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11642417-Cromatografia-Fundamentos-y-Aplicaciones

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CROMATOGRAFIA
PRINCIPIOS Y APLICACIONES
Rafael Gómez-Ullate Ricón
Alonso Serrano Álvarez
1. Conceptos básicos sobre cromatografía
Antes de definir los conceptos básicos para entender los distintos tipos de separaciones
cromatográficas, haré una breve introducción y una explicación general sobre la cromatografía. Los
conceptos que más adelante se explican se refieren a la cromatografía en columna, sin embargo, es
importante señalar que como los equilibrios en los que se basan los dos tipos de cromatografía son
idénticos, la teoría desarrollada para la cromatografía en columna se adapta también fácilmente a la
cromatografía plana.
1.1. Breve introducción a la cromatografía
La cromatografía es un método muy utilizado en todas las ramas de la ciencia y que permite la
separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. Ningún
otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía.
1.2. Descripción general de la cromatografía
Es difícil definir rigurosamente el término de cromatografía, ya que se ha aplicado ese nombre a
varios sistemas y técnicas. Sin embargo, todos esos métodos tienen en común el uso de una fase
estacionaria y una fase móvil.
En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil, que puede ser
un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria
con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie sólida. Las dos fases se eligen de
tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la
fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes
de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o
cuantitativamente.
1.3. Conceptos básicos
Cromatograma:
Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la concentración del soluto y se
registra su señal en función del tiempo (o del volumen de fase móvil añadido) se obtiene una serie de
picos que representan un grafico denominado cromatograma. Este grafico es útil tanto para el análisis
cualitativo como cuantitativo. La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar
los componentes de la muestra; las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la
cantidad de cada componente, (ver Figura 4-1).
Tiempo de retención tR:
Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra hasta que el pico de concentración
del analito alcanza el detector; es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna; es el tiempo
que tarda en aparecer el máximo de un pico, (Figura 1-1).
1
Se representa con el símbolo tR.
La velocidad lineal promedio de migración del soluto v es:
v=
L
tR
(1.1)
donde L es la longitud de la columna que esta rellena.
Figura 1-1. Cromatograma característico de una mezcla de dos componentes. El pico pequeño de la izquierda
representa una especie que no se retiene en la columna, y de esta forma alcanza el detector casi inmediatamente
después del inicio de la elución. Por tanto, su tiempo de retención tM es aproximadamente igual al tiempo que
emplea una molécula de la fase móvil para pasar a través de la columna.
Tiempo muerto tM:
Es el tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector; es el tiempo de migración
de la especie no retenida; es el tiempo necesario para que, por termino medio, una molécula de la fase
móvil pase a través de la columna, (Figura 1-1).
De manera semejante la velocidad lineal promedio u del movimiento de las moléculas de la fase móvil es
u=
L
tM
(1.2)
Constante de distribución:
En general, los equilibrios de distribución implicados en cromatografía se describen por ecuaciones
sencillas que suponen la transferencia de una analito entre las fases estacionaria y la móvil. Así, para el
soluto A, se puede escribir:
Amovil ⇔ Aestacionaria
(1.3)
La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de distribución, la razón de
distribución o coeficiente de distribución, y mide la distribución del analito entre la fase estacionaria y la
fase móvil. Se define como:
K=
C
C
S
(1.4)
M
donde CS es la concentración molar del soluto en la fase estacionaria y CM es la
concentración molar en la fase móvil.
CS = moles/Litro de analito en la fase estacionaria.
CM = moles/Litro de analito en la fase móvil.
Factor de retención o factor de capacidad:
2
Es un parámetro que describe la velocidad de migración de los solutos (analitos) en la columna. Para
una especie A, el factor de capacidad k’A se define como
k A′ =
K AVS
t −t
k A′ = R M
VM
tM
(1.5)
donde KA es el coeficiente de distribución de la especie A, VS es el volumen de la fase estacionaria y VS
es el volumen de la fase móvil. Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la
unidad, la elución tiene lugar tan rápidamente que es difícil determinar con exactitud los tiempos de
retención, estos son demasiado cortos. En cambio cuando el factor de retención es del orden de 20 o 30 o
tal vez mayor, los tiempos de retención son excesivamente largos, (Figura 1-1).
Factor de selectivitad:
El factor de selectividad α de una columna para dos especies A y B se define como:
α=
(t ) − t
KB
k′
α= B α= R B M
k A′
KA
( tR ) A − tM
(1.6)
donde KB es el coeficiente de distribución para la especie mas fuertemente retenida B, y KA es el
coeficiente de distribución para la menos retenida, o que eluye con mas rapidez, la especie A. Según esta
definición α siempre es mayor que la unidad, por que B es el compuesto más retenido (de > tR).
donde k’B y k’B son los factores de capacidad de B y de A, respectivamente.
Resolución cromatográfica:
La resolución cromatográfica RS de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para
separar dos analitos. La resolución de una columna se define como
2 ⎡( tR ) − ( tR ) A ⎤⎦
2 ∆Z
RS = ⎣ B
RS =
WA +WB
WA + WB
(1.7)
donde WA y WB son la anchura de los picos A y B.
A partir de la Figura 1-2 se deduce que si R> 1,5 la separación de los componentes es completa, no
será así si R<1,5. Por lo que para una fase estacionaria dada, la resolución puede mejorarse alargando la
columna, aumentando así el número de platos. Aunque una consecuencia negativa del aumento de platos
es el incremento del tiempo requerido para la separación.
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Figura 1-2. Separaciones correspondientes a tres resoluciones distintas. Donde, Rs = 2∆Z/(WA + WB).
Eficiencia en cromatografía:
La eficiencia se define en base a dos términos, que son medidas cuantitativas de la eficiencia de una
columna: 1º la altura del plato H y 2º el número de platos N. Los dos están relacionados por la ecuación:
N=
L
H
(1.8)
donde L es la longitud (normalmente en centímetros) del relleno de 1a columna. De la ecuación (1.8) se
deduce que la altura del plato H es:
H=
L
N
(1.9)
La eficacia de la columna cromatográfica aumenta cuanto mayor es el número de platos, y cuanto
menor es la altura de plato. Existen diferencias en las eficacias por diferencias en el tipo de columna y/o
el tipo de fases móvil y estacionaria. Las eficacias en términos de número de platos varían de cientos a
miles, y las alturas de plato de unas pocas décimas a milésima de centímetro o menos.
Existe otra ecuación para calcular el número de platos N:
⎛t ⎞
N = 16 ⎜ R ⎟
⎝W ⎠
2
(1.10)
En este caso N se puede calcular a partir de dos medidas de tiempo, tR y W (anchura del pico); para calcular
H, se hade conocer también la longitud del relleno de la columna L. (Figura 1-3)
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Figura 1-3. Definición del numero de platos N=16(tR/W)2
En general se asume que las bandas cromatográficas tienen una forma gaussiana, por ello resulta
conveniente definir la eficacia de una columna en los términos de varianza por unidad de longitud de la
columna. De esta forma, la altura de plato H viene dada por:
H=
σ2
L
(1.11)
Esta definición de la altura de plato se ilustra en la Figura 1-4, donde se muestra una columna con un
relleno de L cm. de longitud. En esta figura se muestra una gráfica que representa la distribución de las
moléculas del analito a lo largo de la columna en el momento en que el pico del analito alcanza el
extremo final del relleno (es decir, en el tiempo de retención tR). La curva es gaussiana, y la ubicación de
L -1σ y L +1σ se indica mediante líneas verticales discontinuas. Obsérvese que las unidades de L son
centímetros y las de σ2 son centímetros cuadrados; de este modo H representa una distancia lineal, en
centímetros (ecuación 1-11).
Figura 1-4. Definición de la altura de plato H=σ2/L
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2. Tipos de separación cromatográfica
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero de ellos se basa
en la forma en que las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto, diferenciándose así la
cromatografía en columna de la cromatografía en plano o plana. En la cromatografía en columna, un
tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual hace se pasar la fase móvil por presión o
gravedad. En la cromatografía en plano o plana, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los
intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por
capilaridad o por efecto de la gravedad. Nos centraremos principalmente en la cromatografía en columna,
y como ya hemos dicho la teoría que se desarrolle para la cromatografía en columna se adaptara también
para la cromatografía plana.
Otra clasificación más fundamental de los métodos cromatográficos se basa en el tipo de fase móvil y
estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases.
La Tabla 2.1 da la relación de las tres clases generales de cromatografía: cromatografía de líquidos,
cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre indica las fases
móviles en las tres técnicas son, respectivamente, líquidos, gases y fluidos supercríticos.
Hay que mencionar que solamente la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse a cabo en
columnas o sobre superficies planas; por otra parte, tanto la cromatografía de gases como la de fluidos
supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna, de tal modo que las paredes de la
columna contienen la fase móvil.
Tabla 2.1 Clasificación de los métodos cromatográficos en columna
Clasificación general
Método específico
Fase estacionaria
Cromatografía de líquidos
(LC) (fase móvil: líquida)
Líquido-líquido, o reparto
Líquido adsorbido sobre
un sólido
Líquido-fase unida
químicamente
Especies orgánicas
enlazadas a una superficie
sólida
Tipo de equilibrio
Distribución entre
líquidos
inmiscibles
Distribución entre
líquido y la superficie
enlazada
Líquido-sólido, o
adsorción
Sólido
Adsorción
Intercambio jónico
Exclusión por tamaño
Cromatografía de gases
(GC) (fase móvil: gas)
Gas-líquido
Gas-fase unida
químicamente
Gas-sólido
Cromatografía de fluidos
supercríticos (SFC) (fase
móvil: fluido supercrítico)
Resina de intercambio
iónico
Líquido en los intersticios
de un sólido polimérico
Líquido adsorbido sobre
un sólido
Especies orgánicas
enlazadas a una superficie
sólida
Sólido
Especies orgánicas
enlazadas a una superficie
sólida
Intercambio iónico
Distribución/exclusión
Distribución entre un
gas
y un líquido
Distribución entre el
líquido y la superficie
enlazada
Adsorción
Distribución entre el
fluido supercrítico y
superficie enlazada
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3. Cromatografía plana
Los métodos de cromatografía plana incluyen la cromatografía en capa fina (TLC) y la
cromatografía en papel (PC). En todos los casos se emplea una capa plana y relativamente delgada de un
material que a su vez es el soporte, o bien que recubre una superficie de vidrio, plástico o metálica. La
fase móvil se mueve a través de la estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o por
aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad, la cromatografía en plano se centra en la técnica de
la capa fina, que es más rápida, tiene mejor resolución, y es más sensible que su alternativa en papel. Por
ello nos centraremos en los métodos de capa fina.
Las separaciones en capa fina se realizan en placas de vidrio o plástico que se recubren con una capa
delgada y adherente de partículas finamente dividas; esta es la capa estacionaria. Las partículas son
semejantes a las descritas en cromatografía en columna de adsorción, de reparto en fase normal y en fase
inversa, y las fases móviles también son similares las utilizadas en cromatografía de líquidos de alta
eficacia en columna.
Las placas de capa fina se obtienen de forma comercial. Los tamaños son varios 5X20, 10X20, y
20X20. Estas placas comerciales se presentan en dos formatos. El convencional, donde las placas tienen
un espesor de 200 a 250 µm un tamaño de partícula de 20 µm o más. Presentan por lo común unos 2000
platos teóricos en 12 cm. y con un tiempo de desarrollo de 25 min. El segundo tipo de placas comerciales
es el de alta eficacia, que tienen películas de unos 100 µm de espesor, y un diámetro de partícula de 5 µm
o menos. El número de platos teóricos es mayor unos 4000 en 3cm y con 10 min. de desarrollo. Las
placas de alta eficacia permiten mejores separaciones y en menos tiempo, pero tienen la desventaja de
tener una menor capacidad de carga.
La aplicación de la muestra es el aspecto mas critico de la cromatografía en capa fina. Por lo general,
se aplica una disolución de la muestra del 0,001 al 0,1 %, como una mancha, a 1 o 2 cm. del extremo de
la placa. Pero para una separación de mayor eficacia, la mancha debería tener un diámetro mínimoaproximadamente 5nm para una aplicación cualitativa y menor para el análisis cuantitativo, y en el caso
de las disoluciones diluidas se realiza tres o cuatro aplicaciones superpuestas secando la zona entre
aplicación. La aplicación puede ser manual o por aplicadores mecánicos. Si es manual es por contacto
entre la placa y un capilar que contiene la muestra, o utilizando una jeringa hipodérmica. En el caso de
que sea mecánico, se mejorara la precisión y exactitud de la aplicación.
El desarrollo (Figura 3-1) de la placa es un proceso análogo a la elución en la cromatografía de
líquidos, en el que la muestra es transportada por la fase móvil a través de la fase estacionaria. La forma
más común de desarrollar la placa consiste en depositar una gota de la muestra cerca de unos de los
extremos de la placa, y marcar su posición con un lápiz. Tras la evaporación del disolvente en el que
estaba disuelta la muestra, se coloca la placa en un recipiente cerrado y saturado con los vapores del
disolvente con el que se efectuara el desarrollo. Uno de los extremos de la placa se introduce en el
eluyente procurando evitar el contacto directo de este con la muestra. El eluyente asciende por la placa
gracias el efecto de capilaridad ejercido entre las finas partículas. A medida que el eluyente se desplaza
pasa por el punto de aplicación de la muestra, la disuelve y la arrastra por la placa distribuyéndose entre el
disolvente que se desplaza y la fase estacionaria. Después que el disolvente ha pasado a través de la mitad
o las dos terceras partes de la longitud de la placa, se retira esta del recipiente y se seca. Las posiciones de
la muestra se pueden determinar por distintos procedimientos. Dos de ellos se usan con la mayoría de las
mezclas de sustancias orgánicas. Consisten en nebulizar sobre la placa una disolución de yodo o de ácido
sulfúrico, ya que ambos reaccionan con los compuestos orgánicos para dar productos oscuros. También se
utilizan reactivos específicos (como la ninhidrina) para localizar las especies separadas. Otro método de
detección se basa en incorporar un material fluorescente a la fase estacionaria. Una vez ha finalizado el
desarrollo, se examina la placa bajo luz ultravioleta. Los componentes de la muestra amortiguan la
fluorescencia del material de tal forma que, toda la placa exhibe fluorescencia menos los lugares donde
están los componentes de la muestra, no fluorescentes.
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Figura 3-1. Aspecto ideal que puede presentar una placa tras el desarrollo de la cromatografía en capa fina. La muestra 1
estaba constituida por dos componentes, mientras que la 2 sólo por uno.
Existen distintos tipos de análisis cualitativos para identificar los distintos componentes de la muestra
tras realizar la cromatografía en capa fina:
Uso de patrones: Consiste en aplicar a la placa la muestra desconocida y disoluciones de muestras
purificadas, de las especies que probablemente pueden estar presentes en la muestra desconocida. La
coincidencia entre los valores RF de alguna de las manchas de la muestra desconocidas el de alguno de los
estándares proporciona evidencias para la identificación de uno de los componentes de la muestra. RF es
un nuevo parámetro denominado factor de retardo, siendo el factor de retardo en la Figura 3-1 para el
soluto de la muestra 2. Este método necesita una confirmación mediante la repetición del ensayo con
diferentes fases móviles y estacionarias y con distintos reactivos de revelado.
RF =
dR
dM
(3.1)
Métodos de elución: Se raspa la zona de la placa que contiene el analito con una espátula o una
navaja, y se recoge el sólido sobre un papel satinado. Se trasfiere a un tubo de ensayo u otro recipiente,
donde el analito se disuelve con un disolvente adecuado y se separa de la fase estacionaria por
centrifugación o filtración. La identificación se realiza por técnicas como la espectrometría de masas, la
resonancia magnética nuclear o la espectroscopia de absorción en infrarrojo.
Cromatografía en plano bidimensional: En este caso la muestra se coloca en una de las esquinas de
una placa cuadrada y se realiza el desarrollo en dirección ascendente con el disolvente A. A continuación
se elimina este disolvente por evaporación, y se gira la placa 90 grados, realizando ahora el desarrollo
ascendente con el disolvente B. Tras la eliminación del disolvente, se determina la posición de los
componentes con un reactivo de revelado, tipo ninhidrina, y las manchas originadas se identifican
comparando sus posiciones con las de los estándares, (Figura 3-2).
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Figura 3-2. Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de sílice) de algunos aminoácidos. Disolvente A: tolueno/2cloroetanol/piridina. Disolvente B: cloroformo/alcohol bencilico/ácido acético. Aminoácidos: (1) ácido aspártico, (2) ácido
glutámico, (3) serina, (4) f3-alanina, (5) glicina, (6) alanina, (7) metionina, (8) valina, (9) isoleucina y (10) cisteína.
En cuanto al análisis cuantitativo, éste se puede hacer comparando el área de la mancha del estándar
con la del analito, se puede hacer una estimación semicuantitativa de la cantidad del componente
presente. Los mejores resultados se obtienen si se raspa la mancha de la placa, se extrae el analito del
sólido que forma la fase estacionaria, y se determina el analito por métodos físico o químicos. Otro
procedimiento consiste en usar un densitometro de barrido que puede medir la radiación emitida de la
mancha por fluorescencia o reflexión.
4. Cromatografía en columna
Para poder explicar la cromatografia en columna utilizaremos el concepto de elución en columna. La
Figura 4-1 muestra como dos sustancias A y B se separan en una columna por cromatografía de elución
con una fase móvil. La elución implica el transporte de una especie a través fe una columna por la adición
continuada de nueva fase móvil. El proceso empieza cuando una única porción de la muestra se introduce
en la parte superior de la columna (tiempo t0) después de lo cual los componente de la muestra se
distribuyen entre las dos fases, La introducción de fase móvil adicional, el eluyente, hace que la fase
móvil que la fase móvil que contiene una parte de la muestra avance por la columna, donde tienen lugar
una posterior reparto entre la fase móvil y las porciones frescas de la fase estacionaria a las que accede
(tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribución entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria
en el lugar en el que inicialmente se ubicaba la muestra.
Las sucesivas adiciones de la fase móvil hacen avanzar las moléculas de soluto (analitos) por la
columna en una serie de continuas transferencias entre las fases estacionaria y móvil. Sin embargo,
debido a que el movimiento de los solutos solo puede ocurrir en la fase móvil, la velocidad media a la que
una zona de soluto migra en la columna depende de la fracción de tiempo que reside en esta fase. Esta
fracción de tiempo es pequeña para las sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria
(compuesto B) y es grande cuando es más probable la retención en la fase móvil (componente A). Las
diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes de la mezcla en bandas o
zonas, que se localizan a lo largo de la columna (tiempo t2). El aislamiento de las especies separadas se
realiza haciendo pasar suficiente cantidad de fase móvil a través de la columna hasta que las bandas
individuales salen de ella, pudiendo así detectarse o reconocerse (tiempos t3 y t4).
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Figura 4-1. (a) Diagrama que muestra la separación de una mezcla de A y B por cromatografía de elución en columna. (b)
Señal de salida del detector en las distintas fases de la elución mostradas en (a).
Durante la elución en la columna cromatográfica de los distintos analitos de la muestra ocurre un
proceso asociado y muy importante, la dilución del analito, proceso que acompaña casi siempre a las
separaciones. Así el tamaño de la banda original que contiene los analitos es notablemente más pequeño
que cualquiera de las zonas que llegan al detector, lo que significa que se produce una importante dilución
de los analitos (su concentración disminuye) mientras están siendo separados, (Figura 4-2). Es evidente
que el movimiento de avance por la columna aumenta la distancia entre las bandas. Sin embargo, al
mismo tiempo tiene lugar un ensanchamiento de ambas zonas, lo que disminuye la eficacia de la columna
como sistema de separación. Existen condiciones en las que se puede lograr que el ensanchamiento de
bandas se de mas lentamente que la separación.
Figura 4-2. Perfiles de concentración de las bandas de los analitos A y B a dos tiempos distintos en su migración a
lo largo de la columna de la Figura 4-1. Los tiempos t1 y t2 se indican en la Figura 4-1.
La cromatografía en columna es uno de los principales métodos para la separación de especies
químicas. Además, se puede emplear para la identificación tanto cualitativa como para la determinación
cuantitativa de las especies separadas.
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En cuanto al análisis cualitativo, la cromatografía proporciona información acerca de las especies de
la muestra en cuanto a su tiempo de retención o su posición en la fase estacionaria tras el periodo de
elución.
A pesar de todo la cromatografía no nos aporta mucha información de la identificación positiva de las
especies químicas separadas, pero si que es un buen método para evidenciar la ausencia de ciertos
compuestos.
La cromatografía en columna es también un buen método que proporciona información cuantitativa
acerca de las especies separadas, basándose en la comparación de la altura, o del área, del pico del analito
con la de uno o más patrones. Pudiéndose hacer así análisis cuantitativos basados en la altura del pico,
en las áreas del los picos, mediante el método de calibrado y patrones, el método del patrón interno, y
por ultimo el método de la normalización de las áreas.
5. Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
5.1. Fundamentos y principios básicos
El HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o Cromatografía liquida de alta
resolución, es una técnica cromatográfica usada para separar componentes usando una variedad de
interacciones químicas entre el analito y la columna cromatográfica.
Básicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase móvil, bomba, inyector, columna de
separación y detector.
El analito se pasa a través de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase móvil liquida
con alta presión. La muestra se introduce en pequeños volúmenes a la corriente de la fase móvil y allí se
retarda por medio de interacciones químicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna.
El retardo se conoce como tiempo de retención, único para analito. Depende de la naturaleza del
analito, de la fase estacionaria y de la composición de la fase móvil.
Los solutos mas comunes usados en la fase móvil son combinaciones de agua purificada con líquidos
orgánicos, los mas comunes son Metanol y Acetonitrilo, también suelen usarse sales y bufferes para
contribuir a la separación de componentes. También se usa el Acido Trifluoroacetico para actuar como
formador de pares iónicos.
Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elución. Consiste en la variación de la
composición de la fase móvil, para adaptarse a los diferentes analitos y conseguir mejores resultados. El
gradiente separa la matriz del analito en función de la afinidad del analito por la composición de la fase
móvil. Cada analito tiene un gradiente de elución óptimo para obtener la máxima separación de picos en
el detector.
Existen varios tipos de HPLC:
Cromatografía de fase normal:
Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basándose en la polaridad. Este método usa una fase
estacionaria polar y una fase móvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es
retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito y la interacción
entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elución. La fuerza de interacción depende
no solo de los grupos funcionales, sino también de factores estéricos e isómeros estructurales.
El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retención, mientras que disolventes hidrófobos
aumentan el tiempo de retención. Algunos solutos polares interaccionan con la fase estacionaria y
desactivan la columna.
Cromatografía de fase inversa
Este tipo de HPLC es el más común. En esta técnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase
móvil moderadamente polar.
La fase estacionaria típica es silicio tratado con RMe2SiCl, donde R es una cadena lineal con un
grupo alcalino.
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La adición de disolventes polares incrementa el tiempo de retención y añadir disolventes
hidrofóbicos lo disminuyen. El tiempo de retención es mayor para moléculas no polares.
El principio básico de este método esta basado en las interacciones del disolvente polar, el analito no
polar y la fase estacionaria no polar.
Las características del analito son importantes para sus propiedades de retención. Las moléculas muy
grandes pueden causar que la interacción no sea completa. El tiempo de retención aumenta con el área
hidrofobicidad, que es inversamente proporcional al tamaño del soluto. Los componentes ramificados
eluyen más rápido por que el área total esta disminuida.
Hay otros modificadores de la fase móvil que afectan a la retención del analito. Añadir sales
inorgánicas causa incremento lineal en la tensión superficial de soluciones acuosas, incrementando el
tiempo de retención.
El pH también es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso se suele usar un
buffer como fosfato sódico para controlar el pH. Un ácido orgánico como ácido fórmico o ácido
trifluoracetico. Sirven para muchas cosas, controlan el pH, neutralizan cualquier carga residual del
silicato en la fase estacionaria y actúa como formador de pares iónicos para neutralizar la carga del
analito. Los efectos varían pero aumentan la calidad de la cromatografía.
Las columnas de fase inversa son más difíciles de dañar que las normales. Algunas consisten en
silicatos alcalinos y nunca se deben usar con sales acuosas, destruirían el silicato. Pueden ser usados con
ácidos acuosos, pero no durante mucho tiempo, pueden corroer metal. El metal debe estar en bajo
contenido para que la separación de sustancias sea mejor.
Cromatografía de exclusión por tamaño:
También conocida como cromatografía de gel permeante o cromatografía de gel filtrante. Separa las
partículas en función del tamaño.
Es una cromatografía de baja resolución y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias
de proteínas y es la técnica común para averiguar el peso molecular de polímeros sintéticos y naturales.
Cromatografía de intercambio iónico:
La retención esta basada en la atracción entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase
estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Algunos
intercambiadores de iones son:
Resinas de Poliestireno: permite entrecruzamientos que dan estabilidad a la cadena.
Celulosa: Tiene tamaño de poros mas grandes y bajas densidades de carga que los hacen ideales para la
separación de proteínas.
Poro controlado de vidrio o silicona porosa.
Los intercambiadores de iones favorecen la unión de iones de mayor carga y radio inferior. Un
incremento en el contra-ión (con respecto a los grupos funcionales de resinas) reduce el tiempo de
retención. Un incremento del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio catiónico, pero bajar el
pH reduce la retención en intercambio aniónico.
Se usa en la purificación de agua, preconcentración de componentes traza, cromatografía de
intercambio de ligandos, cromatografía de intercambio de iones de proteínas, intercambio de aniones a
alto pH de carbohidratos y polisacáridos.
Cromatografía de bioafinidad:
Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos estables, específicos y
reversibles. La formación de los complejos implica fuerzas moleculares como Van der Waals,
electrostática, dipolo-dipolo, hidrofóbicas y puentes de hidrogeno. Una unión bioespecífica se forma por
acción simultánea de estas fuerzas en los sitios de unión.
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5.2. Instrumentación
Bombas:
La bomba tiene la función de proveer un flujo continuo del eluyente a través del inyector, la columna
y el detector. Los requisitos de una bomba para HPLC son:
-
Rango de flujo: de 0.01 a 10 ml/min
Rango de presión: de 1 a 5000 psi
Pulsos de presión: menos del 1% para HPLC normal e inverso y menos del 0,2% para el HPLC
de exclusión de tamaño.
Existen distintos tipos de bombas:
De presión constante: son fáciles de usar y con bajo mantenimiento, además evitan los pulsos de
presión. El problema es que requiere una vigilancia constante del flujo, puesto que las variaciones pueden
producir fallos.
De flujo constante: son capaces de mantener el flujo, existen varios tipos:
-
Pistón recíproco: un pistón expela líquido a través de una válvula anti-retorno.
-
Pistón dual: Usando dos pistones, provee un fllujo constante y libre de pulsos.
-
Desplazamiento positivo (jeringuilla): un pistón controlado por motor que provee un flujo
suave y sin pulsos.
Gradiente de elución:
Para crear el gradiente de la fase móvil, es necesaria una mezcla de los componentes. La capacidad
de mezcla es vital para obtener el eluyente óptimo. Existen dos métodos:
-
Mezcla de alta presión: se usan bombas de alta presión individuales para cada líquido. Las
salidas se conectan en una camara de mezcla Se usa un controlador electrónico para asegurar
que la mezcla es óptima.
-
Mezcla de baja presión: la mezcla ocurre antes de pasar por la bomba, el controlador
electrónico regula la cantidad de liquido que pasa por los tubos.
Inyectores:
Los inyectores deben introducir muestras liquidas en un rango de volumen desde 0,1 ml a 100 ml con
una alta precisión y alta presión. Normalmente se usan inyectores Rheodyne ® que poseen válvulas de 6
puertos con un bucle que permite no solo la inyección de muestra sino también la purga del sistema y la
eliminación de burbujas.
Columna:
Normalmente compuesta de acero inoxidable del tipo 316, con diámetros internos desde 2,6 a 5 mm,
normalmente con filtros de acero poroso.
Tubos conectores:
Todos aquellos tubos que transportan las sustancias de columna a columna, de columna a detector o
de detector a detector. No deben superar los 0,634 mm de diámetro interno o causaran picos en las
mediciones.
13
Filtros:
Situados entre la bomba y el inyector de muestras, para evitar la entrada de ciertas sustancias y evitar
el colapso de la columna. Normalmente estos filtros estas compuestos de acero poroso.
Medidores de presión:
Son indicadores de fallos en el sistema, nos indica cuando un flujo continuo falla por motivos de
presión y si existe alguna fuga en la infraestructura del sistema.
Termostatos de columna:
Son importantes para mantener la columna a una temperatura optima, sobretodo en análisis
cualitativo, puesto que las variaciones de temperatura pueden cambian la viscosidad del eluyente e influir
en el volumen retenido.
Detectores:
De conductividad electrolítica: el flujo pasa a través de un capilar con dos electrodos, la
conductividad varia en función de la composición del eluyente y se miden. Muy común en combinación
con el HPLC de intercambio iónico.
Electroquímicos: se basa en la reacción de oxidación/reducción del analito con un electrodo, el nivel
de reacción es proporcional a la concentración de analito, midiendo esto y comparándolo con el electrodo
de referencia nos da datos que podemos usar para cuantificar.
De fluorescencia: es el detector más usado y el mas preciso, nos permite hacer un análisis cualitativo,
puesto que las sustancias al ser excitadas con ciertas longitudes de onda, emiten en longitudes de onda en
el espectro ultravioleta únicas para cada sustancia.
De índice de refracción: la detección implica la medida del cambio del índice de refracción de la
columna de eluyente. Se mide la diferencia entre el índice de refracción de la fase móvil y la muestra.
De luz visible/ultravioleta: el detector es básicamente un espectrofotómetro que mide el cambio que
sufre un haz luminoso al atravesar la muestra, midiendo la absorbancia de las sustancias.
De dispersión de luz evaporativa: se nebuliza la muestra de la columna hasta formar un aerosol,
después se vaporiza el disolvente y se forman gotas de soluto, después la célula de dispersión de luz
detecta su composición.
5.3. Aplicaciones al análisis de alimentos
Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimétrico para medir
simultáneamente los nueve antioxidantes más comunes.
Análisis de carbohidratos en bebidas: la adición de mono y disacáridos a bebidas y zumos sirve
como propósito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad añadida es correcta se miden los
azucares usando HPLC de intercambio iónico con detección de pulso amperométrico con detectores de
refracción o ultravioletas.
Isómeros de carotenoides: el HPLC en combinación con detectores calorimétricos permite el análisis
de los carotenoides dietéticos en tejidos animales y vegetales.
Flavonoides y fenoles: en el vino la medición de estas sustancias permite la determinación del color,
la edad y las variedades de uva usadas. El HPLC en combinación con colorímetros, permiten la
determinación de hasta 22 compuestos diferentes simultáneamente.
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Lípidos: la determinación de lípidos animales y vegetales como: colesterol, triglicéridos, glicéridos y
esteroles, se basa en el uso del HPLC y un detector de Dispersión de Luz Evaporativa (ELS).
Acidos lipoico y ácido dihidrolipoico en suplementos alimenticios: aun en estudio pero su detección
combinando HPLC con detectores colorimétricos es importante ya que estos dos compuestos parecen
importantes como antioxidantes y reguladores del ciclo celular.
Medición de nutrientes liposolubles en tabletas multivitamínicas: el uso del HPLC permite la
detección de múltiples vitaminas en alimentos suplementarios para neonatos.
4-Hidroxinonenal y otros aldehídos: se forman como resultado de peroxidación de lípidos, durante la
cocción o podredumbre. Se usa HPLC con detectores de fluorescencia para detectar estas sustancias que
son citotóxicas.
Surfactantes no iónicos: la detección de estas sustancias es crucial puesto que están altamente
reguladas debido a problemas medioambientales, se usa HPLC combinado con dispersión de luz
evaporativa.
Carbohidratos simples: usar HPLC con ELSD elimina la necesidad de usar bases fuertes o alto pH,
convirtiéndose en un método no destructivo.
Catequinas del té: las catequinas son flavonoles del té, posiblemente anticancerígenos. Se usa HPLC
con hidrólisis enzimática para detectar estas sustancias tan beneficiosas.
Triglicéridos: HPLC con ELSD permite la separación y caracterización de todos los tipos de
triglicéridos.
Contaminantes triptófanos: el HPLC con ELSD y detectores colorimétricos permiten la detección de
esta sustancia tóxica proveniente de plaguicidas.
6. Cromatografía de gases (GC)
6.1. Fundamentos y principios básicos
La idea de esta técnica se basa en la volatilización de la muestra y su posterior inyección en la cabeza
de una columna cromatográfica. Para la elución de la muestra se usa un gas inerte como fase móvil, de
esta manera la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito, simplemente transporta el analito
a través de la columna.
Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC):
Cromatografía gas-sólido (GSC): la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos se
produce mediante adsorción.
Cromatografía gas-líquido (GLC): la fase estacionaria son moléculas de líquido inmovilizadas sobre
la superficie de un gas inerte. Esta es la que se usa más ampliamente.
GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el
proceso de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no es lineal, es el que ha provocado
que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención del analito sobre la superficie
es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su única aplicación es la separación de
especies gaseosas de bajo peso molecular.
La GC es un sistema compuesto de gas portador, sistema de inyección de muestra, columna
(generalmente dentro de un horno), y detector.
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6.2. Instrumentación
Gas portador:
Debe ser un gas inerte para evitar que reaccione con el analito o con la columna. Los gases de uso
mas común son helio, nitrógeno, hidrogeno o argón. Se controla su entrada en el sistema mediante
manómetros para garantizar un flujo constante y estable. Las presiones de entrada son desde 10 a 25 psi.
Sistema de inyección de muestra:
El analito se inyecta usando una microjeringa en una cámara de vaporización instantánea sellada por
una junta de silicona (Septum). El analito debe ser introducido en pequeñas cantidades para asegurar el
mejor análisis, si la columna es ordinaria el volumen es de unos 20 microlitros; si la columna es capilar el
volumen es menor de 10-3 microlitros. Se usan divisores de flujo a la entrada de la columna para desechar
analito hasta alcanzar estos volúmenes. Las muestra sólidas deben introducirse en forma de disolución, el
disolvente se pierde en la cámara de vaporización y así no interfiere en la elución.
Columnas y sistemas de control de temperatura:
Existen dos tipos de columnas:
-
Empaquetadas o de relleno
Tubulares abiertas o capilares (Mas eficaces y rápidas)
La longitud de las columnas es de 2 a 50 metros, de acero inoxidable, vidrio, sílice o teflón. Las
columnas se enrollan de forma helicoidal para encajar en el horno.
La temperatura influye directamente sobre la separación de los analitos, se necesita una precisión de
décimas de grado. La temperatura depende del punto de ebullición del analito, así pues se ajusta la
temperatura un poco por encima del punto de ebullición. Si son varios analitos se debe ajustar la rampa de
temperatura, que consiste en aumentar la temperatura de forma gradual o por etapas hasta separar los
analitos. El problema de subir demasiado la temperatura es que aumenta la velocidad de elución y
también aumenta el riesgo de descomposición del analito.
Detectores:
Detector de ionización de llama: es un quemador de hidrogeno/oxigeno donde se mezcla el eluyente
con hidrogeno. En esta cámara se produce una chispa para causar ignición, los compuestos orgánicos al
quemarse se pirolizan y producen iones y electrones, aprovechando que se convierte en conductor se
induce una corriente eléctrica, para detectar iones desprendidos. Es un detector de masa, puesto que
aproximadamente el numero de iones desprendidos es igual al numero de carbonos transformados.
Detector de conductividad térmica: se basa en el calentamiento de una resistencia mediante el uso de
una corriente eléctrica. Esta resistencia tiene una temperatura que depende del gas circundante. La
resistencia es un hilo de tungsteno, platino u oro.
Detector termoiónico: Se usa para compuestos fosforados y nitrogenados, su funcionamiento es
parecido al detector de ionizacion de llama, el eluyente se mezcla con hidrogeno y se quema. El gas se
pasa alrededor de una esfera de rubidio calentado a 600º C y sometida a 180 V, creando un plasma en el
cual se forman gran cantidad de iones que producen una corriente medible, la intensidad es proporcional
al numero de iones formados y así determinar la cantidad del analito.
Detector de captura de electrones: se basa en la emisión de una partícula β por parte de átomos como
el 63Ni o tritio, el electrón emitido ioniza el gas portador y emite una ráfaga de electrones, esta ráfaga es
sensible a una corriente eléctrica que podremos medir. En el caso de especies orgánicas los electrones son
absorbidos, disminuyendo la intensidad de la corriente.
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Detector de emisión atómica: el gas se introduce en un plasma de helio inducido por microondas, la
alta temperatura ioniza toda la muestra y se miden los espectros de emisión mediante un
espectrofotómetro acoplado al sistema.
Columnas:
-
Columnas de relleno: Son tubos de vidrio, metal inerte o teflón de 2 o 3 metros de longitud
y 2 a 4 mm de diámetro interno el material de relleno del interior consiste en partículas
esféricas para interaccionar con el analito. Normalmente se usan diatomeas puesto que es un
material ideal para la adsorción.
-
Columnas capilares:
o WCOT: Pared recubierta: son tubos capilares donde la pared interna esta recubierta
con una fina capa de fase estacionaria. Son mas eficaces.
o SCOT (soporte recubierto): tienen una capa en su lado interno de superficie
adsorbente donde se acopla la fase estacionaria. Tienen mayor capacidad de carga.
Fase estacionaria:
Una fase estacionaria liquida inmovilizada requiere:
-
Características de reparto.
Baja volatilidad.
Baja reactividad.
Estabilidad térmica.
Algunos de las fases estacionarias mas comunes son:
-
Polidimetilsiloxano: fase no polar de uso general para hidrocarburos, drogas y esteroides.
Poli(fenilmetidifenil)siloxano: para ésteres metílicos de ácidos grasos, alcaloides, drogas y
compuestos halogenados.
Poli(fenilmetil)siloxano: drogas, esteroides, pesticidas y glicoles.
Poli(trifluoropropildimetil)siloxano: para aromáticos clorados, nitroaromáticos, bencenos
alquilsustituidos.
Polietilenglicol: para compuestos como glicoles, alcoholes, eteres y aceites esenciales.
Poli(dicianoalildimetil)siloxano: para ácidos grasos poliinsaturados, ácidos libres y
alcoholes.
6.3. Aplicaciones al análisis de alimentos
Caracterización de aceites esenciales: se basa en la detección de sustancias terpenicas responsables
de propiedades aromáticas en los alimentos.
Análisis de nitrosaminas en agua potable: las nitrosaminas son sustancias carcinógenas potenciales,
se debe controlar su presencia en agua potable. Para esto se usa extracción de la fase sólida y GC con
columna capilar.
Controles de alcoholemia: la GC se puede usar para determinar el volumen de alcohol en sangre.
Determinación de trazas de pesticidas organo-fosforicos (OPP) en aceite de oliva: el GC en
combinación con los detectores de ionización de llama permiten la detección de estos pesticidas, que a
pesar de ser baratos y de amplio espectro, son causantes de problemas irreversibles en la actividad de los
neurotransmisores.
Contaminación por dioxinas: usando detectores de conductividad electrolítica, permite el análisis de
residuos de dioxinas muy perjudiciales para la salud humana.
Detección de pesticidas en aves y peces: se usan columnas capilares para la detección de pesticidas
volátiles o sustancias de vertidos tóxicos.
17
Bibliografía
1.
2.
Skoog, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Análisis Instrumental, Madrid: McGraw-Hill.
Mc Master, Marvin (1994) HPLC: A Practical User's Guide. Wiley-VCH.
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