Análisis Instrumental - Tema 12

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Cromatografía líquida
Tema 12
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
En este capítulo se tratarán diversas formas de cromatografía en las que la fase
móvil es un líquido. Potencialmente, la cromatografía líquida (CL) es más importante
que la cromatografía de gases (CG), ya que, cerca del 80 % de los compuestos químicos
no son suficientemente volátiles para separarlos y determinarlos por CG, y en ellos se
incluyen una gran variedad de especies de interés industrial, biológico y ambiental.
La cromatografía líquida considerada como clásica se lleva a cabo en columnas
abiertas y en ella la fase móvil fluye por gravedad (figura 12.1.a.) o mediante la
aplicación de vacío, con un dispositivo como el representado en la figura 12.1.b.
eluyente
capa protectora
(arena, papel de filtro)
relleno
disco de vidrio sinterizado
.
vacío
a)
b)
Figura 12.1. Cromatografía líquida convencional
Claudio González Pérez
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Tanto en las columnas alimentadas por gravedad, como en las que el proceso se
facilita mediante vacío (también por bombeo del líquido) el mecanismo de la separación
puede ser de adsorción, reparto, intercambio iónico, en función del tamaño
molecular o dependiendo de la afinidad entre los diferentes solutos y la fase
estacionaria, originándose distintos tipos de cromatografía que se considerarán en
este capítulo.
La eficacia de las columnas aumenta a medida que disminuye el tamaño de las
partículas del relleno, si bien, en este caso, la fase móvil fluye con mayor dificultad.
Para solucionar las dificultades derivadas del empleo de fases estacionarias de
tamaños muy pequeños (entre 3 y 10 µm), se requiere una instrumentación sofisticada,
que contrasta con las simples columnas de vidrio usadas en cromatografía clásica.
Estos procedimientos operativos, relativamente modernos, se denominan como
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR o HPLC), cuyas características más
importantes se incluirán también en este capítulo.
En la parte final del capítulo se hará una breve descripción de la cromatografía
de líquidos sobre soporte plano (papel y capa fina), pues con estas técnicas se
consigue la resolución de muchos problemas de forma sencilla y barata. Asimismo, se
hará referencia a la cromatografía de fluidos supercríticos.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA CONVENCIONAL
La cromatografía líquida clásica se lleva a cabo generalmente en columnas de
vidrio como las representadas en la figura 12.1. y cuyas dimensiones dependen de la
cantidad de material a separar. Como regla de uso común, la longitud de la columna
debe ser, por lo menos, equivalente a diez veces su diámetro, de forma que una
columna típica puede ser de 20 cm de largo y entre 1 y 2 cm de diámetro. Para
obtener la máxima eficacia, el relleno de la columna deberá estar constituido por
partículas de tamaños similares y uniformemente empaquetada, evitando que se
formen canales. De este forma, se minimiza la distorsión de las bandas
cromatográficas. Para conseguirlo, la fase estacionaria suele adicionarse a la columna
en forma de suspensión con una porción de la fase móvil, dejando que se asiente
lentamente, proceso que se facilita en ocasiones mediante una suave agitación.
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Cromatografía líquida
La adición de la muestra por la parte superior de la columna se hará en forma de
disolución concentrada, muy cuidadosamente para no remover la fase estacionaria. Con
esta finalidad, suele colocarse en la parte superior de ésta una fina capa de arena,
lana de vidrio o papel de filtro*.
CROMATOGRAFIA DE ADSORCION (CLS)
Las especies químicas (átomos, moléculas, iones) que están en la capa superficial
de un sólido no tienen todas sus cargas eléctricas compensadas y como consecuencia
de ello, presentan fuerzas residuales, o sitios activos, que pueden actuar sobre los
componentes del fluido que baña su superficie, originando fenómenos de adsorción.
Las fuerzas responsables de la adsorción dependen de la naturaleza de la superficie y
de la estructura de las especies adsorbidas, ocurriendo la separación como se indica
en el tema 10 ("Mecanismo de las separaciones cromatográficas").
Adsorbentes. Aunque se ha utilizado una gran cantidad de sólidos como fases
estacionarias en CLS, las más empleadas son la gel de sílice y la alúmina. La gel de
sílice, (SiO2.xH2O), también llamado ácido silícico, es un material que se obtiene por
precipitación en medio ácido de soluciones de silicato sódico. El área superficial, el
tamaño de poro y el pH de la superficie dependen de las condiciones de precipitación.
Así, a pH 3.7. la superficie específica es 830 m2/g, mientras que a pH 5.7, el valor
obtenido es 348 m2/g. Los centros activos son los grupos silanol (Si–O–H)
superficiales, espaciados unos de otros aproximadamente 5 Å, los cuales pueden
desactivarse lentamente por adsorción de agua superficial. Este tipo de agua
adsorbida puede eliminarse fácilmente por calefacción a unos 200 ºC, con lo que se
reactiva el gel, pero si la calefacción se realiza a temperatura del orden de 400 ºC,
tiene lugar una deshidratación irreversible con pérdida de área superficial, debido a la
eliminación de una molécula de agua de dos grupos silanol contiguos, produciéndose un
enlace siloxano, que es cromatográficamente inactivo
– Si–OH –H2 O
– Si
– Si–OH
– Si
O
La alúmina (Al2O3.x H2O) presenta distintos tipos de interacción con los solutos,
ya que, por una parte, tiene sitios activos ácidos en las zonas próximas al Al3+, y
centros básicos en las zonas próximas al O2–. La proporción relativa de centros ácidos
* En ocasiones se utiliza un adaptador de flujo ajustable que se comprime estrechamente contra la parte
superior de la fase estacionaria, de modo que no quede espacio para que la muestra y el disolvente se
mezclen sobre la columna.
Claudio González Pérez
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aumenta con la temperatura de activación, mientras que la superficie puede
desactivarse por adición de agua.
Disolventes. En CLS el disolvente compite con los solutos por los centros activos
de la fase estacionaria, por lo que la elución puede describirse como un
desplazamiento del soluto por el disolvente. Así, cuanto más intensa sea la interacción
disolvente-fase estacionaria, más tiempo pasará el soluto en la fase móvil y, en
consecuencia, más rápidamente será eluido. De hecho, la capacidad relativa de los
distintos disolventes para eluir un soluto dado de una columna, es casi independiente
de la naturaleza del soluto. Por ello, en la práctica, la variable a controlar en
cromatografía de adsorción, es el disolvente.
Una serie eluotrópica es una lista de disolventes ordenados conforme a su
capacidad relativa para desplazar solutos de un adsorbente dado. Así, en columnas de
gel de sílice, el poder eluyente disminuye en el orden siguiente:
agua > metanol > etanol > acetona > acetato de etilo > cloroformo > benceno >
tolueno > tetracloruro de carbono > ciclohexano > hexano
Utilizando series como la citada, es posible seleccionar un disolvente o una
mezcla con el poder eluyente adecuado para llevar a cabo una determinada
separación*.
CROMATOGRAFIA DE REPARTO (CLL)
En la cromatografía de reparto, la fase estacionaria líquida está retenida por un
soporte sólido, que deberá reunir una serie de características ya mencionadas en
relación con la cromatografía gas-líquido. Los soportes sólidos más utilizados en CLL
son: gel de sílice, tierra de diatomeas (Kieselguhr, Celita, etc.) y celulosa, aunque,
también se han usado otros en menor extensión, como almidón o microbolas de vidrio.
La mayor dificultad en relación con el soporte sólido, es la presencia de
fenómenos de adsorción, pues, aunque esté totalmente cubierto por la fase
estacionaria, casi siempre muestra algo de actividad superficial.
Para la separación de una gran cantidad de compuestos orgánicos, se utiliza agua
como fase estacionaria. Esto hace que como eluyentes se usen líquidos cuya
solubilidad en agua sea mínima, tales como cloroformo, tetracloruro de carbono,
hidrocarburos, etc. Sin embargo, como no existe sustancia alguna cuya insolubilidad
* La presencia de impurezas (por ejemplo, metanol en benceno) puede alterar de forma sustancial el poder
eluyente de una determinada sustancia. Por ello, es necesario utilizar disolventes lo suficientemente puros.
Cromatografía líquida
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sea total, siempre, al cabo de cierto tiempo, la fase estacionaria va siendo arrastrada
por la fase móvil fuera de la columna. Este problema puede evitarse, o al menos
paliarse, mediante una pre-saturación del eluyente con la fase estacionaria.
CROMATOGRAFIA DE CAMBIO IONICO (CCI)
La cromatografía de intercambio iónico se basa en el equilibrio de los iones de
soluto entre el disolvente y los sitios cargados en la fase estacionaria (ver la figura
10.5.c.). Esta consta de una matriz (R) con grupos funcionales cargados (A) y
contraiones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con especies de la
misma carga contenidas en la fase móvil (X)
R–A– M+ + X+ <—> R–A–X+ + M+ (intercambio catiónico)
R–A+M– + Y– <—> R–A+Y– + M– (intercambio aniónico)
La competición entre los iones de la muestra y el contra-ión por un determinado
sitio es muy similar a la que existe entre el soluto y el disolvente para los sitios de
adsorción en CLS. De hecho, en ocasiones, se hace referencia a la CCI como
cromatografía de adsorción implicando interacción electrostática, si bien, la
naturaleza de las fases móvil y estacionaria, así como el tipo de muestras a separar,
hace que sea preferible considerarla independientemente de aquella.
Fases estacionarias. Existe una gran variedad de materiales, orgánicos e
inorgánicos, naturales y sintéticos, que presentan propiedades adecuadas para el
intercambio iónico, si bien, normalmente se prefieren sustancias sintéticas conocidas
como resinas de intercambio iónico. Las resinas se preparan introduciendo grupos
ionizables en una matriz constituida por un polímero orgánico, de los cuales el más
común es el poliestireno, obtenido por co-polimerización del estireno y del divinilbenceno.
CH=CH2
CH=CH2
Estireno
CH=CH2
Divinilbenceno
La polimerización da como resultado una estructura tridimensional de carácter
poroso y si se lleva a cabo en suspensión acuosa se obtienen pequeñas esferas con
diámetros que van de 0.1 a 0.5 mm. El grado de entrecruzamiento varía con la
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Claudio González Pérez
proporción de divinilbenceno, que oscila entre 1 y 16 %*. Por otra parte, los anillos
bencénicos pueden modificarse para producir una resina de intercambio catiónico, con
grupos –SO3H o COOH, o una resina aniónica, con grupos –CH2–N+R3 o –CH2–NR2
— CH — CH2— CH — CH 2— CH — CH2—
SO3– H+
SO3–H+
— CH — CH — CH — CH— CH — CH — CH — CH— CH — CH—
2
2
2
2
2
SO3– H+
SO3– H+
Resina de intercambio catiónico (ácido fuerte)
— CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2
+
CH2 N(CH3 )3 Cl–
+
CH2 N(CH3 )3 Cl–
— CH —CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 —
+
CH2 N(CH3 )3 Cl–
+
–
CH2 N(CH3 )3 Cl
Resina de intercambio aniónico (base fuerte)
Las resinas de ácido sulfónico son intercambiadores de ácido fuerte,
encontrándose disociados y pudiendo intercambiar protones prácticamente a cualquier
valor de pH, mientras que las que contienen grupos –COOH el margen de intercambio
suele estar limitado entre 5 y 14.
En cuanto a las resinas aniónicas, las que contienen compuestos de amonio
cuaternario son bases fuertes, mientras que las constituidas por aminas se comportan
como bases débiles. Tanto unas como otras suelen emplearse en forma de cloruros, en
lugar de hidróxidos, debido a la mayor estabilidad de aquellos.
Desde el punto de vista práctico, es importante considerar el grado de
accesibilidad de los iones contenidos en la fase móvil a los centros de intercambio. En
este sentido, las resinas con bajo nivel de entrecruzamiento hacen posible que el
equilibrio de intercambio se establezca rápidamente, mientras que si el nivel de
* El grado de formación de enlaces cruzados se indica con la notación "—XN" después del nombre de la
resina. Así, una resina Dowex 1–X4 contiene 4 % de divinilbenceno.
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Cromatografía líquida
entrecruzamiento es alto, ello significa tamaños pequeños para los poros, con lo que la
resina se hace más selectiva para los iones pequeños. En este caso, la resina presenta
mayor capacidad de intercambio y selectividad, pero tiempos de equilibrio más
elevados.
Selectividad de las resinas. Considérese una resina catiónica con el ión
intercambiable H+ en contacto con una disolución conteniendo el ión monovalente M+.
Se establece el siguiente equilibrio de intercambio:
R– H+ + M+ <—> R– M+ + H+
donde R representa la matriz de la resina. La constante de equilibrio, llamada
coeficiente de distribución o coeficiente de selectividad viene expresada por,
Kd=
M
M
+
R
+
H
H
+
+
R
donde [M+]R y [H+]R representan las concentraciones de M+ y de H+ en la resina*. La
constante Kd representa la afinidad de la resina por los iones M+, respecto a los iones
H+ (en este caso), de forma que cuanto mayor sea el valor de Kd, mayor será la
tendencia a retener los iones M+.
Mecanismo de las separaciones. Cuando una pequeña cantidad de disolución
conteniendo iones M+ se pone en contacto con una resina como la mencionada
anteriormente y se lava con agua, todos los iones M+ reemplazarán a los iones H+ y
quedarán fijados en la parte superior de la columna formando una banda adsorbida
sobre la fase estacionaria. Si Kd es grande, la banda será estrecha y concentrada,
mientras que si es pequeña, la banda será amplia y difusa.
Para desplazar la banda de iones M+ adsorbidos a lo largo de la columna, es
evidente que no puede utilizarse agua, pero sí puede hacerse con un ácido o con una
disolución que contenga otro catión. La velocidad a la que se desplazará la banda de
iones M+ depende del pH del eluyente y del valor de Kd, de forma que dos iones con
diferentes afinidades para la resina (diferentes valores de Kd) se desplazarán a
diferente velocidad y podrá tener lugar la separación correspondiente.
* Cuando las disoluciones se apartan del comportamiento ideal las concentraciones deberán reemplazarse
por las correspondientes actividades.
Claudio González Pérez
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En solución acuosa diluida, la afinidad de los cationes para la resina aumenta con
la carga, y, a igualdad de carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del
ión hidratado, de forma que puede escribirse la siguiente secuencia:
Na+(ac) < Ca2+(ac) < Al3+(ac) < Th4+(ac)
Li+(ac) < Na+(ac) < K+(ac)
Mg2+(ac) < Ca2+(ac) < Sr2+(ac) < Ba2+(ac)
En el caso de las resinas aniónicas, en soluciones acuosas diluidas la afinidad de
los aniones depende de su grado de polarización. En general, los aniones polivalentes
tienen mayor afinidad que los monovalentes y entre aniones de la misma carga, los de
mayor tamaño presentan mayor afinidad,
Cl– < CN– < Br– < NO3– < I– << SO42–
Aplicaciones. Dentro del campo de la química inorgánica es posible la separación
de iones metálicos ordinarios por cromatografía de intercambio iónico. Asimismo, el
desarrollo de métodos de cambio iónico para separaciones de lantánidos y otras
especies fisionables fue fundamental para el desarrollo de los reactores nucleares.
Por otra parte, la CCI se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgánicos y
bioquímicos, incluyendo drogas y sus metabolitos, conservantes alimentarios, azúcares
y preparaciones farmacéuticas, así como a la elucidación de la estructura de proteínas
y ácidos nucleicos.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR (CEM)
La cromatografía de exclusión molecular, también denominada cromatografía de
filtración en geles y cromatografía de permeación en geles, es una técnica que se
aplica fundamentalmente para la separación y caracterización de sustancias de peso
molecular elevado. Se utiliza extensamente en Bioquímica para separar moléculas
grandes como proteínas e hidratos de carbono, si bien, también encuentra aplicaciones
en la química de los polímeros.
Mecanismo de las separaciones y principios teóricos. La fase estacionaria está
constituida por una matriz porosa, cuyos poros tienen un tamaño determinado y están
completamente llenos con el disolvente usado como fase móvil.
10
Cromatografía líquida
Las moléculas de soluto que tienen diámetros significativamente menores que los
poros pueden penetrar en ellos y, de esta manera, ser retenidos durante un cierto
tiempo, mientras que las moléculas que son más grandes que el tamaño medio de los
poros del relleno son excluidas, y, de esta forma, no se retienen, siendo eluidas en
primer lugar (figura 12.2.). Entre estos dos extremos existirán moléculas de tamaño
intermedio, cuya penetración media en los poros depende de su tamaño y cuyo avance
a lo largo de la columna será algo retardado.
.
.
fase estacionaria porosa
moléculas grandes (K=0)
moléculas pequeñas
Figura 12.2. Separación por cromatografía de exclusión molecular.
En el capítulo 10 se dedujo la ecuación
VR = VM + K VS
donde VR es el volumen de retención, VM el volumen muerto, VS el volumen de fase
estacionaria y K la constante de distribución. En cromatografía de exclusión
molecular, VM se denomina generalmente volumen intersticial, Vo, y representa el
volumen de fase móvil que está en el exterior de la matriz porosa, mientras que VS es
el volumen de fluido contenido en los poros de la matriz, y suele representarse por Vi.
Reagrupando la ecuación anterior, se obtiene*,
* La constante K se sustituye frecuentemente por una constante alternativa K , definida por
pr
K pr =
V R– V o
Vt – Vo
Si el material de que está constituida la matriz no ocupara volumen, Vi = Vt – Vo, (Vt=volumen total de la
columna). Sin embargo, como ésto no es así, Vt – Vo será mayor que Vi, aunque Vi es proporcional a Vt – Vo,
puesto que el líquido dentro de las partículas ocupa una fracción constante del volumen de ellas.
Claudio González Pérez
K=
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VR – VM VR – Vo
=
VS
Vi
La constante K caracteriza el comportamiento de un soluto en lo referente a su
retención. Si K=0, el soluto en cuestión es totalmente excluido (VR=Vo), mientras que
para las moléculas pequeñas que penetran libremente en el gel, K=1 (VR=Vo+Vi). Las
moléculas de tamaño intermedio que pueden penetrar en algún grado en el gel, pero no
libremente, presentan valores de K que oscilan entre 0 y 1.
Las sustancias susceptibles de ser separadas por un determinado tipo de matriz
se obtienen a partir de una curva de calibrado como la indicada en la figura 12.3.,
donde se ha representado el peso molecular (Mr) frente a VR.
Figura 12.3. Curva de calibrado y cromatograma de exclusión molecular.
Las moléculas cuyos tamaños sean mayores que el límite de exclusión no son
retenidas por la columna y se eluyen todas juntas, igual que aquellas cuyos tamaños
sean inferiores al límite de permeabilidad.
El fraccionamiento tiene lugar en la zona de permeabilidad selectiva, situada
entre ambos límites, originándose picos que corresponden a solutos individuales. La
selección de un gel para llevar a cabo la separación de una determinada mezcla de
sustancias se hará de forma que sus pesos moleculares incidan en la zona recta del
calibrado*. Comercialmente se dispone de un gran número de geles con diferentes
* Debido a que el peso molecular no está directamente relacionado con el tamaño y la forma de las
moléculas, es necesario indicar, junto con los márgenes de fraccionamiento, el tipo de moléculas que se ha
utilizado para las determinaciones.
12
Cromatografía líquida
márgenes de fraccionamiento. En la figura 12.4. se muestran las curvas de calibrado
de algunos.
Los efectos de la adsorción sobre la superficie de las partículas de gel
normalmente suelen ignorarse, de forma que esta cromatografía puede considerarse
como un tipo de cromatografía de reparto, donde las fases móvil y estacionaria tienen
la misma composición, ya que ésta puede considerarse que es el líquido contenido en el
interior de los poros, y aquella el resto de líquido contenido en la columna.
10 7
IV
10 6
III
Mr
10 5
II
10 4
I
10 3
VR
Figura 12.4. Curvas de calibrado para determinados geles.
Tipos de geles. El gel deberá ser una sustancia químicamente inerte,
mecánicamente estable, con un tamaño de partícula uniforme y con estructura de
poros perfectamente reproducible. Posiblemente, los dos tipos de materiales más
utilizados sean los geles de dextranos con enlaces cruzados y los de poli-acrilamida.
En los geles de dextrano, el material de partida, dextrano, es un polisacárido
lineal, en el que las moléculas de glucosa están unidas mediante enlaces α–1,6. La unión
entre unas y otras cadenas se produce mediante puentes de glicerilo entre grupos
hidroxilo, originándose la siguiente estructura:
O
HO
H 2C
HO
HO
HO
CH 2
O
O
HO
O
OH
OH
O
CH 2
O
HO
O
HO
H
O
O
HO
O
CH 2
O
HO
CH 2 O
HO
O
HO
HO
HO
O
El producto resultante, comercializado con el nombre de Sephadex G, es
insoluble en agua, pero hidrofílico, debido a los grupos –OH residuales, lo cual hace
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Claudio González Pérez
que al ponerlo en solución es acuosas el gel se hinche, reteniendo entre 1 y 20 mL de
agua por gramo de resina seca. En disolventes no polares únicamente tiene lugar un
ligero hinchamiento, por lo que estas sustancias se utilizan casi exclusivamente en
medio acuoso.
Los geles de poliacrilamida, comercializados con el nombre de Bio-Gel P, se
preparan por copolimerización de la acrilamida con N,N'-metilenbisacrilamida y su
estructura puede representarse así:
O
=
CH 2 =CH–CONH
2
(CH 2 =CH–C–NH–)
Acrilamida
CONH
– CH
2 –CH–CH
2
2 –CH–CH
.
CONH
2 –CH–CH
CONH
CONH
2 –CH–CH
2 –C H
–
CONH
CH 2
– CH
2 CH 2
NN'-metilenbisacrilamida
CONH
2
2 –CH–CH
2 –CH–CH
CH 2
CONH
CONH
2 –CH–CH
2 –CH–
2
CONH
2
CONH
CH 2
CONH
–CH–CH
CONH
2 –CH–CH
2
CONH
2 –CH–CH
2 –CH–CH
2 –CH–
CONH
Los geles de poliacrilamida se comportan de forma similar a los geles de
dextrano, si bien son menos resistentes a los álcalis y los grupos amida pueden
hidrolizarse a ácidos carboxílicos cuando se ponen en contacto con disolventes de pH
extremos.
Los materiales descritos no son los únicos que se utilizan en cromatografía de
exclusión molecular. Los hay de naturaleza inorgánica, como la gel de sílice y el vidrio
poroso y otros de naturaleza orgánica como los co-polímeros de estireno–
divinilbenceno que se describieron en relación con la C C I. Estos polímeros (sin los
grupos sulfónicos) se hinchan en disolventes como el tolueno o el cloruro de metileno,
y forman fases útiles para la cromatografía de macromoléculas que son solubles en
disolventes orgánicos.
Aplicaciones. La aplicación más simple de la CEM es la separación de dos grupos
de sustancias con pesos moleculares muy diferentes. Es posible le eliminación de
especies de bajo peso molecular de disoluciones que contengan moléculas grandes,
mediante el paso a través de una columna de filtración en gel. La técnica, conocida
como desalinización, es útil, por ejemplo, para la separación de hemoglobina y cloruro
sódico. Asimismo, es posible el fraccionamiento de mezclas más o menos complejas de
14
Cromatografía líquida
diferentes materiales, como péptidos, ácidos nucleicos, enzimas, polisacáridos, etc.
Por otra parte, la técnica puede usarse con fines analíticos o a escala preparativa.
Otra aplicación de la CEM es la determinación de pesos moleculares comparando
los volúmenes de elución de patrones. Sin embargo, debe considerarse que moléculas
con el mismo peso molecular pero distinta forma exhiben diferentes características
de elución.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD (CA)
La cromatografía de afinidad es, desde el punto de vista experimental, una
técnica que generalmente se usa con fines preparativos más que analíticos. Se ha
convertido en una herramienta importante en la investigación biomédica y consiste
básicamente en lo siguiente: una especie (un ligando bio-específico) que interaccione
con un solo soluto de una mezcla compleja se une covalentemente a la matriz de la
fase estacionaria de una columna (figura 12.5.a.). Cuando la mezcla se hace pasar a
través de la columna, únicamente el mencionado soluto queda retenido, siendo
eliminados por lavado todos los demás (figura 12.5.b.), después de lo cual, el único
soluto retenido se eluye mediante el cambio de las condiciones experimentales al
debilitar lo suficiente el enlace gel-ligando (figura 12.5.c).
matriz
estacionaria
ligando bioespecífico
mezcla
.
b)
a)
lavado
elución
c)
Figura 12.5. Representación esquemática de la cromatografía de afinidad.
La matriz deberá estar constituida por partículas de tamaño uniforme, porosas,
inertes y estables. Con esta finalidad, en muchas ocasiones, se utilizan geles de
dextrano, geles de poliacrilamida, celulosa, vidrio poroso y, muy frecuentemente, las
Sepharosas, que es el nombre comercial de la agarosa con enlaces cruzados*. La unión
entre el ligando y la matriz normalmente se hace a través de los grupos –OH de ésta,
y debe poder realizarse en condiciones suaves, por lo que se hace necesario activar la
matriz.
* La agarosa es un polisacárido de galactosa y anhidrogalactosa. Es un componente del agar que se obtiene
de un tipo de algas marinas.
15
Claudio González Pérez
La activación de la matriz puede llevarse a cabo por reacción con bromuro de
cianógeno, con lo que se forma un imido-carbonato,
—OH
—O
+ CNBr
—OH
C=NH + HBr
—O
imidocarbonato
En una etapa posterior, el ligando reacciona con la matriz activada para originar
el material con que se llenará la columna cromatográfica.
=
NH
—O
—O
—O—C—NH–proteina
C=NH + H2 N–proteina
—OH
Con frecuencia, el ligando está situado demasiado cerca de la matriz, lo cual
dificulta o impide su asociación con la especie a retener, especialmente si se trata de
macromoléculas (figura 12.6.a). Este problema se resuelva por vía química con los
denominados "brazos de extensión", que son simplemente cadenas de hidrocarburos
situados entre la matriz y el ligando (figura 12.6.b.)
.
.
b)
a)
Figura 12.6. "Brazo de extensión" en cromatografía de afinidad.
Casi todas las aplicaciones de la cromatografía de afinidad inciden en el campo
de la Bioquímica, donde se utilizan las interacciones específicas en las que están
implicados enzimas y sustratos o coenzimas, anticuerpos y antígenos, receptores y
hormonas, etc. Hay que mencionar que esta forma de cromatografía es la única en la
que se diseña la fase estacionaria para que interactúe con un soluto particular.
Cromatografía líquida
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CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION
(CLAR o HPLC)
Los avances obtenidos en el desarrollo de la instrumentación científica
consiguieron que al final de la década de 1960 fuese posible el análisis de mezclas
complejas por cromatografía de gases en cuestión de minutos o incluso segundos,
pudiéndose detectar, en las condiciones más favorables, cantidades de sustancias del
orden de los nano-gramos, y algunas veces de los pico-gramos. Sin embargo, para
muestras no volátiles, la cromatografía líquida clásica, a pesar de haber demostrado
un gran poder de separación, no alcanzaba la eficiencia y la sensibilidad de la CG, ya
que, en muchas ocasiones, era necesario invertir horas para la elución, recoger
fracciones de forma manual conteniendo miligramos o gramos de material eluido y
utilizar litros de disolvente. Era, pues, necesario lograr que la CL proporcionase unas
prestaciones similares a las logradas con la CG. Para ello, tenía que acelerarse,
automatizarse y adaptarse a muestras mucho más pequeñas. Como consecuencia de los
esfuerzos efectuados en estas direcciones, surgió la moderna Cromatografía Líquida
de Alta Resolución (CLAR o HPLC*)
PRINCIPIOS BASICOS
El primer aspecto considerado en orden a optimizar la CL fue incrementar la
velocidad de la fase móvil, lo cual puede hacerse sin demasiados problemas mediante
la utilización de bombas adecuadas y conexiones de tubos que impidan fugas, al estar
sometido el líquido a presiones elevadas. Sin embargo, con fases estacionarias
convencionales, el empleo de altas velocidades de fase móvil implica una pérdida de
resolución. Para mejorar ésta, se hace necesario modificar el empaquetamiento de la
fase estacionaria, lo cual se considerará seguidamente en conexión con la ecuación de
van Deemter,
H=A+
B
+Cu
u
que, aunque desarrollada para cromatografía en fase gaseosa, es razonable considerar
que el ensanchamiento de las bandas en CL se debe al mismo tipo de factores.
La resolución en cromatografía líquida se mejora al disminuir el tamaño de las
partículas de la fase estacionaria, lo cual, en primer lugar, reduce el término A de la
* Ya se indicó en el capítulo 10 que las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominación inglesa
High Performance Liquid Chromatography, si bien, en algunos artículos las mencionadas siglas significa "alta
presión", High Pressure.
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Claudio González Pérez
ecuación de van Deemter, ya que las trayectorias seguidas por la fase móvil son más
uniformes en el caso de partículas de menor tamaño.
En relación con la difusión longitudinal, B/u, este término es importante en
cromatografía de gases, pero como la difusión es mucho más lenta en los líquidos, el
ensanchamiento de las bandas por este motivo en CL solo es significativo cuando la
velocidad de flujo es excesivamente lenta.
El término de resistencia a la transferencia de masa, Cu, es fundamental, ya que,
con velocidades de flujo elevadas, se conseguirán bajas resoluciones, al menos que la
transferencia de solutos entre las fases móvil y estacionaria sea muy rápida. A esto
colabora decisivamente la reducción del tamaño de las partículas de la fase
estacionaria. Los materiales que normalmente se utilizan en cromatografía líquida
convencional están constituidos por partículas de tamaño relativamente grande (150
µm ó más) y con poros profundos, como se representa en la figura 12.7.a. Estos poros
se llenan con porciones estancadas de fase móvil y es posible que las moléculas de
soluto penetren en ellos a una profundidad tal que su regreso por difusión al líquido
móvil sea lento. Esto es favorable en CL convencional, que trabaja con lentas
velocidades de flujo, pero cuando se opera con velocidades de flujo elevadas, se
origina un ensanchamiento de bandas excesivamente grande.
poro
superficial
poro
profundo
poro
superficial
50 µm
150 µ m
5 µm
1-2 µm
al detector
al detector
al detector
Diámetro de partícula
Longitud de la columna
Diámetro de la columna
Presión
150 µm
50-200 cm
20-30 mm
Š 1 atm.
a
40-70 µm
50-100 cm
1-3 mm
30-50 atms.
5-10 µm
10-50 cm
2-6 mm
100-200 atms.
b
c
Figura 12.7. Columnas y fases estacionarias en CL. a) CL convencional. b) HPLC con partículas
peliculares. c) HPLC con partículas microporosas.
Cromatografía líquida
18
Los primeros intentos satisfactorios para mejorar las prestaciones en el sentido
indicado, condujeron a la utilización de fases estacionarias de partículas peliculares,
constituidas por partículas esféricas de un material sólido no poroso (frecuentemente
bolitas de vidrio de unos 40 µm de diámetro) recubiertas de una capa superficial
porosa y de espesor muy pequeño (entre 1 y 3 µm ). Esta capa puede ser gel de sílice,
alúmina o geles de poliamida (figura 12.7.b.). De esta forma, la presencia de poros
superficiales facilita considerablemente el proceso de transferencia de masa. Sin
embargo, debido al pequeño espesor de la película porosa, el volumen de la fase
estacionaria, VS, es pequeño, por lo que este tipo de columnas no resultan adecuadas
para cromatografía preparativa.
En época relativamente reciente se ha incrementado el uso de una nueva generación
de materiales de partículas micro-porosas con tamaños inferiores a 30 µm y que son
totalmente porosos (figura 12.7.c.). Estas fases estacionarias no pueden conseguirse
mediante simple pulverización, ya que de esta forma se obtienen partículas muy
irregulares, sino que requieren la utilización de una tecnología diferente. En cualquier
caso, tanto con partículas peliculares como con partículas micro-porosas, el precio a
pagar es la elevada resistencia al flujo. Por ello, es necesario utilizar presiones
elevadas para forzar el paso de líquido a través de la columna. Normalmente, se
requieren presiones que pueden llegar a ser de hasta 200 atmósferas para
velocidades de flujo de 0.5 a 5 mL/min.
La utilización de columnas de pequeño diámetro presenta ciertas ventajas, sobre
todo en análisis de trazas, si bien, aunque la reducción del diámetro de la columna a
niveles capilares también aumenta la resolución, tales columnas no son de uso común en
HPLC.
INSTRUMENTACION
Los componentes básicos de un sistema para HPLC se han representado
esquemáticamente en la figura 12.8. y son:
*
*
*
*
*
*
Depósitos para la fase móvil.
Sistema de bombeo para proporcionar presión a la fase móvil.
Dispositivo para la introducción de la muestra.
Columna cromatográfica.
Detector.
Sistema para el tratamiento de datos y registrador.
19
Claudio González Pérez
Como algunas fases móviles usadas en HPLC pueden ser químicamente activas,
como ácidos, bases o líquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema
estén fabricados con materiales resistentes a esos posibles ataques. La mayoría de las
partes del cromatógrafo en contacto con la fase móvil suelen estar fabricadas con
acero inoxidable, previamente pasivado con ácido nítrico 6 M, de forma que en esas
condiciones, su superficie es resistente al ataque de la mayoría de los disolventes, con
excepción del ácido clorhídrico. Las mayores ventajas del acero residen en su coste
relativamente bajo, la facilidad para construir con él los distintos componentes y la
resistencia mecánica, lo que permite operar a presiones muy elevadas.
He
Introducción de la muestra
Columna
Registro
Disolvente
.
Bomba
Detector
.
Figura 12.8. Componentes básicos de un sistema para HPLC.
En cromatografía de gases se hacía necesario un control bastante estricto de la
temperatura de trabajo. Sin embargo, en cromatografía líquida, este control no suele
ser tan necesario, debido a que la transmisión de calor del soluto entre las fases móvil
y estacionaria es mucho más pequeña. Por ello, los cambios en la temperatura ejercen
menos influencia sobre el grado de retención y la resolución. Esto hace que en muchas
aplicaciones no sea necesario un control estricto de esta variable y las columnas
trabajen a temperatura ambiente. De cualquier forma, es posible el control de la
temperatura mediante el empleo de hornos que la regulan desde la del ambiente hasta
150 ºC, o bien mediante el encamisado de la columna.
Cromatografía líquida
20
CARACTERISTICAS DE LAS FASES MOVILES Y SISTEMAS DE
ELUCION
Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase móvil (y las tuberías que la
conduzcan) tienen que ser inertes, esto es, el disolvente no deberá extraer especie
alguna del material con que estén construidos. Generalmente se usan botellas de vidrio
y tubos de teflón, provistos éstos últimos de un sistema de filtros para eliminar
cualquier partícula que pueda contener la fase móvil.
Los disolventes más utilizados en HPLC suelen ser agua, disoluciones tampón
acuosas y disolventes orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas.
En cualquier caso, todos los disolventes deberán ser espectroscópicamente puros,
exentos de partículas sólidas y desgasificados. Esto puede llevarse a cabo por
filtración a vacío a través de filtros de 0.22–0.45 µm, o mediante el burbujeo con un
gas inerte muy poco soluble, como nitrógeno o helio. La des-gasificación reduce la
posibilidad de formación de burbujas en la válvulas de las bombas y en los detectores.
Asimismo, es importante porque se reduce el ruido de fondo cuando se utiliza un
detector ultravioleta, y porque se evita la interferencia del oxígeno disuelto en la
detección fluorimétrica. Además, es fundamental cuando se utiliza elución por
gradiente en fase inversa, especialmente con gradientes de presión baja, ya que de
esta forma se evita la formación de burbujas de aire cuando se mezclan el agua y el
disolvente orgánico.
Aunque la separación de muchas mezclas se lleva a cabo utilizando un disolvente
de composición constante (elución isocrática), en ocasiones se usa la elución por
gradiente, en la cual se cambia la composición de la fase móvil durante el desarrollo
del cromatograma. Con ello se consigue aumentar la eficiencia de la separación, con
unos efectos similares a los producidos por la programación de temperatura en
cromatografía de gases. El esquema representado en la figura 12.8. corresponde a un
sistema de este tipo con dos disolventes.
SISTEMAS DE BOMBEO
Como consecuencia de las elevadas presiones de trabajo, debido al pequeño
tamaño de las partículas de la fase estacionaria, es necesario utilizar bombas que
proporcionen un flujo aceptable de eluyente. Los sistemas de bombeo usados en HPLC
deberán reunir las siguientes características:
* Estar construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados.
Claudio González Pérez
21
* Suministrar un flujo de eluyente libre de pulsaciones, en el margen
comprendido entre 0.1 y 10 mL/min con una precisión del 0.5 %.
* Generar presiones superiores a 6000 psi (lb/in2)*.
La mayor parte de los sistemas de HPLC utilizan las denominadas bombas
recíprocas, cuyo principio de funcionamiento se ilustra en la figura 12.9.
Estas bombas consisten en un pistón de zafiro situado en el interior de una
cámara de volumen reducido (35–400 µL) que, alternativamente succiona eluyente
contenido en un depósito a baja presión y lo impulsa hacia la columna a presión alta,
mediante un sistema de válvulas como el representado esquemáticamente en la figura
12.9. Con este dispositivo se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal
constante, pudiéndose adaptar fácilmente a la técnica de elución con gradiente,
debido a su pequeño volumen interno. Sin embargo, producen un flujo pulsante que se
ha de amortiguar convenientemente, para lo cual se utiliza en ocasiones un sistema
constituido por dos pistones.
Válvula de salida
Pistón
Válvula de entrada
Eluyente
Figura 12.9. Principio de funcionamiento de una bomba recíproca.
Las bombas de desplazamiento se utilizan mucho menos que las anteriores y
básicamente consisten en una cámara relativamente grande equipada con un
mecanismo de tornillo (figura 12.10.). Suministran un flujo libre de pulsaciones, pero
presentan el inconveniente de su capacidad limitada (≅250 mL).
* Las presiones que se generan en HPLC, a pesar de ser muy elevadas, no constituyen peligro de explosión,
debido a la incompresibilidad de los líquidos. Unicamente, si el disolvente es inflamable, existirá riesgo de
incendio como consecuencia de la rotura de algún componente.
22
Cromatografía líquida
Válvula
de entrada
Válvula
de salida
Eluyente
Columna
Cámara conteniendo
eluyente
Figura 12.10. Bomba de desplazamiento.
Las bombas neumáticas hacen uso de la presión de un gas aplicado al recipiente
conteniendo la fase móvil. Estas bombas son muy sencillas y no provocan pulsaciones, si
bien, están limitadas a presiones relativamente bajas.
INTRODUCCION DE LA MUESTRA
La introducción de las muestras en la columna cromatográfica es frecuentemente
el factor controlante de la reproducibilidad de las medidas. Los volúmenes a inyectar
deberán ser pequeños, para evitar la sobrecarga de la columna y se ha de introducir la
muestra sin despresurizar el sistema.
La forma más simple de inyectar la muestra es utilizar un diafragma ("septum")
análogo al utilizado en cromatografía de gases (ver la figura 11.3.a.), si bien este
sistema está limitado a una presión máxima de operación de 1500 psi.
El método más utilizado en HPLC consiste en usar válvulas de inyección con
bucles de volumen conocido, como el representado en la figura 10.17 (Capítulo 10) y,
más esquemáticamente, en la figura 12.11.
Bomba
Bomba
Columna
Columna
Jeringa
.
Entrada de
muestra
Bucle
a)
b)
Figura 12.11. Válvula de inyección. a) Llenado. b) Inyección.
Claudio González Pérez
23
En la posición de llenado (figura 12.11.a.), la fase móvil pasa directamente a la
columna, y la muestra se introduce en el bucle mediante una micro-jeringa. Una vez
lleno el bucle, se gira la válvula a la posición de inyección (figura 12.11.b.) en la que la
fase móvil impulsa la muestra hasta la columna. Un inconveniente que presenta este
sistema es que la precisión de la inyección varía con el tamaño del bucle.
COLUMNAS, FASES ESTACIONARIAS Y FASES MOVILES
Las características físicas de las columnas usadas en HPLC (longitud, diámetro)
se han indicado anteriormente (ver figura 12.7.), así como los tamaños de las
partículas que constituyen la fase estacionaria (partículas peliculares, partículas
micro-porosas). En cuanto a la resolución, lo normal es operar con columnas que tienen
entre 40000 y 60000 platos teóricos por metro.
Cromatografía de adsorción
Las únicas sustancias usadas como fase estacionaria en este tipo de
cromatografía son la gel de sílice y la alúmina, siendo aquella la preferida en casi todas
las aplicaciones.
Como ya se indicó en relación con la CLS convencional, la gel de sílice presenta
gran actividad superficial, debido a la presencia de grupos silanol, los cuales pueden
interaccionar con grupos funcionales polares presentes en las moléculas de soluto,
tales como alcoholes, aminas, cetonas y ácidos carboxílicos.
La desactivación de la gel de sílice tiene lugar por hidratación, pudiéndose
distinguir entre agua débilmente unida, y que puede eliminarse fácilmente por
calefacción o por extracción, agua enlazada más fuertemente y agua presente como –
OH en grupos silanol contíguos, y que únicamente puede eliminarse por calefacción
fuerte. En los dos primeros casos, la deshidratación es reversible, mientras que en el
último, es irreversible.
El tamaño de los poros superficiales influye sobre el proceso de deshidratación.
Así, puede considerarse que la superficie interna de los poros está recubierta de
grupos hidroxilo. Si se trata de poros anchos, la pérdida de agua tiene lugar a 110 ºC,
originándose grupos siloxano, poco importantes cromatográficamente, y que pueden
re-hidratarse con facilidad (figura 12.12.a.). Si, por el contrario, se trata de poros
estrechos, la deshidratación puede transcurrir como se representa en la figura
24
Cromatografía líquida
12.12.b., en cuyo caso, el proceso es irreversible y conduce a una pérdida efectiva de
área superficial debida al entrecruzamiento producido.
Si
Si — OH
∆
Si — OH
O
Si
H2O
a) Poros anchos
Si
OH
HO
Si
∆
Si
O
Si
b) Poros estrechos
Figura 12.12. Tamaño de poro y deshidratación.
La composición de la fase móvil es prácticamente la única variable que puede
utilizarse para optimizar las separaciones de mezclas de solutos. Como se indicó en
relación con la cromatografía de adsorción convencional, una serie eluotrópica es un
listado de disolventes ordenados según su capacidad relativa para desplazar solutos
de un adsorbente dado. Una forma de cuantificar la fuerza de los disolvente es
utilizar el parámetro denominado fuerza eluyente, εo, que se define como la energía
de adsorción del disolvente por unidad de área. Sin embargo, con frecuencia, un
disolvente solo no resulta adecuado para una determinada separación, recurriéndose
en estos casos a mezclas binarias o ternarias, con objeto de encontrar la más
adecuada en cuanto a su fuerza eluyente. Para ello, puede utilizarse el tanteo, si bien,
es más conveniente usar ciertos métodos que se han desarrollado con esa finalidad.
Por otra parte, para la resolución de determinadas mezclas, en ocasiones, es
necesario llevar a cabo una elución por gradiente, en lugar de hacerlo isocráticamente.
Cromatografía de reparto
En cromatografía de reparto, las fases móvil y estacionaria deben seleccionarse
de forma que la solubilidad recíproca sea mínima. Sin embargo, por muy distintos que
sean dos líquidos, siempre serán algo miscibles y, por ello, la fase móvil deberá
presaturarse con la fase estacionaria antes de ponerse ambas en contacto dentro de
la columna. Esta pre-saturación puede efectuarse simplemente por agitación de ambas
25
Claudio González Pérez
hasta que se equilibren, si bien, suele ser preferible utilizar una pre-columna situada
antes del sistema de introducción de las muestras. La pre-columna deberá contener un
relleno de gran área superficial, tal como gel de sílice, recubierto con una cantidad
relativamente grande (30-40%) de la sustancia usada como fase estacionaria. Sin
embargo, cuando la fuerza del disolvente es lo bastante elevada para disolver
cantidades apreciables de fase estacionaria, la pre-saturación se hace difícil. Por otra
parte, evidentemente, el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide
utilizar la técnica de la elución con gradiente.
Cromatografía de fase enlazada (CFE)
Las limitaciones mencionadas que presenta la cromatografía de reparto —
encontrar pares de líquidos inmiscibles, pre-saturación de la fase móvil e imposibilidad
de la elución por gradiente — pueden superarse con la cromatografía de fases
enlazadas. En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria se une químicamente a
la superficie del soporte sólido, el cual casi siempre está constituido por
micropartículas de gel de sílice, cuyos diámetros oscilan entre 3 y 10 µm. Los grupos –
OH pueden ser silanizados por reacción con organocloro u organoalcoxisilanos para
formar enlaces siloxano estables
CH3
CH3
Si—O–Si–R+ HCl
Si— OH + Cl–Si–R
CH3
CH3
Así, por ejemplo, con octadecilclorosilano, el proceso es,
Si— OH + C18H37Si(CH3 )2 Cl
CH3
Si—O–Si–C18H37
CH3
Los grupos silanol residuales que no hayan reaccionado
desactivarlos, lo cual suele hacerse con clorotrimetilsilano.
es
necesario
Considerando las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria, se
distinguen, como ya se mencionó, dos tipos de cromatografía. En la cromatografía en
fase normal, la fase estacionaria es polar, utilizándose como tales, rellenos en los que
R en la estructura del siloxano puede ser un grupo ciano (–C2H4CN), diol (–
C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (–C3H6NH2) y dimetilamino [–C3H6N(CH3)2]. La
elución se lleva a cabo con disolventes no polares, como etiléter, cloroformo o nhexano. Operando en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido
a que es el más soluble en la fase móvil, y un aumento de la polaridad de ésta, hace
disminuir el tiempo de elución.
Cromatografía líquida
26
En la cromatografía en fase inversa, que es la utilizada en la mayoría de las
aplicaciones, la fase estacionaria es no polar, tratándose frecuentemente de
hidrocarburos tales como C8 (n-octilo) ó C18 (n-octadecilo). Los tiempos de retención
aumentan al hacerlo la longitud de la cadena de la fase enlazada. Para una determinada
fase, en esta modalidad de fase inversa, los componentes más polares aparecen
primero y un aumento de polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución. Los
grupos de hidrocarburos de cadena larga se alinean unos junto a otros,
perpendicularmente a la superficie de la partícula, originando una estructura
semejante a la de un cepillo. La elución se lleva a cabo con una fase móvil de polaridad
elevada, como disoluciones acuosas conteniendo metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano.
La principal limitación de estas fases enlazadas con base silícea reside en que el
pH del eluyente debe estar comprendido entre 2 y 8, para evitar la hidrólisis de la
fase estacionaria. El mecanismo de retención por las fases enlazadas no está
suficientemente claro. Para algunos, el proceso es análogo al que tiene lugar en la
cromatografía convencional líquido-líquido, si bien, parece que simultáneamente puede
participar también un mecanismo de adsorción.
En cromatografía líquida, la selección de la columna y de la fase móvil para la
separación de una mezcla determinada es un problema más complicado que en
cromatografía de gases, ya que en aquella, los componentes de la muestra
interaccionan con ambas fases, móvil y estacionaria, mientras que en CG la fase móvil
únicamente se comporta como portador de los componentes a través de la columna.
Para elegir una columna puede utilizarse la norma siguiente: la polaridad de la
fase estacionaria debe ser bastante similar a la de los analitos, y para la elución
se utiliza entonces una fase móvil con una polaridad considerablemente distinta.
Esta norma tiene el inconveniente de que si la diferencia de polaridades es muy
grande, los tiempos de retención pueden ser excesivamente largos. También podría
utilizarse una fase estacionaria cuya polaridad fuese muy diferente a las de la fase
móvil y los componentes de la muestra, si bien, en este caso, los tiempos de retención
podrían ser demasiado cortos. En la práctica, se suele elegir la fase estacionaria de
una manera general, y seguidamente seleccionar la fase móvil empíricamente, después
de realizar una serie de ensayos.
Además de los tipos de cromatografía mencionados, se han desarrollado fases
estacionarias para separaciones por HPLC mediante los mecanismos de intercambio
iónico, exclusión molecular, así como fases quirales para la resolución de
enantiómeros. Esta cromatografía quiral implica un proceso de derivatización precolumna en el cual los componentes D- y L- de una mezcla racémica reaccionan con un
27
Claudio González Pérez
compuesto puro ópticamente activo para originar una mezcla de diastereoisómeros, la
cual puede resolverse por HPLC, en fase normal o inversa.
En las páginas anteriores se ha hecho referencia a todo un conjunto de tipos
distintos de HPLC y de fases estacionarias. El problema que se presenta en la práctica
es: ¿cual de ellos se elegirá para una determinada mezcla?. En este sentido, puede
decirse que en la mayoría de los casos se utiliza un método conocido, por haber sido
previamente publicado. Si esto no es así, o no se dispone de la columna requerida,
puede utilizarse en plan orientativo el cuadro representado en la tabla 12.1., si bien,
hay que tener en cuenta que suele haber varias formas posibles para separar los
componentes de una mezcla dada.
Tabla 12.1.
Guia simplificada para la elección del tipo de HPLC.
Compuesto
Cromatografía
agua
iónico
CCI
no iónico
C F E normal
ciano, amino
CH3OH
C F E normal
ciano, amino,
diol
CHCl3
C. Adsorción
sílice
hexano
C F E inversa
C8, C18, fenil,
ciano
Tamaño
Cromatografía
Peso molecular
< 2000
Solubilidad
Compuesto
iónico
Peso molecular
Fase
estacionaria
Solubilidad
agua
CCI
< 30 nm
C F E inversa
30-400 nm
CEM
disolventes
< 30 nm
C F E inversa
orgánicos
30-400 nm
CEM
>2000
no iónico
Cromatografía líquida
28
DETECTORES
En HPLC no existen detectores de uso tan general como lo son el de
conductividad térmica o el de ionización de llama para cromatografía de gases. Por
ello, se utilizan distintos tipos de sistemas de detección que pueden clasificarse de la
forma siguiente:
Absorbancia ultravioleta
Propiedad del soluto
Fluorescencia
Electroquímicos
Indice de refracción
Propiedad de la disolución
Conductividad
Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a una propiedad
física o físico-química del soluto, y que generalmente no la presenta la fase móvil.
Estos detectores suelen ser bastante selectivos y muy sensibles. Por su parte, los
detectores basados en una propiedad de la disolución comparan el cambio global de
alguna propiedad física de la fase móvil con y sin soluto eluido. Estos detectores
responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles.
Un detector ideal en HPLC deberá reunir las siguientes características*:
* Sensibilidad elevada.
* Buena estabilidad y reproducibilidad.
* Amplio margen de respuesta lineal.
* Pequeño tiempo de respuesta, independiente de la velocidad de flujo.
* Pequeño volumen muerto, para minimizar el ensanchamiento de las bandas
cromatográficas.
* Insensible a cambios en la presión y la temperatura.
* Respuesta independiente de la composición de la fase móvil.
* No destructivo.
* Muchas de las características coinciden con las indicadas para los detectores relacionados con la
cromatografía de gases.
29
Claudio González Pérez
Los detectores que seguidamente se reseñan no cumplen todas las
características anteriores, pero, sin embargo, resultan adecuados para la mayoría de
las aplicaciones rutinarias en HPLC. Se presentan en orden decreciente en cuanto a la
frecuencia de su uso.
Detectores de absorbancia ultravioleta
Los detectores de absorbancia ultravioleta (también visible) son los más
utilizados en HPLC. Su fundamento es la espectrofotometría de absorción, cuyos
principios se indican en el capítulo 3. Para adaptar un espectrofotómetro convencional
a medidas en HPLC, la modificación más importante es diseñar adecuadamente la
célula de flujo. Esta deberá contener un volumen mínimo (entre 1 y 10 L) y ser capaz
de soportar presiones de varias atmósferas. En la figura 12.13. se muestra
esquemáticamente una de estas células, diseñada en forma de Z.
De la
columna
hν
Detector
Desecho
Figura 12.13. Célula de flujo para HPLC.
El detector ultravioleta más sencillo utiliza la emisión intensa a 254 nm de una
lámpara de mercurio y la detección a una sola longitud de onda. Se estima que casi
las dos terceras partes de los solutos orgánicos analizados por HPLC presentan
absorción a esa longitud de onda, especialmente los compuestos aromáticos, los cuales
tienen absortividades molares del orden de 104.
En instrumentos más versátiles se utiliza una lámpara de deuterio y un
monocromador para mediciones a longitud de onda variable. Cuando los picos están
suficientemente separados, se puede elegir una longitud de onda para cada pico, si
bien, cuando se desean obtener los espectros completos con fines de identificación,
puede pararse el flujo durante el tiempo necesario para efectuar el barrido de
longitudes de onda, o bien, utilizar algún sistema de barrido rápido, como el que se
menciona seguidamente.
Los detectores espectrofotométricos más potentes son los que utilizan un
montaje de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa
30
Cromatografía líquida
por el detector. En estos dispositivos, toda la radiación procedente de la fuente
(lámpara de deuterio) se hace pasar a través de la muestra, en lugar de seleccionar
previamente una radiación determinada con un monocromador como en
espectrofotometría convencional (figura 12.14.).
La radiación emergente de la célula de flujo se dispersa por una red de
difracción holográfica en radiaciones monocromáticas que se focalizan
simultáneamente sobre un conjunto de fotodiodos constituido por varios centenares
de elementos fotosensibles y dispuestos linealmente. Cuando la radiación transmitida
incide sobre los fotodiodos, se genera una señal eléctrica que se procesa para dar
datos de absorbancia, que representados en función de la longitud de onda detectada
por cada uno de los fotodiodos origina el correspondiente espectro de absorción. Este
proceso puede repetirse muchas veces por segundo, por lo que pueden generarse una
gran cantidad de datos experimentales durante el tiempo que la muestra pasa por la
célula.
Fotodiodos
UV
Visible
Lámpara de deuterio
Célula de flujo
Red halográfica
Figura 12.14. Dispositivo de fotodiodos.
Los datos de absorbancia se representan en función de la longitud de onda y del
tiempo, con lo que se obtienen gráficos como el representado en la figura 12.15.,
donde se muestra el mapa espectral correspondiente a la separación de los
compuestos 1, 2 y 3 por HPLC.
2
3
1
A
m
tie
po
λ , nm
Figura 12.15. Espectros de una separación por HPLC con dispositivo de fotodiodos.
31
Claudio González Pérez
Detectores de fluorescencia
Un cierto número de compuestos químicos tienen propiedades fluorescentes,
esto es, pueden absorber radiación electromagnética de una determinada longitud de
onda y emitir radiación fluorescente a longitud de onda más larga. Como se comentó en
el capítulo 4, son compuestos típicamente fluorescentes aquellos sistemas cíclicos con
un alto grado de conjugación. Tal es el caso de hidrocarburos aromáticos
polinucleares, quinoleínas, esteroides, alcaloides, etc.
Para detectar las especies fluorescentes en HPLC se utilizan dispositivos
semejantes en diseño a los fluorímetros y espectrofluorímetros que se describieron
en el tema 4. En ellos, el detector se coloca perpendicularmente a la dirección del haz
de radiación de excitación (figura 12.16.), la cual suele originarse por una lámpara de
xenón o deuterio y seleccionar la longitud de onda adecuada mediante los
correspondientes filtros.
.
Célula de flujo
Fuente de
radiación
Filtros de
excitación
Filtros de emisión
Detector (fotomultiplicador)
Figura 12.16. Diagrama esquemático de un detector de fluorescencia.
Los detectores de fluorescencia se caracterizan por ser especialmente
sensibles, si bien, responden solo a la limitada gama de analitos que tienen propiedades
fluorescentes. Con objeto de incrementar su aplicabilidad, es posible comunicar
fluorescencia a determinados analitos mediante el uso de reactivos apropiados. Esta
derivatización puede realizarse en la muestra antes de la columna, si bien, lo normal
es llevar a cabo una derivatización poscolumna. Este proceso puede llevarse a cabo en
un dispositivo como el representado esquemáticamente en la figura 12.17., donde el
reactivo derivatizante se añade continuamente al flujo que sale de la columna. Con
frecuencia, la reacción química entre el reactivo y el analito necesita un cierto tiempo
para que ocurra, por lo cual suele colocarse un bucle entre el punto de inserción del
reactivo y el detector.
32
Cromatografía líquida
Bucle
Columna
Detector
.
Baño de agua
Bomba
.
Reactivo
Figura 12.17. Derivatización poscolumna.
Detectores electroquímicos
La detección electroquímica ofrece ciertas ventajas respecto a otros métodos
de detección, en orden a su especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad,
especialmente para compuestos orgánicos. En este sentido, cualquier especie capaz de
ser oxidada o reducida sobre un electrodo es susceptible de detección por via
electroquímica en una variedad de matrices, como medioambientales, farmacéuticas y
químicas. Así, por ejemplo, fenoles, aminas, peróxidos y mercaptanos pueden
detectarse por oxidación, mientras que hidrocarburos no saturados, cetonas,
aldehidos y nitrocompuestos aromáticos pueden ponerse de manifiesto mediante
procesos de reducción. Las técnicas electroquímicas más utilizadas con esta finalidad
son la amperometría, voltamperometría y culombimetría*.
La configuración básica de un detector electroquímico se representa en la figura
12.18., y consta de un dispositivo en el que se incluyen un electrodo de trabajo, un
electrodo de referencia y uno auxiliar.
En el detector amperométrico se aplica un determinado potencial al electrodo de
trabajo y se mide la intensidad de la corriente resultante de la reacción
electroquímica que ocurra en dicho electrodo. La superficie de este electrodo suele
ser muy pequeña (menor de 0.5 cm2), por lo que la electrólisis del analito es
incompleta. Cuando se usan electrodos de gran área superficial, puede tener lugar una
reacción cuantitativa sobre el electrodo, y entonces se tiene la detección
* En algunos textos se incluye tambien la conductimetría dentro de este apartado, si bien, los detectores de
conductividad suelen tratarse de forma independiente.
33
Claudio González Pérez
culombimétrica. Por su parte, la detección voltamperométrica (incluida la
polarográfica) implica la aplicación de un potencial variable al electrodo de trabajo
seguida de la medida de la intensidad de la corriente resultante de la reacción
electródica.
Electrodo
de referencia
Electrodo
de trabajo
Electrodo
auxiliar
Figura 12.18. Configuración básica de un detector electroquímico.
De las tres técnicas mencionadas, la más utilizada en la práctica es la
amperometría. La polarografía se utiliza poco, debido a las dificultades para construir
células de pequeño volumen para el electrodo de gotas de mercurio, así como las
limitaciones de dicho electrodo para operar en la zona anódica (ver "Características
del electrodo de gotas de mercurio" en el tema 9).
Los electrodos más utilizados para la detección amperométrica son los
siguientes: como electrodo de referencia se usan casi exclusivamente el de Ag-AgCl y
el de calomelanos, mientras que los electrodos auxiliares suelen ser de platino o de
carbón vítreo. En algunas células, el capilar de acero inoxidable usado para conectar la
columna cromatográfica a la célula puede servir como electrodo auxiliar. En cuanto a
los electrodos de trabajo, se han utilizado una amplia variedad de materiales. Para
procesos de reducción se usa fundamentalmente mercurio, mientras que para
oxidaciones el material más empleado es el carbón, en sus distintas variedades de
pasta de carbón, carbón vítreo, grafito pirolítico o fibra de carbón. El oro y el
platino también pueden usarse en procesos anódicos.
Cromatografía líquida
34
En general, los detectores electroquímicos son relativamente simples y muy
sensibles para determinados analitos, pudiéndose medir fácilmente corrientes del
orden de los nano-amperios. La intensidad de la corriente es proporcional a la
concentración en varios órdenes de magnitud, si bien, se requieren disolventes
acuosos u otros disolventes polares que contengan electrolitos disueltos, y, además, en
ocasiones, deben estar rigurosamente exentos de oxígeno.
Detectores de índice de refracción
El detector de índice de refracción es, posiblemente, el que más se aproxima al
detector universal ideal, ya que, en principio, el índice de refracción (IR) de la fase
móvil deberá modificarse por la presencia de cualquier soluto que tenga un índice de
refracción diferente de ella. Por ello, la comparación del IR de la fase móvil pura con
el de los efluentes que salen de la columna cromatográfica, indicará la presencia de
cualquier soluto eluido.
El principal inconveniente de este tipo de detectores es que son muy sensibles a
los cambios de temperatura, la cual debe ser controlada con fluctuaciones de ± 0.0001
ºC. Por otra parte, no resultan adecuados para trabajar con la modalidad de elución
por gradiente.
Detectores de conductividad
Los detectores de conductividad son los más utilizados cuando los solutos eluidos
son iónicos, como, por ejemplo, ácidos y bases, así como cationes y aniones inorgánicos
después de su separación por cromatografía de cambio iónico.
La medida de la conductividad de los líquidos se lleva a cabo normalmente
aplicando un potencial eléctrico entre dos electrodos, lo cual origina un movimiento de
los aniones y cationes presentes en el seno de la disolución. La resistencia (o la
conductividad) de la disolución contenida entre los dos electrodos depende de la
naturaleza y concentración de las especies iónicas presentes. Generalmente se opera
con corriente alterna, con un dispositivo experimental como el que se muestra
esquemáticamente en la figura 12.19., donde la célula de conductividad se coloca en
una de las ramas de un puente de Wheatstone.
35
Claudio González Pérez
R1
.
Rs
C.A.
R2
Célula de conductividad
Figura 12.19. Detector de conductividad.
Los detectores de conductividad son simples, baratos, robustos y de prolongada
duración. Asimismo, pueden tener una sensibilidad elevada y responden
proporcionalmente a los cambios de concentración de especies iónicas. Sin embargo,
su principal limitación proviene de que la elevada conductividad de los componentes de
las fases móviles usadas en cromatografía iónica tiende a enmascarar la de los
analitos, reduciendo la sensibilidad. Este inconveniente se resolvió mediante el uso de
columnas supresoras colocadas inmediatamente después de la columna cromatográfica.
En ellas, se transforman los iones del disolvente en especies moleculares poco
disociadas, sin alterar los iones del analito*.
APLICACIONES
La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica extraordinariamente
versátil, como lo prueba la amplia variedad de mezclas que pueden separarse con ella.
Posiblemente es la técnica instrumental más importante en relación con análisis
farmacéutico y de alimentos. Así-mismo, desempeña un papel importante en estudios
forénsicos, ambientales y bioquímicos.
Además de las aplicaciones mencionadas en páginas anteriores en relación con la
cromatografía líquida convencional, se citan seguidamente algunos ejemplos
característicos.
* Para la separación de cationes, cuando se usa HCl como eluyente, la columna supresora es una resina
aniónica en forma de hidróxido, con lo que el Cl– queda retenido por la resina y los H+, con los OH– forman
H2O,
H+ + Cl– + R–OH–(s) —> R–Cl(s) + H2O
En la separación de aniones, muchas veces se utiliza carbonato o bicarbonato sódico como eluyente. En este
caso, la columna supresora contiene la forma ácida de una resina catónica, con lo que se forma H2CO3 muy
poco disociado,
Na+ + HCO3– + R–H+(s) —> R–Na+ + H2CO3
Cromatografía líquida
36
La cromatografía en fase normal se utiliza extensamente para el análisis de
sustancias que son solubles en disolventes no polares, tales como vitaminas, pigmentos,
aceites esenciales, aditivos no polares en distintos productos comerciales y
formulaciones farmacéuticas. Así-mismo, uno de los usos más importantes de esta
modalidad de cromatografía es la separación de isómeros.
La cromatografía en fase inversa, y particularmente la de fase enlazada, es, sin
duda, la más ampliamente utilizada. Se calcula que el 75 % de las separaciones por
HPLC se llevan a cabo por dicha técnica. En la industria farmacéutica sus aplicaciones
se centran, entre otras, en el análisis de vitaminas, β-bloqueantes, alcaloides,
esteroides, tetraciclinas, prostaglandinas, etc. Así-mismo, es utilizada para el análisis
de especies biológicamente activas, como aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos.
Por último, mencionar que otro campo de acción de la técnica es el análisis de
muestras medioambientales, como pesticidas y herbicidas, incluyendo paracuat,
dicuat, carbamato y compuestos organofosforados, así como distintos polutantes,
tales como hidrocarburos poliaromáticos fenolicos y aldehidos/cetonas.
37
Claudio González Pérez
CROMATOGRAFIA PLANA
La cromatografía plana es un tipo de cromatografía líquida en la que la fase
estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una columna.
Existen dos técnicas de cromatografía plana: cromatografía en papel (CP) y
cromatografía de capa fina (CCF). Aunque la CP precede en 10–15 años a la CCF, ha
sido ampliamente superada por ésta, debido a su mayor rapidez, versatilidad y
reproducibilidad.
En cromatografía plana, la muestra se aplica en forma de gota sobre una lámina o
superficie plana. Después de evaporado el disolvente, la lámina se coloca verticalmente
en una cámara cerrada con su extremo sumergido en el eluyente elegido (fase móvil),
pero no la muestra (figura 12.20.a.). La fase móvil percola a través de la fase
estacionaria por capilaridad y desplaza los componentes de la muestra a distinta
velocidad, teniendo lugar la separación. Una vez que el disolvente ha pasado a través
de la mitad o de las dos terceras partes de la longitud de la lámina, se saca ésta de la
cámara y se seca, poniéndose de manifiesto la presencia de las especies separadas por
los procedimientos que se indicarán más adelante. El cromatograma está constituido
por un conjunto de manchas que corresponden a los componentes separados (figura
12.20.b.)
Componente A
Frente del
disolvente
.
dw
Lámina plana
dM
Componente B
Muestra
Eluyente
Compuesto
de referencia
dR
Componente C
dP
Aplicación
de la muestra
a)
b)
Figura 12.20. Cromatografía plana. a) Cámara cromatográfica. b) Cromatograma.
Cromatografía líquida
38
PRINCIPIOS BASICOS
Casi todos los parámetros y ecuaciones desarrolladas para la cromatografía
líquida en columna pueden aplicarse, con ligeras modificaciones, a la cromatografía
plana, si bien, en ésta, la caracterización de los componentes separados se lleva a cabo
por el denominado factor de retardo, RF, definido por*,
distancia recorrida por el soluto (centro de la mancha) d R
RF =
=
distancia recorrida por el frente del disolvente
dM
Los valores de RF pueden variar desde 1, para los analitos que no se retrasen,
hasta valores próximos a cero. Estos valores pueden ayudar a la identificación de una
determinada especie, si bien, la coincidencia en los RF no deberá tomarse como prueba
inequívoca de identificación, debido al gran número de variables que pueden influir,
como pequeñas diferencias en la composición de la fase móvil, temperatura, tamaño de
la cámara, naturaleza de la mezcla, etc.
Con objeto de minimizar las diferencias entre los valores de los RF debidas a los
factores mencionados, se ha propuesto utilizar el parámetro Rx, definido por,
Rx =
distancia recorrida por el soluto d R
=
distancia recorrida por un patrón d P
En cualquier caso, a pesar de la coincidencia en los valores de Rx, la identificación
plena de un compuesto deberá hacerse de forma específica, con técnicas auxiliares,
como espectroscopia IR, espectrometría de masas, RMN, etc.
El factor de retención o factor de capacidad viene definido por,
k' =
t' R
tM
En cromatografía plana, t'R, (tiempo realmente invertido en la retención de un
soluto por la fase estacionaria) es proporcional a la distancia recorrida por el frente
del disolvente menos la distancia recorrida por el soluto,
t'R = cte. (dM – dR)
Por su parte, tM (tiempo de residencia del soluto en la fase móvil) será
proporcional a la distancia recorrida por el soluto
* En realidad, el valor de R observado es un poco más pequeño que el verdadero R termodinámico, el cual
F
F
puede obtenerse multiplicando el observado por un factor que varía entre 1.0 y 1.6.
Claudio González Pérez
39
tM = cte. dR
por lo que,
'
k =
cte. d M – d R 1 – R F
=
cte. d R
RF
Análogamente a lo enunciado de forma general (ver tema 10), el número de platos
teóricos, N, puede obtenerse por la expresión:
d
N = 16 R
dW
2
donde dW es la anchura de la gota.
CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA (CCF)
Las separaciones por cromatografía de capa fina se llevan a cabo en placas de
vidrio o plástico recubiertas con una capa delgada de partículas finamente divididas
que contienen la fase estacionaria. Aunque descubierta muchos años antes, las
primeras aplicaciones de la CCF datan de 1951, al utilizar esta técnica para el
aislamiento e identificación de los componentes de zumos de naranja y pomelo.
Históricamente, el desarrollo de la CCF ha estado relacionado con el análisis de
alimentos, si bien, se utiliza también ampliamente en la industria farmacéutica para la
determinación de la pureza de fármacos, así como en laboratorios clínicos y en la
propia industria química. Por otra parte, el hecho de que las fases móvil y estacionaria,
así como muchas de sus aplicaciones, sean similares a las de la cromatografía líquida
en columna, hace que la CCF se utilice en muchas ocasiones como guía para desarrollar
las condiciones óptimas para separaciones cromatográficas en columna. La rapidez y el
bajo coste de los ensayos de capa fina representan ventajas importantes. Respecto a
la cromatografía en papel, la CCF presenta la importante ventaja de su mayor
velocidad y, en muchos casos, mejor resolución.
Fases estacionarias
Las propiedades generales de los adsorbentes (fases estacionarias) utilizables en
CCF son similares a las descritas para la cromatografía de adsorción en columna.
Generalmente se utilizan partículas cuyo tamaño oscila entre 10 y 25 µm. En este
sentido, es preciso indicar que, mientras que en una columna, un material muy
finamente pulverizado resulta inadecuado, por no permitir altas velocidades de flujo,
en capa fina, un tamaño de grano pequeño, además de facilitar el flujo, incrementa
considerablemente la resolución.
Cromatografía líquida
40
Tradicionalmente, los materiales más usados como fase estacionaria han sido gel
de sílice, alúmina, celita, poliamida y celulosa, si bien, en época relativamente reciente,
el tipo de materiales usados con esta finalidad se ha extendido considerablemente,
tanto para operar en fase normal, como en fase inversa o enlazada, análogamente a lo
que sucede en HPLC.
La gel de sílice es la sustancia más empleada en CCF. Se trata, como ya se
comentó en relación con otros tipos de cromatografía, de una fase estacionaria
inorgánica de características polares, y a la que es necesario activar por calefacción
previa a su uso. Con frecuencia se adiciona CaSO4.1/2H2O con objeto de facilitar la
adherencia, designándose entonces con el sufijo "G". Esta fase estacionaria resulta
adecuada para separar numerosas sustancias, tales como aminoácidos, alcaloides,
azúcares, ácidos grasos, lípidos, aceites esenciales, esteroides, así como también
cationes y aniones inorgánicos.
El mecanismo predominante con esta fase estacionaria es la adsorción, siendo
posible la separación de sustancias hidrofílicas neutras, ácidas y básicas eligiendo
convenientemente el eluyente. Este es el modo de separación considerado como
normal. Sin embargo, puede operarse también en fase inversa, para lo cual puede
recurrirse a impregnar el soporte con hidrocarburos de cadena larga, tales como
parafinas o aceite de silicona. Estos materiales resultan adecuados para el análisis de
sustancias lipofílicas, tales como grasas y ceras, esteroides y vitaminas liposolubles,
etc. Así-mismo, pueden formarse fases enlazadas de forma análoga a lo indicado para
HPLC.
Otro adsorbente polar, también muy utilizado, es la alúmina. Para obtener
resultados reproducibles y separaciones óptimas, es necesario proceder a su
activación, con objeto de controlar la cantidad de agua adsorbida, la cual bloquea los
centros activos. Dicha activación normalmente se lleva a cabo calentando a unos 125150 ºC durante un tiempo determinado.
La celita es un material diatomáceo altamente poroso y de gran área superficial,
si bien, su poder de adsorción es pequeño. Este es el motivo por el que se utiliza en
menor extensión que la gel de sílice y la alúmina. Sin embargo, es muy usado como
soporte sólido para fases estacionarias en cromatografía de reparto.
41
Claudio González Pérez
Un cierto número de poliamidas, como policaprolactama y nylon 66 pueden
manufacturarse como fases estacionarias para CCF. Estas sustancias resultan
particularmente útiles para la separación de compuestos relacionados con los fenoles,
al producirse la interacción entre los solutos y la fase estacionaria por medio de
enlaces de hidrógeno.
Para la preparación de las placas, el material que constituye la fase estacionaria
se dispone en forma de suspensión (en agua o en otro disolvente) y se extiende sobre
una lámina de vidrio o de plástico, que puede ser rígido o flexible. Es fundamental que
la capa sea lo más uniforme posible, para lo cual suelen utilizarse dispositivos como el
representado en la figura 12.21.
Fase estacionaria
(suspensión)
.
.
Placas sin recubrir
Placas recubiertas
con la fase estacionaria
Figura 12.21. Preparación de placas para CCF.
El espesor de las películas usadas para trabajos analíticos suele ser de 0.2 a 0.3
mm, mientras que en cromatografía preparativa el espesor puede variar entre 2 y 10
mm. Una vez extendida la fase estacionaria, la placa se seca al aire y se activa por
calefacción a 110 ºC.
Uno de los aspectos más críticos de la CCF es la aplicación de la muestra. Esta
suele hacerse por contacto entre la placa y un tubo capilar que contiene la muestra en
disolución, a 1 ó 2 cm del extremo. La aplicación de la muestra deberá hacerse con
sumo cuidado, al objeto de no perturbar la capa de adsorbente.
Fases móviles
Un disolvente adecuado para utilizarlo en CCF deberá reunir las siguientes
características:
* Inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase estacionaria.
42
Cromatografía líquida
* Pureza elevada.
* Adecuada viscosidad y tensión superficial.
* Punto de ebullición bajo, para facilitar el secado de las placas.
* Barato, de baja inflamabilidad y toxicidad.
La elección del disolvente, o mezclas de disolventes, adecuados para una
determinada separación es fundamentalmente empírica, si bien, pueden utilizarse, en
función de las características de los compuestos a separar, las series eluotrópicas, ya
mencionadas anteriormente.
Desarrollo del cromatograma
Una vez preparada la placa y aplicadas las muestras, se coloca en una cámara
cerrada (para operar en atmósfera saturada de vapor del disolvente) como se indica
en la figura 12.20.a. y se espera a que el disolvente haya pasado a través de la mitad o
de las dos terceras partes de la placa. Además de la modalidad ascendente,
representada en la mencionada figura, pueden también utilizarse las modalidades
descendente (figura 12.22.a.), bidimensional (figura 12.22.b.) o radial (figura 12.22.c.).
La modalidad bidimensional se utiliza cuando se trata de grupos de compuestos
de estructura química y propiedades similares, tales como aminoácidos, con valores de
RF demasiado próximos para que la separación unidireccional proporcione resultados
satisfactorios. En esta modalidad, la muestra se aplica de forma normal y se
desarrolla según la dirección 1 (ver la figura 12.22.b.), en contacto con un disolvente
determinado. A continuación, se espera a que se seque y se eluye con un segundo
disolvente en la dirección 2.
Eluyente
.
Placa
2
.
Aplicación
de la muestra
1
a)
b)
c)
Figura 12.22. Cromatografía de capa fina. a) Descendente. b) Bidimensional. c) Radial.
Claudio González Pérez
43
En la forma radial, la muestra se aplica en el centro de la placa, que normalmente
tiene forma de disco, y el disolvente se introduce por un orificio a través de una
mecha sumergida en el depósito que lo contiene. A medida que se desarrolla el
cromatograma, se van formando una serie de círculos como los representados en la
figura 12.22.c.).
Localización de las sustancias separadas
La localización de las sustancias separadas sobre la placa puede hacerse
directamente si dichas sustancias son coloreadas. Para sustancias incoloras, es
necesario utilizar distintos métodos químicos o físicos.
Métodos químicos. Estos métodos implican una reacción química, que puede ser
específica para algún determinado componente, o general. Dentro de estas
últimas, se utiliza el vapor de yodo, el cual se adsorbe reversiblemente sobre
una gran cantidad de sustancias, originando puntos oscuros en las zonas donde
existe un compuesto en la placa. Otro reactivo de aplicación bastante general es
el ácido sulfúrico concentrado, el cual, pulverizado sobre una placa de sílice,
permite visualizar las sustancias orgánicas después de haber calentado la placa
en una estufa. Asimismo, la fluoresceína origina color amarillo-verdoso con una
gran cantidad de sustancias orgánicas, y la ninhidrina se utiliza para detectar
aminoácidos.
Métodos físicos. El método físico más común para la detección en CCF es la
radiación ultravioleta, en combinación con un indicador fluorescente. La placa
contiene un material fluorescente cuya emisión (a 254 nm) es inhibida por la
mayoría de los solutos. Una vez evaporado el disolvente, se ilumina la placa con
radiación ultravioleta en un cuarto oscuro. Las manchas de soluto se ven más
oscuras, mientras que el resto de la placa es brillante.
Aplicaciones
En análisis cualitativo, la identificación de las sustancias separadas se basa en
los valores de los RF con respecto a patrones cuyo cromatograma se ha desarrollado
en las mismas condiciones. De todas formas, a pesar de la coincidencia en los valores
de RF, siempre se necesita una confirmación, lo cual puede hacerse repitiendo el
ensayo con distintas fases móviles y estacionarias, así como también con distintos
reactivos de revelado. En última instancia, puede recurrirse a raspar la mancha,
Cromatografía líquida
44
disolver el analito y proceder a su identificación por RMN, espectrometría de masas o
espectroscopia infrarroja.
La comparación del área de la mancha del patrón con la del analito permite hacer
una estimación semicuantitativa de la cantidad presente. Otros procedimientos
cuantitativos implican la utilización de un densitómetro, así como proceder de forma
análoga a la indicada para fines cualitativos, extrayendo el analito y determinarlo por
algún método químico o físico adecuado.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL (CP)
La técnica es extraordinariamente simple, ya que utiliza una tira de papel de
filtro, por ejemplo, Whatman No 1, como medio para las separaciones. Actualmente, la
CP no se utiliza demasiado, debido al desarrollo alcanzado por otras técnicas
cromatográficas, especialmente la CCF, CG y HPLC.
El mecanismo que interviene en la cromatografía en papel es fundamentalmente
de reparto, donde la fase estacionaria es al agua adsorbida sobre las moléculas de
celulosa del papel. Sin embargo, la misión del papel es realmente más compleja que
actuar simplemente como soporte de la fase estacionaria, ya que, al parecer, la
adsorción de los componentes de la fase móvil y de los solutos, así como efectos de
cambio iónico, también toman parte en el proceso de separación.
El papel utilizado puede ser, en principio, papel de filtro estándar, si bien,
existen en el comercio papeles especiales para CP. Estos papeles están fabricados con
una porosidad y espesor determinados, así como con muy bajo contenido de restos
metálicos. El desarrollo del cromatograma debe hacerse, en estos papeles, en una
determinada dirección. Asimismo, deben conservarse en condiciones de humedad
controlada y en lugares exentos de humos o vapores que puedan adsorberse sobre las
fibras de celulosa y alterar las separaciones.
Si las sustancias a separar son apreciablemente solubles en agua, puede ser
conveniente impregnar el papel en un medio no acuoso para que actúe como fase
estacionaria. En esta modalidad de cromatografía en fase inversa, la fase móvil no
tiene por qué ser necesariamente agua, si bien, el eluyente usado suele contenerla en
determinada proporción.
La elección de la fase móvil en CP es esencialmente empírica. Normalmente se
utilizan mezclas, consistentes en un compuesto orgánico, agua y otras especies, tales
Claudio González Pérez
45
como ácidos, bases o agentes complejantes que modifiquen la solubilidad de los
componentes de la muestra. Las sustancias polares, que son más solubles en agua que
en líquidos orgánicos, se desplazarán muy lentamente si se utiliza un eluyente
totalmente anhidro, por lo que deberá añadirse algo de agua. Así, por ejemplo, el nbutanol no es un buen eluyente para aminoácidos polares, al menos que esté saturado
con agua. Si se añade también ácido acético, entonces puede aumentarse la cantidad
de agua y la mezcla ternaria resultante incrementa considerablemente la solubilidad y
la movilidad de los aminoácidos.
Muchos iones inorgánicos se separan en forma de complejos o de quelatos
apreciablemente solubles en líquidos orgánicos. Así, por ejemplo, los complejos
clorurados de hierro son muy solubles en acetona, mientras que el niquel no.
Consecuentemente, podrán separarse hierro y níquel con este disolvente.
En la cámara cromatográfica deberá mantenerse una atmósfera saturada de
vapor del disolvente, con objeto de evitar la evaporación del disolvente, ya que si ésta
se produce, el aporte de fase móvil al frente del disolvente puede ser insuficiente
para su desplazamiento a través del papel.
Las técnicas para desarrollar el cromatograma son similares a las empleadas en
CCF, esto es, ascendente, descendente, bidimensional y radial. La muestra, disuelta en
un disolvente volátil, se aplica al papel con un capilar, una microjeringa o una
micropipeta. Su tamaño deberá ser de unos 2 mm de diámetro y la cantidad de
muestra comprendida entre 10 y 50 µg. El disolvente se elimina por evaporación (por
ejemplo, con un secador de pelo) y si la muestra es muy diluida se aplican varias gotas,
evaporando el disolvente después de cada aplicación. En la figura 12.23. se muestran
algunos sistemas para desarrollar los cromatogramas en CP.
Figura 12.23. Cromatografía en papel. a) Ascendente. b) Descendente.
Cromatografía líquida
46
La mayoría de las técnicas usadas para la localización de las sustancias
separadas en CCF pueden aplicarse a la cromatografía en papel, excepto,
evidentemente, aquellas que impliquen el uso de reactivos que puedan atacar al papel,
como el ácido sulfúrico concentrado. Sin embargo, la detección sobre papel es menos
sensible que en capa fina, debido a que las manchas se muestran generalmente más
difusas.
Aunque se comentó que en las últimas décadas, en muchas aplicaciones, la CP ha
sido sustituida por la CCF, aún se sigue utilizando aquella, no solo con fines didácticos,
por su simplicidad, sino para separaciones de ciertas muestras clínicas y bioquímicas (
por ejemplo, azúcares y aminoácidos en orina), así como en otras aplicaciones
analíticas generales.
47
Claudio González Pérez
CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS (CFS)
En esta técnica, la fase móvil es un fluido a temperatura y presión superiores a la
crítica. En la figura 12.24. se muestra el diagrama de fases para el CO2 puro, donde se
indican los estados de agregación (sólido, líquido, gas) para cualquier combinación
presión-temperatura.
Zona
supercrítica
80
70
P, atms.
Punto crítico
(31.3ºC, 72.9 atms.)
60
Líquido
50
Sólido
40
30
Gas
20
10
Punto triple (–56.4 ºC, 5.11 atms.)
–80
–60
–40
–20
0
20
40
t, ºC
Figura 12.24. Diagrama de fases para el CO2.
A lo largo de cada una de las líneas del diagrama existe un equilibrio entre las
fases adyacentes, esto es, coexisten ambas fases, mientras que en el punto triple,
coexisten en equilibrio las tres fases, sólida, líquida y gaseosa. Cuando se cruza alguna
de las líneas resulta un cambio de fase, como consecuencia de lo cual se produce un
cambio brusco en las propiedades físicas (densidad, viscosidad, difusividad, etc.). Sin
embargo, por encima del punto crítico (caracterizado por una presión y un
temperatura definidas) solo existe una fase, cualquiera que sea la presión. Esa fase se
llama fluido supercrítico. Las propiedades físicas del fluido en esas condiciones son
intermedias entre las del gas y el líquido, y varían gradualmente (no bruscamente) al
desplazarse dentro de esa zona.
Cromatografía líquida
48
El empleo de fluidos supercríticos como fase móvil presenta ciertas ventajas
sobre la utilización de fases gaseosas o líquidas, debido a lo siguiente: en CG la
separación depende fundamentalmente de la volatilidad, por lo que si un analito no
tiene una presión de vapor suficientemente elevada o si es térmicamente inestable, en
principio, la técnica no resulta adecuada para su separación. En HPLC y en CFS, la
volatilidad del analito no constituye un prerrequisito, mientras que la separación está
condicionada por diferencias de afinidad para la fase móvil y la fase estacionaria, de
forma que, para una columna dada, modificando la composición de la fase móvil se
influye sobre las separaciones. Una característica única de la CFS es que la afinidad
de la fase móvil para un analito es también función de la densidad, y ésta se puede
variar prácticamente a voluntad sin más que modificar la presión. Así, es posible la
elución de compuestos que difieren ampliamente en los factores de capacidad
simplemente variando la presión.
En HPLC, la fuerza eluotrópica se modifica operando con elución por gradiente y
en CG por aumento de la temperatura. En CFS este efecto se logra variando la
densidad del disolvente. Además, la CFS es más rápida y con mayor poder de
resolución que la cromatografía líquida, debido a los mayores coeficientes de difusión
de los solutos en los fluidos supercríticos que en los líquidos, si bien, son menores que
en los gases. Sin embargo, la CFS no resulta adecuada para los sistemas de polaridad
elevada y particularmente los sistemas acuosos son difíciles de manejar, sobre todo
por los elevados valores que presentan sus constantes críticas.
Hasta la fecha, la fase móvil más utilizada para este tipo de cromatografía es el
dióxido de carbono, debido a su temperatura crítica relativamente baja. Además no
es tóxico y es compatible con el detector de ionización de llama empleado en CG. Por
otra parte, el CO2 presenta un amplio margen de densidad en las condiciones normales
de operación, lo cual proporciona una gran versatilidad para optimizar las condiciones
de operación. Otra ventaja es que puede obtenerse comercialmente en un alto grado
de pureza y es relativamente barato. Sin embargo, los compuestos muy polares y los
de peso molecular elevado tienen bajas solubilidades en CO2. Por este motivo, y para
incrementar su poder disolvente, se añaden modificadores, como metanol, isopropanol,
diclorometano, tetrahidrofurano y otras especies.
La instrumentación para cromatografía de fluidos supercríticos suele ser
adaptación de la empleada para HPLC o en CG. Un componente importante es la bomba,
que debe proporcionar a la fase móvil la presión necesaria de forma precisa y
controlada. Además, es necesario, evidentemente, un control adecuado de la
temperatura de operación. Un dispositivo característico de la CFS es el restrictor,
Claudio González Pérez
49
cuya misión es básicamente facilitar la descompresión. Se sitúa después del detector,
si éste requiere una fase móvil de densidad elevada (por ejemplo, detectores ópticos),
mientras que si esto no es así, se coloca entre el sistema de detección y la columna.
En CFS se utilizan dos tipos de columnas: tubulares abiertas y empaquetadas. Las
primeras difieren de las empleadas en cromatografía de gases en que los diámetros
son más pequeños. En la práctica, se utilizan columnas de 50 µm de diámetro interno y
entre 10 y 20 metros de longitud. Las fases estacionarias más utilizadas son
polisiloxanos.
Las columnas empaquetadas en CFS son similares a las usadas en HPLC, con
partículas porosas de 10, 5 y 3 m, y fases estacionarias enlazadas sobre una base de
gel de sílice.
La mayoría de los detectores utilizados en HPLC o en CG son compatibles con la
CFS, pero los más empleados son el de ionización de llama y el de absorción
ultravioleta. El primero proporciona buena sensibilidad y puede considerarse como el
detector universal para la mayoría de los compuestos orgánicos. Sin embargo, es
incompatible con fases móviles que contienen modificadores orgánicos. En estos casos,
puede utilizarse el detector de absorción UV. Asimismo, también es posible la
detección con espectrometría de masas y de infrarrojo.
La CFS encuentra aplicaciones en distintas áreas. En Bioquímica se utiliza para la
separación de antibióticos, drogas de abuso, lípidos y ácidos grasos, prostaglandinas y
esteroides, mientras que en el campo puramente industrial se emplea para colorantes,
isocianatos, pesticidas, surfactantes, ceras y, sobre todo, en la industria
petroquímica, en la cual es muy frecuente la separación de mezclas de compuestos
muy poco polares. En cualquier caso, a pesar de las numerosas aplicaciones de la CFS,
posiblemente el futuro más prometedor de esta metodología de fluidos supercríticos
resida en la técnica de extracción para la preparación de muestras analíticas.
.