Bruceana2014a2

ANEXO 2
GUIAS DE LABORATORIO PARA LLEVAR A CABO METODOS NORMALIZADOS
PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS PARAMETROS DBO5, DQO, NTK Y PT EN EL
LABORATORIO DE INGENIERÍA AMBIENTAL DE LA UNIVERSIDAD ANTONIO
NARIÑO
DEMANDA BIOQUIMICA DE OXIGENO
INCUBACIÓN 5 DÍAS - ELECTROMÉTRICO
1. FUNDAMENTO
Se define como D.B.O. de un líquido a la cantidad de oxígeno que los
microorganismos, especialmente bacterias, hongos y plancton, consumen durante la
degradación de las sustancias orgánicas contenidas en la muestra. Se expresa en
mg / L [1]
Es un parámetro indispensable cuando se necesita determinar el estado o la calidad
del agua de ríos, lagos, lagunas o efluentes. Cuanto mayor cantidad de materia
orgánica contiene la muestra, más oxígeno necesitan sus microorganismos para
oxidarla (degradarla) [1].
Como el proceso de descomposición varía según la temperatura, este análisis se
realiza en forma estándar durante cinco días a 20 º C; esto se indica como D.B.O5.
El oxígeno disuelto es medido al inicio y al final del periodo de incubación y la DBO5
es calculada de la diferencia entre estos [1].
Este valor se calcula por el método electrométrico (electrodo de membrana), basado
en la tasa de difusión del oxígeno molecular a través de una membrana plástica
permeable al oxígeno, que recubre el elemento sensible de un electrodo y actúa a la
vez como una barrera de difusión contra muchas impurezas que interfieren. En los
otros métodos para la determinación del OD. Bajo condiciones regulares, la "corriente
de difusión" es lineal y directamente proporcional a la concentración del OD [2].
Según las reglamentaciones, se fijan valores de D.B.O 5 máximo que pueden tener
las aguas residuales, para poder verterlas a los ríos y otros cursos de agua. De
acuerdo a estos valores se establece, si es posible arrojarlas directamente o si deben
sufrir un tratamiento previo [2].
2. INTERFERENCIAS

Neutralización de muestras Llevar el pH entre 6.5 y 7.5 utilizando soluciones
de Ácido Sulfúrico 1N ó de Hidróxido Sódico 1N respectivamente. El volumen
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añadido de ácido o base no debería diluir más 0,5% el volumen de la muestra.
Si es necesario utilizar soluciones más concentradas.

Eliminación de agentes desinfectantes Son agentes oxidantes y se
destruyen mediante adición de pequeños volúmenes de solución de Sulfito
Sódico 0.025 N. Las muestras desinfectadas requieren una siembra
bacteriana después de eliminar el desinfectante.

Eliminación de metales tóxicos Algunas aguas residuales industriales (e.j.
enchapados metálicos) contienen metales tóxicos. Si el pH de esas aguas
residuales se lleva a 8.5 la mayoría de los metales se precipitan como óxidos
o hidróxidos y se eliminan por filtración. El pH irá entonces entre 6.5 y 7.5 y se
añadirá una siembra bacteriana. En algunos casos puede obtenerse una
reducción de toxicidad mediante una simple dilución de la muestra. El
problema de la toxicidad en muestras normalmente requiere investigaciones
particulares.

Inhibición de la nitrificación Algunas veces se requiere para excluir de la
medición D.B.O. la contribución debida a la nitrificación; efluentes tratados
biológicamente, muestras sembradas con efluentes biológicamente tratados,
aguas de ríos. La nitrificación normalmente comienza después de 5 días a 20
ºC y además su influencia sobre la evaluación de la D.B.O. es mínima. Si las
bacterias nitrificantes están presentes en números grandes en la muestra a
examinar, su actividad puede ser inhibida mediante la adición de agentes
químicos. Este es obtenido mediante la adición para cada botella de D.B.O.
los siguientes volúmenes de una solución de 0.05 % de allythiourea.
Volumen de muestra Volumen de solución
inhibidora
100 mL
0,3 mL
150 mL
0,5 mL
250 mL
0,8 mL
400 mL
1,3 mL
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El mismo resultado puede obtenerse mediante adición de los mismos volúmenes
mostrados de una solución 0.35% de 2-Chloro-6 (trichloromethyl) pyridine. Si se
utiliza un inhibidor de la nitrificación éste debe ser registrado y mostrado con los
resultados.
3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS.
3.1 MATERIALES






Botellas Winkler
Pipetas
Bureta
Aireadores
Beaker
Filtros (si se desea DBO soluble).
3.2 EQUIPOS


Incubadora a 20 °C  1°C, sin luz.
Oximetro
3.3 REACTIVOS
3.3.1 Reactivos generales.
-
Cloruro de Hierro, férrico, hexahidratado (FeCl3 • 6 H2O).
Cloruro de Calcio, anhídrido (CaCl2).
Sulfato Magnésico, heptahidratado (MgSO4 • 7 H2O).
Orto-Fosfato Potásico, bi-acido, (KH2PO4).
Orto-Fosfato Potásico, monoácido (K2HPO4).
Orto-Fosfato Sódico, monoácido, (Na2HPO4).
Cloruro Amónico (NH4Cl).
3.3.2 Reactivos para soluciones especiales y patrón.
-
Ácido Sulfúrico (H2SO4) solución 1N.
Hidróxido Sódico (NaOH) solución 1N.
Sulfito Sódico (Na2SO3).
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-
-
Allylthiourea (Thiosinamina), C4H8N2S. ó 2-Cloro-6 (Triclorometil)
piridina, C6H3Cl4N (CTCMP, Servida N-). Aditivo para fertilizantes
minerales punteado para bajar las pérdidas de nitrógeno en suelos.
Glucosa grado puro
Acido glutámico grado puro
4. PREPARACIÓN.
4.1 Nutrientes:

Solución amortiguadora de fosfatos: Disolver 2,125 g de KH2PO4, 5,4375
g de K2HPO4, 8,35 g de Na2HPO4.7H2O ó 4,4236 g Na2HPO4 y 0,425 g de
NH4Cl en agua destilada y diluir a 250 ml. Verificar el pH (7,2 sin ajuste).
Si el pH no se encuentra en el rango, se debe disolver 10,625 g de KH2PO4
o 13,55g de K2HPO4 en aproximadamente 200 ml de agua destilada, se ajusta
el pH a 7,2 con NaOH 30% y se diluye a 250 ml.

Solución de sulfato de magnesio: Disolver 5,625 g de MgSO4.7H2O en
agua destilada y diluir a 250 ml.

Solución de cloruro de calcio: Disolver 6,875 g de CaCl2 en agua destilada
y diluir a 250 ml.

Solución de cloruro férrico: Disolver 0,0625 g de FeCl3.6H2O en agua
destilada y diluir a 250 ml.
4.2 AGUA DE DILUCIÓN AIREADA
Tomar agua destilada a 20°C y saturarla con Oxigeno bien sea agitando
fuertemente una botella parcialmente llena o por medio de aireación con piedra
difusora.
Añadir 1 ml de solución amortiguadora de fosfato, solución de sulfato de
magnesio, solución de cloruro de calcio y solución de cloruro férrico, por cada litro
de agua aireada.
4.3 INÓCULO
Puede ser utilizado como inoculo el efluente de un tratamiento biológico que no
haya sido desinfectado (utilizar inhibidor de nitrificación en este caso), licor mixto
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diluido, aguas superficiales aguas abajo de un punto de descarga de aguas
residuales, sobrenadante de un agua residual domestica fresca después de
airearla y dejarla sedimentar mínimo una hora y máximo 36 horas o si se desea
de un cultivo especifico.
Si se trata de aguas residuales domésticas, no es necesario utilizar inóculo.
4.4 SOLUCIONES NEUTRALIZADORAS:

Solución de álcali 1,0 N: para neutralización de muestras acidas, se
adicionan 40 g de NaOH y se diluye a un litro con agua destilada.

Solución acida 1,0 N: para neutralización de muestras básicas, adicionar 28
ml de ácido sulfúrico concentrado en 500 mL de agua, agitar levemente y diluir
a un litro.
4.5 PATRÓN:

Solución glucosa - ácido glutámico: Secar la glucosa y el ácido glutámico,
los dos grado reactivo (103°C por 1 hora). Se Adicionan 150 mg de glucosa y
150 mg de ácido glutámico a agua destilada y se diluye a 1 litro. (vigencia de
5 refrigerar a 4°C)
4.6 SOLUCIONES ESPECIALES

Solución de desactivación de cloro sulfito de sodio: se disolver 1.58 g de
Na2SO3 por litro de agua destilada. La solución es inestable y debe utilizarse
durante el día.

Inhibidor de la nitrificación: Solución de 0.05 % de allythiourea (50 mg en
100 mL de agua) o solución 0.35% de 2-Chloro-6 (trichloromethyl) pyridine
(350 mg en 100 ml de agua).
5. PROCEDIMIENTO.

Para determinar DBO soluble se debe filtrar la muestra (papel fibra de virio y papel
0,45 micras).

Dejar aclimatar la muestra hasta 20 °C.
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
Se debe adicionar inoculo a muestras de aguas industriales, con cloro residual o
con pH extremo (>8 ó <6).

Alistar las botellas winkler previamente purgadas con agua destilada, incluyendo
una para blanco (agua de dilución aireada) tres replicas por cada muestra, si se
va inocular alguna muestra, una muestra para el blanco con inoculo.

Estimar como mínimo tres valores probables por muestra, por su procedencia o
por su valor de DQO, teniendo en cuenta la Tabla 1.
TABLA 1: Mililitros de muestra a adicionar dependiendo del rango de DBO esperada.
Mililitros de Muestra Rango de DBO Esperada




1
600-1.650
2
300-825
5
120-420
10
60-165
20
30-82
50
12-33
100
6-16,5
150
4-11
200
3-7
300
2-5,5
Si la concentración probable es mayor a 1600 mg /L se deben realizar diluciones de
la muestra, registrando su valor.
Llenar parcialmente cada botella con agua de dilución aireada.
Adicionar el volumen de la muestra según la Tabla 1 a la botella Winkler de 300 mL.
Si se adicionan más de 200 ml de la muestra, adicionar los nutrientes directamente
a la botella. Adicionar 0,30 ml de cada uno, terminar de llenar la botella con agua
destilada aireada y agitar.
Si se requiere el inoculo adicionar de 1ml a 3 ml si el inoculo utilizado son aguas
residuales crudas sedimentadas o efluente primario y de 1ml a 2 ml si se trata de
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






dilución 1:10 de licor mixto, el blanco debe llevar la misma cantidad de inoculo.
registrar el volumen adicionado.
Si se requiere adicionar el inhibidor de nitrificación, 3 mg de TCMP a cada botella de
300 ml.
Llenar la botella con agua de dilución hasta el inicio del esmerilado.
Medir el oxígeno disuelto inicial de cada una de las botellas con el oximetro.
Tapar herméticamente con sello de agua sin dejar burbujas de aire en la botella, si
queda algún espacio se debe completar con agua de dilución aireada.
Mezclar girando la botella manualmente varias veces.
Incubar durante 5 días a 20 °C ± 1°C.
Medir el oxígeno disuelto final con el oximetro, eliminando primero el sello de agua.
6. CÁLCULO.
Para calcular la DBO5 cuando la muestra no fue inoculada se debe utilizar la siguiente
formula:
D  D2
DBO5 , mg / L  1
 Vbotella  f
Vmuestra
D1 = Oxígeno disuelto inicial (mg/L)
D2 = Oxígeno disuelto final (mg/L)
Vmuestra = volumen de muestra adicionado
Vbotella = volumen de la botella Winkler
f = factor de dilución (Volumen final/Volumen inicial) aplica si se realizó dilución
adicional, de lo contrario poner 1.
Para calcular la DBO5 cuando la muestra fue inoculada se debe utilizar la siguiente formula:
D  D2   B1  B2   V
DBO5 , mg / L  1
botella  f :
Vmuestra
D1 = Oxígeno disuelto inicial (mg/L)
D2 = Oxígeno disuelto final (mg/L)
Vmuestra = volumen de muestra adicionado
Vbotella = volumen de la botella Winkler
f = factor de dilución (Volumen final/Volumen inicial) aplica si se realizó dilución
adicional, de lo contrario poner 1.
B1 = Oxígeno disuelto del control de inoculo antes de la incubación (mg/L)
B2 = Oxígeno disuelto del control del inoculo después de la incubación (mg/L)
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
Solo se deben reportar resultados que registren un oxígeno disuelto final de al
menos 1 mg/L, y consumo de oxigeno de al menos 1 mg/L.

Si varias diluciones cumplen este parámetro se reporta el promedio de los resultados.
Esto si la diferencia máxima entre estas es menor del 30%. Si no es así se deben
descartar los datos ya que es evidencia de anomalías.

En el caso de que todas las diluciones realizadas dependiendo la DBO esperada
tengan un oxígeno disuelto final < 1,0 mg/L se selecciona la botella con la mayor
dilución, es decir a la que se añadió menor volumen de muestra y se reporta su valor
como “> valor obtenido” y se especifica que no cumple criterio de calidad del método.

En el caso de que ninguna de las diluciones presente un consumo mayor a 1 mg/L,
y se haya incubado una botella con volumen de muestra de 300 mL, se debe reportar
la DBO como “menor al límite de detección”, si se incubaron valores menores a 300
ml de muestra se reporta la DBO que se obtuvo en la botella a la que se adicionó
mayor volumen de muestra con la siguiente especificación “no cumple criterio de
calidad del método”.

Si la muestra fue filtrada se reporta el resultado como DBO filtrada ó soluble.

Si se usó inhibidor de nitrificación, el resultado se debe reportar como DBOc5
7. VERIFICACIÓN
Control de blanco: El consumo de oxígeno disuelto no debe ser mayor de 0,20 mg/L y
preferiblemente menor de 0,10 mg/L. Si el valor es mayor de 0,20 mg/L se deben
descartar todos los datos de ensayos usando dicha agua o identificar claramente estas
muestras en el registro de datos, en el reporte de resultados se debe indicar que “no
cumple el criterio de control de calidad”.
La diferencia porcentual relativa entre los resultados de diferentes diluciones, no debe
ser mayor del 30%.
De la mezcla glucosa glutámico sembrar una solución al 2%, es decir 6 mL cuando el
volumen final es 300 mL, con duplicado la DBO debe ser de 198  30,5 mg/L ó promedio
± 3 ds (desviaciones estándares) con los últimos 20 datos del laboratorio. Se realizan
cartas de control.
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REFERENCIAS
[1] M. Andreo, «Demanda Biológica de Oxígeno (D.B.O),» 2002.
[2] H. R. Quiroz Ruiz, «Microbiología acuática,» Lambayeque, 2012.
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Diagrama de flujo – solución amortiguadora de fosfatos.
Diagrama de flujo – Solución de sulfato de magnesio.
Diagrama de flujo – Solución de cloruro de calcio
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Diagrama de flujo – Solución de cloruro férrico.
Diagrama de flujo- Patrón glucosa- Acido glutámico
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Diagrama de flujo Demanda Bioquímica de Oxígeno
A
Llenar parcialmente la botella
con agua de dilución
Adicione el volumen de
muestra para cada
botella Winkler
B
SI
Inocule la muestra
La muestra
presentaba pH
extremo, cloro, son
NO
NO
Inoculo proviene de
efluente de tto
biológico, licor mixto?
Llene la botella con agua
de dilución
Mezclar
Incubar 20  1°C, 5d  6h
Medir OD final (MT-PRE-65,111) de todas
diluciones, blanco agua dilución, control
inoculo
Calcular DBO, con diluciones de
abatimiento > 2 y ODf > 1 mg/L
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SI
Adicione inhibidor de
nitrificación
Medir OD inicial de 1
botella
DEMANDA QUÍMICA DE OXIGENO
INCUBACIÓN 5 DÍAS – MANOMÉTRICA
1. FUNDAMENTO.
Los microorganismos ya presentes o inoculados deliberadamente en una muestra de
agua que contiene materia orgánica biodegradable, usan oxígeno para sus procesos
bioquímicos y producen un volumen equivalente de dióxido de carbono. Si el proceso
se desarrolla en un sistema cerrado y el dióxido de carbono es absorbido por un
fuerte álcali, por ejemplo cal sodada (una mezcla de óxido de calcio e hidróxido de
sodio, con una capacidad de absorción de dióxido de carbono de un 20%) o potasa
cáustica, puede medirse un descenso progresivo de la presión interna
2. INTERFERENCIAS.

Neutralización de muestras Llevar el pH entre 6.5 y 7.5 utilizando soluciones
de Ácido Sulfúrico 1N ó de Hidróxido Sódico 1N respectivamente. El volumen
añadido de ácido o base no debería del 0,5% del volumen de la muestra. Si
es necesario utilizar soluciones más concentradas.

Eliminación de agentes desinfectantes Son agentes oxidantes y se
destruyen mediante adición de pequeños volúmenes de solución de Sulfito
Sódico 0.025 N.Las muestras desinfectadas requieren una siembra bacterial
después de eliminar el desinfectante.

Eliminación de metales tóxicos Algunas aguas residuales industriales (e.j.
enchapados metálicos) contienen metales tóxicos. Si el pH de esas aguas
residuales se lleva a 8.5 la mayoría de los metales se precipitan como óxidos
o hidróxidos y se eliminan por filtración. El pH irá entonces entre 6.5 y 7.5 y se
añadirá una siembra bacterial. En algunos casos puede obtenerse una
reducción de toxicidad mediante una simple dilución de la muestra. El
problema de la toxicidad en muestras normalmente requiere investigaciones
particulares.

Inhibición de la nitrificación Algunas veces se requiere para excluir de la
medición D.B.O. la contribución debida a la nitrficación; efluentes tratados
biológicamente, muestras sembradas con efluentes biológicamente tratados,
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aguas de ríos. La nitrificación normalmente comienza después de 5 días a 20
ºC y además su influencia sobre la evaluación de la D.B.O. es mínima. Si las
bacterias nitrificantes están presentes en números grandes en la muestra a
examinar, su actividad puede ser inhibida mediante la adición de agentes
químicos. Este es obtenido mediante la adición para cada botella de D.B.O.
los siguientes volúmenes de una solución de 0.05 % de allythiourea.
Tabla 1: Volumen de solución inhibidor, según volumen de muestra.
Volumen de muestra Volumen de solución
inhibidora
100 mL
0,3 mL
150 mL
0,5 mL
250 mL
0,8 mL
400 mL
1,3 mL
El mismo resultado puede obtenerse mediante adición de los mismos volúmenes
mostrados de una solución 0.35% de 2-Chloro-6 (trichloromethyl) pyridine. Si se
utiliza un inhibidor de la nitrificación éste debe ser registrado y mostrado con los
resultados.
3. IMATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS.
a.
MATERIALES


b.
EQUIPOS


c.
Probeta
Pipeta
Sistema DBO de 10 plazas
Incubadora
REACTIVOS
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i. Reactivo generales








Varias escalas de Hidróxido Potásico (KOH), de grado comercial (No
se necesita particularmente puro). ó • Cal Sodada no deslicuada,
gránulos de 1.0-1.7 mm.
Cloruro de Hierro, férrico, hexahidratado (FeCl3 • 6 H2O).
Cloruro de Calcio, anhídrido (CaCl2).
Sulfato Magnésico, heptahidratado (MgSO4 • 7 H2O).
Orto-Fosfato Potásico, bi-acido, (KH2PO4 ).
Orto-Fosfato Potásico, monoácido (K2HPO4).
Orto-Fosfato Sódico, monoácido, (Na2HPO4).
Cloruro Amónico (NH4Cl).
ii. REACTIVOS ESPECIALES






Ácido Sulfúrico (H2SO4) solución 1N.
Hidróxido Sódico (NaOH) solución 1N.
Sulfito Sódico (Na2SO3).
Allyl thiourea (Thiosinamina), C4H8N2S. ó 2-Cloro-6 (Triclorometil)
piridina, C6H3Cl4N (CTCMP, Servida N- ). Aditivo para fertilizantes
minerales punteado para bajar las pérdidas de nitrógeno en suelos.
Glucosa grado puro
Acido glutámico grado puro.
4. PREPARACIÓN.
4.1 NUTRIENTES

Solución de cloruro férrico: - 0.25 g de Cloruro Férrico Hexahidratado
(FeCl3 • 6 H2O) a 1 L de agua destilada.

Solución de cloruro de calcio: 27.5 g de Cloruro Cálcico anhídrido (CaCl2)
a 1 L de agua destilada.

Solución de sulfato de magnesio: 22.5 g de Sulfato Magnésico
Heptahidratado (MgSO4 • 7 H2O) a 1 L de agua destilada.
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
Solución amortiguadora de fosfatos: 8.5 g de Fosfato Potásico monobásico
(KH2PO4), 33.4 g de Fosfato di-Sódico Heptahidratado (Na2HPO4 • 7 H2O),
21.7 g de Fosfato Di-Potásico (K2HPO4), 1.7 g de Cloruro amónico, (NH4 Cl)
a 1 L de agua destilada.
PH final = 7.2.
Las muestras sin nutrientes con una D.B.O. menores a 800-900 ppm se les
añade con 1 mL de cada solución por cada litro de muestra.
4.2 AGUA DE DILUCION:
Cuando se va a diluir muestras se debe preparar un agua diluida mediante la
añadidura de nutrientes al agua destilada. A cada litro de agua destilada se le
añadirá 1 mL de cada solución. El agua de dilución debería tener una
D.B.O.520 no mayor a 0.2 ppm.
4.3 INOCULO
Por lo general, las aguas residuales municipales, después de 1-2 horas de
sedimentación, se utilizan como siembra. Estas contienen de 103-106 bacterias
por mL. Esta variabilidad hace necesaria un volumen de siembra del 3 al 30%
del volumen de la muestra. Generalmente se utiliza un volumen cercano al
10%.
Se debe realizar un blanco, adicionando la misma cantidad de inoculo, La
D.B.O obtenida de este blanco debe ser restada de los valores obtenidos con
las muestras sembradas.
5 PROCEDIMIENTO.

Estimar como mínimo dos valores probables por muestra, por su procedencia
o por su valor de DQO y escoger la escala según la tabla 2.

Si el valor esperado de DBO, supera las escalas, realizar diluciones con agua
de dilución (numeral 3), registrar el factor de dilución.

Poner dentro de las botellas un volumen de muestras de acuerdo a la escala
elegida (tabla 2) medido con una probeta graduada.
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
Introducir un imán de agitación en cada botella.

Llenar el depósito de álcalis de cada botella con una cantidad de absorbente
de dióxido de carbono (escamas de hidróxido potásico o gránulos de cal
sodada) hasta el borde sin que rebose por los agujeros de las paredes. En
caso de caer algo de absorbente en la botella, lavar bien antes de verter en él
otra muestra.

Colocar las botellas en su posición dentro del equipo de agitación.

Introducir el equipo de agitación dentro de un refrigerador termostático a la
temperatura elegida para la medición de la D.B.O. Conectar el cable de
corriente al enchufe interior y encender el equipo con el interruptor situado en
el panel frontal.
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
Esperar de 20 a 30 min, ya que el equilibrio térmico entre las muestras y el
equipo a la temperatura elegida se alcanza en este tiempo.

Colocar los sensores de D.B.O. en cada botella girando y presionando.
Resetee cada sensor D.B.O para cancelar cualquier valor almacenado (oprimir
A y B al mismo tiempo), seleccione la escala más adecuada (oprimir A hasta
que aparezca la escala querida) e inicie el ciclo de medición.(oprimir B).

Incubar por 5 días

Para leer los valores de DBO diarios se oprime la tecla B prolongadamente,
hasta que aparezca el número 1, a continuación cada vez que se oprima la
tecla B aparecerá la secuencia de medición (2,3,4,5) y al oprimir la tecla A se
visualizará cada valor correspondiente al día..
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Tabla 2: Volumen de muestra según escala elegida.
Escala
Volumen de muestra
A: 0 ÷1000 mg O2/l
100 ml
B: 0 ÷ 600 mg O2/l
150ml
C: 0 ÷ 250 mg O2/l
250ml
D: 0 ÷ 90 mg O2/l
400ml
Las escalas dan directamente el valor del oxígeno consumido como mg O2/L,
después de un periodo de tiempo establecido. La posibilidad de medir muestras
diluidas extiende el rango de mediciones. Cuando son utilizados factores de dilución
altos (1:100, 1:1000) y existen dudas sobre el agua destilada utilizada para las
diluciones se sugiere medir también la D.B.O. del agua de dilución, cuyo valor se
restará del valor obtenido para la muestra diluida, antes de multiplicar el resultado
por el factor de dilución.
6 CÁLCULO.

Para calcular la DBO5 cuando la muestra no fue inoculada se debe utilizar la
siguiente formula:
𝑫𝑩𝑶𝒓𝒆𝒂𝒍 = 𝑫𝟏 ∗ 𝒇
f = factor de dilución (Volumen final/Volumen inicial) aplica si se realizó dilución
adicional, de lo contrario poner 1.
D1= Valor DBO5 de la muestra

Para calcular la DBO5 cuando la muestra fue inoculada se debe utilizar la siguiente
formula:
𝑫𝑩𝑶𝒓𝒆𝒂𝒍 = 𝑫𝟏 ∗ 𝒇 − 𝑫𝟐
f = factor de dilución (Volumen final/Volumen inicial) aplica si se realizó dilución
adicional, de lo contrario poner 1.
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D1= Valor DBO5 de la muestra
D2= Valor DBO5 del blanco inoculado
7 VERIFICACIÓN.
La precisión del método puede ser evaluada mediante la utilización de soluciones con un
contenido conocido de Glucosa y Acido Glutámico, grado puro y previamente secado a 105
ºC durante 1 hora.
Las soluciones deben prepararse utilizando agua destilada de alta calidad, adicionadas con
nutrientes (1 mL/L de cada solución previamente descrita numeral 3.1) y sembradas con
bacterias.
Utilizar150 mg de Glucosa y 150 mg de Ácido Glutámico en 1 Litro de solución, se debe
obtener una D.B.O.5 20 = 220 ± 18 mg O2/L.
Para calcular este resultado se deben introducir 250 mL del patrón diluido 1:10 con agua
destilada en una botella de incubación, sembrada con 1 o 2 mL de lodo biológico. Después
de 5 días se debe leer una D.B.O. de 200 mg/L.
En otra botella se introduce la misma cantidad de agua destilada y lodo, después de 5 días,
se debe leer una D.B.O. de 15 mg/L (valor del blanco).
El valor real de la D.B.O., considerando la dilución de la muestra, es:
𝐷𝐵𝑂 𝑟𝑒𝑎𝑙 = (200 − 15) ∗ 10 = 1850 𝑚𝑔/𝐿
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DIAGRAMA PARA ESTIMAR DBO5 POR EL METODO MANOMETRICO
Estimar dos valores
probables por
muestra
SI
El valor esperado
supera las
escalas de la
tabla 2
Diluir la muestra y
escoger una escala
según la dilución
NO
Poner dentro de las botellas
un volumen de muestras de
acuerdo a la escala elegida
(tabla 2) medido con una
probeta graduada.
Resetear cada sensor de
D.B.O y escoger la escala
más adecuada, iniciar ciclo de
medición
Introducir un imán de
agitación en cada botella.
Colocar los sensores de
D.B.O. en cada botella
girando y presionando
Incubar por cinco días
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Llenar el depósito de álcalis
de cada botella con una
cantidad de absorbente de
dióxido de carbono
Esperar de 20 a 30 min
Colocar las botellas en su
posición dentro del equipo de
agitación.
Introducir el equipo de
agitación dentro de un
refrigerador termostático a
20°C
NITROGENO TOTAL KJENDAHL
MÉTODO SEMI MICRO KJENDAHL
1. FUNDAMENTO.
Se utiliza ácido como oxidante y oxido de mercurio como catalizador, para convertir,
mediante digestión, el nitrógeno orgánico en bisulfato de amonio. Para la digestión
se utiliza una mezcla de ácido sulfúrico y sulfato de potasio. El sulfato de potasio se
añade para elevar el punto de ebullición. Una vez se complete la digestión, la forma
más común de determinar el nitrógeno es por destilación. Para destilar el amoniaco
es necesario neutralizar el exceso de ácido utilizando una solución de hidróxido de
sodio. El amoniaco es liberado como un gas junto con el vapor producido al ebullir la
muestra. El amoniaco es absorbido en ácido bórico. La cantidad de nitrógeno
amoniacal se mide a continuación por titilación con ácido sulfúrico. [1
El método consta de tres etapas: Digestión – Destilación y Titulación [2]
En la DIGESTIÓN se produce la descomposición del nitrógeno que contienen las
muestras orgánicas utilizando una solución de ácido concentrado. Esto se obtiene
haciendo hervir la muestra en una concentración de ácido sulfúrico. El resultado es
una solución de sulfato de amonio.
En la etapa de DESTILACIÓN se libera amoniaco, el cual es retenido en una solución
con una cantidad conocida de ácido bórico. Inicialmente se realiza una destilación
con vapor por el método de arrastre de vapor de agua, mediante la cual acelera la
obtención del destilado.
Al final, se utiliza la TITULACIÓN para valorar finalmente la cantidad de amonio
presente en la muestra destilada.
2. INTERFERENCIAS.

Nitratos: en el proceso de digestión, los nitratos con una concentración mayor a
10mg/L pueden oxidar una parte de amonio del nitrógeno orgánico digerido, teniendo
como producto N2O y resultando una interferencia negativa. Cuando la materia
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

orgánica presente está en un bajo estado de oxidación, el nitrato puede ser reducido
a amonio y dar una interferencia positiva.
Sales inorgánicas y sólidos: Si la temperatura sube a más de 400°C por un alto
contenido de sales o sólidos inorgánicos, puede ocurrir una pérdida de nitrógeno por
pirolisis. Para evitar esto adicione más ácido sulfúrico a una relación de 1 ml H2SO4/
g de sal. Sin embargo demasiado ácido puede bajar la temperatura de digestión por
debajo de los 380°C y resultar en una digestión incompleta y baja recuperación.
Materia Orgánica:
Durante la digestión, el ácido sulfúrico oxida la materia orgánica a CO2 y H2O si hay
gran cantidad de materia orgánica se debe incrementar la cantidad de ácido en
relación de 10 ml H2SO4/3 g de DQO. Adicionalmente agregue, más solución básica
antes de la destilación.
3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS.
3.1 MATERIALES




Bureta ( si no hay titulador automático)
Balón aforado de 50 ml
Perla de ebullición
Pipeta
3.2 EQUIPOS




Aparato de Digestión velp csientifica DK6 con su respectivo scrubber
Aparato de Destilación UDK 132
pHmetro
Titulador automático
3.3 REACTIVOS
 Ácido Bórico
 NaOH
 H2SO4 concentrado
 K2SO4
 HgO
 Cloruro de amonio
4 PREPARACIÓN.
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
Ácido Bórico al 4%: Añadir 4 g de ácido bórico a agua destilada y aforar a 100
ml.

NaOH al 35%: Añadir 35g de NaOH a agua destilada y aforar a 100 ml.

Solución de H2SO4 0,01 molar= añadir 0,53 ml de H2SO4 en agua destilada y
aforar a un litro.

Solución estándar de amonio 1000 mg/L-N: en 800mL de agua disuelva
3.819g de cloruro de amonio, el cual ha sido secado durante dos horas a 110
oC; diluya y mezcle muy bien.
4.1 PROCEDIMIENTO.

Agregar 50 ml de la muestra en tubo de digestión.

Añadir 7g de K2SO4, 350 mg de HgO y 10ml de H2SO4 concentrado.

Agregar una perla de ebullición para evitar la explosión violenta.

Poner a digestión con el primer set a 60 min a 200°C y el segundo a 120 min
a 370 °C de la siguiente manera:
4
1
2

3
El montaje para realizar la digestión consta de un tanque de agua (1) que
permita el recirculado de esta por medio de una bomba, una aspiradora de
gases (2), el scrubber (3) y el digestor DK 6 (4). La aspiradora debe contener
agua hasta donde indica, el scrubber consta de 2 frascos, se adiciona agua al
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frasco de la izquiera, el otro se deja desocupado. Es necesario revisar que
todas las mangueras estén conectadas y permita un ciclo entre los equipos.

Dejar enfriar hasta 50° o 60°

Destilar programando el destilador por arrastre de vapor UDK132 de la
siguiente manera:
 Prender el destilador y esperar a que se caliente.
 Verificar las conexiones de agua potable, agua destilada (manguera
negra) y NaOH (manguera blanca).
 Verificar las mangueras de salida, de agua potable ubicándola en el
desagüe y de residuos que debe dirigirlos a una caneca plástica
destinada para este propósito.
 Oprimir la tecla esc, luego oprimir la tecla down hasta llegar a programa.
 Oprimir la tecla enter, aparecerá programa 1, oprimir enter de nuevo,
oprimir la tecla down programar con la tecla up hasta llegar a 50 ml de
H2O luego oprimir enter, de igual manera se programa.

Medir el pH del ácido Bórico al 4% y registrar el resultado.
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
Recoger el destilado en 25 ml de Ácido bórico al 4%.

Titular hasta llegar al pH del ácido Bórico con H2SO4 0,01 molar.
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5 CÁLCULO.
Se calcula el N total mediante la siguiente ecuación:
𝑚𝑙 (𝐴 − 𝐵) ∗ 𝑁 ∗ 14,000 ∗ 𝐹
𝑚𝑔 𝑁⁄
=
𝐿
𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
A= Volumen de H2SO4 gastado en la titulación de la muestra, ml
B= Volumen de H2SO4 gastado en la titulación de la muestra, ml
N= normalidad
F= Factor de dilución
6 REFERENCIAS
[1] M. Andreo, «Demanda Biológica de Oxígeno (D.B.O),» 2002.
[2] H. R. Quiroz Ruiz, «Microbiología acuática,» Lambayeque, 2012.
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Diagrama de flujo – Procedimiento NTK
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FÓSFORO TOTAL
MÉTODO DE DIGESTIÓN POR PERSULFATO –
ÁCIDO FOSFO VANADO MOLIBDICO.
1. FUNDAMENTO
El fósforo es de gran importancia en los estudios de agua ya que influye sobre los
procesos de productividad acuática, reduce la eficiencia de los procesos de
coagulación, es difícil de remover mediante tratamientos convencionales para
obtener bajas concentraciones, forma gran variedad de compuestos y posee la
característica de cambiar de una forma a otra en determinadas condiciones [1]
El fosforo se encuentra en las aguas naturales y en las aguas servidas casi
exclusivamente en la forma de fosfatos. Los fosfatos se clasifican a su vez en:
ortofosfatos, fosfatos condensados (piro-, meta- y otros polifosfatos) y fosfatos
orgánicamente ligados [1]
La determinación de fósforo total incluye dos pasos principales, el primero consiste
en la conversión a ortofosfato disuelto de todas las diferentes formas de fósforo
presentes, incluido el fósforo reactivo, el fósforo ácido hidrolizable y el fósforo
orgánico. El segundo paso consiste en la detección colorimetrica del ortofosfato en
solución por algún método cuantitativo [2]
A través de una digestión con persulfato se convierten todas las formas de fosforo a
ortofosfatos estos en condiciones acidas reaccionan con el molibdato de amonio para
formar heteropoliácido. En presencia de vanadio se forma un complejo amarillo de
ácido fosfovanado molibdico, cuyo color es proporcional a la cantidad de fósforo
presente.; la intensidad del color desarrollo es proporcional a la concentración de
fósforo en la muestra y es medida por método colorimétrico a una longitud de onda
entre 400 y 470 nm [2]
2. INTERFERENCIAS
 El sílice y el arsénico causan interferencias positivas, solo si la muestra se
calienta.
 Las interferencias negativas son causadas por arsenatos, flururos, torio
bismuto, sulfuro, tiosulfato, tiocianto o exceso de molibdato.
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


El color azul es causado por el ión ferroso pero este no afecta los resultados
si el Fe (II) se encuentra en concentraciones menores de100 mg/L.
La interferencia por sulfuros puede removerse mediante oxidación con agua
de bromo. Los iones que no interfieren en concentraciones superiores a 1000
mg/L. son Al, Fe (III), Mg, Ca,Ba, Sr. Li, K, Na, NH4+,Cd. Mn, Hg (II), Hg (I),
Sn( II ) , Cu, Ni, Ag, U, Zr, AsO3-, Br -, CO3-2,ClO4,CN-, IO3-,SiO4,
NO3,NO2,SO4-2, pirofosfatos, molibdato, tetraborato, selenato, benzoato y
salicilato.
Si el HNO3 se usa en la determinación, el ion cloruro aportado por el ácido
clorhídrico interferirá a concentraciones de 75mg/L.
3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS.
3.1 Equipos y materiales






Espectrofotómetro, pasa uso entre 400 y 490nm, celdas de 1 cm.
Balanza
Plancha de calentamiento
Balón aforado
Pipeta
Reloj de vidrio
3.2 Reactivos para la Digestión






Ácido sulfúrico concentrado
Ácido clorhídrico concentrado
Fenolftaleína
Persulfato de amonio (NH4)2S2O8 sólido
Solución ácida: Tome 300 ml de ácido sulfúrico concentrado y adiciónelo en
aproximadamente 600 ml de agua destilada a temperatura ambiente y lleve a
un litro
Hidróxido de sodio NaOH 6N. 240 g de NaOH por cada litro de solución.
3.3 Reactivos para el desarrollo del color Colorimetría

Reactivo vanadio- molibdato
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
Solución A. Disolver 25 g de molibdato de amonio (NH 4)6Mo7O24.4H2O,
en 300 mL de agua destilada

Solución B Disolver 1,25 g de metavanadato de amonio NH4VO3, por
calentamiento hasta ebullición en 300 ml de agua destilada. Enfriar y
agregar 330 ml de HCl concentrado en baño de agua como se observa
en la siguiente imagen.

Enfriar la solución B a temperatura ambiente, y agregar la solución A,
mezclar y diluir a un litro.
4 PREPARACIÓN.
Todo el material utilizado en este método debe ser lavado con una solución HCL 1+1
(Adicionar la misma cantidad de HCL que de agua destilada). Incluyendo el material
para filtración, sistema de vacío y celdas espectrofotométricas. No se deben utilizar
materiales plásticos y afines.
Antes de comenzar el ensayo, preparar los reactivos para la digestión y para el
desarrollo del color Colorimetría.
5 PROCEDIMIENTO.
Este método se compone de dos partes, la primera es la digestión con persulfato y
la segunda es la determinación colorimétrica.
5.1 Digestión con persulfato
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Tener en cuenta que siempre se debe realizar con todo el proceso un patrón de
2 mg/L para la celda de 1 cm.
-
Tomar 100 ml de la muestra en un balón aforado.
-
Luego adicionarle 1 ml de la solucion ácida y 0,4 g de persulfato de amonio.
-
Colocar los recipientes en la plancha de calentamiento precalentada a una
temperatura de 280°C hasta que la muestra llegue a un volumen final de 10 ml.
-
Dejar enfriar la muestra, filtrar en el papel cualitativo y agregar 20 ml de agua
destilada.
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-
Agregar una gota de solución indicadora de fenolftaleína y luego neutralizar con
NaOH &N, hasta un rosado suave.
-
Se redisuelve en condiciones ácidas neutralizando con 1 mL de HCl 1 + 1 (Se
verifica la neutralización con solución indicadora de fenoftaleina hasta que
desaparezca el color rosado).
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5.2 Determinación colorimétrica
-
La muestra se lleva a 100 ml. Se toman 35 ml de este aforado en un balón
volumétrico de 50 ml.
-
Se adicionan 10 ml del reactivo vanadio-molibdato y se afora a 50 ml con agua
destilada.
-
Después de 10 minutos, realizar un barrido espectrofotométrico de absorbancia
con la celda de 1 cm a 400, 420 y 470 nm.
6 CURVA DE CALIBRACIÓN.
Se disuelven 219,5 mg de KH2PO4 anhidro en agua destilada y se diluye a 1 litro; 1
ml es equivalente a 50 microgramos de P. = 50 ppm-P para curva.
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Se preparan soluciones del patrón como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Preparación para la curva de calibración.
Mg/L – PO4 – P /
volumen final de
100 ml
0,5
Ml de solución
madre
(50 ppm)
1
1
2
2
4
3
6
4
8
5
10
7,5
15
10
20
15
30
18
36
Se lleva a cabo el procedimiento mencionado.
8 CÁLCULO
Se realizan los cálculos de fosforo teniendo en cuenta las curvas de calibración y la
siguiente formula:
(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝑏)
𝑚𝑔
⁄𝐿 − 𝑃 =
∗𝐹
𝑦
b= intercepto curva de calibración
y= pendiente de la curva de calibración
F= Factor de dilución
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Se toma el intercepto de curva de calibración (b) y la pendiente de curva de
calibración (y) de cada una de las curvas leídas a las correspondientes longitudes
de onda (400, 420 y 470).
Se obtendrán 3 concentraciones de fosforo diferentes, se debe tomar la que se
acerque más al punto medio de su rango de operatividad.
Rango de P (mg/L) Longitud de onda (nm)
1,0-5.0
400
2,0-10
420
4,0-18
470
Ejemplo:
Obteniendo los siguientes resultados
Longitud de Onda (nm) Concentración (mg P/L)
400
1,35
420
0,96
470
1,04
El resultado que más se acerca al punto medio del rango de operatividad de la
respectiva longitud de onda es 1,35 mg P/L.
7 REFERENCIAS
[1] M. Andreo, «Demanda Biológica de Oxígeno (D.B.O),» 2002.
[2] H. R. Quiroz Ruiz, «Microbiología acuática,» Lambayeque, 2012.
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DIAGRAMA DE FLUJO – PATRÓN FOSFORO
Disolver 219,5 mg de
𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 anhidro en agua
destilada
1ml= 50 ppm de P
DIAGRAMA DE FLUJO – REACTIVO VANADIO-MOLIBDATO
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DIAGRAMA- DETECCION DE FOSFORO
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DEMANDA QUIMICA DE OXIGENO
MÉTODO COLORIMÉTRICO DE DICROMATO A REFLUJO CERRADO.
1. FUNDAMENTO.
La Demanda Química de Oxígeno (DQO) se define como la cantidad de un oxidante
específico que reacciona con una muestra bajo condiciones controladas. La cantidad
de oxidante consumida se expresa en términos de su equivalencia en oxígeno:
mgO2/L. El método colorimétrico se basa en la oxidación de la materia orgánica por
medio de un oxidante fuerte como el dicromato, el cromo Cr +6 de color naranja
presente en la solución de análisis se reduce a Cr +3 de color verde, la reducción del
cromo depende directamente de su reacción con la materia orgánica total existente
en la muestra Fuente especificada no válida..
2. INTERFERENCIAS.




3.
Los compuestos orgánicos volátiles se oxidan totalmente en el sistema cerrado,
porque hay un mayor contacto con el oxidante.
Es necesario verificar que los viales se encuentren sin roturas, ni ralladuras.
Especies inorgánicas reducidas como el hierro, sulfuro, manganeso, etc. se
oxidan cuantitativamente bajo las condiciones del ensayo.
La materia suspendida insoluble o los compuestos coloreados generan
interferencias por la absorción de luz visible.
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS.






Bloque de calentamiento –Termoreactor para DQO a 150  2°C
Fotómetro HI 83099.
Viales de DQO Hanna 93754B – 25.
Rejilla porta viales.
Pipeta.
Adaptador DQO para el fotómetro HI 83099.
4. PREPARACIÓN.
Los viales a utilizar son debidamente etiquetados y el fotómetro ajustado para método
de Demanda química de oxigeno RM. Precalentar el fotómetro.
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5. PROCEDIMIENTO.
Para este método se requiere una buena homogenización de muestras conteniendo
sólidos suspendidos para obtener resultados reproducibles. Por lo tanto es necesario
filtrar las muestras.

Seleccionar los viales que serán utilizados en el análisis.

Agregar 2ml de la muestra a evaluar en el vial con una inclinación de 45°. Agregar
2 ml de agua destilada en un vial para blanco.

Girar de arriba a abajo los viales para homogenizar la muestra. Tener mucho
cuidado porque los viales se calientan.

Colocar los viales a digestión en el termoreactor, 120 minutos a 150°C.

Cuando termine la digestión, esperar aproximadamente 20 minutos a que la temperatura
llegue a 120°C, cuando esto suceda sacar los viales con mucho cuidado y girarlos de
arriba abajo dos veces.
Colocar los viales en la rejilla hasta que se alcancen la temperatura ambiente.

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
Colocar el adaptador para viales de DBO en el fotómetro.

Comenzar la lectura de los viales en el fotómetro, colocando como cero el vial del blanco.
6. VERIFICACIÓN
Patrón de ftalato hidrógeno potásico: pese 0,425g de biftalato de potasio previamente seco
a 110°C y diluya a 500 mL con agua destilada. Esta solución es estable cuando se refrigera,
pero no indefinidamente. Se recomienda preparar semanalmente.
REFERENCIAS
[1] M. Andreo, «Demanda Biológica de Oxígeno (D.B.O),» 2002.
[2] H. R. Quiroz Ruiz, «Microbiología acuática,» Lambayeque, 2012.
[3] Universidad de los Andes. Laboratorio Ambiental, «Nitrogeno total kjeldahl,» Bogotá, 2010.
[4] Grupo selecta, «Método kjeldahl».
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DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO
Agregar 2ml de la muestra en los
viales y 2 ml de agua destilada
para el blanco
Girar de arriba a abajo los viales.
Tener mucho cuidado porque se
calientan
Colocar los viales a digestión, 120
minutos a 150°C.
Cuando termine la digestión, esperar
aproximadamente 20 minutos a que baje
la temperatura a 120°C, cuando esto
suceda sacar los viales con mucho cuidado
y girarlos de arriba abajo dos veces.
Colocar los viales en la rejilla hasta
que se alcancen la temperatura
ambiente.
Colocar el adaptador para viales de
DBO en el fotómetro.
Ajustar el Fotómetro para la
lectura de DQO.
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en el fotómetro, colocando como
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cero el vial del blanco.