La proteína DNA-A reconoce a las cajas de 9 mer de OriC
(tiene que estar metilado). Es una ATP’asa.
Cuando llega a 30 monómeros de DNA-A sobre las cajas de 9
mer, recluta a HU e IHF, que se unen a DNA-A y rompen los
puentes de H2 de la región anterior: las cajas de 13 mer.
Lo hacen porque estiran, no porque sean helicasa.
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Al “agujero” de las cajas de 13 mer se une DNA-C, la cual
permite que entre DNA-B (=Helicasa) gastando ATP. Cuando
DNA-C ha ayudado a entrar a DNA-B, se va. DNA-B, la
helicasa, es un homohexámero en forma de anillo, sin
especificidad de secuencia, a través de ella pasa la cadena
de ssDNA que será la molde a la lagging (es decir, se
coloca sobre la que está en 5’3’).
La helicasa rompe los enlaces de H2 entre las bases. A
continuación vienen las SSBP (Single Strand Binding
Proteins) que se unen al ssDNA, ya que el ssDNA sin
protección es MUY peligroso (puede recombinar, etc). Las
SSBP se separan cuando se ha replicado.
Ahora entra la DNA-G (=Primasa), un tipo de RNA Polimerasa.
No tiene especificidad de secuencia. Necesita activarse,
para ello, la DNA-G se activa al tocar a la DNA-B. Queda
enganchada a las 2 cadenas molde donde está DNA-B. El 1er
primer que se hace es el de la cadena leading. Es un primer
de RNA. Mientras la Helicasa avanza, va reclutando
Primasas, lo cual es necesario para sintetizar la lagging.
La Primasa se marcha después de hacer el primer.
La replicación normal dura unos 40’. En cultivo con medio
rico, dura 20’. Esto pasa gracias a que la activación de
los OriC se hace antes de que acabe la replicación
anterior. La célula hija recibe un cromosoma circular que
se está replicando.
El inicio de la replicación se regula con dos enzimas:
- SeqA: se une a la secuencia GATC de OriC, cuando está
hemimetilado (=recién sintetizado).
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SeqA bloquea que entre la metilasa DAM, que metila.
Pero con el tiempo, se llega a soltar SeqA. Entonces
entra metilasa DAM, metila y puede entrar DNA-A
(necesita DNA metilado, no vale el hemimetilado)si hay
que replicar. La metilasa DAM y SeqA tienen la misma
diana.
- Metilasa DAM: puede añadir grupos metil a las Adeninas
que no estén metiladas, que estén en un DNA
hemimetilado. Reconoce a la secuencia GATC El DNA no
metilado es reciente. El DNA metilado es antiguo. El
hemimetilado es recién sintetizado. Cuando está
metilado en las dos cadenas, puede entrar DNA-A.
La reacción es Adenina + SAM6-metilAdenina + SAM sin
el grupo metil.
OJO: los factores en CIS son secuencias de DNA adyacentes a
un gen. Los factores en TRANS son proteínas que se mueven
por el citosol, o secuencias de otro DNA que no es del
genoma que considero.
2. Elongación: siempre hay que tener presente que 1 burbuja
tiene 2 horquillas de replicación.
La replicación es bidireccional, a partir de un único OriC.
El DNA siempre se sintetiza en 5’3’. Un fragmento de
Okazakt (F.O.) tiene el primer de RNA + segmento de DNA
elongado por la Polimerasa III.
Los primers son fragmentos pequeños de RNA que que
sintetiza la DNA-G, al activarse en contacto con la
helicasa. El primer es de unos 10-15nt, sin diana definida,
pero suele empezar por 5’-AG-3’.
La cadena leading necesita un único primer. La cadena
lagging necesita un primer por cada fragmento de okazaky.
En la lagging, la primasa va entrando y saliendo, ya que al
sintetizar el primer salta enseguida porque es poco
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Página 61
procesiva. ¡Siempre se activa al tocar a la helicasa! (la
helicasa toca a la DNA Polimerasa, la primasa no).
El 1er primer es el de la cadena leading. El de la lagging
se hace cuando la horquilla de replicación se ha abierto un
poco.
Realmente, es el DNA que se mueve dentro de la Polimerasa y
la helicasa, no al revés. Son como dos cuerdas que se
estira cada una por el lado opuesto. Para poder acompasarse
a la leading, la cadena lagging va formando bucles para
acompasar el ritmo.
Sobre las DNA Polimerasas Procariotas son complejos
multienzimáticos.
Todas
polimerizan
en
5’3’.
Hay
diferentes tipos:
- DNA Polimerasa I: es poco procesiva (= se separa
rápido del DNA); tiene actividad exonucleasa 5’3’ y
actividad exonucleasa 3’5’ proofreading (corrige
errores en el DNA). Los mutantes son poco viables.
- DNA Polimerasa II: Es similar a la DNA Polimerasa III
pero es prescindible.
- DNA Polimerasa III: Hay pocas en cada célula, es un
agregado
de
10
polipéptidos.
Tiene
actividad
exonucleasa
3’5’
(gracias
a
ello
hace
el
proofreading: pone una base mal por error, lo detecta,
se para y da marcha atrás degradándola y poniendo la
buena en 5’3’). No puede hacer exonucleasa en
5’3’. Es la más procesiva (aguanta mucho unida al
DNA) y rápida. Los mutantes son letales condicionales:
mueren si se han de replicar.
Su estructura tiene 3 subunidades:
Core/núcleo catalítico. Tiene 3 polipéptidos: α
(actividad catalítica 5’3’, es el “pulgar”), ξ
(exonucleasa 3’5’, proofreading) y Ө (mantiene unido
el core)
Asociación. Tiene 2 polipéptidos: ββ (también llamado
“Sliding clamp”, es un anillo homodimérico por dentro
del cual pasa el ssDNA; toca a la polimerasa por la
parte de atrás del núcelo catalítico y también toca a
γ, pero en momentos separados) y γ (carga el ssDNA
dentro de Sliding clamp, es un pentámero de 5
polipéptidos γ,δ,δ’,Ψ,χ; es una ATP’asa que unida a
ATP carga el ssDNA dentro de Sliding clamp, y al
hidrolizar el ATP se separa).
Puente. Son dos proteínas τ (unen el núcleo catalítico
con la subunidad de asociación).
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Página 62
La Sliding clamp es necesaria para mantener el core
catalítico unido al ssDNA, sinó se separaría de golpe
durante la replicación (malísimo).
Gracias a que se carga el ssDNA dentro de la Sliding
clamp (ββ) gracias a γ+ATP. Lo hidroliza y se separa
de ββ. Para ir poniendo las ββ dentro de la cadena
molde de la lagging, se tiene que ir sintetizando más
ββ, la cual es reclutada por γ para anillarla al ssDNA
de la siguiente región.
El replisoma en acción. Replisoma= conjunto de todos los
enzimas funcionando que intervienen en la replicación.
La actividad proofreading (exonucleasa 3’5’) de la DNA
Polimerasa I convierte el primer de RNA en DNA cuando ya
está constituido el fragmento de Okazaky, y también
convierte el primer de RNA en DNA de la cadena leading.
Genética Molecular.
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Página 63
Revisa a la nueva cadena: es una actividad exonucleasa de
RNA en 5’3’ (por delante) y exonucleasa de DNA en 3’5’
(sólo degrada los errores, no degrada el DNA que acaba de
sintetizar la DNA Polimerasa III); evidentemente el DNA
nuevo se polimeriza en 5’3’ (lo hace por detrás). Si
encuentra un error que la DNA Polimerasa III haya pasado
por alto (porque también hace proofreading) lo repara
degradándolo. Avanza así por todo el DNA.
Finalmente actúa la ligasa uniéndolo todo, forma los
enlaces fosfodiéster típicos entre los fragmentos de
Okazaky, gastanto ATP.
Actualmente hay visiones alternativas de la replicación
(the replication factory), que afirman que aunque el
funcionamiento es el mismo, la estructura que se adquiere
es distinta.
Hasta ahora considerábamos que 1 Replisoma está sobre 1
horquilla. Una burbuja tendrá, por tanto, dos replisomas.
Cada replisoma tiene una cadena molde de la leading y una
cadena molde de la lagging.
Pero según algunos modelos recientes, una misma cadena (la
5’3’ molde de la lagging ó la 3’5’ molde de la leading)
se replica mediante el mismo replisoma, y todo el resto es
igual. Los enzimas están quietos, se muede el DNA.
Las helicasas unidas entre ellas, inmovilizan a la DNA
Polimerasa III.
3. Terminación: (lo explican muy mal en clase). El final
teórico es la mitad del cromosoma circular, en línea recta
Genética Molecular.
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respecto al OriC. Si se pasa de ese final teórico es porque
el otro replisoma se ha atascado.
La dirección de replicación y de transcripción de los genes
es la misma. Hay genes que se tienen que expresar durante
la replicanción, si lo hacen en la horquilla de replicación
donde está el replisoma que no se ha pasado del final, no
hay problema porque van en el mismo sentido y no se topan.
Pero si se pasa el replisoma del final y se topa con la RNA
polimerasa que está transcribiendo en la otra horquilla, es
MUY malo porque se chocan y se “estropean” los enzimas.
Al tener aproximadamente la misma velocidad de replicación
las dos horquillas, en teoría deberían encontrarse en el
final teórico y saltar los dos. Pero si esto no sucede
(porque uno de los dos se ha atascado), hay un mecanismo
para hacer saltar al replisoma si se pasa del final de
manera alarmante.
Pasado el final teórico, hay una serie de secuencias en el
DNA llamadas TER (terminación), hay 3 ó 4 en cada
horquilla.
Sucede que cuando, por ejemplo, el replisoma derecho pasa
por encima de las secuencias TER trampa del replisoma
izquierdo, se activa la transcripción de la proteína TusA
en el la horquilla derecha. Va en el mismo sentido la
transcripción
y
la
replicación.
Ésta
proteína
TusA
sintetizada por la horquilla derecha tiene como diana las
secuencias TER de la horquilla izquierda. Así, TusA
sintetizada en una horquilla se une a TER de la horquilla
opuesta, para asegurarse que si el replisoma se pasa del
final, se pare. La proteína TusA unida a TER tiene una
actividad antihelicasa que hace que se desmonte el
replisoma que viene de la otra horquilla, no haciendo nada
al replisoma de la horquilla donde está ella (se parará
cuando se tope con el DNA de la otra). Por eso se dice que
Genética Molecular.
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TusA actúa asimétricamente.
funciona TusA.
Sólo
cuando
hay
replicación
RESUMEN DE LA REPLICACIÓN.
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Página 66
TEMA 9: LA REPLICACIÓN EUCARIOTA.
Se da por Replicones múltiples: hay muchos “OriC” sobre un
cromosoma. Aparte, hay muchos cromosomas. Son lineales y
están encerrados en el núcleo.
Cada origen de replicación es bidireccional. Como es más
complejo, hay más Replicones, aunque ello no implica que
haya más cantidad de genoma. Un tamaño pequeño del
cromosoma indica unos replicones más largos. Los replicones
se activan cuando la célula ha de dividirse (para que un
tejido prolifere, etc), pero cada uno se puede activar en
diferentes momentos.
Ya que hay tantos replicones, hay algunos que se utilizan y
algunos que no. Los que no se llaman orígenes de
replicación críptico.
Un origen de replicación nunca puede ocupar nada que tenga
que ver con la transcripción: ni la región reguladora ni la
región codificante. Por eso, los orígenes de replicación
siempre están en lugares no codificantes. Un tamaño pequeño
del genoma indica muchas secuencias codificantes, muy
juntas y por tanto pocos OriC, cuyos replicones serán muy
grandes. Por el contrario, un gran tamaño del genoma indica
muchas secuencias codificantes, y también muchas no
codificantes, por tanto hay muchos replicones, pero de poca
longitud.
En levaduras (S.Cerevisiae): El origen de replicación se
llama ARS (Autonomous Replication Secuence). Son regiones
de 50pb imprescindibles, muy conservadas. A ella se une la
proteína ORC (homóloga de DNA-A). Hace que las dos cadenas
se empiecen a separar un poco más atrás, en B2-B3. La
proteína ABF1, a veces, se une un poco más atrás de B3 y
ayuda a replicar. ABF1 no tiene correspondencia en
Procriotas.
En Mamíferos: Muy relacionado con el ciclo celular. En el
punto de origen de la replicación, el cual no tiene una
secuencia consenso, se une la proteína ORC (homóloga de
DNA-A). Recluta a CDC-6 y CDT-1 (son homólogas a DNA-C). En
cada horquilla se une un heterodímero de CDC6+CDT1.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 67
Reclutan a MCM7 (homóloga a la helicasa, DNA-B), un
heterohexámero formado por MCM2 a MCM7. En Procariotas era
un homohexámero. Habrá, también, uno para cada horquilla.
Así se ha formado el complejo pre-replicativo (pre-RC).
Está en estado latente, pudiendo quedar mucho tiempo así
formado unido a su secuencia diana, a la espera de recibir
el estímulo que lo activa. El pre-RC se forma al final de
la telofase y al principio de la fase G1, y se activa al
principio de la fase S.
El estímulo que activa al pre-RC implica la pérdida de CDT1
y CDC6, que sólo ayudaban a entrar a la helicasa. Ambas son
fosforiladas por CDK y DDK, y posteriormente degradadas. La
helicasa también se debe fosforilar por CDK y DDK para
activarse, pero evidentemente no se degrada.
El sentido es que al final de la fase G1 se produce un
incremento en la concentración intracelular de CDK y DDK,
por lo que se fosforila el pre-RC permite que empiece la
fase S.
Una
RC,
-
vez se han dado las fosforilaciones y activado al preentra el Replisoma Eucariota. Contiene:
RPA: equivale a las SSBP
RFC: equivale al complejo cargador γ Procariota. Pone
la PCNA detrás de la Polimerasa δ-ξ.
- PCNA: Equivale a la Spliding clamp Procariota (=anillo
ββ)
- MCM7: La helicasa heterohexamérica. Se activa por
fosforilación.
- Polimerasas: α (es una primasa. No hace proofreading,
hace un “primer híbrido”) y δ-ξ (son el core
catalítico
intercambiable,
tiene
actividad
proofreading). En orgánulos, hay la γ (sustituye a δ-ξ
en la mitocondria).
El primer híbrido que sintetiza la polimerasa α tiene una
parte de RNA en 5’ y una parte de DNA en 3’.
Aparte, hay otras polimerasas que no participan en
replicación asociada a división celular, sino en
replicación
asociada
a
reparación
(por
ejemplo,
Genética Molecular.
Carlos F.R.
la
la
la
Página 68
Polimerasa β participa en el mecanismo de reparación BER, y
la polimerasas Ө,λ,κ,η,µ,ι en otros tipos de reparación).
Una vez que se han fosforilado CDC6 y CDT1, se van. Se
fosforila MCM7 y empieza a separar las cadenas. Enseguida
entra la polimerasa δ-ξ y la polimerasa α en la que será la
molde de la leading (en la que está 3’5’). Hacen los
primers hibridos, la MCM7 va avanzando, entran RFC y PCNA.
Salta la polimerasa α y así sigue elongando la leading. Una
vez que se ha sintetizado un trozo de la leading, empieza
la lagging.
El procesado de los fragmentos de Okazaky se realiza
mediante un enzima llamado Fen1. No actúa la DNA Polimerasa
I, porque es Procariota. Las actividades de Fen1 son
exonucleasa 5’3’ (sobre un trozo del RNA y todo el DNA
del primer)y endonucleasa de ssDNA. No polimeriza.
Modelos hipotéticos para explicar su funcionamiento:
A) Modelo de la RNasaH: Actúan la RNasaH y Fen1. Tenemos un
dsDNA, en el cual una cadena es la molde, de DNA, y la otra
tiene los fragmentos de Okazaky formados por el primer
híbrido. No están unidos. Actúa la RNasaH degradando un
trozo del RNA, en 5’3’. Ahora actúa Fen1 degradando el
trocito de RNA que queda y el fragmento de DNA, en 5’3’.
Después, la DNA Polimerasa δ-ξ sintetiza el fragmento de
DNA complementario al primer degradado. Finalmente la
ligasa lo une.
B) Modelo flap. Actúan la MCM7 y la Polimerasa δ-ξ. Tenemos
un dsDNA, en el cual una cadena es la molde, de DNA, y la
otra tiene los fragmentos de Okazaky formados por el primer
híbrido. No están unidos. Entra MCM7 por el 5’ de la zona
con RNA y la separa del DNA, dejando al aire el trozo de
RNA. Inmediatamente entra la DNA Polimerasa δ-ξ que
sintetiza el DNA complementario al fragmento de RNA que ha
levandado la MCM7. Van avanzando la DNA Polimerasa δ-ξ y
MCM7 “empujando” el primer, haciendo que se separe,
avanzando con la síntesis. Cuando casi ha separado el
fragmento de Okazaky completo, llega Fen1, corta el ssDNA
del fragmento de Okazaky que está colgando y saltan la DNA
Polimerasa δ-ξ y MCM7. No se sintetiza todo el DNA de
nuevo. Finalmente, la ligasa lo une. Se ha de resintetizar
la zona del primer porque la DNA Polimerasa α no tiene
proofreading, no degrada RNA y se equivoca. La DNA
Polimerasa δ-ξ sí tiene proofreading.
Sucede que debido a la reparación de los fragmentos
Okazaky, se van acortando cada vez más los cromosomas
los brazos 5’, ya que el RNA se pierde. Ésto pasa en
dos extremos del cromosoma, porque la replicación
bidireccional.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
de
por
los
es
Página 69
De las 4 “nietas”, la mitad ya tiene delecion estable. Para
evitar que ésto suceda (sería catastrófico para la
especie), están los telómeros.
Los telómeros son unas secuencias de 10-15nt repetidas “n”
veces, en los extremos 3’ del cromosoma. Son de ssDNA,
3’protuberante. Únicamente se encuentran en las células
germinales, debido a que los sinetiza un enzima llamado
telomerasa, que se expresa sólo en el tejido germinal.
Actúa al final del ciclo celular, añadiendo el telómero a
ambos extremos 3’ del cromosoma.
En humanos, un telómero es una repetición de 1000 veces de
la secuencia 5’-TTAGGG-3’. El sentido de ésto es que ya que
se ha de perder forzosamente una secuencia en 5’ debido a
la reparación del fragmento de Okazaky, pues que sea la
complementaria a algo inútil* (el telómero).
*es inútil desde el punto de vista codificante, pero de
inútil nada porque sin ellos, cada espermatozoide u óvulo
que se genera tendría cada vez menos DNA extinción.
Molecularmente, la telomerasa es una DNA polimerasa
dependiente de RNA. Es un enzima de la familia de las
Transcriptasas Inversas. Sintetiza DNA a partir de un RNA
molde que tiene ella en su estructura. Es un RNA molde
igual en los organismos de la misma especie.
El telómero lo añade a los 2 extremos 3’ del cromosoma,
antes de que se empiece a replicar. Se engancha al 3’ del
cromosoma, y añade nt en 5’3’.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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El DNA que sintetiza en ssDNA. Cuando ha acabado con la
secuencia 5’-TTAGGG-3’, salta y se pone en el 3’ de 5’TTAGGG-3’. Y le añade al lado otra secuencia igual. Así
1000 veces.
Éste 3’ protuberante de ssDNA que forma ha de evitar ser
degradado por nucleasas. Para ello, forma estructuras en
forma de lazo o “loop”.
En Tetrahymena, se forma un tetrámero de Guaninas que
determina a un hairpin. Ya que el telómero de Tetrahymena
tiene muchas guaninas, se dobla y se aparean 2 guaninas con
otras 2 guaninas, mediante enlaces de H2 entre ellas en
lugares que no son los típicos.
Son 8 enlaces entre 4 Guaninas, formando un bucle cerrado.
En humanos, se forman lazos o “loops” terminales. El 3
protuberante (telómero) enlaza con la secuencia anterior
suya. Primero se forma el t-loop separándose las dos
cadenas, se engancha el 3’ por complementariedad y se forma
el d-loop.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 71
En la superficie de ambos loops hay proteínas asociadas que
interactúan con la telomerasa. Siempre se unen al dsDNA, no
a la zona con ssDNA.:
- TRF1: Tiene unidas las subunidades Tankyasa y Tin2
(dímeros
también).
Bloquea
la
entrada
de
la
telomerasa.
Una
sobreexpresión
acorta
a
los
cromosomas. Cuando se va, entra la telomerasa. Se
encuentra distribuida por los t-loop y d-loop, de
manera más o menos uniforme.
- TRF2: Tiene una función estructural, está por ambos
loops, pero a mayor [ ] en el punto donde se hibridan
las cadenas (en el d-loop).
Cuando una célula somática se vuelve tumoral, sobreexpresa
ciclinas.
Si
además
expresa
la
telomerasa,
como
consecuencia de que es tumoral, se vuelve inmortal.
En la línea germinal (células que hacen los espermatozoides
y óvulos), la telomerasa funciona. La longitud del telómero
siempre es igual.
En las células somáticas, el acortamiento progresivo de los
brazos
de
los
cromosomas
se
debe
a
que
no
hay
Una
de
las
causas
telomerasasenescenciaapoptosis.
principales de que envejezamos.
Los telómeros cortos
en células somáticas
cancerosas,
podrían
ser
el
señal
que
induce la expresión
de la telomerasa (no
se
sabe).
La
p53
también
tiene
un
papel importante en
la tumorogénesis, que
se activa (p53) por
telómeros muy cortos,
aunque
las
células
tumorales
suelen
tener mutada a p53.
Genética Molecular.
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Página 72
TEMA 10: REPARACIÓN DE LAS MUTACIONES EN
PROCATIOTAS I.
Las mutaciones pueden ser por bases no complementarias
(inserción, deleción, cambio de nt) o por lesiones el el
DNA
(aparición
de
substancias
que
perjudican
la
estructura).
Frecuencia teórica de aparición de las mutaciones:
- Longitud del genoma humano: 3000x106
- Nº medio de replicaciones en 1 vida: 1015
- Error en selección de nt: 10-5 o 10-6
- Error al revisar el nt(falla proofreading): 10-2 ó 10-3
- Error al revisar cadena ya sintetizada: 10-1 o 10-2
Teóricamente se cometerían 3x1018 errores en una vida, un
número inadmisible. Si consideramos que para que se quede
la mutación en el organismo han de darse los 3 errores
juntos, entonces la tasa real de errores es de 10-10 aprox.,
lo cual ya es relativamente tolerable.
El sistema de reparación reconoce la cadena de DNA no
metilada (= nueva) para detectar posibles mutaciones en
ella. A la larga, se llega a metilar todo (ver Tema 8).
Reparación de apareamientos erróneos: Es el missmatch
repair. En Procariotas. Supongamos que cuando el DNA se
replica, la Polimerasa coloca una base equivocada.
Supongamos
también
que
la
Polimerasa III no se ha dado
cuenta, y que la Polimerasa I
tampoco.
Así
queda
la
mutación
en
un
DNA,
por
elegir el nt que no toca. No
se aparean las bases porque
no son complementarios, y se
forma
una
estructura
extrusionada
en
la
dóble
hélice de DNA.
Ésta estructura que sobresale, es detectada en primera
instancia por los enzimas reparadores. Actúan después de la
replicación. Éstos son:
- MUT-S: Homodímero que contacta con el punto en el DNA
que
tiene
el
apareamiento
erróneo
(estructura
extrusionada). Tiene forma de “manos en pregaria” (?).
- MUT-L: Homodímero reclutado por MUT-S. Se une a la
cadena de DNA que está metilada (antigua), en GATC.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 73
- MUT-H: Endonucleasa reclutada por MUT-S que hace un
corte por debajo de MUT-L, en la cadena no metilada.
Las MUT tienen más afinidad por la estructura extrusionada
del DNA que la Metilasa DAM por GATC.
Cuando MUT-S está sobre la zona con el error, capta ATP.
Así recluta a MUT-L y MUT-H, y hace que se unan al DNA. La
diana de MUT-L es GATC metilado, quedando MUT-H debajo de
ella (en la cadena no metilada, nueva, con el error).
Entonces MUT-L se acerca
a MUT-S, haciendo que el DNA
adquiera una estructura en forma de loop entre el error y
el GATC. Entonces, actúa MUT-H (endonucleasa) haciendo el
corte en 1 cadena, la no metilada. Deja un Nick (separación
entre dos bases contiguas, no se pierde información, sólo
se rompe el enlace fosfodiéster), justo debajo de la GATC
metilada (justo debajo de MUT-L).
Éste sistema es bidireccional, es decir, la secuencia GATC
puede estar a 5’ ó a 3’ de la zona con el apareamiento
erróneo. Según donde esté, actúan diferentes enzimas
después de hacer el corte.
- Si GATC está a 5’ del error, entonces viene la
exonucleasa I y degrada en 3’5’ aprovechando el 3’
del Nick. Degrada el DNA de la cadena nueva (la del
Nick) hasta un poco pasado el error (osea, elimina la
base mal apareada). Deja un GAP (“agujero” en el DNA
en el que falta información, es una zona con ssDNA).
- Si GATC está a 3’ del error, actúa la exonucleasa VII
ó RecJ, que degradan el DNA en 5’3’ aprovechando el
Nick, igual que antes degradan el DNA de la cadena
nueva con el error, hasta un poco más allá, y se
separan. Dejan también un GAP.
Los GAPS que quedan, se siga el camino que se siga, tienen
ssDNA, el cual es el sustrato favorito de RecA.
Como han dejado el mismo producto, ahora actúa la DNA
Polimerasa III rellenando el GAP y la ligasa finalmente lo
une. No actúa la DNA Polimerasa I porque tiene exonucleasa.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 74
Los mutantes de MUT no pueden reparar, causa directa de
inviabilidad. En eucariotas, mutantes en las proteínas
homólogas de MUT tienen cáncer.
Los Eucariotas tienen un sistema homólogo a missmatch
repair, pero con Polimerasas de DNA específicas y enzimas
concretos. Las proteínas que intervienen son homólogas a
MUT y otras llamadas PMS (forman heterodímeros, se combinan
los diferentes tipos).
Las principales diferencias respecto a Procariotas son que
los
homólogos
a
MUT
son
heterodímeros
siempre(no
homodímeros) y que su ausencia causa tumorogénesis.
- La MUT-S procariota tiene de homóloga en S.cerevisiae
a MHS1, 2, 3, 4, 5 y 6. En humanos son MSH2, 3, 4, 5 y
6 (=GTBP).
- La MUT-L procariota tiene de homóloga en S.cerevisiae
a MLH1, 2 y 3, y PMS1. En humanos son MLH1 y PMS1 y 2.
- La MUT-H procariota no tiene homólogos ni en
S.cerevisiae ni en humanos.
No se han encontrado todas las combinaciones
posibles, sólo algunas. Otras no se dan nunca.
teóricas
Los
complejos
equivalentes
a
missmatch
repair
en
S.cerevisiae son:
- MUT-S MSH2 (siempre está) + MSH3 (para inserciones y
deleciones de todo tipo) ó MSH6 (pequeñas inserciones
y deleciones, mutación puntual).
- MUT-L MSH1 (siempre está) + PMS2 (para mutaciones
puntuales,
inserciones
y
deleciones)
ó
PMS1
(inserciones y deleciones) ó MLH (también para
inserciones y deleciones).
- MUT-H no se ha encontrado.
Los complejos equivalentes a missmatch repair en humanos
son:
- En células somáticas:
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 75
- En células germinales (hacen meiosis):
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 76
TEMA 11: REPARACIÓN DE LAS MUTACIONES EN
PROCATIOTAS II.
Las mutaciones pueden ser por bases no complementarias
(inserción, deleción, cambio de nt) o por lesiones el el
DNA
(aparición
de
substancias
que
perjudican
la
estructura).
Supongamos un punto mutado en el DNA. Si por algún motivo
no actúa el mecanismo anterior, actúa el siguiente. Se
pueden clasificar según cómo actúan o según cuando actúan:
- Según cuando actúan los enzimas reparadores:
- Según cómo actúan los enzimas reparadores:
1) Reversión de la lesión: Se arregla el daño en el
DNA. Lo que arregla son las bases dañadas, no
erróneas. Antes de replicar. Fotoliasa.
2) Escisión del trozo dañado: Se arreglan bases
dañadas. Antes de replicar. A continuación se
resintetiza el trozo escisionado. Lo hacen el BER y
el NER.
3) Tolerancia de la lesión: Se permite que termine
la replicación, función vital de la célula, antes de
reparar. Después de replicar. Son el missmatch
repair (corrige bases mal apareadas), Reparación por
recombinación
(actúa
frente
a
bases
dañadas
permitiendo que siga la replicación, pero no las
arregla) y Reparación sobre lesión (=SOS, actúa
sobre
bases
dañadas
permitiendo
que
siga
la
replicación pero no las arregla).
Estudiaremos los sistemas con detalle, basándonos en la 2ª
clasificación.
1) Reversión de la lesión: Repara los dímeros entre 2
pirimidinas contiguas (CC ó TT), que se unen mediante 2
enlaces ciclobutilo. Se forman debido a la luz UVA (260nm).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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Éstos enlaces
normales.
son
transversales
a
los
enlaces
de
H2
El enzima que repara éstos enlaces es la fotoliasa. El
mecanismo mediante el cual actúa se llama fotoreactivación:
deshace los enlaces ciclobutilo entre las dos pirimidinas
contiguas, gracias a la energía que obtiene de la luz
blanca (activa a la fotoliasa). Esto se explica teniendo en
cuenta que la fotoliasa tiene nucleótidos de flavina
reducidos (FADH2). Tiene 2 FADH2. Cada FADH2, en presencia
de luz blanca, cede 2e- (se oxida) a uno de los dos enlaces
ciclobutilo (captan el e-, se reducen), dejando al final a
las dos pirimidinas sin ninguna anomalía.
Se ha de unir al lugar con la anomalía, y NO tiene ningún
homólogo en Eucariotas.
2A)Base Excision Repair (BER): Corta y resintetiza un
fragment de DNA. Actúan enzimas llamados N-Glucosidasas ó
DNA-Glucosidasas. Repara bases dañadas, antes de replicar.
No actúa frente a dímeros de pirimidina. Excepcionalmente,
alguna también actúa frente a apareamientoe erróneos.
Cortan el enlace N-glucosídico entre la pentosa y la base
nitrogenada de un nucleótido. Eliminan la base, y dejan un
lugar AP (apurínico si era una purina; apirimidínico si era
una pirimidina). La más conocida es la N-Glucosidasa de
Uracilo, ya que tener un uracilo en el DNA es una
aberración.
A continuación actúa
lugar AP, y luego una
AP. Se rompen así
flanqueaban al nt que
una endonucleasa que corta a 5’ del
endonucleasa que corta a 3’ del lugar
los dos enlaces fosfodiéster que
tenía la anomalía.
Finalmente, actúa la DNA Polimerasa I y pone el nt correcto
que falta (sería mucha casualidad que se equivocara, pero,
¿porqué no?). La ligasa une los nicks que puedan quedar.
2B)Nucleotide Excision Repair (NER): Es el mecanismo
principal. Corta y resintetiza un fragment de DNA. Repara
bases dañadas, antes de replicar. También actúa frente a
dímeros de pirimidina.
Lo realizan los enzimas UVR-A, B, C y D. La zona con error
de apareamiento forman una estructura extrusionada, que es
reconocida por un heterotrímero (ααβ): dos monómeros de
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 78
UVR-A y un monómero de UVR-B. El ααβ necesita unirse a ATP
para poder unirse al DNA. Una vez unido al DNA, UVR-B
deshace los puentes de H2 de la región con el error. Ahora
saltan los dos monómeros de UVR-A. Queda UVR-B unido, que
dobla al DNa formando un “codo”. UVR-B recluta a UVR-C, la
única endonucleasa, que hace dos cortes (nicks) en la
cadena con el error: un Nick a 8nt en 5’ del error y un
Nick a 4-5nt en 3’ del error. Siempre mantiene las
distancias.
Entra UVR-D, que es una helicasa y separa los puentes de H2
del fragmento con los nicks (en total, 12-13nt que incluyen
al error). Éste fragmento se separa, no hay ningún enlace
ya que lo una. El GAP que queda, como tiene ssDNA, puede
ser sustrato de RecA. Ahora entra la DNA Polimerasa que
resistetiza el trozo que falta y la ligasa, une.
UVR-B se puede unir al DNA gracias a que detecta la
estructura extrusionada que adquiere. Tiene unos AA con
secuencias
aromáticas
laterales
que
le
permiten
intercalarse entre las bases del DNA que son erróneas. Así,
UVR-B queda intercalada dentro del DNA para separar los
enlaces de H2 (algunos) estirando, ya que dobla al DNA
formando el codo. Se puede incrustar en el DNA gracias a
que el punto donde la base se debería unir a la
complementaria no hay ningún enlace, porque es una base
errónea y UVR-B tiene sitio para unirse.
Es posible que la reparación se acople con la transcripción
si, por casualidad, la maquinaria transcripcional está
funcionando sobre una región con un error. Entonces, se
para la maquinaria transcripcional (no salta aún) y se
recluta a TRFC (Transcription-Repair Compling Factor), una
proteína. TRFC se une a la RNA Polimerasa, y hidrolizando
ATP, la hace saltar ahora, junto al RNA. Entonces, TRFC
recluta a ααβ, que comienza el NER. Junto a los dos
monómeros de UVR-A, también salta TRFC (en Eucariotas, hay
el TCR-NER ó TCNER, pero es un tipo de respuesta en la que
participan diversos enzimas, no se trata de una única
proteína como en Procariotas).
3A)
Missmatch
Repair.
Se
permite
que
termine
la
replicación, función vital de la célula, antes de reparar.
Actúa después de replicar. Ver Tema 10.
3B) Reparación por Recombinación Homóloga. Se permite que
termine la replicación, función vital de la célula, antes
de reparar. Actúa después de replicar. En principio no
repara por si mismo ni las bases dañadas ni los dímeros de
pirimidinas, pero si después actúa la fotoliasa o el NER,
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 79
sí. El sentido es que si se para la replicación, la célula
muere (y por eso se permite que termine).
Supongamos que hay un daño en el DNA, el cual aparece justo
antes de que la DNA Polimerasa copie el DNA. Entonces,
cuando el replisoma llega, la DNA Polimerasa III “salta” y
sigue más adelante. El resultado:
La cadena de nueva síntesis complementaria a la cadena
original con el daño, tiene un GAP (=una hija tiene un gap
en la zona complementaria al daño) porque la polimerasa III
ha saltado. Éste GAP con ssDNA podría ser sustrato de RecA
para procesos que no interesan.
Se arregla por recombinación: la cadena de abajo que sería
complementaria a la mutada de arriba, es arrastrado hasta
arriba,
y
se
hibrida
con
las
bases
que
le
son
complementarias (únicamente no son complementarias por el
error).
Originalmente, la donadora del trozo de DNA y la que tiene
el daño eran las dos cadenas del DNA de la célula madre.
Ahora la ligasa los une. Para el GAP que queda en el DNA
donador, rápidamente la DNA polimerasa III resistetiza lo
que falta (sinó, sería sustrato de RecA). La ligasa lo une.
3C) Reparación Sobre Lesión (SOS). Se permite que termine
la replicación, función vital de la célula, antes de
reparar. Actúa después de replicar. En principio no repara
por si mismo ni las bases dañadas ni los dímeros de
pirimidinas, pero si después actúa la fotoliasa o el NER,
sí. El sentido es que si se para la replicación, la célula
muere (y por eso se permite que termine).
La respuesta SOS es una respuesta masiva, se expresan
muchos genes a la vez, y en mucha cantidad. Los genes de la
reparación sobre el cromosoma de E.Coli son los genes SOS:
UVR (para hacer el NER), UMU-D y C, LexA, RecA, y muchos
otros.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 80
- RecA:
es
imprescincible
para
recombinar
en
Procariotas. Aquí no recombina, sino que aparece
porque tiene mucha afinidad por el ssDNA. Puede
considerarse, en éste contexto, producto de un gen
SOS.
- LexA: Represor constitutivo de los genes de la
respuesta SOS, está unida a la caja SOS del operador
de todos los promotores de los genes SOS. Es un
producto de los genes SOS.
- Genes SOS: reparan el DNA. UVR, UMU, RecA, LexA… Todos
están bajo el control de un promotor con caja SOS,
diana de LexA.
Basalmente, LexA está expresada. Se une a las cajas SOS del
operador de los promotores de los genes SOS (inlcuyendo su
propio promotor, regula su propia síntesis).
Como hemos visto en Reparación por recombinación, la DNA
polimerasa III salta cuando se topa con daños en el DNA y
sigue sintetizando un poco más adelante. Así, hay un
instante en el que hay ssDNA sin protección. Es éste ssDNA
el estímulo que activa a RecA, la cual se une al ssDNA.
Entonces RecA pasa a estar activada por contacto con el
ssDNA. Estando activa, se mueve por el DNA del cromosoma
buscando a LexA, la cual está unida a muchos sitios a la
vez. Cuando RecA toca a LexA, se activa la actividad
autoproteolítica de LexA, la cual se degrada a si misma, a
LexA que bloqueaba a los promotores y a toda la nueva LexA
que se pueda producir (estaba bloqueando a su propio
promotor). Es un feedback positivorespuesta masiva.
Uno de los productos de los genes SOS son las DNA
Polimerasas IV y V. La más conocida es la DNA Polimerasa V.
Tiene subunidades codificadas por los genes UMU-D y C, los
cuales pueden transcribirse cuando LexA se autodegrada.
UMU-C basalmente es activa. UMU-D basalmente no. Necesita
procesamiento post-traduccional por RecA. Poco claro. Se
convierte en UMU-D2’. Finalmente, UMU-D2’ + UMU-C = DNA
Polimerasa V.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 81
Las Polimerasas IV y V son un tipo de polimerasas llamadas
polimerasas translesión (= TLS = Polimerasas Y).
Así, cuando el replisoma llega a la región con el error,
salta el core y el complejo cargador γ, todo excepto la
Sliding clamp (anillo ββ). Se carga el core de la DNA
Poliemrasa V al anillo ββ, polimeriza en 5’3’ poniendo nt
al azar sobre la región con el daño y su región
circundante. Además es poco procesiva por lo cual se separa
rápido y vuelve el core de la DNA Polimerasa III, que sigue
con la síntesis normalmente.
La ventaja de éste sistema es que salva la vida de la
célula y la replicación, lo cual es el primer objetivo.
Existen
pocos
mecanismos
para
reparar
apareaminetos
erróneos frente a los que hay para reparar daños. Eso
indica que la célula se permite cierta plasticidad en
cuanto a cambios de nt, para ir variando a lo largo del
tiempo. Lo que no se tolera es dañar esas bases, por eso
hay varios mecanismos para arreglarlas.
Para reparar los dímeros de pirimidinas en el DNA, se
puede:
1) Fotoliasa, antes de replicar.
2) NER. Antes de Replicar.
3) Reparación por Recombinación: no repara por si misma
pero permite que siga la síntesis. Si después se da
fotoliasa o NER, sí que repara. Después de la
replicación.
4) Síntesis sobre lesiónSOS: no repara por si misma
pero permite que siga la síntesis. Si después se da
fotoliasa o NER, sí que repara. Después de la
replicación.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 82
TEMA 12: REPARACIÓN DE LAS MUTACIONES EN
EUCARIOTAS.
En humanos, el mecanismo más importante es, con diferencia,
el NER. Las enfermedades genéticas asociadas a mutaciones
en NER son autosómicas recesivas y los pacientes presentan
gran sensibilidad a la luz UVA. Son las siguientes:
- XP: Xenoderma Pigmentosum. Elevada predisposición al
cáncer de piel, la cual está alterada. El 25% sufre
neurodegeneración. No hay UDS.
- CS: Síndrome de Cockayne. No tienen predisposición al
cáncer, piel alterada. Todos tienen neurodegeneración.
Reparan con UDS, pero sin preferencia de zona.
- TTD: TricoTrioDistrofia. No hay predisposición al
cáncer. Fragilidad en piel y pelo. Descamaciones
abundantes. Retraso en el desarrollo físico y mental.
Baja fertilidad. No hay UDS.
Genéticamente,
los
fibroblastos
de
éstos
pacientes
presentan patologías moleculares en la Sintesis de DNA no
Programada (UDS, Unscheduled DNA Synthesis). El UDS
consiste en que el DNA no sólo se sintetiza durante la fase
S del ciclo celular, sinó también antes y después. Es en
éstos momentos que no corresponden a la fase S cuando se
repara el DNA y hay síntesis de nuevo material genético (la
UDS).
Ello se estudió haciendo la Prueba de Complementación (ver
Genética General) hibridando dos células y observando el
fenotipo. Hay que considerar que los enzimas reparadores
son como los enzimas de una vía metabólica, donde si falla
un intermediario, o uno de los iniciales, no hay producto
final:
- Al
hibridar
2
células
mutantes
del
mismo
genmutanteno complementa.
- Al
hibridar
2
células
mutantes
de
diferentes
genesnormalcomplementan. Lo que no tiene uno, lo
produce el otro.
Célula A (paciente A)+Célula B (paciente B)Fusión por
aglutinación. Resultado: Monocarionte (no han fusionado,
porque las cosas no siempre son perfectas), Dicariontes
(heterocariontes si son A+B complementados ó homocariontes
si son A+A o B+B, no complementados). Los genotipos de las
células iniciales se saben porque se han marcado las
células con bolas de látex “pequeñas” en A y “grandes” en
B. Se ven al M.O.
Así, se llegaron a establecer los detalles
Eucariota. El NER Eucariota tiene 2 modalidades:
Genética Molecular.
Carlos F.R.
del
NER
Página 83
-NER-GGR: NER con reparación Global del Genoma.
-NER-TCR: NER con reparación acoplada a Transcripción.
NER nunca arregla apareamientos erróneos, solo lesiones.
Ambas tienen vías de entrada diferente pero el resultado es
el mismo. Ambas se encuentran operativas en individuos
sanos.
NER-GGR: Global Genome reparation. Partimos de dsDNA
genómico con una base dañada. Se pone “XP-algo” porque se
encontraron en pacientes de XP.
- XPC: Reconoce y se une al punto de la lesión, junto a
R-23. Marca la cadena con la mutación.
- XPE: Ayuda a XPC.
Juntas, XPC+XPE forman un heterodímero que recluta al
reparasoma, formado por:
- XPA: marca la cadena con lesión, para los enzimas de
después.
- XPB y XPD: Son helicasas que forman parte de TF2H. Hay
un heterodímero de XPB+XPD por cada horquilla (TF2H
forma parte, también, del reparasoma).
- RPA: equivale a la SSBP Procariota, protege al ssDNA.
- XPG: Endonuclesa que corta en una cadena, a 3’ de la
lesión, haciendo 1 nick.
- XPF: Endonuclesa que corta en una cadena, a 5’ de la
lesión, haciendo 1 nick. Actúa unida a ERCC1.
El reparasoma es un agregado proteico, formado por éstos
enzimas y alguno más. El ssDNA con la lesión cortado es más
largo que el de los Procariotas (12-13 nt). La lesión no
está centrada, suele quedar hacia el 3’ del trozo cortado.
El Gap que queda implica que la DNA Polimerasa δ-ξ tiene
que sintetizar DNA allí, y la ligasa lo une.
NER-TCR: Transcription Coupled Reparation. Acoplado a la
transcripción, cuando la RNA Polimerasa toca la lesión, se
para. Entonces se unen las siguienes proteinas (se pone CS
porque se encontraron en pacientes de CS):
- CSA+CSB: Heterodímero que se une a la RNA Polimerasa
ya parada, y la “retiran”*.
Ellas reclutan al reparasoma, que como antes, tiene:
- XPA: marca la cadena con lesión, para los enzimas de
después.
- XPB y XPD: Son helicasas que forman parte de TF2H. Hay
un heterodímero de XPB+XPD por cada horquilla (TF2H
forma parte, también, del reparasoma).
- RPA: equivale a la SSBP Procariota, protege al ssDNA.
- XPG: Endonuclesa que corta en una cadena, a 3’ de la
lesión, haciendo 1 nick.
- XPF: Endonuclesa que corta en una cadena, a 5’ de la
lesión, haciendo 1 nick. Actúa unida a ERCC1.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 84
* No se sabe si realmente, la RNA Polimerasa se aparta
momentáneamente por acción de CSA-CSB o si se separa del
complejo y se desmontan todos los factores y el tránscrito.
Se cree que se aparta momentáneamente ya que los Eucariotas
producen un pre-mRNA muy largo, y si justamente hay un
error antes del final de la transcripción, el tener que
desmontarlo todo y empezar de nuevo es muy costoso.
Interesa no perder el tránscrito, así que por eso se cree
que se aparta momentáneamente.
Relación entre mutación y sintomatología.
Las mutaciones en las proteínas implicadas pueden estar en
dominios catalíticos de acción ó en dominios de interacción
con otras proteínas.
Son vitales siempre XPB y XPD: las helicasas. Forman parte
de TF2H, el cual está en el reparasoma. Están en los dos
tipos de NER: GGR (entran por XPC+XPE) y TCR (entran por
CSA+CSB).
- En pacientes de XP, se afecta la via NER-GGR. Hay una
mutación en XPB y en XPD en el dominio de unión a
XPC+XPEno entra el reparasomano UDS.
- En pacientes de CS, se afecta la via NER-TCR. La
mutación está preferentemente en CSA+CSB (en el
dominio de unión a XPB y XPD), pero también puede
estar en XPB y XPD en el dominio de unión a CSA+CSB.
Se da el GGR porque el XPB y XPD pueden unirse a
XPC+XPE, pero no a CSA+CSB, por lo tanto, no hay
preferencia de zona.
- En pacientes de TTD, se afecta al dominio de unión de
XPB y XPD con XPC+XPE, pero sólo cuando XPB y XPD
están en el transcriptoma (TF2H + RNA Polimerasa + XPB
y XPD). Hay poca transcripción, pero la hay, no es
absoluto. No GGR porque no entra reparasomano UDS.
Sintesis sobre lesión en Eucriotas.
Actúa en caso de que se encuentren dímeros de pirimidinas
en el genoma. En Procariotas, actuaban la DNA Polimerasa IV
y V. En Eucariotas, actúan las DNA Polimerasas η, ι, ζ.
Todas ellas son polimerasas translesión (TLS) ó polimerasas
Y. Polimerizan en 5’3’, ponen nt aleatoriamente sobre
dímeros de pirimidinas, por lo que cometen muchos errores.
No tienen proofreading, y por lo tanto su tasa de error es
alta. Además son poco procesivas (factor de infidelidad).
Se estudió mediante el mutante XPV, que tenía la DNA
Polimerasa η no funcional. En su lugar, se observó que la
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 85
célula utilizaba en lugar de la DNA Polimerasa δ-ξ a las
subunidades ι y ζ, con las características ya citadas.
Las Polimerasas Translesión también están relacionadas
estrechamente con en fenómeno de hipermutación somática
(ver Tema 20). Éste fenómeno sucede en los linfocitos B.
Primero, realizan recombinaciones somáticas para reordenar
sus genes y después, mitosis para “clonarse”. Pero sus
células hijas tienen variedad elevada, no son como las
parentales, debido a que, entre otras cosas, cuando hay
errores en la mitosis, se suelen usar las DNA Polimerasas
translesión µ y ι para reparar y replicar el DNA, junto con
la DNA Polimerasa δ-ξ.
Sistema NHEJ.
Non-Homologous End Joining. Es un mecanismo de reparación
del
DNA
Eucariota
(exclusivo)
de
muy
reciente
descubrimiento.
Si se rompe el DNA genómico generando extremos romos,
pueden suceder translocaciones, etc. No interesa. Por ello,
cuando aparecen los extremos romos se activan KU70 y KU80.
Se unen formando un heterodímero. Un heterodímero se une a
un extremo. Otro heterodímero, se une al otro extremo.
Tienen mucha afinidad el uno por el otro, y acercan los
extremos. Cuando están muy juntos, se activa la DNA-PK
(kinasa), que fosforila a ARTEMIS. Cuando ARTEMIS se ha
activado por fosforilacion, es una endonucleasa. No se sabe
qué hace. También aparece XRCC4, cuya función no está muy
clara, pero está relacionada con la ligasa.
Si en lugar de extremos romos se generan
protuberantes, las Polimerasas translesión los
pasándolos a romos, añadiento nt al azar.
extremos
arreglan
Actualmente se intenta relacionar NHEJ con la replicación,
y con la recombinación.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 86
TEMA 13: RECOMBINACIÓN GENERAL:
INTRODUCCIÓN.
Éste tema es introductorio y conceptual. Se explica cómo se
resuelve la cruz de Holliday, un intermediario presente en
todo proceso de Recombinación Homóloga Procariota.
Recombinar es reordenar genes ó marcadores génicos siempre
como consecuencia de un intercambio físico. Funcionalmente,
consiste en cortar un trozo de DNA y unirlo en un lugar
diferente al original. La Recombinación puede ser Natural
(Homóloga, de Sitio Específico, Transposición) ó Artificial
(la que provoca la Ingeniería Genética, con enzimas de
restricción). La Artificial actúa sobre la Natural.
Tipos de Recombinación (Natural):
1. Recombinación Homóloga: Es lo visto en Genética
General, actúa sobre regiones grandes del genoma (de más
de 100pb) que han de ser homólogas (casi iguales en cuanto
a composición de nt, pero iguales estrictamente en cuanto
a la región que ocupan del
genoma) en los dos DNA.
La Recombinación Homóloga origina la Recombinación General
(se considera sinónimo de Recombinación Homóloga, implica
apareamiento
y
entrecruzamiento
en
los
cromosomas
homólogos, con cambio o no de orden en los alelos) ó
Recombinación
Ilegítima
(=“Recombinación
no-homóloga”,
sucede por error, dos regiones no homólogas o con muy poca
homología recombinan entre sí, sin cambiar el orden de los
genes). Temas 13 y 14.
2. Recombinación de Sitio Específico: Interactúan 2
DNA con una pequeña región de homología de unos 10-15 nt,
demasiado pequeña para que pueda actuar RecA. Ésta región
de 10-15 nt es igual en cuanto a composición de nt.
Lo hacen Integrasas, Resolvasas (resuelve intermediarios de
la fusión) ó Invertasas. Ver Tema 15.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 87
3. Transposición: Se escinde un dsDNA de un sitio
donador, se mueve por el citoplasma libremente y se integra
en un sitio receptor, totalmente al azar. No requiere
ningún tipo de homología. Sólo se da en momentos concretos
de la vida de la célula, y se da en múltiples organismos.
Implica la actividad de la Transposasa. Hay muchos tipos,
se estudia en los Temas 16 a 19. Un ejemplo:
Otra Clasificación:
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 88
La Recombinación Homóloga. En Procariotas, se resuelve
mediante la cruz de Holliday, siguiendo el “modelo de
Holliday” (1960). Se ha demostrado que la recombinación
homóloga Procariota no es estrictamente así, pero se
explica por ser didáctico y sirve para entender el que se
cree que es el verdadero modelo (el de Meselson-Radding,
Tema 14). Eso si, TODOS los modelos comparten que hay un
intermediario común, llamado la cruz de Holliday.
Son, por ejemplo, un dsDNA lineal
que
he
introducido
para
transformar y otro dsDNA lineal
que pueda hacer en el citosol. La
polaridad
de
las
cadenas
no
hermanas ha de ser la misma. Es
AB/ab. Necesitan una región de
100pb de homología MÍNIMO.
Una endonucleasa hace 1 nick en 1 cadena de
cada una de las cromátidas no hermanas.
Suponemos entre A y B.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 89
Una ligasa une una cadena cortada con la otra.
Es la invasión.
Se ha producido ENTRECRUZAMIENTO =
RECOMBINACIÓN FÍSICA. Éste es el 1er
Intermediario. Es la juntura de
Holliday. La zona con la cruz es el
Branchpoint ó punto de ramificación.
Siempre,
los
intermediarios
requieren una resolución.
Migración del Branchpoint.
Al moverse el branchpoint por acción
de una helicasa, la cadena de abajo
sube hacia arriba y la de arriba
baja hacia abajo. Se aparean con la
otra porque eran homólogas. Es el 2º
intermediario.
Ésto es un DNA heterodúplex: regiones de un dsDNA donde
cada una de las dos cadenas viene de un origen distinto.
El 2º intermediario se estira:
Un enzima gira
la
parte
de
abajo 180º sobre
sí misma.
Esto es la cruz
de Holliday.
Se puede resolver de dos maneras diferentes, cada una de
las cuales tiene 1/2 de probabilidades de suceder (al
azar):
- Corte Este-Oeste: Una endonucleasa corta a la cruz de
Holliday de derecha a izquierda, por el centro. Genera
2 dsDNA heterodúplex en los cuales no ha habido
reordenación de alelos: es un recombinante físico (por
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 90
el entrecruzamiento)pero no un recombinante génico. Es
como los dsDNA parentales, los mismos alelos.
- Corte Norte-Sur: Una endonucleasa corta de arriba
hacia abajo por el centro de la cruz de Holliday.
Genera 2 dsDNA heterodúplex que tienen cada uno un
alelo que antes no tenía. Son recombinantes físicos
(por el entrecruzamiento) y recombinantes génicos (por
los nuevos alelos).
Dos DNA homólogos son aquellos que comparten la misma
región física del genoma de 100nt o más, aunque no tienen
el 100% de sus bases iguales (de hecho nunca lo tienen).
El entrecruzamiento ó recombinación física consiste en que
diferentes cadenas de ssDNA se juntan y forman el
heterodúplex, no se aparean perfectamente porque la que
“sube” del cromosoma de abajo al de arriba (por ejemplo),
puede tener alelos diferentes (con bases diferentes). Éste
problema se solventa con la conversión génica. Se detecta
mediante los recombinantes genéticos (1/2 veces), usando
genes marcadores.
Consideremos ahora 3 genes. También se resuelve por la cruz
de Holliday. Seguimos en Procariotas.
Igual que antes, considero
lineales
bajo
las
mismas
ABC/abc.
Nick en
cadena.
una
cadena
entre
A
y
B.
Invasión
dos dsDNA
premisas.
de
Primer Intermediario. Branchpoint.
Migración del Branchpoint.
Segundo Intermediario. Heterodúplex.
Nueva distribución de B.
Se gira lo de abajo 180º.
Cruz de Holliday.
Tiene 2 resoluciones, N-S ó E-O. Cada
una tiene 1/2 de probabilidades.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 91
- El corte E-O forma un heterodúplex que no tiene nuevas
combinaciones de alelos, es recombinante físico a
secas. Sigue siendo ABC/abc. “Apedazado”.
- El corte N-S forma un heterodúplex que aparte de
recombinante físico, es recombinante génico porque
tiene nuevas combinaciones de alelos respecto al
parental. Es ABc/abC. “Empalmado”.
La conversión génica es consecuencia de la recombinación
física (entrecruzamiento) que forma regiones heterodúplex.
Inmediatamente se da la reparación…o no.
Consideremos el gen B en el ejemplo anterior. Evidentemente
se trata de un dsDNA.
El gen B tiene dos alelos B:
b:
Cuando llegamos al heterodúplex final, producto del corte
N-S, tenemos que:
Éste pequeño error genera problemas de apareamiento, debe
repararse (o no). Considero que:
- No repara ninguno de los dos dsDNA se queda así.
-
Repara uno de los 2 dsDNA
- Repara a los dos dsDNA, lo
más frecuente. Dependiendo
de cual de las dos bases se
repare,
tendremos
uno
u
otro alelo.
½ de que se
repare 1 de las dos cadenas
de 1 dsDNA X ½ que se
repare una de las 2 cadenas
del otro dsDNA = 1/4. Hay 4
combinaciones posibles:
¼ bb, ¼ bB, ¼ Bb, ¼ BB.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
½ de que sea
.
Puede reparar la TC
(½) y hacer alelo “b”,
o la GA (½)y hacer
alelo “B”
½ de que repare
.
Puede reparar la AG
(½) y hacer alelo “b”,
o la CT (½) y hacer
alelo “B”.
Página 92
En Eucariotas, la meiosis implica siempre entrecruzamientos
(recombinación física). Si no sale recombinante genético,
se llama heterodúplex parental. Si sale recombinante
génico, se llama heterodúplex recombinante, que puede ser
en región no codificante (poco importante a nivel de
expresión del gen) ó en región codificante: se da la
conversión génica, la cual puede reparar ninguna, una o
ambdas cadenas de dsDNA. Es decir, se calculan las
proporciones igual que antes.
Esto
se
demostró
en
Neurospora
(hongo
Eucariota,
ascomiceto, ciclo haplodiplonte, mitosis post-meiótica que
duplica las células después de hacer meiosis, era 2n antes
de hacer meiosis). No mantenía proporciones de herencia
mendeliana de un gen porque hay recombinación que puede o
no repararse.
Se demuestra partiendo de un individuo 2n
heterocigoto
para B (Bb de genotipo). Se resuelve igual que el ejemplo
con el gen B de antes. Recordar que una vez que se ha
terminado la meiosis, las células n hacen mitosis.
Volviendo a Procariotas, el modelo de la cruz de Holliday
se puede aplicar a dsDNA circular también. De nuevo, las
cadenas deben estar en la misma polaridad (se indica con +
ó -).
Resolución
con
Corte
E-O:
endonucleasa corta por fuera y
ligasa
une.
Recombinante
no
génico. Cambia orden de alelos
en 1 plasmidio.
Endonucleasa corta en lugar
específico
de
recombinación
entre A y B. Hace un Nick en
cada dsDNA. Cuando invade una
cadena el otro DNA, se forma la
Cruz
de
Holliday
(con
el
branchpoint).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Se gira la parte
de abajo. Primer
intermediario
Resolución con Corte N-S: endonucleasa talla
por dentro, ligasa une y se forma el 2º
intermediario el COINTEGRANTE.
Página 93
El Cointegrante no es el final de la resolución N-S. Tiene
secuencias diana de enzimas específicas que son reconocidas
por nucleasas. Siempre, los intermediarios requieren una
resolución.
El cointegrante se resuelve generando
circulares que son recombinantes genétivos
dos
dsDNA
La cruz de Holliday siempre aparece en Procariotas cuando
hay
recombinación
Homóloga.
Reúne
una
serie
de
características:
- Primero se sinapsan los dsDNA (se juntan mucho uno con
otro), y después se cortan.
- Se hace un corte en una sola cadena (Nick) en cada
dsDNA.
- Los heterodúplex que se generan son 100% recíprocos.
Supongamos que tenemos dos dsDNA
lineales homólogos que van hacen
recomb. homóloga. Los dos brazos
cortos de la cruz y los dos
brazos largos de la cruz tienen
la misma longitud, y si sumamos
la longitud en pb de un brazo
corto
y
un
brazo
largo,
obtenemos la longitud de la
molécula
original
de
dsDNA:
porque son RECÍPROCOS (todo lo
que lo que le falta a uno de los
dos dsDNA, lo tiene el otro).
Los Eucariotas también hacen Recombinación Homóloga y
generan DNA heterodúplex, pero no es válido el modelo de la
cruz de Holliday porque los Eucariotas…
- Primero cortan y después sinapsan los homólogos.
- El corte que hacen es un corte de doble cadena, se
corta un dsDNA.
- No tienen porqué hacer un heterodúplex 100% recíproco.
Los Eucariotas siguen el modelo de Szöstack (=DSB), no de
Holliday.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 94
TEMA 14: RECOMBINACIÓN GENERAL: MECANISMO
ENZIMÁTICO.
La recombinación General sucede, realmente (o eso creemos),
por el modelo de Meselson-Radding en el que se resuelve la
cruz de Holliday. En Procariotas, la Recombinación General
(la principal consecuencia de la Recombinación Homóloga)
tiene 3 grandes etapas en las cuales se resuelve la cruz de
Holliday:
1. Iniciación: Se rompe el dsDNA y se generan extremos de
ssDNA. Lo hace RecBCD.
2. Invasión: Se cambia de cadena, la cadena de ssDNA va a
aparearse con la complementaria de la otra molécula de DNA.
Lo hace RecA.
3. Desplazamiento y Resolución: Migra el branchpoint, gira
180º y se corta. Lo hace RuvABC.
1. Iniciación. Lo inicia todo RecBCD. Es un heterotrímero
formado por:
- B: helicasa lenta basal en 3’5’, endonucleasa 3’5’
basal y endonucleasa 5’3’ críptica.
- C: Función poco clara. ¿Reconoce secuencia χ?
- D: ATP’asa dependiente de ssDNA, helicasa rápida en
5’3’ críptica.
Se comienza uniendo RecBCD a 1 de los extremos romos de uno
de los 2 dsDNA. Se situa, según el dibujo, en la cadena de
arriba. La orientación de la molécula sigue el consenso.
Actúa RecB como helicasa lenta en 3’5’, sobre la cadena
de arriba, separándola de la de abajo. Mientras, va
haciendo de endonucleasa 3’5’ dejando trozos de ssDNA que
se van. También se va usando la endonucleasa para la cadena
de abajo, pero muy poco. Va avanzando hasta que RecC
detecta la secuencia χ en la cadena de arriba.
La secuencia χ sólo es la cadena de arriba, y se lee en
3’5’. Es un hot-spot de recombinación. Una vez leída la
secuencia χ, se inactiva la helicasa lenta 3’5’ de RecB y
cambia su nucleasa 3’5’ por la nucleasa 5’3’ críptica.
Se activa la helicasa 5’3’
empieza a hacer cosas ahora.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
rápida
de
RecD,
la
cual
Página 95
Ahora se degrada la cadena de abajo porque las actividades
enzimáticas así lo permiten. El extremo de ssDNA con χ en
el extremo no se degrada, porque se ha bloqueado esa
actividad enzimática 3’5’.
Se degrada un trocito más de la de abajo, para definir bien
el fragmento de ssDNA protuberante con χ en el extremo.
RecBCD no se separa aún.
Ahora, se unen las SSBP y RecA al ssDNA. Se unen por todo.
En principio, la afinidad de SSBP por el ssDNA es algo
mayor que la afinidad de RecA por el ssDNA. Se soluciona
gracias a que cuando RecA se une al ssDNA y toca a RecBCD,
su afinidad por el ssDNA se vuelve mucho mayor, y empieza a
cargarse sobre el ssDNA en 5’3’ desplazando a las SSBP.
Sólo se carga RecA sobre el fragmento de ssDNA con χ en el
extremo, porque es en esa cadena a la que se había unido
RecBCD.
Según éstos dibujos, el extremo con ssDNA y la secuencia χ
envuelto en RecA sería el que presenta el 3’ invasor. Esto
no tiene porque ser así siempre, RecA se unirá siempre al
que aporte el ssDNA, tenga el 3’ o el 5’ libre.
Los sustitutos de RecBCD en caso de que éste falle son:
- RecJ (para la nucleasa) y RecQ (para la helicasa
3’5’ lenta) sustituyen a RecB.
- RecC no tiene sustituto, los mutantes RecC- tienen
menos capacidad de reconocer a χ.
- RecQ también tiene helicasa 5’3’ rápida, que
sustituye la de RecD.
2. Invasión. RecA cataliza el intercambio de pareja.
Se descubrió mezclando, en una proveta, RecA + ATP + SSBP +
(ssDNA circular + dsDNA linealmodelo de las 3 cadenas) ó
(dsDNA circular con Gap + dsDNA lineal modelo de las 4
cadenas) ó (dsDNA circular + ssDNA lineald-loop). SON
MODELOS QUE SE HAN DEDUCIDO IN-VITRO.
- Modelo de las 3 cadenas: RecA (bolitas) se carga sobre
el ssDNA acceptor polimerizando en dirección 5’3’.
Es la única cosa que se mueve. La tracción que genera
hace que la molécula de ssDNA gire en 5’3’ como
indica la flecha curvada, y mientras gira, se va
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 96
uniendo a la cadena de DNA complementaria que aporta
el 3’ libre: la invasora. Ésta se mueve en 3’5’.
Finalmente queda dsDNA con un Nick (no había ligasa) y
ssDNA.
- Modelo de las 4 cadenas: RecA se une a la zona de
ssDNA que hay en el Gap del dsDNA. RecA polimeriza en
5’3’ sobre la aceptora haciendo tracción, por lo que
ésta gira como indica la flecha curva (en 5’3’)
mientras se va uniendo a la cadena invasora que aporta
un 3’ libre, la cual se mueve en 3’5’. Obsérvese la
cruz. Finalmente queda un dsDNA circular con un Nick
porque no había ligasa y un dsDNA lineal con Gap en
los extremos. Cada uno de los dsDNA tiene una de las
dos cadenas que pertenecía al otro, es decir, son dos
HETERODÚPLEX.
- Modelo d-loop: RecA se carga sobre el ssDNA en 5’3’
como siempre, pero en éste caso, es también el DNA
invasor (porque aportará el 3’). Así, cuando se
introduce en el dsDNA para unirse a la complementaria,
desplaza a la cadena exterior sin romperla. La cadena
de ssDNA que tenía RecA (la invasora en éste caso
Genética Molecular.
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Página 97
porque aporta un 3’) se mueve en 3’5’, desplazándose
como indica su flecha debido a la tracción de RecA,
mientras que la aceptora va girando en 5’3’ por la
tracción, como indica la flecha curva. Obsérvese la
cruz.
Finalmente se extrusiona la cadena de DNA exterior intacta,
y queda un dsDNA circular con Nick.
Los fragmentos a unir tenían en los 3 casos, regiones
homólogas de unos 50nt, o con diferencias de bases mínimas.
Si
no
las
tuvieran,
no
podrían
hibridar
por
complementariedad (porque por eso se unen).
Lo que los 3 modelos comparten es que la proteína RecA
(p.m. de 38 KDa) se une al ssDNA con mucha afinidad,
SIEMPRE. El DNA invasor ha de aportar SIEMPRE un 3’OH
libre, y “girará” en 3’5’. El receptor “girará”, por
tanto, en 5’3’ (a veces coincide que el invasor con el 3’
es de ssDNA, será él quien tiene a RecA por ser de ssDNA).
Los DNA “giran” porque RecA hace tracción, es lo único que
se mueve.
In-vivo, RecA se une al ssDNA formando un nucleofilamento =
filamento presináptico. El ssDNA al que se une puede ser un
fragmento tal cual de ssDNA, un gap en un dsDNA o un
extremo protuberante del dsDNA.
Debe haber una homología de mínimo unos
invasor que incluye el 3’ y el aceptor.
50nt
entre
el
RecA se carga sobre el ssDNA, en el centro, polimerizando
en
5’3’
de
manera
helicoidal,
para
formar
el
nucleofilamento. Cada vuelta de RecA son 6 monómeros, y
ello ocupa unas 19 bases. También se ha visto que se carga
en 3’5’, pero tan lenta que es despreciable. RecA estira
al filamento, lo pone rígido, recubriéndolo hasta el
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 98
extremo. Se ha visto también que si se trata de recubrir un
gap en un dsDNA, RecA puede pasarse un poco cuando recubre
el ssDNA y llegar a ponerse sobre el dsDNA. Por afinidad,
llega a desplazar a SSBP. Los monómeros que salen por un
extremo pueden entrar por el otro, haciendo “treadmilling”
(intercambio rotatorio).
Funcionamiento de RecA (consideremos un ssDNA de un extremo
protuberante 3’ que será invasor y un dsDNA circular que
será invadido).
- Se
forma
el
nucleofilamento
(ssDNA
+
RecA)
polimerizando RecA en 5’3’.
- El nucleofilamento captura al dsDNA en principio en
cualquier zona.
- Los dos DNA giran uno respecto al otro hasta que las
regiones homólogas quedan sinapsadas. RecA debe tener
ATP para hacer esto, aunque aún no lo hidroliza.
- RecA cataliza la desnaturalización del dsDNA (es
helicasa, aunque sigue sin hidrolizar el ATP) formando
una “burbuja” y une el nucleofilamento (el 3’ invasor)
al DNA invadido (el dsDNA circular).
- Se forma un branchpoint que va migrando debido a que
RecA hace tracción sobre las cadenas de DNA. Sigue
usando su actividaa helicasa. Al unir un DNA con el
otro de la otra molécula, forma los heterodúplex. Para
hacer los puentes de H2 entre las bases, hidroliza el
ATP. Las bases se unen porque son complementarias (han
de estar en regiones homólogas, si hay alguna base de
diferenteconversión génica).
El dominio de intercambio de las cadenas de RecA puede
formar una triple hélice (ssDNA + dsDNA) o una cuádruple
hélice (dsDNA + dsDNA), según. RecA se une físicamente a
las cadenas que han de intercambiarse, las toca. Como por
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 99
el otro lado puede tener la complementaria (puede ser un
dsDNA), puede haber triples y cuádruples hélices. Sólo
dentro de RecA, momentáneamente. No son los típicos enlaces
de Watson y Crick.
RecA aparea unos 100nt, después se va y entra RuvBCD. NO
TIENE NINGÚN SUSTITUTO, los mutantes de RecA no pueden
recombinar. Se venden mutantes RecA- para que no recombinen
de manera imprevista si se hacen otros experimentos.
3. Desplazamiento y Resolución. Lo hace RuvABC. Es un
complejo multienzimático. Actúa cuando RecA ha unido 100
nt.
- RuvA: Tetrámero que reconoce la estructura de la cruz
de Holliday y se une con un monómero en cada parte.
Tiene un pequeño centro catalítico.
- RuvB: Dímero, cada uno de sus 2 monómeros tiene 6
subunidades. Cada monómero se une a un dsDNA que
recombina. Es una helicasa dependiente de ATP. Cuando
se une a RuvA (y forma RuvAB), desnaturaliza las
cadenas de dsDNA y permite que se siga formando el
heterodúplex mediante la migración del branchpoint.
- RuvC: Es una endonucleasa de ssDNA. Se ponen dos
monómeros
en
cada
uno
de
los
dos
ssDNA
del
branchpoint. Tiene un hot-spot de corte, 5’-ATTG-3’.
Hace 2 cortes en total. También es la encargada de
hacer girar 180º la parte de debajo de la cruz de
Holliday. No se sabe si para que entre RuvC ha de
salir RuvAB. RuvC puede hacer esos 2 cortes de dos
formas diferentes, con ½ de probabilidad cada una: el
corte N-S ó el corte E-O.
Hay un sistema alternativo de Migración y Resolución,
suponiendo que RuvABC falle: RecG (unión a la cruz,
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 100
helicasa y ATP’asa, sustituye a RuvAB) y RusA (endonucleasa
de ssDNA,, sustituye a RuvC) juntas equivalen a RuvABC.
Si en un tubo de ensayo mezclamos el intermediario primario
y…
- RecG + RusA migración y resolución.
- RusA el branchpoint se corta justo donde ha salido
RecA, a 100nt. Apenas hay formación de un heterodúplex
significativo.
- RecG El branchpoint migra y cuando llega al final,
se para y vuelve hacia atrás desnaturalizando al
heterodúplex y dejándolo todo como estaba al principio
antes de recombinar. Deja los dsDNA originales
separados, sin unirse por el branchpoint porque aún no
se ha formado el enlace fosfodiéster que falta en el
punto de invasión, donde entraba RecA. No recombina de
ninguna manera pero conserva la integridad de los
dsDNA.
RESÚMEN RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA EN PROCARIOTAS,SEGÚN EL
MODELO DE MESELSON-RADDING, QUE INCLUYE LA CRUZ DE
HOLLIDAY:
En Eucariotas, ésto no es válido porque los Eucariotas:
- Primero cortan el dsDNA y luego sinapsan.
- Sólo se corta uno de los dos dsDNA.
- La reciprocidad no es obligatoria.
De éstas 3 premisas parte el modelo de Szöstack (=DSB ó
Double Strand Breaks) para explicar cómo los Eucariotas
hacen Recombinación Homóloga sin la cruz de Holliday. Se
estudió en S.cerevisiae.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 101
Modelo DSB ó de Szöstack. Poco claro. Hay que entender
las generalidades y el funcionamiento de los enzimas del
principio, las homologías…
DNA duplicado. Los extremos se
ponen iguales el uno respecto
al otro.
SPO11 es un homodímero con
actividad
endonucleasa
de
ssDNA. Corta las dos cadenas en
el mismo dsDNA. Cada subunidad
tiene una Tyr (con grupo OH),
que se une momentáneamente al
5’P. No tiene secuencia diana
específica. La recombinación es
aleatoria.
Una vez que SPO11 se une al
5’P, viene el complejo MRX
(MREII+Rad50+XRSII), se une a
SPO11 y hace que se vaya. Se
activa la endonucleasa 5’3’
de MRX y deja extremos 3’
protuberantes. Se va al acabar.
Entra DMC1+Rad51. Rad51 es la
homóloga de RecA en Eucariotas.
Se unen ambas a los ssDNA
formando
2
nucleofilamentos
(que también aportan el 3’
libre), de los cuales sólo uno
será invasor. Específicamente,
en meiosis hay DMC1+Rad51, y en
mitosis sólo Rad51.
Sucede que “baja” uno de los
dos
nucleofilamentos,
es
complementario con el que se
aparea.
A la vez, el DNA que ocupaba la región en la que ahora está
el DNA invasor, “sube” y se une al otro nucleofilamento que
no se ha movido. Es el Primer entrecruzamiento (ver ultimo
dibujo).
Ahora entra la DNA Polimerasa Eucariota δ-ξ y sintetiza
DNA, aprovechando el 3’ del nucleofilamento invasor (va
empujando mientras sintetiza al DNA con el que se topa,
para que “suba”) y a la vez, se sintetiza DNA en el 3’
libre que hay en la cadena de “arriba”, desde el 3’ del
nucleofilamento no invasor.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 102
Debido a que la DNA Polimerasa está empujando al DNA de
“abajo” para que “suba”, llega un momento que de tanto
subir, se toca con el 5’ complementario al nucleofilamento
no invasor. Entonces, éste 5’ “baja” y se une al 3’ del
extremo que se está sintetizando abajo. Se forma así el
Segundo entrecruzamiento.
Por tanto, CONCLUSIONES:
-La recombinación está
acoplada a la replic.
-Las
polimerasas
al
empujar,
hacen
migrar
los
puntos
de
entrecruzamiento.
-Se
sintetiza
DNA
a
partir del 3’ que aporta
una cadena del homólogo
y a partir del 3’ del
nucleofilam. no invasor.
-Hay un 5’ invasor sin
Rad51 y un 3’ invasor
con Rad51.
-Se forman 2 heterodúp.
“abajo” y uno “arriba”.
El heterodúp. es, por
definición,
DNA
de
cromosomas
diferentes,
no
se
forma
con
el
fragmento
sintetizado
por la polimerasa.
-NO
SON
ENTRECRUZAM.
RECÍPROCOS,
NO
TIENEN
PORQUÉ.
-La homóloga a RecA en
humanos es Rad51. DMC1
se parece pero no lo es
tanto,
además
Rad51
siempre está.
-SPO11 es endonucleasa
de ssDNA, corta los dos
ssDNA del dsDNA en la
misma
posicióndeja
extremos romos.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 103
-MRX es exonucleasa 5’3’ que deja 3’ protuberantes.
-Primero se corta, luego se sinapsan.
Proteinas (que se sepa) que intervienen: Spo11, MRX
(Mre11/Rad50/Xrs2), Rad52, Rad51, Rad54, Rad55, Rad57,
Rad59, Rdh54/Tid1, Dmc1, Red1, Hop1, Trd1/Rdh54, Sac3,
Msh4/Msh5, Endo – X1, Endo – X2...
Éste mecanismo se da en la meiosis, pero sucede algo muy
parecido en la recombinación ilegítima y en algún tipo de
reparación.
RECOMBINACIÓN-REPLICACIÓN-REPARACIÓN: CONJUNTO FUNCIONAL
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 104
TEMA 15: RECOMBINACIÓN DE SITIO ESPECÍFICO.
Suceso de recombinación independiente de RecA, consideramos
dos secuencias de nt de dsDNA. Se les llama “cajas de
homología”: son secuencias homólogas pero NO se da
recombinación homóloga (no RecA porque la secuencia es
demasiado corta, y es independiente de la replicación).
Pueden estar en el mismo dsDNA o en distintos dsDNA. Son
pequeñas secuencias de unos 10-15 nt cada una, por tener
las mismas bases: pueden recombinar. Para que recombinen,
han de superponerse una a la otra y el sentido de las
secuencias ha de ser igual. La orientación se indica con
flechas.
Cuando recombinan, un trozo de la caja de homología queda
en un dsDNA y el otro trozo se va al otro dsDNA. Así,
después de recombinar, cada caja de homología tiene
aproximadamente la mitad de bases suya original y la otra
mitad, de la otra caja. Después de recombinar siguen
estando en la misma orientación.
Si las 2 cajas de homología están sobre un mismo DNA, se
trata de recombinación intramolecular. Pueden estar:
- Misma
orientación
=
repetición
directa
al
recombinar se escinde el fragmento intermedio.
Se dobla el DNA.
Queda una caja de
Homología en cada
dsDNA.
- Orientación opuesta = repetición invertida al
recombinar se invierte el fragmento intermedio.
Quedan las dos cajas
sobre el dsDNA y en
la misma orientación.
Los enzimas que actúan son Recombinasas (recA también era
una recombinasa). Son:
- Recombinación intramolecular: Si están en repetición
invertida, actúa la Invertasa (Inv). Si están en
repetición directa, puede actuar la Escisionasa (Xis,
no corta, es estructural) o la Resolvasa (Res, si es
un intermediario que requiere resolución, sólo en los
transposones).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 105
- Recombinación intermolecular: lo cataliza la Integrasa
(Int, fusiona dos moléculas de dsDNA diferentes, cada
una de las cuales tiene una caja de homología).
Caso1: Repetición Directa: El fago λ.
Hace recombinaciones de sitio específico para integrarse y
escindirse del genoma del huésped (ver Tema 2).
Leyenda: att (attachment=sujeción)
P= phage
Son las cajas de homología.
B= bacteria
El DNA libre del fago se integra,
L= left
y el virus integrado se escinde.
R= right
Integración: Es una recombinación de sitio específico
intermolecular. Lo protagoniza la Int de λ (la codifica
él). Cuando λ hace el ciclo lisogénico, siempre se integra
en el mismo sitio del cromosoma de E.Coli: entre los
Operones Gal y Bio. La escisión permitirá el paso de
lisogenia a lisis. En ambos casos, tanto en integración
como en escisión, quien actúa es la Int. La Xis es
estructural, y a elevadas [ ] bloquea a la Int.
Composición de las secuencias:
La reacción es dirigida por el fago, así que la secuencia
attP del fago es la más larga siempre (porque ella lo
dirige). Las cajas de homología son el “core O”, de 15pb
siempre, han de ser iguales en virus y bacteria para que se
integre y encontrarse en repetición directa.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 106
La Int cataliza la integración, la codifica λ. También es
necesaria la proteína IHF (integration Host Factor) que
viene de E.Coli, la cual dobla el DNA y permite que entren
las otras.
La Int de λ es muy parecida a las Res de los transposones,
que también hace Recombinación de Sitio Específico, pero
éstas
últimas
actúan
resolviendo
intermediarios
de
transposición. Características diferenciales de la Int:
- El AA activo es una Tyr.
- Se requieren 4 Int que hacen 4 cortes secuenciales (2
cortes que cruzan dos cadenas, otros 2 cortes para las
otras dos cadenas).
- Dejan un 5’OH y un 3’P que se une al -OH de la Tyr.
La formación del “Intasoma” es el proceso en el que se
organizan en el espacio alineándose en repetición directa
las dianas attP y attB juntamente con 4 moléculas de Int y
una de IHF, para recombinar e integrarse:
- Primero se forma el core proteico con 4 Int + 1 IHF.
- El core proteico se une a attP enrollándolo.
- Éste complejo se une a attB.
El sitio attP tiene (no se indicaba arriba):
Detalle del proceso molecular de integración:
- Se unen 2 Int al attP y 2 Int al attB.
- Corta, en el dsDNA de attP, dejando un Nick en la
cadena de arriba. A la vez, corta en el dsDNA de attB
dejando un Nick en la cadena de abajo. Son los cortes
secuenciales. Ha hecho 2.
- Los extremos que deja son 3’P y 5’OH. Su AA activo,
una Tyr, se une por su grupo OH al 3’P.
- Así se mueve del 3’P de “arriba” al 5’OH de abajo
formando un entrecruzamiento. Lo mismo para el otro
extremo libre que vendrá de “abajo” a “arriba”. No
depende de ATP.
- Ahora, hace lo mismo con las otras dos cadenas que aún
no había cortado.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 107
En el proceso se llega a formar una verdadera cruz de
Holliday. Son reversibles.
Escisión: Se trata de otra recombinación de sitio
específico, pero es intramolecular. Requiere la Int
(siempre corta) y la Xis (estructural). IHF podría unirse a
alguna diana del att correspondiente, pero NUNCA interviene
en la reacción. Requiere que el dsDNA de E.Coli que tenía
las secuencias en repetición directa se doble (ver esquema
página siguiente).
Sentido: Si Xis no estuviera, sería un bucle constante de
integración escición, no fucionaría nada. Xis lo regula.
IHF puede unirse a una caja durante la escisión, pero nunca
actúa, gracias a que la Xis lo impide.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 108
ESCISIÓN.
Entran Int y Xis. Puede entrar
IHF pero NUNCA actuar.
Integración
Entran Int e IHF. La Xis inhibe
a la Int
Caso2: Repetición Invertida: Salmonella.
La Salmonella tiene flagelina en el flagelo, una proteína
muy antigénica que desencadena una respuesta inmune
intensa. Pero si alguna sobrevive a eso, se multiplica y su
flagelina ya no es reconocida por los mismos anticuerpos
originales. Sucede porque pueden codificarla diferentes
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 109
genes. Puede venir del gen H1 ó H2. Sólo hace falta uno de
los dos para que haya flagelina.
En principio, se expresan los dos Promotores a la vez. Hay
H1, H2 y H1R. Pero ésta situación acaba inmediatamente,
porque H1R es represor del Promotor de H1. Así no hay H1,
hay H2.
Si queremos la H1, tenemos que transcribir el gen HIN
(activación¿estrés? ). HIN codifica para una recombinasa
llamada Invertasa (Inv).
Inv reconoce a las secuencias HIX-L y HIX-R, que están en
repetición invertida. Las pone cara a cara, haciendo que en
el DNA se forme una protuberancia.
Cuando se han dado la vuelta por la inversión, el Promotor
de H2 queda mirando hacia fuera y no se puede transcribir
ni H2 ni el represor H1R.
Así, sin el represor y gracias a la Inv, se puede expresar
la “nueva” flagelina H1. Se trata de una Recombinación de
Sitio
Específico
Intramolecular
con
secuencias
de
repetición Invertida.
El gen de la Inv también se da la vuelta porque queda entre
las secuencias invertidas (no se ve en el dibujo con fondo
negro) pero no le afecta.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 110
TEMA 16: TRANSPOSICIÓN PROCARIOTA.
Un Transposón (=Tn) es un fragmento de material genético
que se mueve en el citoplasma de la célula, sin ningún tipo
de restricción. Se encontraron en maíz. Pueden moverse
gracias a la Transposasa (Tnp=Tra). Los transposones de
Procariotas consideramos que todos son de DNA. Los
transposones Eucariotas pueden ser de DNA ó de RNA (ver
Temas 17 y 19).
Una de las cosas más importantes en los transposones son
las secuencias de bases de los extremos. Si hay mutaciones
en ellas, no pueden transponerse y son defectivos. La
mayoría lo son, pero consideremos que no, que funcionan
bien porque tienen bien las secuencias de los extremos.
En Procariotas
(todos DNA)
Elemento IS
(exclusivo)
Elemento IS estricto
-Sólo
-En transposones Compuestos
Módulo IS. Nunca solo, siempre en los Complejos.
Transposones
Compuestos
-Tn5
-Tn10
Complejos Tn3
Los elementos IS. Sólo en Procariotas.
- Elemento IS estricto: Es lo más simple que transpone.
Tiene lo esencial para ello: el gen de la transposasa
flanqueado por 2 secuencias Invertidas y Repetidas
(IRS = IR = ITR).
Se
puede
encontrar
sólo
(raro,
flanqueado
por
secuencias DR en repetición directa que no se pintan
aquí) o formando parte de los extremos de un
transposón compuesto (por un lado tendrá la DR y por
el otro, la secuencia del Compuesto).
- Módulo IS: No tiene vida propia, nunca está sólo,
siempre forma parte de los transposones complejos.
Simplemente es un elemento IS con más cosas aparte de
la Transposasa, con sus secuencias IR (IRS = ITR) que,
a su vez, tienen en sus extremos más exteriores
secuencias en repetición directa (DR = DRS) SIEMPRE.
Éstas DR son las secuencias del huésped (escojida “al
azar”) que se han duplicado, dentro de las cuales se
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 111
inserta el transposón. Se transpone (=mueve) de manera
diferente al IS estricto.
Si encontramos
genético.
ésto
en
un
genoma,
es
un
fósil
El gen de la Tnp codifica para la Transposasa, una
endonucleasa. Es un heterodímero formado por una subunidad
de unión al DNA y una subunidad catalítica que corta
(¡tanto en Procariotas como en Eucariotas!). Corta a ambos
lados del transposón (entre la IRS y la DR) y lo hace
“saltar” del lugar donde está. Le ha dejado extremos romos.
Después, corta al azar una secuencia en el genoma del
huésped, dejando unos extremos protuberantes. Dentro se
pone el transposón, unido únicamente por los “enlaces
fosfodiéster” (se basan en ataques nucleofílicos)a esos
extremos protuberantes del genoma. Así quedan “gaps” a
ambos lados del transposón con ssDNA.
Viene la DNA polimerasa Procariota y los rellena los dos en
5’3’. Con ello, se duplica la diana del huésped.
Así se forman las secuencias en repetición directa que
flanquean a todos los transposones. Ésto corresponde a la
transposición no-replicativa, una de las 3 maneras que
tienen los transposones de transponer. La diana se duplica
siempre, se mueva como se mueva.
La Transposasa viene codificada por el propio transposón.
Hay varios tipos de elementos IS, y cada tipo de IS
codifica para una transposasa, la cual reconoce secuencias
en el huésped de una determinada longitud pero de
composición de nt aleatoria (se dice por ello que corta al
azar en cuanto a secuencia, pero en cuanto a longitud, cada
tipo de transposasa corta secuencias de una longitud
deterinada).
La frecuencia de transposición es de 10-3 – 10-4 divisiones.
Se cree que cada IS puede tener hasta 10 copias por célula.
Ya que se insertan al azar, 10-5 – 10-7 causa mutación
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 112
porque cae dentro de un gen o una región reguladora. La
transposición está controlada por el propio transposón, ya
que si transpone y cae donde no toca, mata al huésped el
transposón se comporta como un parásito.
Transposones Compuestos. Estudiaremos a Tn5 y Tn10. Son
regiones grandes de DNA que se mueven como un solo
bloque(si hubiera 1 mutación en 1 IRS del IS, se movería
sólo el otro IS). Siempre tiene 2 elementos IS que
flanquean un gen de, por ejemplo, resistencia a un
antibiótico.
La orientación de los promotores de la transposasa en el IS
puede ser igual en los 2 o diferente (se dice que estan en
repetición directa o invertida uno respecto al otro según
esté el promotor de la transposasa). Puede haber uno de los
dos IS que no codifique para una transposasa funcional, ya
que si basta una sola transposasa, es redundante que haya
los dos IS haciendo transposasa. De hecho, lo más frecuente
es que un IS haga transposasa y el otro haga una
transposasa no funcional o no haga transposasa (hay algún
transposón compuesto que tiene sus dos IS que hacen
tranposasa funcional: Tn9).
Siempre tienen la DR del huésped flanqueándolos, porque se
mueven por transposición no replicativa.
Transposones Complejos. Son la familia de
ejemplo, Tn3. Su principal diferencia es
secuencia IR (=ITR) en los extremos en lugar
IS. La transposasa la codifican en la región
a otras cosas. Estructura de Tn3:
los TnA, por
que tienen la
de un elemento
central, junto
Regulación de la transposición. El transposón se comporta
como un parásito intracelular, que si mata al huésped,
muere él también. La transposición es una herramienta de
mutagénesis elevada, ya que puede ir a parar a secuencias
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 113
reguladoras o codificantes. Por ello puede silenciar genes,
recombinar, hacer deleciones… A pesar de ello, están
seleccionados a favor porque incrementan la variabilidad, y
han ido evolucionando disminuyendo el número de copias y la
tasa de transposición.
- Tn5. Es un transposón compuesto.
IS50-L es no funcional porque tiene 1nt diferente en
el gen de la transposasa. Éste único nt de diferencia
causa un codón STOP prematuro de su transposasa. Pero
también, ese nt determina que se forme el promotor del
gen de resistencia al antibiótico (kanamicina ó
neomicina). Si no hubiera esa mutación, no habría
resistencia a antibiótico y se formarían dos mRNA
complementarios (por venir de promotores en dirección
opuesta) que hibridarían y formarían un dsRNA que no
se traduceno habría transposasa.
IS50-R es funcional. Su mRNA tiene 2 AUG (ORF, ver
Tema 7): uno que codifica para la transposasa, es el
primer AUG, hace proteína larga. El segundo AUG está
más adentro y codifica proteína corta represora de la
transposasa. Éste represor, se cree que puede unirse
directamente a la transposasa funcional y bloquear su
dominio de unión al DNA, o bien unirse a la diana de
la transposasa en el transposón y bloquear que entre,
entorpeciéndola.
- Tn10: Transposón compuesto también.
Regula su transposición mediante 3 mecanismos de
control. Consideramos que IS10L no es funcional.
1) mRNA: Dentro de IS10R hay 2 promotores que hacen
dos
mRNA
en
direcciones
opuestas,
solapando
parcialmente.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 114
El promotor in (Pin) apunta hacia dentro, codifica
para una proteína larga, la transposasa. El promotor
out (Pout) apunta hacia fuera, codifica para un mRNA
corto no codificante. Resulta que los 36 primeros nt
de ambos mRNA son complementarios, se pueden hibridar
los dos mRNA por el extremo 5’. Así, no se traduce la
transposasa. El mRNA de Pout tiene 100 veces más
afinidad por el mRNA de Pin que el ribosoma. También
tiene más afinidad por el mRNA de Pin que la RNA
polimerasa por Pin. Además es más estable.
Si la [ ] de mRNA de Pout es 5 veces mayor que la de
mRNA de Pin, entonces se unen. Si es igual o menor a 5
veces, no se unen porque está más disuelto en el
citosol, y hay transposasa porque no se bloquea el
mRNA de Pin.
2) La transposasa: Supongamos que la [ ] de mRNA de
Pout es menor a 5, entonces se traduce el mRNA de Pin
y hay transposasa. La transposasa Procariota actúa en
CIS: sólo corta a su propio transposón Tn10. No sucede
así en Eucariotas. Ello determina que se incremente de
manera lineal la transposición (1 transposón 1
transposasa, 2 transposones 2 transposasas, etc),
si no fuera así, todos cortarían a todos y sería un
incremento exponencial de tranposición (¡malo!).
3) La metilación: Un tranposón sólo puede transponer
si está hemimetilado o no metilado. Ello sólo sucede
justo cuando ha acabado la replicación, que hay DNA
hemimetilado. Es entonces que la transposasa puede
actuar y transponer, no en otro momento. Sentido: DNA
hemimetiladoDNA
nuevocélula
jovencitosol
con
pocos
radicales
perjudiciales
y
toxinas,
pocas
nucleasas, puede enfrentarse mejor a los daños que
podría hacer el transposónbuen momento para “saltar”
y transponer (es como un parásito).
Tipos de transposición:
- Transposición no replicativa: el transposón se mueve, no
se copia. Lo hacen IS estrictor, Tn compuestos. Es lo
explicado al principio. No sabemos qué pasa con el DNA
desde el cual “salta” el transposón: ¿reparadocómo?
¿letal?. Implica forzosamente la duplicación de la diana
del huésped.
- Transposición replicativa: Se transpone a la vez que se
duplica el transposón. Queda en el sitio original y en
la diana. Lo hacen los transposones complejos.
- Transposición conservativa: Se transpone durante la
replicación pero sin duplicarse. Se reparan siempre. Es
propia de Eucariotas (ver Tema 17).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 115
La transposición Replicativa de Tn3. Es un transposón
complejo. Necesita la transposasa y la resolvasa, ya que se
debe resolver un intermediario hay una recombinación de
sitio específico.
La región de resolución tiene 3 subregiones. Una de ellas
es una caja de homología, concretamente, la subregión 1. Es
la diana de la Resolvasa (TnpR), para resolver el
intermediario de la transposición.
La transposición replicativa se lleva a cabo por el modelo
de Shappiro. Se parte de un DNA con Tn3 (el donador) que
suele estar en un plasmidio (o no), y de un DNA sin Tn3 (el
receptor) que suele ser el cromosoma bacteriano (o no).
El Tn3 también está flanqueado por las secuencias DR del
sitio receptor. Recordar que es un dsDNA. El modelo de
Shappiro es así (ver página siguiente):
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 116
+
La transposasa corta en el donador haciendo
nicks (entre DR e ITR), dejando el Tn3 con 3’ libre
(sin separar las dos cadenas),, en el receptor
corta dejando 5’ protuberantes (de ssDNA).
+
Tn3 es de dsDNA. Se separan sus dos cadenas. Cada una de las dos cadenas que
forman Tn3 tiene un extremo que finaliza con ITR y el 3’ (es como si fuera un extremo
protuberante 3’). Así, siendo ssDNA separado, se va al receptor que está cortado y los
3’ libres del Tn3 se unen a los 5’ protuberantes del receptor por “un enlace
fosfodiéster” ( en realidad es un ataque nucleofílico,, no se aparea ninguna base).
Así, se unen el 3’ del ssDNA separado de Tn3 con el 5’ del ssDNA protuberante
de la diana del receptor.
Ahora actúa la DNA Polimerasa Procariota, la cual aprovecha los extremos 3’
libres que quedaban en el cromosoma bacteriano, y polimerizando en 5’3’
como indican las flechas discontinuas,
sintetiza “arriba” un DNA
complementario a la diana del receptor y al transposón; y “abajo” también: un
DNA complementario a la diana del receptor y al transposón. Así se duplica la
diana del receptor y se replica el transposón.
Finalmente, la ligasa une los nicks que quedan. Llegados aquí, ésta figura en forma de “8” es el COINTEGRANTE. Es un
intermediario, no producto final, y requiere resolución. Recordemos que dentro del Tn3 hay la región de resolución, cuya
subregión 1 es diana de la Resolvasa. Ahora está duplicado el transposón, por tanto ya hay dos subregiones 1 (cajas de
homología).
Para que actúe la Resolvasa , se forma
una estructura con 4 monómeros de
resolvasa unidos a las 2 subregiones 1.
También puede unirse a las otras
regiones en forma de tetrámero, pero
sólo corta en la 1.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Recombina en Res y se une la región donadora con la
donadora, y la receptora con la receptora,
rompiéndose el cointegrante. Finalmente, quedan el
DNA donador con el transposón y sus secuencias DR
originales, y en el DNA receptor, está el transposón y
las secuencias DR suyas, las cortadas al principio.
El Tn3 final, en las 2 moléculas, es hírido de cadena
(porque vienen de otro sitio, recombina) y 1/2 de
cadena quimera (1/2 nuevo sintetizado y 1/2 antiguo).
Página 117
En total, hay 12 monómeros de Res unidos a la región de
resolución (4 en cada una de las 3 subregiones). Sólo
cortan los de la subregión 1. Los otros 8 hacen función
estructural.
Los cortes que hace la Res para resolver el cointegrante:
- Hay un monómero de Res en cada una de las 4 cadenas de
DNA. Como son dos dsDNA, son 4 cadenas.
- Los cortes que hace la resolvasa son concertados: 4
cortes a la vez, en cada una de las cadenas de DNA.
- Deja extremos normales, 5’P y 3’OH.
- La Serina es el AA activo de la Res, y se une por su
grupo OH al 5’P momentáneamente.
- Giran 180º arrastrando lo que llevan unido, hacia la
molécula de DNA opuesta. Es el entrecruzamiento. R2 se
cambia con R4 y R1 con R3
- Cuando se han intercambiado las cadenas, se suelta el
5’P del OH de la Ser de la Res.
- La ligasa une los 5’P con los 3’OH de las moléculas y
queda separado.
Las recombinaciones de sitio específico:
Integrasa de λ
1. Cortes
secuenciales 2 a 2
2. 3’P-Int ,, 5’OH
3. AA activo: Tyr
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Resolvasa
Cortes concertados
4 a la vez
3’OH ,, 5’P-Res
AA activo: Ser
Página 118
TEMA 17: TRANSPOSICIÓN EUCARIOTA.
Puede ser por vía DNA (similar al Procariota, se estudia en
el
maíz
y
en
Drosophila)
ó
por
vía
RNA
(los
retrotransposones, los retrovirus).
Consideramos las panochas del maíz. La panocha es una
infrutescencia. El grano de maíz es el fruto. Cada grano
tiene un genoma independiente del grano de al lado. Los
granos provienen de división mitótica de una célula
original. Si durante el desarrollo de la panocha se da
algún evento que propicia la pérdida de un alelo dominante,
entonces los descendientes de ésa célula tendrán esa
pérdida de alelo: si la pérdida del alelo sucede pronto en
el desarrollo, muchas células(grano) de la panocha
tendrán la pérdida. Si sucede tarde en el desarrollo de la
panocha, entonces pocas células (grano) tendrán la
pérdida. Ello se explicó por “movilizaciones” del DNA, ya
que no cuadraba ninguna de las otras hipótesis conocidas.
Lo propuso Barbara McClintock en los años 50 y apenas nadie
se fijó en su trabajo. Pero acababa de descubrir los
transposones Eucariotas.
En el grano de maíz hay 4 loci con los que se estudió toda
ésta teoría. Todos tienen un patrón de herencia mendeliano
con relación de dominancia. El más importante es “C”. Tener
el genotipo “C_” da un fenotipo lila, porque hay
antocianinas. El genotipo “cc” da un color blanquecino, no
hay antocianinas.
Las mutaciones ocasionadas pueden mantenerse estables (no
revierten) o inestables (revierten a normal). Así, el
transposón es Autónomo cuando procude mutaciones inestables
que pueden revertir a normal, ya que codifica para una
transposasa funcional y si entra en una región del genoma,
también puede salir, por si mismo puede transponer. Por
contraposición, el transposón es No Autónomo si produce
mutaciones estables que no revierten a normal, ya que
codifica para una transposasa no funcional y si entra en
una región, no puede salir de ella y queda allí
estable(puede entrar porque previamente había uno Autónomo
que lo ha movido, y podría salir si un autónomo lo mueve),
por si mismo no puede transponer.
La transposasa que codifica el Autónomo puede actuar sobre
el propio autónomo que la codifica y también sobre otros
tranposones no autónomos que no pueden producirla, es
decir,
la
transposasa
Eucariota
actúa
en
TRANS.La
transposasa la usan para saltar y para insertarse en la
diana, a la cual corta generando como siempre la DR).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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Las familias de transposones en el maíz son:
- AC(autónomo)-DS (no autónomo).
- SPM (autónomo)-dSPM (no autónomo).
La familia AC-DS.
Los AC (autónonos) tienen una secuencia más larga que los
DS (no autónomos). El elemento AC es:
Miden 4563 pb. Un elemento DS es igual, pero con deleciones
en exones y algún intrón. Dependiendo del tipo faltan más o
menos, pero siempre faltan (por eso es más corto). Debido a
que falta siempre alguna región exónica, la transposasa es
no funcional. CUANDO SE INSERTAN, SIEMPRE FLANQUEADOS POR
LAS DR (NO SE PINTAN).
Debido a que los AC tienen la misma secuencia IR que los
DS, son reconocidos por la transposasa de AC.
Cómo transponen: Es una transposición conservativa. No se
copian los AC-DS por sí mismos, pero pueden copiarse
durante
la
replicación.
Sólo
pueden
transponer
inmediatamente después de la replicación (porque el DNA
está hemimetilado). Siempre hay reparación después de
transponer.
Los elementos AC-DS producen mutaciones en el fenotipo que
son estables si DS entra en la célula (origen???) y cae en
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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un punto del genoma que rompe la pauta de lectura de un
gen, por ejemplo del color ( fen. incoloro), o bien cae
en una región no codificante (fen. color). Sea como sea,
al ser un DS únicamente, no puede moverse y ahí se quedará,
siendo un fenotipo estable.
Causan mutaciones inestables (que revierten) si hay un AC
(origen???) aparte del DS, el cual puede moverlo y hacer
que caiga en región codificante o no codificante. Como
puede moverse, la mutación puede revertir, generando
fenotipos con manchas. Regulación poco conocida.
Y siempre hay reparación del punto de escisión.
La familia SPM-dSPM.
También los no autónomos (dSPM) tienen secuencia más corta
que los autónomos (SPM), pero algún autónomo puede tener
secuencia corta también. ¿Cómo? Primero hay que considerar
la estructura de un transposón “salvaje”:
CUANDO SE INSERTAN, SIEMPRE FLANQUEADOS POR LAS DR (NO SE
PINTAN).
El
salvaje
codifica
para
una
transposasa
funcional, por tanto es SPM (autónomo). Todos los salvajes
son autónomos.
Pero los mutantes, algunos pierden trozos de los últimos
exones y codifican para una transposasa no funcional, por
tanto son no autónomos (dSPM). Otros mutantes pierden
trozos del intron 1 que contienen una de las dos ORF (suele
ser la ORF2). Ello da lugar a un autónomo porque aunque
falte un trozo de intrón, los exones están todos bien, y
ello da lugar a una transposasa funcional.
Por tanto, algunos mutantes son dSPM (no autónomos) y otros
son SPM (autónomos).
Cómo transponen: También es una transposición conservativa
con reparación del sitio de escisión. Debido a que el maíz
es poliploide, a veces algún punto de escisión no se repara
(porque hay muchos) y puede dar lugar a problemas de
viabilidad aunque fuera mutación inestable.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 121
Así se rompe la pauta de lectura del locus C y debería, en
principio, quedar incoloro.
Pero pueden pasar dos cosas que hacen que a veces si que
haya “algo” color:
a) No había SPM. Llega un dSPM (origen???) que con mala
suerte cae dentro del gen C, y hace una mutación
estable: color intermedio. Es intermedio porque cuando
se transcribe a mRNA, se hace el Splicing de los
intrones normales de C y también del tránscrito de
dSPM, que se elimina casi todo como si fuera un intrón
también. Ésto es un caso de PSEUDOSPLICING. Debido a
que se elimina casi todo, quedan algunos nt (2-3
codones) de dSPM extra en el mRNA maduro, que no
ocasionan un corrimiento de la pauta de lectura
deleterio (porque son 2-3 codones extra). Así, la
enzima del color codificada tiene algún AA extra que no
estaba en la original, aparte de todos los AA normales,
por eso su actividad se ve algo reducida y produce
menos pigmento del normal. Grano de color INTERMEDIO.
b) Había un SPM: Llega un dSPM (origen???) que con mala
suerte cae dentro del gen C. Se produce un fenotipo
“manchado” en el grano, se considera “null”, incoloro.
Es una mutación inestable suprimida por el SPM. Sucede
que la transposasa que codifica SPM se une, como
siempre, a los extremos del transposón dSPM para
cortarlo y hacer que salte. Entonces pueden suceder dos
cosas dentro de un mismo grano:
b.I.) La transposasa al estar unida a los extremos
del dSPM, bloquea físicamente a la RNA Polimerasa
cuando transcribe, no
puede avanzar y salta.
Aborto transcripcional, no hay color.
b.II.) La transposasa tiene éxito y corta antes de
que
llegue la RNA Polimerasa a transcribir. Hay
transcipción de Chay color.
Ya que son cosas que pueden pasar dentro del mismo grano,
hay fenotipo “a manchas”. No se considera color, se le
llama “null” incoloro.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 122
En Drosophila: se estudió la transposición mediante la
disgénesis híbrida (híbridos estériles). Era debido a los
“elementos P”. Moscas con el elemento P se llaman “P” y
moscas salvajes (sin P) se llaman “M”. Son transposones
Eucariotas de DNA.
Un elemento P es así:
Tiene varios lugares de Poliadenilación diferentes (no son
el STOP del dibujo, aunque funcionalmente es indicativo),
ya que sufre Splicing Alternativo (ver Tema 4) según el
tejido.
Por tanto, al tener diferente Splicing, hay diferente mRNA
maduro que se poliadenilan en diferentes lugares. Su
estructura es similar a Tn5:
- El splicing Normal elimina todos los intrones, se da
en células germinales. Codifica para la transposasa
(proteína larga).
- El splicing Alternativo deja el intrón 3 con un STOP
prematuro, se da en los tejidos somáticos. Codifica
para el represor de la transposasa (proteína corta).
Hay dos hipótesis acerca de cómo funciona el represor de la
transposasa: Puede ser una transposasa que no tiene el
dominio catalítico, con lo cual se une al dsDNA pero no lo
corta y bloquea la entrada de la transposasa normal.
Tambien puede ser que el represor se una a monómeros de la
transposasa bloqueando que se una al DNA.
Existen muchos tipos de elementos P con diversas deleciones
internas, similar a la variedad en el maíz.
Explicación de la disgénesis híbrida: primero de todo hay
que repasar la fecundación. La hembra hace un oocito (n) a
partir de las células germinales, dentro del cual hay
muchas sustancias de reserva (y otras cosas…) que se
sintetizan en las células foliculares (somáticas).
Cuando el oocito es fecundado, se vuelve óvulo, se fusionan
los pronúcleos y se vuelve zigoto 2n. Se empieza a
desarrollar el embrión.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 123
Así, se pueden explicar los resultados de los cruces:
- Hembra M X Macho M Control. La descendencia es toda
fértil.
- Hembra P X Macho P Descendencia toda fértil. Las
células foliculares somáticas hacen el represor que va
al citosol del óvulo y bloquea a la transposasa. Se
fecunda. El represor siempre se une a la transposasa
que hace el óvulo y a la que viene del espermatozoide.
Se queda unida a ella para siempre, no deja que actúe.
En las del polo animal quedan determinadas así, sin
proliferar más. Las del polo vegetal por diferenciarse
en somáticas hacen más represor por su cuenta,
bloqueando toda la transposasa que pudiera quedar.
- Hembra P X Macho M Descendencia toda fértil, por el
mismo motivo.
- Hembra M X Macho P Descendencia estéril. El ovulo
que hace la hembra no tiene ni transposasa ni
represor. El espermatozoide tiene transposasa. Al
fecundarse, la transposasa nunca encuentra al represor
ni en el óvulo ni en el zigoto. Al volverse embrión,
en el polo vegetal se hace represor y se bloquea la
transposasa, pero en el polo animal no se puede hacer
represor y la transposasa que hay desorganiza el
genoma de allí hijos estériles, y nietos inviables?
Biología de los elementos P: Actualmente la mayoría de
moscas son P, pero no siempre ha sido así, se estudió la
transposasa en líneas muy antiguas conservadas y se vió que
cuando más antiguas, menos elementos P. En Europa y Asia,
todas eran M. En África y Sudamérica, muchas eran P.
También se ha dado el salto entre especies de los elementos
P, debido al Plasmodium (parásito) transmisión horizontal
del DNA. Origen desconocido. Por crear limitaciones
reproductivas, son un mecanismo de especiación y se
seleccionan a favor. Los elementos P, actualmente, son la
forma más común de introducir mutaciones estables en
Drosophila. En 2 generaciones se puede fijar una mutación
si se hacen los cruces correctos con la F1 y se tiene algo
de suerte (por lo de las proporciones).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 124
TEMA 18: BIOLOGÍA DE LOS RETROVIRUS.
Los retrovirus tienen un funcionamiento muy similar al de
los retrotransposones (transposones vía RNA, ver Tema 19).
Afectan a aves, mamíferos… nunca Procariotas. Causan
tumores o inmunodeficiencias. Ejemplo: el virus VIH causa
la enfermedad SIDA. El primer retrovirus que se encontró
fue el que causa tumores el las aves de corral, el RSV
(Rous Sarcomer Virus) a principios del siglo XX.
Todos los retrovirus tienen como material genético RNA.
Integran la información en el genoma de DNA de los
huéspedes.
Éste
cambio
en
el
materia
genético
(ssRNAdsDNA) lo consiguen mediante la RT (Reverse
Transcriptase). Gracias a ella se acabó de establecer el
Dogma Central de la Biología Molecular.
Según lás últimas filogenias, estan todos emparentados.
Todos los retrovirus tienen en
su estructura:
-Membrana
externa
(vida
extracel.): con proteínas del
propio virus (TM y SU, una de
ellas es la famosa gp120) y
restos de membrana celular del
último huésped.
-Membrana Interna: MA (matriz),
CA (cápside), NC (nucleoprot.).
-Material interno: dos copias
del ssRNA, dos el tRNA, RT, Int
y Proteasa.
El ciclo vital: las proteínas de la membrana externa del
virus que vienen de otras células ya infectadas interactúan
uniéndose a receptores extracelulares de la que será su
nueva célula huésped (en el caso del VIH: gp120 CD4 de
los linfocitos T). El virus está “disfrazado” con la
membrana de las células huésped anteriores. Hay fusión de
las membranas por endocitosis (gp41 en el caso del VIH). El
virus queda en el citosol limitado por su membrana interna.
Ahora
ha
de
retrotranscribirse
el
ssRNAdsDNA
e
integrarse. Después, cuando se expresa, puede salir por
exocitosis y quedar envuelto por la membrana del huésped.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 125
Así, el virus puede estar en estado de latencia (desde la
infección hasta que acaba la integración en forma de
provirus) o de virulencia (se forman nuevos virones,
exocitosis). Siempre usa las funciones del huésped. No hay
acuerdo acerca de cómo el material genético vírico
atraciesa la membrana nuclear.
Organización genómica de los retrovirus:
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 126
Como siempre, al integrarse se duplica la diana del
huésped. También se da que se pierden dos bases en los
extremos del LTR.
LTR (Long Targed Repeat)es U3 + R + U5 es éste orden,
siempre. Está en repetición Directa, se considera respecto
a R.
El promotor es MUY fuerte (dominante) y está entre U3 y R.
Sólo se expresa si el virus está integrado en el huésped
(latente, profago).
R es igual en los dos LTR. Tiene un PolyA, que
funciona para parar la transcripción en el LTR de 3’.
La secuencia Ψ (psi) sirve para
empaquetar el mRNA que la tiene.
indicar
que
se
sólo
ha
de
Las zonas codificantes son GAG (proteínas de la cápside
viral, membrana interna), POL (los 3 enzimas), ENV
(proteínas de la cubierta externa, membrana externa).
El PBS (Primer Binding Site) es el sitio de unión al Primer
en la retrotranscripción. El primer tiene, obviamente, una
secuencia complementaria al PBS.
La Transcriptasa Reversa (RT): Es una DNA Polimerasa
dependiente de RNA o DNA. Necesita un primer que aporte un
3’OH libre a partir del cual elongar. Tiene actividad
RNasaH (degrada el RNA que forma parte de los híbridos de
doble cadena de RNA-DNA, dejando ssDNA). También es capaz
de moverse o “saltar” sobre el material genético sin
polimerizar (????). El primer que utiliza es el tRNA que
llevaba el virus.
Funcionamiento:
El ssRNA del retrovirus entra
en la célula huésped. En su
región PBS se une el primer de
tRNA que llevaba el retrovirus.
Da
un
3’OH
libre.
La
RT
polimeriza DNA (U5 y R) a
partir del primer de tRNA. Es
el 1er trozo de la 1ª cadena.
Ahora usa su actividad RNasaH
sólo en la zona del híbrido que
acaba de formar, dejando un
ssDNA protuberante con un 3’.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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Se circulariza y se hibrida por
los R (que son iguales).
La
el
de
el
el
RT hace un salto y queda en
3’ libre del R que acababa
sintetizar. Polimeriza sobre
molde de RNA, pero elongando
DNA.
Ahora usa de nuevo la RNasaH
degradando el RNA del híbrido
(por donde acaba de pasar)
excepto un trozo, el PPT. A
partir del 3’ del PPT, se
polimeriza DNA con la RT.
Se
degrada
todo
el
RNA,
incluido el primer de tRNA y el
PPT, y se circulariza el DNA
por las secuencias PBS, que son
complementarias. Se separa de
U3, R y U5, queda unido sólo
por las PBS.
Aprovechando los dos extremos
3’ que dejan las dos PBS y
usando el molde de DNA, la RT
salta de nuevo y polimeriza
DNA. Ya tenemos dsDNA libre,
listo para integrar.
Éste dsDNA se integra al azar en el genoma del huésped,
gracias a la reacción que cataliza la integrasa.
Los LTR (U3-R-U5) son atacados por la integrasa: les
degrada dos nt en los extremos 3’, dejando un dsDNA vírico
con extremos 5’ protuberantes de 2nt de longitud.
Ahora, la integrasa corta en el DNA diana del huésped al
azar, dejando extremos protuberantes en 5’ de 2nt o más de
longitud. El DNA del virus de sitúa entre los dos gracias a
complementariedad de bases (OJO: como sólo son dos nt, es
bastante probable que por azar encuentre las que son
complementarias).
A
continuación,
la
DNA
Polimerasa
Eucariota rellena los gaps de la diana que están a loa
extremos del genoma vírico, generando así los extremos con
repetición directa característicos.
Genética Molecular.
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Se suelen integrar de una a diez copias del retrovirus en
un genoma.
Expresión de los Retrovirus: Sólo se expresan cuando se han
integrado. EL promotor está en el U3 del LTR 5’. Es muy
fuerte (el promotor). Es específico de la RNA Polimerasa II
(cajas CAAT). Si se modifica éste U3, no expresan nada.
El mRNA producido puede seguir dos caminos diferentes (50%
cada uno).
- Splicing: se cortan los lugares de Splicing eliminando
la secuencia de empaquetamiento Ψ, GAG y POL, como si
fueran intrones. Sólo se traduce el gen ENV (prots de
membrana
Externa).
La
proteína
inmadura
que
inmediatamente se traduce requiere 1 corte con la
proteasa que viajaba con el retrovirus para que salgan
los productos SU y TM.
Ya que se ha cortado Ψ, éste mRNA no es bueno para
encapsidar (falta GAG y POL). Su función es hacer ENV
para el bueno.
- No Splicing: se traduce desde el AUG de GAG. Hay un
STOP al final de GAG, que en el 5%-10% de los casos es
saltable* para hacer POL. El STOP de después de POL no
es saltable. GAG codifica una proteína inmadura que al
recibir los cortes de la proteasa, genera MA, CA y MC
(las proteínas de la cápside Interna). Cuando POL se
ha traducido, recibe cortes de la proteasa y genera
los Enzimas del retrovirus: RT, Int y más proteasa. La
célula huésped no las degrada porque las reconoce como
propias. Ya que tiene a Ψ (lo tiene todo), se puede
encapsidar con ENV para salir de la célula e infectar
a otras.
Las terapias antirretrovirales se basan en combinar
fármacos que inhiben a las 3 proteinas a la vez y al tRNA.
*El STOP de GAG es saltable. Para expresar POL, es
imprescindible saltarse ése STOP. Tampoco se puede hacer
Splicing (se eliminaría POL, con GAG). Existen varias
maneras de que el ribosoma se salte el STOP: Frameshift-1,
Frameshift -2, Frameshift +1 y tRNA complementario a un
STOP.
Los frameshift consisten en cambiar la pauta de
lectura del ribosoma sobre el mRNA para que no reconozca el
codón STOP.
-Frameshift -1 (se retrocede 1 nt, el más común, el
del HIV).
-Frameshift -2 (MMTV).
-tRNA supresor (reconoce al codón STOP aportanto un
tRNA con ácido glutámico, pero es un mecanismo MUY
raro. Virus MLV).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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En el caso del HIV es un frameshift -1. Funcionamiento:
- El ribosoma llega al final de GAG y se forma un loop
en el RNA.
- El loop hace que se pare la traducción. No salta el
polipéptido ni el ribosoma.
- Se rompen los puentes de H2 entre codón y anticodón
con polipéptido naciente.
- EL ribosoma se mueve una posición hacia atrás, se
mueve -1nt. Aprovechando la “wobble position” del
tRNA, se mantiene el AA cambiando la tercera base. Se
une por 2 puentes de H2 entre las dos bases del
anticodón y el codón (que tiene 2 de las bases que han
parado al ribosoma), que ya estaba preparado para que
fueran complementarias.
- Se deshace el loop y el ribosoma sigue leyendo el
mRNA, pero con la nueva pauta de lectura -1. Sigue
añadiendo AA a la proteína que NO había saltado.
Los Retrovirus como transductores de oncogenes.
Un oncógen es un gen que hace tumores (estimula la mitosis)
debido a que:
- Expresa una proteína nueva
- Expresa a elevada [ ] algo
- Expresa a baja [ ] algo
- Expresa cuando no debe.
Tipos de oncogenes:
- c-onc: gen normal, funciona correctamente, implicado
en la división celular. Regulan la mitosis, ciclinas,
factores de transcripción… Se una la terminología “conc” en el contexto de los retrovirus.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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- v-onc: es la variante vírica de un gen que funciona
correctamente en la célula. Las diferencias son de un
3-10% respecto al “c-onc” en cuanto a nt. Son c-onc
que están fuera de control.
Los retrovirus que llevan oncogenes pueden ser:
- con algún componente de menos (GAG, POL o ENV, o los
3).
- El gen tiende a estar a 3’ del retrovirus.
Para
estudiarlo,
se
hace
una
infección
simultánea
(coinfección) del normal con el recombinante.
El origen de los v-onc constituye un misterio (como otros
tantos), pero se baraja alguna hipótesis al respecto:
Célula normal con c-onc (intrones) infección con
retrovirus (1-10 copias/genoma) el retrovirus se integra
al azar, y ésta vez lo hace a 5’ del c-onc por azar
también, se produce una deleción entre el virus y el c-onc
(deleción de POL, ENV, y el LTR de 3’ por ejemplo) al
trascribirse desde el U3 del LTR de 5’, se transcribe
también el c-onc porque no hay el señal de poliadenilación
de la R del LTR 3’ se realiza el splicing sobre el
mensajero y se obtiene un mRNA con 5’R-U5-GAG-E1-E2…-AAA3’.
Los exones son del c-onc, ya no tiene intrones. Ahora se
daría una infección con el normal (de nuevo, 1-10 copias
por genoma) que aporta los genes que faltan virus que ha
recombinado con el c-onc. Le aporta los genes POL y ENV,
los codifica el normal. Ahora, se podrá volver un v-onc. Se
encapsida:
- 2RNA que tengan Ψ (por probabilidad, uno de normal y
uno con c-onc).
- El resto de material.
Ahora infecta a una nueva célula. Si hay 2 RNA de moldes,
la RT puede saltar mientras retrotranscribe de un RNA a
otro, generando nuevas combinaciones de genes. El dsDNA con
c-onc se integra en la célula del huésped, y se vuelve vonc.
Genética Molecular.
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Página 131
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 132
TEMA 19: RETROTRANSPOSONES Y RETROGENES.
Un retrotransposón (=retroposón) es un transposón que
transpone en forma de RNA. Se retrotranscribe a DNA y se
integra en el DNA del huésped. Sólo en Eucariotas.
Es como un retrovirus que ha perdido la capacidad de pasar
de una célula a otra, y ha de hacer el ciclo dentro del
huésped. Su origen, por tanto, es desconcertante: ¿se trata
de un retrovirus que por azar perdió la capacidad de
infectar a otras células (env) o bien se trata de un
retrotransposón ancestral que por azar ganó la capacidad de
infectar a otras células (env) y originó, así, a todos los
retrovirus? A día de hoy, no se sabe.
Consideramos los elementos Ty de la levadura (Transposon
yeast),
son
los
retrotransposones
que
primero
se
descubrieron. Los elementos Ty integrados son así:
Las cajas δ(=LTR) también se pueden encontrar solas en el
genoma, flanqueadas por la DR del huésped. Ésto es debido a
que se dan recombinaciones de sitio específico entre las
cajas δ para eliminar exceso de Ty.
La traducción del mRNA del Ty:
- Normal: se traduce el TyA (desde AUG hasta el primer
STOP), hace la P1 que requiere un corte con la
proteasa para volverse P2, la forma madura. Con ella,
se hacen las VLP (virus-like proteins). Polimerizan.
- Frameshift +1: en retrovirus era -1. Se traducen el
TyA y el TyB saltándose el STOP entre ellos. Se
sintetiza una P3, que al ser cortada produce la
proteasa, RT e Int. También se sintetiza la P1 que al
ser cortada se vuelve P2, para hacer VLP. El
frameshift +1 funciona cuando se acerca al codón STOP
entre TyA y TyB. No hay loop. Cerca hay un codón de
Arg (raro en levadura, no viene al ribosoma porque hay
pocos). Se para la traducción, se separa el tRNA con
el polipéptido y el ribosoma avanza 1 nt sobre el
mRNA, sin hacer nada (solo se mueve 1 nt hacia
adelante). Ahora, el codón que se lee codifica para un
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 133
AA común en la levadura (Gly) y se sintetiza el nuevo
polipéptido como si nada.
mRNA + VLP + P3 (las 3 enzimas) “retrovirus” que no
puede salir de la célula pero puede hacer muchas copias de
sí mismo.
Hay diferentes tipos de Ty (1, 2, 3, 4, 5). Todos funcionan
como TyA y TyB. También se han encontrado retrotransposones
en
Drosophila
(llamados
elementos
“Copia”).
Tienen
estructura equivalente al Ty de levadura. Como en Ty, hay
diferentes tipos de elementos Copia. Se estudiaron haciendo
hibridaciones con sonda sobre los cromosomas politénicos de
Drosophila.
Todos, cuando se integran, tienen la diana del huésped
repetida en DR.
Así, los retrotransposones pueden ser:
- Clase I: Retrovirus Like (como los retrovirus), tienen
LTR. Son Ty en levadura y Copia en Drosophila.
- Clase II: non-Retrovirus Like (no son como los
retrovirus), no tienen LTR. Son los LINE.
LINE (Long Interspersed Nuclear Element): El primero en ser
descubierto fue el LINE1. Hay muchas copias por nº haploide
de cromosomas, de 50000 a 100000 copias. Todas ellas
presentan diferente longitud:
- Cortas: muchas copias, ocupan pocos centenares de
bases. Están truncados a 5’.
- Largas: pocas copias, ocupan hasta 7kb. Se les
considera completos. LINE1.
La diferencia entre unos y otros es que las cortas, siempre
están acortadas por el 5’ (ahora veremos porqué). El
extremo 3’ (secuencia de Polyadenilación) se mantiene
siempre. El LINE1 (completo) es:
No hay acuerdo sobre cómo se transcriben los LINES
truncados a 5’, ya que no deberían tener promotor. Tampoco
está claro de dónde vienen.
Codifica para una RT no homóloga a la de los retrovirus
(diferente seq de AA, misma función). Se retrotranscriben
por TPRT (Target Primed Reverse Transcription).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 134
El ORF1 codifica para una proteína llamada P40 ó ORF1.
Función poco clara. El ORF 2 codifica para una proteína
llamada ORF2 que tiene 2 dominios: endonucleasa y RT.
Se forma la partícula nucleoproteica en el citosol:
ORF2+(2xP40)+mRNA del LINE. Se unen en 3’ del mRNA.
Cuando entra en el núcleo, se pierden las dos ORF1 (=P40).
Ahora, gracias a ORF2, el mRNA toca al DNA del huésped, en
una región que ha de ser rica en T (considero que es en la
cadena de “abajo”). A ella, la ORF2 le acerca la cola de
PolyA del mRNA.
Ahora, ORF2 usa su dominio endonucleasa y hace un corte en
el extremo izquierdo de la zona con TTTT, dejando un 3’
libre. ORF2 usa entonces su dominio RT aprovechando ese
3’OH libre para elongar DNA. El sustrato es el RNA
enganchado con sus A a la zona de T:
La RT sintetiza la primera cadena del cDNA en 5’3’
aprovechando ese 3’ libre del Nick. Usa la actividad
RN’asaH para degradar el molde de RNA y sintetiza la
segunda cadena del cDNA. Queda un dsDNA “colgando”, el cual
se integra bien en el lugar donde está. Hay reparación de
los posibles daños.
En
el
momento
de
integrarse éste DNA que
“cuelga”, se produce un
corte
en
el
DNA
del
huésped que deja extremos
protuberantes
(pasa
lo
que indica el dibujo, por
ataque
nucleofílico???),
en-tre los cuales se une
el DNA que “cuelga”
(muy
similar
a
los
transposones).
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 135
Por eso hay la DR que flanquea al LINE, como siempre, y
siempre se repara. En general, el TPRT es un mecanismo con
muchos puntos oscuros y poco conocido.
Debido a que la RT es poco procesiva, se desengancha con
facilidad del molde de RNA.
Ello ocasiona que se separe antes de hora, y no llegue a
retrotranscribir todo hasta el 5’. Por eso, la mayoría de
LINE tienen deleciones en 5’, están “truncados”. Se dice
que los LINE son autónomos porque codifican ellos para su
ORF1 y ORF2.
Así, las ORF1 y ORF2 actúan en CIS si se unen al mRNA del
LINE en el citosol. Pero a veces sucede que, como estamos
en el citosol, hay más RNA que no son sólo del LINE. Puede
suceder que las ORF1 y ORF2 (y de hecho sucede) se
equivoquen y se unan al RNA de otro gen. En éstos casos se
dice que las ORF1 y ORF2 han actuado en TRANS.
Cuando actúan en TRANS, pueden originar 2 cosas según el
sustrato:
- Si actúan sobre mRNA (de la RNA Polimerasa II) generan
un Retropseudogen = Pseudogen Procesado = Retrogen.
- Si actúan sobre pequeños RNA (los de la RNA Polimerasa
III) forman los SINE. Los SINE pueden ser retro t-RNA
(se encontraron en ratón) o elementos ALU (en
primates).
Se
dice
que
son
todos
no
autónomos
porque
para
retrotransponerse necesitan las ORF1 y ORF2 que codifica
previamente el mRNA de un LINE, pero como las ORF1 y ORF2
se
equivocan,
van
a
éstos
RNA
y
los
hacen
retrotranscribirse.
Los Retropseudogenes = Pseudogenes Procesados = Retrogenes
vienen de mRNA de la RNA Polimerasa II. Son el principal
grupo. No tienen promotor porque el mRNA molde que los
forma nunca tiene promotor,, no tienen intrones porque el
mRNA al madurar sufre Splicing,, zona rica en A-T debido a
la cola de PolyA del mRNA,, dos repeticiones directas, como
siempre, los flanquean, debido a la integración del cDNA de
doble cadena cuando estaba “colgando” (ver arriba).
Al ser no codificante (no tiene promotor), no está sometido
a presión selectiva y acumula mutaciones a un ritmo
aproximadamente constante. Es como un Pseudogen, pero el
Retropseudogen no tiene intrones ni promotor, mientras que
el pseudogen sí tiene intrones y no es codificante por
mutaciones en la región reguladora (puede originarse por
Genética Molecular.
Carlos F.R.
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duplicación con inactivación por
inactivación por mutación directa).
selección
ó
simple
Los SINE (Short Interspersed Nuclear Element) se forman
cuando ORF1 y ORF2 se unen a tRNA, 5S-rRNA… es decir, todos
los tránscritos de la RNA Polimerasa III. Son de escaso
tamaño pero tienen un elevadísimo número de copias. Tipos:
- Retro tRNA: Vienen del tRNA. Se encontraron en
roedores. El AA era generalmente una Ala o una Ser.
- Elementos
Alu:
Comunes
en
todos
los
primates
superiores
(usadas
para
hacer
filogenias).
Son
pequeñas secuencias producidas por los tránscritos de
la RNA Polimerasa III. Un elemento Alu es:
Son dos “dímeros” de secuencias (uno de 130pb y otro
de 160pb) que están en tándem (uno tras otro, tras
otro…) por el genoma, muchas veces. En total, una
secuencia Alu mide 300pb. Al venir de la RNA
Polimerasa III, son genes de clase III y tienen
promotores internos (se pueden transcribir). El nombre
de Alu viene de que tienen dianas del enzima de
restricción AluI.
Las secuencias Alu vienen del 7S(L)-RNA. Al ser
transcrito por primera vez por la RNA Polimerasa III,
el RNA es captado por ORF1 y ORF2 (TRANS), y se
integra en el genoma. Forma un Alu. Como tiene
promotor interno, ahora puede volver a transcribirse y
volver a retrotransribirse (si es captado por ORF1 y
ORF2), y así una y otra vez. Por eso hay tantos.
El 7S(L)-RNA es citosólico, y está implicado en la
traducción de proteínas. El 7S(L)-RNA + proteína
estructural forma la SRP (una ribonucleoproteina).
Está implicada en la translocación de proteínas al
Retículo Endoplasmático Rugoso (ver Biología Celular).
EL 7S(L)-RNA está muy replegado sobre sí mismo, con
hibridaciones,
etc.
Tiene
muchas
estructuras
secundarias.
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 137
Tiene dominio en común con las
retrotransponerse, el 7S-RNA Alu.
Alu
porque
al
No se retrotranscribió todo porque falta un trozo en
la homología con los Alu, un trozo propio del 7S-RNA.
La retrotransposición accidental (TRANS) se da mucho
con el RNA implicado en la traducción.
De manera comparativa, consideremos un individuo haploide.
- LINE1: es poco frecuente, entero representa el 5% de
los LINE, y truncado en 5’ es el 95% de los LINE (en
humanos). En ratón, hay 300 veces más del LINE1. 1 de
cada 1000 mutaciones en humanos es debida a un LINE1.
1 de cada 50 individuos tiene un nuevo LINE1 en la
línea germinal.
- SINE (las Alu): 1.1x106 copias, forman el 11% del
genoma en humanos y el 3% del genoma de los ratones.
Hay 20 enfermedades genéticas humanas asociadas a Alu:
por tenerlo en región reguladora, codificante, o por
recombinar las secuencias Alu. 1 de cada 30 individuos
tiene un nuevo Alu en la línea germinal.
Enfermedades asociadas a los Alu: nuestro DNA está lleno de LINE’s y
Alu’s en diferente (o igual) orientacion. Ejemplo: patología asociada
al receptor de las LDL en región no codificante. Supongamos que en el
gen del receptor de las LDL llegan a retrotransponerse 2 7S-RNA en
forma de Alu. Hay dos Alu. Quedan, cada una, dentro de un intrón.
Además, hay una diana de EcoR1 en un intrón que está en medio de los
dos intrones con Alu.
Un individuo “sano”, no habrá recombinado entre las dos Alu, al cortar
el DNA con EcoR1 y hacer un Southern (con sonda determinada) se verán
dos bandas. En un individuo con la patología, se ha dado recombinación
entre las dos Alu y el fragmento entre ambas se ha perdido. Como tiene
exones, al codificar para el receptor de LDL sale una proteína no
funcional y si digerimos el DNA con EcoRI, no se digeriría porque se
ha delecionado la diana debido a esa recombinación, y al hacer el
Southern e hibridar con la sonda específica de antes, saldría una sola
banda.
Genética Molecular.
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Genética Molecular.
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TEMA 20: INMUNOGLOBULINAS.
El sistema inmune consta de células precursoras que se
pueden diferencias en células linfoides (hacen la respuesta
tisular células citotóxicas y los linfocitos T ó hacen la
respuesta humoral linfocitos B) ó en células mieloides
(macrófagos, plaquetas, etc).
Los anticuerpos son sintetizados por los linfocitos B. Los
anticuerpos son el principal tipo de inmunoglobulinas (las
usaremos como sinónimos, pero estrictamente no lo son).
Las inmunoglobulinas
cadena pesada. Tipos:
- IgA secuencia
- IgD secuencia
autoinmunidad.
- IgE secuencia
- IgG secuencia
- IgM secuencia
se
clasifican
según
los
AA
de
la
α de AA en cadena pesada. Saliva.
δ de AA en cadena pesada, regula la
ξ en cadena pesada. Alergias.
γ en cadena pesada. Principal.
µ en cadena pesada. Constitutiva.
Estructura de la más abundante (IgG):
Una Ig tiene dos cadenas ligeras (“l”) y dos cadenas
pesadas (“h”). Tanto la ligera como la pesada tienen cada
una su región Constante (“C”) y su región Variable (“V”).
Están unidas por puentes disulfuro.
Las letras (J, C, L…) de cada gen son cajas que codifican
para diferente secuencia de polipéptido, habrá sólo 1 de
cada en la IG final. Están en clúster. Se puede elegir para
que el AC pueda reconocer muchos antígenos.
Cadena ligera, región Variable: en la cadena ligera, puede
haber una región variable que sea de tipo λ ó de tipo κ.
Genética Molecular.
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- Tipo λ:
Poca preferencia por ésta, se prefiere más el clúster
κ. Tiene un pseudogen en una constante. Sólo se usa si
falla la κ. En raton, el 5% de las Ig tiene la Vl tipo
clúster λ y hay pocas L-V donde elegir. En humanos, el
60% de las Ig tienen la Vl tipo clúster λ, y hay
muchas L-V donde elegir.
- Tipo κ:
Se elige como primera preferencia. Si éste falla, usa
el clúster λ. En raton, el 95% de las Ig tiene una Vl
tipo clúster κ, y hay muchas L-V donde elegir. En
humanos al revés, el 60% lo tiene y hay pocas L-V
donde elegir.
Cadena ligera, región Constante: Poca importancia, si la
variable es κ, la constante es κ. Si la variable es λ, la
constante es λ1, λ2 ó λ3 (la λ4 es el pseudogen).
Genética Molecular.
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Cadena pesada, región Variable:
La variable es más fácil de hacer que la constante. No se
indican todas aquí, pero la constante (ver siguiente
dibujo) tiene muchas posibilidades.
Se pone como ejemplo que la constante se vuelva M (ahora se
explica). Para que se forme el DNA listo para transcribir,
requiere 2 recombinaciones somáticas. Hay mucho donde
elegir. Al hacer las recombinaciones somáticas en el DNA,
ya queda determinado para siempre en esa célula (porque
implica que se pierda un trozo, el trozo que está entre las
dos zonas que recombinan)
Cadena pesada, región Constante: Pueden presentar, a parte
de toda la variedad de la Variable, diferente Forma
(Ssecretable, M1 o M2 de membrana) y también diferente
Clase (tipo de Ig, si IgMIgD es revesible, pero si
IgMIgA, IgG, IgE es irreversible).
Suponemos que ya se han dado las 2 recombinaciones (siempre
son somáticas porque son linfocitos) de la región Variable,
y ya está determinado el DNA. Ahora, para la región
Constante, pueden suceder diversos eventos, ¡se combinan
los dos!
- Clase: 1º se elige la clase. Determina el tipo de Ig.
Puede ser reversible o irreversible. Por defecto,
siempre se va a transcribir a la IgM, por tanto, no es
imprescindible el cambio de clase (si no se diera
cambio de clase, quedaría IgM). Cuando se han hecho
Genética Molecular.
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Página 142
las 2 recombinaciones somáticas de la variable, el DNA
de la Constante es:
Los cambios de Clase Reversibles implican manipular el
mRNA. Es pasar de IgMIgD. Se trascribe todo hasta el
final de C-δ, se elige si quiero que sea IgD ó IgM y
después la Forma. Para que sea IgD, tengo que hacer
Splicing alternativo y perder todo IgM. Para que sea
IgM, no tengo que tocar nada (hay STOP detrás de C-µ).
Luego se elige si es secretable o de membrana.
Los cambios de Clase Irreversibles implican una
tercera recombinación somática, pero ésta se da entre
las regiones de homología llamadas “cajas Switch” (SWletra). Es una recombinación muy parecida a la de
sitio específico, porque hay una deleción de un
segmento por recombinar dos secuencias (cajas SW)
repetidas. Las cajas Switch están al principio de
todas las regiones C, excepto de Cδ (no existe la SWδ). Siempre se recombina la SW-µ con la SW-diana de la
C que quiero. Se elimina el trozo de DNA de en medio
(por eso es irreversible). Luego se transcribe y se
elige si es de membrana o secretable.
- Forma: Es lo 2º que se elige. Los cambios de forma son
todos reversibles, ya que afectan al mRNA una vez se
ha elegido la Clase. Es decir, a partir de un mismo
genoma siempre se pueden generar formas secretable y
formas de membrana de la misma clase de Ig. Al mRNA se
le puede hacer un Splicing alternativo de la región C,
en el cual se pierde la región S, y luego se unen las
cajas M forma de Membrana, tiene AA hidrofóbicos. Si
se usa una región críptica de PoliAdenilación, que
está detrás de S (se pierde M)forma Secretable,
tiene AA hidrófilos.
La Recombinación Somática: sólo se dan en los linfocitos B
porque son las únicas células del cuerpo con las
Recombinasas Rag1 y Rag2 funcionales. Son homólogas a
Transposasas. Éstas recombinaciones somáticas implican
regiones en el DNA con secuencias de bases en repetición
Directa, un entrecruzamiento, y la pérdida del segmento
Genética Molecular.
Carlos F.R.
Página 143
intermedio (parecido pero no igual a recombinación de sitio
específico).
Así, gracias a ésta recombinación, se unen los segmentos de
DNA pueden expresarse los genes de las inmunoglobulinas, ya
que un enhancer específico del promotor de las Ig se acerca
a éste cuando se deleciona el fragmento intermedio por
recombinación.
Éste enhancer que activa al promotor se encuentra entre J y
Cµ, y el promotor está a 5’ de J. Por eso cuando se hacen
las dos recombinaciones somáticas, se acerca el enhancer al
promotor y lo activa. Como para esa recombinación se
necesitan a Rag1 y Rag2, y sólo las expresan los
linfocitos, son las únicas células del cuerpo aparte de las
germinales que pueden recombinar. Y como no son células
germinales porque no hacen gametos, sino que son células
somáticas, al fenómeno se le llama recombinación somática.
Rag1 y Rag2 actúan como transposasas, catalizando todas las
recombinaciones somáticas de los Linfoctos B. Son elementos
de recombinación en “Trans”.
Por ejemplo, si quiero unir la caja V con la caja J (en la
cadena ligera), Rag1 y Rag2 cortan a los lados de las cajas
de homología (no cortan dentro de ellas, por eso no es
igual que la recombinación de sitio específico, aunque el
resultado es equivalente).
Es fundamental que haya las cajas de homología HeptámeroNonámero-(cosa a delecionar)-Nonámero-Heptámero. Cada una
tiene 7-9-X-9-7 bases, respectivamente. Siempre se deben
conservar las distancias de 23pb entre las 7-9 y de 12pb
entre las 9-7. No son distancias arbitrarias, son
reconocidas por Rag1 y Rag2 ya que corresponden con los
giros del DNA. Éstas cajas, son elementos en “Cis” de
recombinación. 1 heptámero + 1 nonámero = 1 RSS. Se
necesitan 2 RSS para recombinar. Los dos RSS están en
repetición invertida.
Genética Molecular.
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Las recombinasas Rag1 y Rag2 no cortan dentro de las cajas
7-9 y 9-7, sino que cortan en el trozo que hay entre la RSS
y el la caja V ó J. Funcionan como transposasas, así que no
cortan dejando extremos protuberantes.
Cómo se da la recombinación Somática:
- Las cajas 7-9-X-9-7 se enfrentan una con la otra
formando una protuberancia.
- Rag1 y Rag1 reconocen las estructuras y cortan,
haciendo un Nick en cada una de las 2 cadenas.
- El 3’OH ataca nucleofílicamente al 5’P que tiene la
cadena de abajo, y forma una estructura en “hairpin”.
A la vez, se separa el fragmento intermedio, con las
cajas 7-9-9-7 y la región que se deleciona del genoma.
Éste DNA que se deleciona se ha circularizado por los
extremos romos.
- Una endonucleasa corta el punto del “hairpin” a los
dos extremos, haciendo un Nick, la posición del cual
es variable. Se rompen los puentes de H2 por la
tensión. Por tanto, deja extremos protuberantes 3’ de
longitud variable (los nt no “caen”, no son goteras
xD).
Éstos nt protuberantes son los nt P.
- La Nucleotidil Transferasa Terminal (NTT) añade
algunos nt aprovechando el 3’ libre, en 5’3’. No
tiene molde, por tanto los pone al azar. Los nt que
pone la NTT son los nucleótidos N.
- Los nt son al azar, pero basta que añada dos que sean
complementarios en las cadenas opuestas y se hibridan,
la distancia de lo cual será, obviamente, variable.
Genética Molecular.
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Página 145
- Al hibridarse, ya hay un gap con un extremo 3’ con un
gap. Una exonucleasa corta la protuberancia 3’ que no
se ha apareado.
- Ahora puede venir la DNA Polimerasa Eucariota a
reparar el gap, a partir del 3’ libre y usando el
molde de la otra.
Debido a que esto se da en regiones codificantes, hay
posibilidad de que haya un corrimiento de la pauta de
lectura y produzca una proteína no funcional. Por eso, 2/3
veces éste fenómeno falla y no produce una cadena
funcional. Pero si funciona (1/3), hay variabilidad
generada por los nucleótidos N que añade la NTT.
La Hipermutación Somática: igual que el fenómeno anterior,
sólo pasa en los linfocitos B. Sucede en las regiones LVJ ó
LVDJ, dependiendo de si es pesada o ligera, pero siempre
sucede en la región V almenos. Sucede cuando se han
producido las Recombinaciones Somáticas, no antes.
Ocurre en elevada frecuencia, del orden de 1/1000 a 1/10000
veces (muta 100 o 1000 veces más rápido de lo normal).
Consiste
en
sustituir
bases
mediante
un
mecanismo
enzimático. Sobretodo en la región V y sus zonas
flanqueantes.
Siempre necesita a los enhancers cerca (dos enhancers: el
Eµ que está entre V-C a 5’ de Cµ ,, el E3’α que es
característico de la cadena pesada y está a 3’ de Cα).
También
necesita
secuencias
intrónicas
cerca,
para
“comprobar”
que
es
una
secuencia
activa
transcripcionalmente
(porque
quiere
mutar
secuencias
codificantes para generar variabilidad).
Sucede cuando una base (C, por ejemplo) es atacada por un
enzima (citosina desaminasa en éste caso) y se convierte en
uracilo. Tener uracilo en el DNA es una aberración, y viene
la Uracilo D-Glucosilasa, que corta la base y deja un lugar
AP (con MSH, MLH, PMS… no es NER porque no son bases
dañadas, y no es translesión porque no son dímeros de
pirimidina). Es reparado por la DNA Polimerasa ι, una
polimerasa translesión. Como se equivoca mucho, sólo ¼ de
las veces pone la base correcta, los otros ¾ añade una
incorrecta. Así, la región variable tiene aún más
variabilidad.
Genética Molecular.
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Página 146
Maduración Y Diferenciación de los Linfocitos B: Éste
proceso implica al factor de transcripción NF-κB. Suponemos
que queremos producir una IgM para la membrana.
La célula madre se diferencia en célula nula cuando une D-J
en la cadena pesada. Tiene dos intentos porque es 2n. Si
falla, apoptosis.
La célula nula se diferencia en célula Pre-B cuando une VDJ en la cadena pesada. También 2 intentos por ser 2n y si
falla, apoptosis. Se decide la clase de la Ig (IgM) y luego
se decide la forma (membrana). Se dá la exclusión alélica.
La célula Pre-B acumula las cadenas pesadas y se diferencia
en célula B cuando sintetiza la cadena ligera (1º κ1 ó κ2,
si falla usa λ. Fusión V-J). Se unen las cadenas ligera y
pesada, y se une la IgM a la membrana por la ruta
secretora, fusión vesicular.
La célula B se especializa en producir otras Ig cuando su
IgM de membrana se une al antígeno. Entonces se da un
cambio de clase reversible (IgMIgD) y se producen IgD,
también de membrana, para evitar la autoinmunidad. Entonces
se exponen al antígeno y:
- Se dan cambios de clase irreversibles (IgMIgA, IgG,
IgE).
- Cambios en la línea celular porque cambia el tipo
celular células de memoria (acumulan Ig en la
membrana) y células plasmáticas (Ig secretables,
expresan los factores para hacer el cambio de forma a
Ig Secretable).
La Exclusión Alélica: Sucede cuando se producen las cadenas
pesadas en las células Pre-B. Son 2n, por tanto, tienen el
genoma duplicado. Hay dos copias de cada cromosoma, que
contiene la información para codificar las cadenas. Si uno
de los dos, al fusionar las cajas, rompe la pauta de
lectura o daña la cadena, se inactiva y lo intenta hacer el
otro cromosoma. Tiene otra oportunidad, pero si también
falla, la célula hace apoptosis.
Si ya funciona bien desde el primero, entonces el que
funciona bien bloquea al que aun no se ha activado.
Con la cadena pesada pasa algo parecido, pero si falla la
κ, antes se inactivar al cromosoma se pasa a la λ.
Numéricamente, en Ratón, si se consideran todas las
probabilidades mencionadas hasta ahora, se pueden producir
más de 270 millones de Ac diferentes para reconocer a todos
los antígenos que podrían llegar al organismo.
Genética Molecular.
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En humanos, hay un orden de magnitud más (se producen más
de 2700 millones de Anticuerpos, debido a que hay 1800
combinaciones posibles LVJC de la variable-ligera λ frente
a las 6 de ratón).
Factores que generan la Variabilidad:
- Nº de segmentos V, D, J.
- Uniones aleatorias de DJ y V-DJ es la variabilidad
combinacional, en elegir qué región se une.
- Uniones aleatorias de DJ y V-DJ es la variabilidad
en la juntura/inprecisional, ya que se corre la pauta
de lectura pudiendo producir STOP prematuro o vete tú
a saber.
- Los nucleótidos N añadidos por NTT a los extremos de
las cajas VDJ.
- La
hipermutación
somática
en
la
región
V
y
circundantes.
- Una cadena pesada se puede unir a cualquier cadena
ligera.
Nunca mejor dicho, “en la variedad está el gusto”.
Genética Molecular.
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