BIOBLOT HTLV I Y II

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bioblot HTLV
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3000-1471
18 tests
Ensayo inmunoenzimático cualitativo para la detección de anticuerpos frente a los virus T-Linfotrópicos
humanos tipo I (HTLV-I) y tipo II (HTLV-II) en suero o plasma humanos. Su uso previsto es como análisis
complementario más específico para muestras de suero o plasma humanos que presentan reactividad
repetida utilizando procedimientos de cribado como la técnica de ELISA.
Sumario
Estudios epidemiológicos recientes, realizados en Estados Unidos y Europa, confirman la presencia de prevalencia
mixta de HTLV-I y HTLV-II en diferentes poblaciones de alto riesgo, tales como usuarios de drogas intravenosas.
Existe actualmente una amplia disponibilidad de pruebas de cribado para determinar la presencia de anticuerpos
frente al HTLV-I y HTLV-II. Las muestras que presentan reactividad repetida utilizando procedimientos de cribado,
requieren análisis de confirmación de seropositividad de HTLV-I y HTLV-II más específicos. Dichos análisis deben ser
capaces de identificar anticuerpos anti proteínas de la cápside (gag) y de la envuelta (env). Uno de los tests
complementarios comúnmente usados son tiras de Western blot que incorporan antígenos nativos del virus HTLV-I.
Sin embargo, debido a la falta de antígenos nativos de envelope en el test clásico de Western blot para HTLV-I,
métodos de radioinmunoprecipitación son frecuentemente necesarios para confirmar la presencia de anticuerpos
frente a HTLV-I/HTLV-II. La discriminación entre seropositividad frente a HTLV-I y HTLV-II requiere análisis
complementarios (ej. péptidos específicos, ELISAs, PCR).
El kit bioblot HTLV tiene alta sensibilidad y especificidad tanto para la confirmación como para la diferenciación de
serorectividad frente a HTLV-I y HTLV-II. Eso es posible gracias a la incorporación de MTA-1, proteína
recombinante de envuelta exclusiva del HTLV-I (rgp46-I), combinada con K55, proteína recombinante de envuelta
exclusiva del HTLV-II (rgp46-II) y de una proteína recombinante de envuelta específica de HTLV-I y de HTLV-II
(rgp21). Cada tira incluye también un control interno de adición de muestras para reducir al mínimo el riesgo de
falsos negativos debidos a errores operativos y para garantizar la adición de las muestras.
El uso previsto del kit bioblot HTLV es como análisis serológico complementario para la caracterización de
muestras que presentan reactividad repetida utilizando métodos de cribado. Los posibles perfiles serológicos
definidos por el bioblot HTLV son los siguientes: positivo de HTLV, positivo de HTLV-I, positivo de HTLV-II,
negativo e indeterminado.
Principio
Las tiras de nitrocelulosa incorporan proteínas del virus HTLV-I derivadas de partículas virales nativas lisadas
inactivadas y proteínas obtenidas por ingeniería genética. Las tiras de nitrocelulosa individuales se incuban
muestras diluidas de suero o plasma y controles. Si la muestra contiene anticuerpos específicos frente a HTLV-I/II,
dichos anticuerpos se unirán a las proteínas del HTLV-I/II de las tiras. A continuación se lavan las tiras para
eliminar el material no ligado. Los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas del HTLV se pueden
detectar mediante una serie de reacciones con anticuerpos de cabra anti-IgG humana conjugados con fosfatasa
alcalina y el sustrato BCIP/NBT. La sensibilidad de este método permite detectar en el suero o plasma cantidades
ínfimas de anticuerpos específicos frente al HTLV.
Componentes
1. STRIPS TIRAS DE NITROCELULOSA:
18 tiras de nitrocelulosa que contienen lisado viral de HTLV-I, antígenos recombinantes de envuelta y una
banda de control de adición de suero (anti-IgG humana). Las tiras están numeradas consecutivamente del 1
al 18, o del 19 al 36. Mantener secas y al abrigo de la luz.
2.
CONJ 1000x CONJUGADO CONCENTRADO:
1 x 120 µl de anticuerpos de cabra anti-IgG humana conjugados con fosfatasa alcalina. Contiene azida
sódica.
3.
CONTROL – CONTROL NEGATIVO:
1 x 80 µl de suero humano inactivado negativo en anticuerpos frente a HTLV-I/II, HIV-1, HIV-2, y HCV, y en
antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Contiene azida sódica y mertiolato sódico.
4.
CONTROL + I CONTROL POSITIVO FUERTE HTLV-I:
1 x 80 µl de suero humano inactivado conteniendo un elevado título de anticuerpos IgG frente al HTLV-I.
Negativo en antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y en anticuerpos frente a HCV y HIV-1/2.
Contiene azida sódica y mertiolato sódico.
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5.
CONTROL + II CONTROL POSITIVO FUERTE HTLV-II:
1 x 80 µl de suero humano inactivado conteniendo un elevado título de anticuerpos IgG frente al HTLV-II.
Negativo en antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y en anticuerpos frente a HCV y HIV-1/2.
Contiene azida sódica y mertiolato sódico.
6.
WASH SOLN 20x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA:
1 x 70 ml de tampón Tris concentrado (20x). Contiene Tween 20 y mertiolato sódico.
7.
BLOT BUF LYOPH TAMPÓN DE BLOTTING LIOFILIZADO:
1 x 100 ml de tampón Tris liofilizado. Cada frasco debe rehidratarse con 100 ml de agua de calidad reactivo.
Contiene proteínas animales y no animales inactivadas por calor y mertiolato sódico.
8.
SUBS SUSTRATO:
1 x 100 ml de solución de 5-bromo-4-chloro-3-indolil-fosfato (BCIP) y nitroazul de tetrazolio (NBT). Listo para
usar.
9.
BLOT POW POLVO DE BLOTTING:
10 x 1 g de leche descremada en polvo.
10. TRAYS BANDEJAS DE INCUBACIÓN:
2 bandejas de incubación de 9 pocillos.
11. FORCEPS PINZAS:
1 pinza.
Precauciones
bioblot HTLV es sólo para el diagnóstico IN VITRO.
Para uso exclusivo por profesionales.
Consulte las etiquetas del producto para obtener información sobre los componentes potencialmente peligrosos.
INFORMACIÓN SANITARIA Y DE SEGURIDAD
PRECAUCIONES: Este kit contiene productos de origen humano. Ningún método de análisis permite ofrecer una
garantía absoluta de que los hemoderivados humanos no transmitan una infección. MANIPULE LAS MUESTRAS,
LOS CONTROLES POSITIVO FUERTE I, POSITIVO FUERTE II Y EL CONTROL NEGATIVO COMO SI FUERAN
POTENCIALMENTE INFECCIOSOS. Se recomienda manipular los componentes del kit y las muestras, de
conformidad con las buenas prácticas de laboratorio. Asimismo, deben desecharse siguiendo los procedimientos de
seguridad establecidos.
El control positivo fuerte I, el control positivo fuerte II y el control negativo contienen mertiolato y azida sódica; el
tampón de blotting liofilizado y el tampón de lavado concentrado contienen mertiolato; el conjugado contiene azida
sódica. La azida sódica puede reaccionar con el cobre y el plomo que se utilizan en ciertas tuberías y formar sales
explosivas. Aunque las cantidades que se usan en este kit son pequeñas, los materiales que contienen azida deben
eliminarse con volúmenes relativamente grandes de agua para evitar la acumulación de azidas metálicas en las
tuberías. A continuación figuran las frases relativas a los riesgos (R) correspondientes.
R20/21/22
Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.
El sustrato contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y nitroazul de tetrazolio, clasificados como nocivos (Xn) por las
directivas de la Comunidad Económica Europea (CEE) que son de aplicación. A continuación figuran las frases
relativas a los riesgos (R) correspondientes.
R20/21/22
Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.
1.
Evite la contaminación microbiana de los reactivos al abrirlos y al extraer partes alícuotas de los viales o
frascos originales.
2.
No pipetee con la boca.
3.
Manipule las muestras, las tiras de nitrocelulosa, los controles positivos fuerte I y II y el control negativo como
si fueran potencialmente infecciosos.
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4.
Use bata de laboratorio y guantes desechables mientras realiza el ensayo. Deseche los guantes en bolsas
para residuos biopeligrosos. Lávese bien las manos al finalizar.
5.
Es muy recomendable que este ensayo se lleve a cabo en una cámara de bioseguridad.
6.
Mantenga el material alejado de bebidas y alimentos.
7.
En caso de accidente o contacto con los ojos, lávese inmediata y abundantemente con agua y acúdase a
un médico.
8.
Acuda a un médico de inmediato si ingiere material contaminado o si éste entra en contacto con heridas
abiertas u otras lesiones de la piel.
9.
Limpie de inmediato los vertidos de material potencialmente peligroso con un papel absorbente y lave la zona
contaminada con una solución de hipoclorito sódico al 1% antes de reanudar el trabajo. El hipoclorito sódico
no debe utilizarse para vertidos que contengan ácido, a menos que se seque la zona previamente con un
papel absorbente. Para su eliminación, el material utilizado (incluidos los guantes desechables) debe tratarse
como material de riesgo biológico. No utilice el autoclave para el material que contenga hipoclorito sódico.
10. Esterilice en autoclave todos los materiales usados y contaminados a 121°C y 15 psi durante 30 minutos antes
de desecharlos. Otra opción consiste en descontaminar los materiales con una solución de hipoclorito sódico al
5% durante 30-60 minutos antes de desecharlos en una bolsa para residuos de riesgo biológico.
11. Descontamine todos los productos químicos y reactivos usados añadiéndoles un volumen de hipoclorito sódico
suficiente como para conseguir una concentración final de al menos el 1%. Déjelos en reposo durante
30 minutos para lograr una descontaminación eficaz.
12. No recomendamos la reutilización de las bandejas de incubación.
PRECAUCIONES ANALÍTICAS
1.
Para obtener un rendimiento óptimo del ensayo es necesario un CUMPLIMIENTO ESTRICTO del procedimiento
descrito en el presente Manual de instrucciones. Cualquier modificación del procedimiento puede provocar
resultados anómalos.
2.
NO CAMBIE NI SUSTITUYA LOS REACTIVOS DE UN LOTE DEL KIT POR LOS DE OTRO. Los controles, el
conjugado y las tiras de Western Blot están ajustados para un funcionamiento óptimo. Use sólo los reactivos que
se suministran con el kit.
3.
No utilice los componentes del kit después de la fecha de caducidad que figura en la caja.
4.
Evite la contaminación microbiana de los reactivos al abrirlos y al extraer partes alícuotas de los viales o
frascos originales, ya que ello reduciría de forma prematura el periodo de validez de los kits y daría lugar a
resultados erróneos. Al extraer partes alícuotas de los viales utilice técnicas asépticas, como pipetas o puntas
de pipeta desechables.
5.
Los controles del kit deben analizarse al mismo tiempo que las muestras clínicas en cada serie de análisis.
6.
Para evitar la contaminación cruzada, use una punta de pipeta nueva para cada alícuota de la muestra.
7.
Para obtener resultados óptimos, dispense todos los reactivos mientras todavía estén fríos y vuélvalos a guardar a
2°C - 8°C lo antes posible.
8.
Se aconseja lavar el material de vidrio que se vaya a utilizar para los reactivos con ácido clorhídrico 2M y
aclararlo bien con agua destilada o desionizada antes de usarlo.
9.
Utilice sólo agua destilada o desionizada de calidad reactivo para diluir los reactivos.
10. Todos los reactivos deben mezclarse bien antes de su uso.
11. La solución del conjugado de trabajo, el tampón de lavado diluido y el tampón de blotting deben estar
recién preparados.
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12. La solución del conjugado de trabajo debe prepararse en un recipiente o vaso de precipitado de
polipropileno.
13. No exponga los reactivos ni realice el análisis en un área en la que exista un nivel elevado de vapores de
desinfectantes químicos (p. ej., vapores de hipoclorito) durante las etapas de almacenamiento y de incubación:
el contacto inhibe la reacción de color. Los reactivos tampoco deben exponerse a la luz intensa.
14. Es preferible efectuar el ensayo a temperatura ambiente (25°C ± 3°C).
15. Asegúrese de colocar las tiras con los números hacia arriba.
16. En los ensayos de Western Blot es importante utilizar un agitador con plato basculante; el uso de un agitador
rotativo podría poner en peligro el rendimiento del kit. La velocidad de agitación y el ángulo de inclinación
recomendados son, respectivamente, de 12 a 16 ciclos por minuto y de 5 a 10 grados.
17. Si se utiliza equipo automatizado, debe verificarse que haya sido validado antes de su uso.
18. Asegúrese de añadir las muestras sin que toquen la tira. Para ello, puede inclinar la bandeja y añadir la muestra
en la parte baja donde se acumula el tampón. De este modo se evitará la formación de puntos negros debidos a
la adición de muestra a la tira.
19. No utilice congeladores con función de descongelación automática para conservar los reactivos y las muestras.
Instrucciones de conservación
1. Conserve el bioblot HTLV y sus componentes a 2°C - 8°C cuando no se estén utilizando.
2.
Todos los reactivos y tiras de análisis, si se conservan a 2°C - 8°C, son estables hasta la fecha de caducidad
que figura en el kit. No congele los reactivos.
A.
Tiras de antígenos
- Evite las exposiciones innecesarias de las tiras de antígenos a la luz.
B.
Reactivos
- Conserve los reactivos en sus viales o frascos originales, que deben permanecer tapados.
- Dispense todos los reactivos cuando aún estén fríos y vuélvalos a guardar a 2°C - 8°C lo antes
posible.
- Cuando el sustrato se conserva a 2°C - 8°C puede precipitar, sin que ello afecte al funcionamiento
del kit.
PRECAUCIÓN: Evite las exposiciones innecesarias del sustrato a la luz.
Recolección de las muestras
Se pueden utilizar muestras de suero o plasma con EDTA, heparina o citrato sódico. Antes de guardar las
muestras, verifique que se hayan separado por centrifugación los coágulos o las células sanguíneas.
Las muestras deben conservarse a 2°C - 8°C si el análisis se va a llevar a cabo en los 7 días posteriores a la
extracción, o congelarse a una temperatura de al menos -20°C si el análisis se va a retrasar más de 7 días. Es
preferible utilizar muestras transparentes y no hemolizadas. Las muestras lipémicas, ictéricas o contaminadas
(por partículas o bacterias) deben filtrarse (0,45 μm) o centrifugarse antes del ensayo.
El suero de los pacientes puede estar inactivado, pero no es un requisito indispensable para el funcionamiento
óptimo del análisis.
Para efectuar la inactivación:
1. Afloje las tapas de los recipientes con el suero.
2. Caliente el suero a 56°C durante 30 minutos al baño de agua.
3. Deje enfriar el suero antes de volver a ajustar las tapas.
4. El suero puede conservarse congelado hasta el análisis.
Recomendamos que el suero de los pacientes no se someta a ciclos repetidos de congelación y descongelación
antes del ensayo.
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Material necesario no incluido en el kit
Agua destilada o desionizada.
Guantes desechables.
Plato basculante (con velocidad de balanceo de 12 - 16 oscilaciones por minuto e inclinación de 5° - 10° para lavar
las tiras uniformemente).
Pipetas y puntas del volumen adecuado.
Aspirador con depósito de hipoclorito sódico.
Baño de agua a 56°C (optativo).
Hipoclorito sódico para la descontaminación.
Operaciones previas
1. SOLUCIÓN DE LAVADO DILUIDA
(a) La SOLUCIÓN DE LAVADO DILUIDA debe estar recién preparada.
(b) Diluya 1 volumen de SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA (20X) con 19 volúmenes de agua de calidad
reactivo. Mezcle bien.
2. TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO
(a) Reconstituir cada vial de TAMPÓN DE BLOTTING LIOFILIZADO con 100 ml de agua de calidad reactivo.
Mezclar bien. El TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO es estable durante 6 semanas si se conserva
a 2°C - 8°C.
(b) El TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO debe estar recién preparado.
(c) Añada 1 g de POLVO DE BLOTTING (1 paquete) por cada 20 ml del TAMPÓN DE BLOTTING
reconstituido preparado en el paso 2(a) anterior. Agite hasta que el polvo se disuelva por completo.
(d) Agite de nuevo antes de dispensar la mezcla.
3.
SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO
NOTA: prepare la solución en un recipiente o vaso de precipitado de polipropileno.
(a) LA SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO debe estar recién preparada.
(b) Prepare la SOLUCIÓN DECONJUGADO DE TRABAJO diluyendo CONJUGADO en TAMPÓN DE
BLOTTING DE TRABAJO en proporción de 1:1000; p. ej., 10 µl de CONJUGADO en 10 ml de TAMPÓN
DE BLOTTING DE TRABAJO.
4.
SOLUCIÓN SUSTRATO (lista para su uso)
(a) Dispense el volumen necesario directamente del frasco.
Use una pipeta limpia. Cierre bien el frasco después de usarlo.
Realización del ensayo
NOTA:
a) Aspire todos los productos químicos y reactivos utilizados con un aspirador provisto de depósito con
hipoclorito sódico.
b) Todas las incubaciones deben efectuarse en un plato basculante.
PRECAUCIONES:
Algunas muestras pueden causar manchas oscuras en el punto de la tira en el que se añadieron. Para evitar este
problema, proceda de la forma siguiente:
I.
Añada siempre la muestra después de haber dispensado el TAMPÓN DE BLOTTING.
II.
Incline ligeramente la bandeja elevando su extremo superior o su fondo. El tampón de blotting se desplazará hacia
la zona más baja de la bandeja. Añada la muestra en la zona en la que se haya acumulado el tampón de blotting.
Cuando haya dispensado todas las muestras, devuelva la bandeja a su posición plana inicial. Asegúrese siempre
de que las tiras se mantengan húmedas durante el proceso.
III.
Otra opción, si no desea inclinar la bandeja, es dispensar las muestras en el extremo superior o en el fondo
del pocillo. De esta forma, si aparecen manchas oscuras, la lectura de los resultados de la tira no se verá
afectada.
Procedimiento:
1.
Utilizando unas pinzas, extraiga con cuidado del tubo la cantidad de TIRAS necesaria y
coloque cada tira en su pocillo con el número hacia arriba. Incluya tiras para los controles
positivo fuerte I, positivo fuerte II y negativo.
2.
Añada 2 ml de SOLUCIÓN DE LAVADO DILUIDA a cada pocillo.
2 ml
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3.
Incube las tiras durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente (25 ± 3°C) en un plato
basculante (velocidad 12 a 16 oscilaciones por minuto). Extraiga el tampón por aspiración.
5 minutos
4.
Añada 2 ml de TAMPÓN DE BLOTTING DE TRABAJO a cada pocillo.
2 ml
5.
Añada 20 μl de suero de los pacientes o de controles, según corresponda, en cada uno de
los pocillos. Debe tomar precauciones para evitar añadir las muestras directamente en las
tiras.
20 μl
6.
Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a temperatura
ambiente (25 ± 3°C) en el plato basculante.
60 minutos
7.
Destape la bandeja con cuidado para evitar salpicaduras y el mezclado de las muestras.
Incline la bandeja para aspirar la mezcla de los pocillos. Cambie las puntas del aspirador
entre muestras para evitar la contaminación cruzada.
8.
Lave 3 veces cada tira con 2 ml de SOLUCIÓN DE LAVADO DILUIDA, dejando en remojo
durante 5 minutos en el plato basculante entre los lavados.
3 x 2 ml
9.
Añada 2 ml de SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo.
2 ml
10. Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a temperatura ambiente
(25 ± 3°C) en el plato basculante.
60 minutos
11. Aspire el CONJUGADO de los pocillos. Lave como en el paso 8.
3 x 2 ml
12. Añada 2 ml de SOLUCIÓN SUSTRATO a cada pocillo.
2 ml
13. Cubra la bandeja e incube durante 15 minutos en el plato basculante.
15 minutos
14. Aspire el SUSTRATO y aclare las tiras un mínimo de tres veces con agua de calidad reactivo
para detener la reacción (el lavado insuficiente durante esta etapa puede provocar la
aparición de un fondo oscuro).
3 x 2 ml
15. Utilizando unas pinzas, coloque las tiras con suavidad sobre paños de papel. Cúbralas con
los paños de papel y séquelas. Otra posibilidad es dejar que las tiras se sequen en los
pocillos de la bandeja.
16. Coloque las tiras en una hoja de trabajo (papel blanco no absorbente). No aplique cinta
adhesiva sobre las bandas reveladas. Observe las bandas (véase Interpretación de los
resultados) y califique los resultados. Para el almacenamiento, mantenga las tiras en la
oscuridad.
RESUMEN DE LOS PROTOCOLOS DE ENSAYO
Reactivos
Cantidad
Tiempo
Tiras de nitrocelulosa
1
Solución de lavado
2 ml
5 min
Tampón de blotting
2 ml
Muestra
20 μl
60 min
Solución de lavado
3 x 2 ml
3 x 5 min
Conjugado
2 ml
60 min
Solución de lavado
3 x 2 ml
3 x 5 min
Sustrato (listo para usar)
2 ml
15 min
Agua destilada
3 x 2 ml
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CANTIDAD DE REACTIVOS NECESARIA PARA DIVERSOS NÚMEROS DE TIRAS
Número de tiras a utilizar
Reactivos
3
6
9
15
18
Solución de lavado diluida (ml)
60
100
140
240
300
Tampón de blotting de trabajo (ml)
20
40
60
80
100
Conjugado de trabajo (ml)
10
20
30
40
50
Sustrato (ml)
11
17
23
35
45
Polvo de blotting (g)
1
2
3
4
5
Control de calidad
Recomendamos que se analicen en todos los ensayos los controles negativo y ambos controles positivos fuertes,
independientemente del número de muestras que se analicen. Para que los resultados obtenidos en cualquier ensayo
se consideren válidos se deben cumplir las siguientes condiciones:
1.
CONTROL NEGATIVO
No deben observarse bandas específicas del HTLV-I/II, rgp46-I, rgp46-II o rgp21 en las tiras de control
negativo. La banda de control de suero (anti-IgG humana) debe ser visible.
2.
CONTROL POSITIVO FUERTE I
Todas las bandas del peso molecular relevante deben ser evidentes. En la Figura 1 se muestra una guía de
las posiciones relativas de las bandas visualizadas con el ensayo bioblot HTLV que permite identificar las
bandas que se observan para el CONTROL POSITIVO FUERTE I. Las bandas son p19, p24, gp46, rgp46-I,
rgp21 y posiblemente otras como se ve en la figura 1. Observar que la banda gp46 es difusa. La banda del
control de suero debe ser visible.
3.
CONTROL POSITIVO FUERTE II
Todas las bandas del peso molecular relevante deben ser evidentes. En la Figura 1 se muestra una guía de
las posiciones relativas de las bandas visualizadas con el ensayo bioblot HTLV que permite identificar las
bandas que se observan para el CONTROL POSITIVO FUERTE II. Las bandas son p24, rgp21 y rgp46-II y
posiblemente otras como se ve en la figura 1. La banda del control de suero debe ser visible.
Interpretación de los resultados
NOTA: las tiras reveladas deben estar completamente secas para evitar errores en la interpretación.
La presencia o ausencia de anticuerpos frente al HTLV-I/II en la muestra se determina comparando cada tira de
nitrocelulosa con las tiras de control del ensayo con los controles NEGATIVO y ambos CONTROLES POSITIVOS
FUERTES.
La Figura 1 (vea la última página de este inserto) puede servir de ayuda para la identificación de las diversas
bandas que aparecen en la tira que se ha hecho reaccionar con los dos controles POSITIVOS FUERTES.
El proceso de interpretación consta de los siguientes pasos:
1.
Verificación de que la banda del control de suero es visible. Si el control es negativo, los resultados deben
considerarse no válidos, ya que ello indica un error técnico, como por ejemplo la falta de adición de muestra, de
conjugado o de sustrato.
2.
Identificación del peso molecular de cada banda de la tira de análisis utilizando como guía las tiras del control
POSITIVO FUERTE I, del control POSITIVO FUERTE II o de ambos.
3.
La interpretación posterior de la tira de análisis se basa en la detección de patrones específicos de las bandas
según las recomendaciones de las autoridades pertinentes (Ministerio de Sanidad, Organización Mundial de
la Salud, etc.).
Recomendamos las siguientes directrices para la interpretación del bioblot HTLV. Deben registrarse los resultados de
todas las bandas detectadas, e interpretarse como NEGATIVO, POSITIVO o INDETERMINADO.
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PERFIL
No aparecen bandas específicas del HTLV.
INTERPRETACIÓN
NEGATIVO
Positividad en bandas GAG (p19 con o sin p24) y dos
bandas ENV (rgp46-I y rgp21).
POSITIVO DE HTLV-I
Positividad en bandas GAG (p24 con o sin p19) y dos
ENV (rgp46-II y rgp21).
POSITIVO DE HTLV-II
Positividad en bandas GAG (p19 y p24) y en ENV (rgp21).
HTLV-I POSITIVO si p19 ≥ p24
HTLV-II POSITIVO si p19 < p24
POSITIVO DE HTLV(1)
Una o más bandas específicas de HTLV presentes, pero
su patrón no cumple con los criterios de positividad.
No obstante, los siguientes patrones indeterminados
pueden interpretarse como SERONEGATIVOS:
-
-
HTLV-I GAG patrones indeterminados de Western
blot (HGIP): Presencia de p19, p26, p28, p32, p36,
p53 pero ausencia de p24 y de cualquier banda de
proteína ENV.
Cualquier combinación de proteínas GAG (p19,
p26, p28, p32, p36, p53) pero ausencia de p24 y
de cualquier proteína ENV.
Una única de las proteínas GAG (p19, p24, p26,
p28, p32 p36, p53).
INDETERMINADO(2)
(1)
Muestras seropositivas para HTLV de tipo no identificable pueden ser resueltas utilizándose el algoritmo de
Wiktor et al en ausencia de rgp46-I y de rgp46-II Este algoritmo, que utiliza la reactividad relativa a la p19 y a la
p24 se ha demostrado efectivo en la diferenciación de los dos serotipos.7,11,12,13,14
(2)
La interpretación de indeterminado se basa en las pautas de la OMS de 1990. Sin embargo, varios estudios han
sugerido que algunos patrones indeterminados de bandas (listados arriba) pueden interpretarse como
seronegativos especialmente con donantes sanos.16-25 Por ejemplo, un estudio con 37724 donantes sanos,
confirmó que HGIP puede ser interpretado con seguridad como seronegativo.26 Con todo, hay que tener cautela
cuando patrones indeterminados se obtienen con usuarios de drogas inyectables o con donantes de sangre de
áreas endémicas e con pacientes de enfermedades neurológicas.26,27
Es posible encontrar sueros de personas infectadas con ambos los tipos de HTLV, aunque sea raro. Tales
individuos presentarán un perfil de bandas que indicará positividad tanto para HTLV-I como para HTLV-II. Los
datos disponibles demuestran que la seroreactividad a rgp46-I es específica para HTLV-I mientras que la
seroreactividad a rgp46-II es específica para HTLV-II. Por lo tanto, los sueros reactivos a rpg46-I, rgp46-II, gp21,
p19 y p24 presentan un perfil característico de doble infección.
Limitaciones del método
Para conseguir unos resultados óptimos con este método, deben seguirse de forma estricta los pasos descritos en
el procedimiento. Cualquier desviación puede dar lugar a resultados aberrantes.
Un resultado NEGATIVO no excluye la posibilidad de exposición o infección por HTLV-I o HTLV-II.
Los resultados de blot INDETERMINADOS no deben utilizarse como base para el diagnóstico de infección por
HTLV-I/II.
Se han descrito algunos casos de seroreactividad a la p19 o a la p24 en poblaciones no infectadas de bajo riesgo,
aunque indeterminados de p24 sean relativamente raros.
Los datos disponibles de sensibilidad de la rgp46-I son de 95% en Francia, 100% de las muestras confirmadas por
PCR en Estados Unidos y Jamaica y más del 98% con muestras de donantes de sangre seropositivos para
HTLV-I. La rgp46-II demostró una sensibilidad superior al 98% con muestras confirmadas por PCR en Estados
Unidos.
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bioblot
La sensibilidad total estimada de cada antígeno tipo específico, rgp46-I y rgp46-II, es más del 97%. El pequeño
porcentaje de muestras de HTLV-I y HTLV-II que no reaccionan con rgp46-I ni con rgp46-II son reactivas por lo
menos con rgp21 y una o más bandas GAG, p19 o p24, cumpliendo el criterio de seropositivo para HTLV o
indeterminado. No hay registros de interpretaciones falso negativas.
Ensayos suplementales como el PCR pueden ayudar en la discriminación de muestras seropositivas para HTLV
que no pueden ser identificadas como HTLV-I o HTLV-II con el bioblot HTLV.
Características funcionales
Las características funcionales del bioblot HTLV para la detección de anticuerpos anti HTLV-I y HTLV-II se evaluaron
utilizando muestras seronegativas y seropositivas de HTLV-I/II, por comparación con dos inmunoensayos de línea
(inmunoblots) que incorporan antígenos HTLV-I o HTLV-II (proteínas recombinantes o péptidos).
Sensibilidad:
La sensibilidad del bioblot HTLV se determinó utilizando muestras positivas de anticuerpos anti-HTLV-I o/y
anti-HTLV-II confirmadas por ELISAs comerciales.
A.
Comparación con el Inmunoblot 1
Los resultados de la comparación entre el bioblot HTLV y el inmunoblot 1 para muestras positivas suministradas por
Boston Biomedica, Inc., USA (BBI) y ProMedDx son los siguientes:
Inmunoblot 1
Método
bioblot HTLV
NEG / IND
POS
Total
NEG / IND
3*
0
3
Total
POS
0
102
102
3
102
105
* bioblot HTLV dio 2 resultados indeterminados y 1 negativo, que resultó también negativo con el inmunoblot 1.
El inmunoblot 1 dio 3 resultados negativos.
La discriminación de las 102 muestras positivas de HTLV entre ambos blots es la siguiente:
Método
bioblot HTLV
Inmunoblot 1
HTLV-I
45
48
Interpretación
HTLV-I &
HTLV-II
HTLV-II**
53
4
51
0
Total
No-tipable***
0
3
102
102
** Aparecen marcadores específicos de HTLV-I y HTLV-II que indican co-infección.
***No es posible tipar las clases de HTLV debido a la ausencia de marcadores específicos.
Ambos métodos, bioblot HTLV e inmunoblot 1 reportan resultados similares. Los escasos resultados discrepantes
son debidos a los diferentes antígenos inmovilizados en el blot y a la diferencia de métodos usados.
El bioblot HTLV presenta una sensibilidad de 97,1% equivalente a la obtenida con el inmunoblot 1.
B.
Comparación con el inmunoblot 2
Se estudiaron las siguientes muestras: Panel anti-HTLV-I/II de la Sociedad Francesa de Transfusión de Sangre,
SFTS-94 compuesto por 26 HTLV-I y 6 HTLV-II. Los resultados del bioblot HTLV comparados con los del
Inmunoblot 2 son los siguientes:
Método
bioblot HTLV
Inmunoblot 2
HTLV-I
26
21
Interpretación
HTLV-II
No-tipable
6
0
6
4
Falso NEG
0
1
Total
32
32
El bioblot HTLV identifica correctamente las muestras positivas de HTLV mostrando una sensibilidad > 99,9% en este
panel. Utilizando el mismo panel, el kit de comparación (inmunoblot 2) dio una sensibilidad de 96,9%.
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bioblot
Especificidad:
Se analizó un total de 200 muestras de donantes de sangre resultando una especificidad de 92,5%. 15 muestras
fueron indeterminadas y no se detectaron resultados falsos positivos.
Si se incluyen las siguientes muestras: 150 de procedencia clínica, 50 de embarazadas, 50 potencialmente
interferentes (10 de ictericia, 10 hemolizados ,10 triglicéridos, 10 lipémicos y 10 de proteína total) y 73 con posible
reacción cruzada (TB, Helicobactor pylori, HEV, Dengue, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2), la especificidad global es de
89,2% (461/517). 56 muestras fueron indeterminadas y no se detectaron resultados falsos positivos. 6 muestras
fueron positivos reales confirmados por otro test confirmatorio.
Cláusula de exención de responsabilidad
El fabricante garantiza exclusivamente que el kit de análisis funcionará como ensayo diagnóstico in vitro, de
acuerdo con las especificaciones y limitaciones descritas en el Manual de instrucciones del producto, cuando se
use de conformidad con las instrucciones citadas en el mismo. El fabricante rehusa cualquier garantía, explícita o
implícita, incluida la garantía explícita o implícita relativa a la comercialización, adecuación para el uso o supuesta
utilidad para cualquier fin. El fabricante sólo se obliga a la sustitución del producto o al reembolso del precio de
compra del mismo. El fabricante no será responsable ante el comprador ni ante terceros, de cualesquiera daños,
perjuicios o pérdidas económicas provocados por la utilización o la aplicación del producto.
Problemas técnicos
En caso de problemas técnicos o si desea presentar una reclamación, proceda de la siguiente manera:
1.
2.
3.
Anote el número de lote del kit y su fecha de caducidad y el número de lote de la tira.
Conserve los kits y los resultados obtenidos.
Póngase en contacto con su distribuidor local.
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bioblot: Guía de problemas
Problema
Posibles causas
Problema
1. Aparecen manchas
oscuras en las tiras
1a. Contaminación
bacteriana o fúngica
de la muestra de
ensayo.
4a. Tiras excesivamente
4. Aparece un fuerte
desarrolladas
fondo oscuro en la tira
(detener la reacción
en ausencia o
antes).
presencia de bandas
positivas.
Posibles causas
1b. Precipitación de
inmuno complejos en
muestra de ensayo
envejecida.
1c. Contaminación
bacteriana o fúngica
de las tiras debido a
almacenaje
incorrecto.
2. Aparecen manchas
blancas en las tiras
5. Ausencia de la banda
Control de Suero
5a. Suero no añadido.
1d. Tiras físicamente
dañadas, rotas o
rayadas.
5b. Tiras volteadas
durante el ensayo
1e. Lavado inadecuado
de las tiras entre
etapas del ensayo.
5c. Conjugado no
añadido.
2a. Tiras volteadas
durante el ensayo.
5d. Sustrato no añadido.
2b. Lavado inadecuado
de la bandeja antes
de su uso.
3. Aparecen otras
bandas además de la
banda Control de
Suero en el control
negativo.
4b. Lavado incompleto.
6a. Están rotas.
6. Las tiras son
defectuosas
2c. Disolución deficiente
del polvo de Blotting.
6b. Contienen burbujas
de aire que provocan
la aparición de
manchas blancas en
las zonas reactivas
suficientemente
grandes como para
evitar cualquier
detección.
2d. Interferencias
electrotransblot
durante la fabricación.
6c. Muestran manchas
oscuras, debido al
crecimiento de hongos
después de la apertura
inicial de los tubos. Sin
embargo, si las
manchas oscuras se
desarrollan después
de la apertura inicial
del tubo, el problema
es debido al
inadecuado
almacenamiento de las
tiras por el usuario.
3a. Puede haber
contaminación cruzada
en los pocillos de la
bandeja o los
controles.
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bioblot: Guía de problemas
Problem
Possible causes
Problem
Possible causes
7.1. Las bandas esperadas
no aparecen o son de
intensidad débil.
7.1a.Reactivos no
preparados
adecuadamente.
8. No hay bandas
específicas y/o
aparece fondo
oscuro en las
tiras.
8a. Muestra o dilución del
conjugado incorrecta.
Y control positivo débil.
7.1b.Dilución incorrecta del
conjugado.
El problema es causado 7.1c. Reactivos inestables
debido a una
probablemente por los
temperatura de
reactivos.
exposición inadecuada.
7.1d.Conjugado
contaminado con IgG
humana.
7.1e.pH del sustrato
incorrecto debido su
exposición a una fuerte
luz UV o a un agente
reductor.
7.1f. Bandejas, reactivo(s) o
agua tiene alta
concentración de
fosfato.
7.1g.Plataforma rotatoria
utilizada en lugar de la
plataforma oscilante.
7.2 Las bandas esperadas
no aparecen o son de
intensidad débil.
Y control positivo OK.
7.2a.Dilución incorrecta de la
muestra.
7.2b.Muestra contaminada
con conjugado.
7.2c. Muestra con gran
cantidad de inmuno
complejos.
El problema es causado
probablemente por la
muestra.
8b. Muestra o incubación
de los reactivos
demasiado larga.
8c. Lavado incompleto
durante el ensayo.
8d. Temperatura de
incubación superior a
30°C.
8e. Muestra reactiva con
proteinas no virales.
9a. Bandeja contaminada
con una muestra
postiva o con el control
positivo.
9b. Control
negativo/muestra
contaminados con
control
positivo/muestra.
9c. Misma punta de la
pipeta utilizada para
dosificación y/o
eliminación de las
muestras/control.
9d. La muestra puede ser
un “falso” negativo de
ELISA.
10. Marcas acuosas 10a.Las tiras se dejan
secar antes de la
desarrolladas
adición de tampón
en las tiras.
Blotting.
9. Bandas
específicas de
HTLV detectadas
en el control
negativo y/o en
muestras
negativas
conocidas.
7.2d.IgGs de la muestra
deterioradas o
desnaturalizadas debido
al almacenamiento
inapropiado o a repetidos
ciclos de congelacióndescongelación.
7.2e.Plataforma rotatoria
utilizada en lugar de la
plataforma oscilante.
7.2f. La muestra puede ser
un “falso” positivo de
ELISA.
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FIGURA 1
Control de suero
rgp46-I
rgp46-II
p53
gp46
p36
p32
p28
p26
p24
p19
rgp21
a
b
c
d
Bandas víricas específicas tal y como se ven con:
a.
b.
c.
d.
Un suero con infección doble HTLV-I/II.
Control positivo fuerte I (reactivo sólo para el HTLV-I)
Control positivo fuerte II (reactivo sólo para el HTLV-II)
Control negativo.
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