ultrasonido

Introducción
1.
INTRODUCCIÓN
1
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Introducción
1.1. Los compuestos fenólicos y su actividad funcional antioxidante.
Los compuestos fenólicos son un amplio grupo de sustancias con diferentes
estructuras químicas y actividad, son constituyentes importantes de las plantas y que a
su vez les otorga múltiples efectos benéficos. Están presentes generalmente en forma de
glucósidos en los extractos de las frutas, hierbas, vegetales, cereales y otros materiales;
lo que ha permitido su utilización por la industria alimentaria no solo por las
características organolépticas que le confieren a los alimentos, sino porque retardan la
oxidación de los lípidos y mejoran la calidad nutricional de los alimentos. (Muñoz A,
Ramos F. 2007).
Los compuestos antioxidantes juegan un papel muy importante en los alimentos.
La oxidación lipídica es una de las principales causas de deterioro químico, lo que
resulta en la rancidez y/o el deterioro de la calidad nutricional, color, sabor y seguridad
de los alimentos, los iniciadores para esta oxidación incluyen rayos UV, luz, calor,
enzimas, variedades de radicales libres, microorganismos, metales y metalopreoteínas
(Albu S. y col., 2004).
Además de su papel como estabilizadores de alimentos, pueden proteger las
células contra los efectos de los radicales libres y por tanto, tienen un efecto destacado
en la prevención de problemas cardíacos, cáncer y otras enfermedades (Suhaj, 2006).
Recientes estudios han indicado el mecanismo fundamental del potencial preventivo de
algunos compuestos fenólicos, los cuales juegan un rol importante por su actividad
antioxidante (Kähkönen y col., 1999) , anti-inflamatoria, aumento del potencial inmune,
efecto antihormonas, modificación de enzimas metabolizadoras de drogas, influencia
sobre el ciclo celular y diferenciación celular, inducción de apoptosis, supresión y
proliferación, angiogénesis, los cuales cumplen roles en la iniciación y modificación del
estado secundario del desarrollo neoplásico (Tsuda y col., 2004).
La relación estructura-actividad influye decididamente sobre la actividad
biológica de los compuestos fenólicos (flavonoles, chalconas, flavonas, flavanonas,
isoflavonas, taninos, estilbenos, curcuminoides, ácidos fenólicos, coumarinas, lignanos
y quinonas). El número y la posición de grupos hidroxi, la glicosilación y otras
substituciones determinan la actividad de secuestro de radicales por los compuestos
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fenólicos. Las diferencias que existen entre la actividad de secuestro de radicales están
atribuidas a las diferencias estructurales de hidroxilación, glicosilación y methoxilación.
Los extractos de hierbas, especias, y otros materiales vegetales ricos en
compuestos fenólicos son de creciente interés en la industria alimentaria porque
retardan la degradación oxidativa de los lípidos y por consiguiente, mejoran la calidad y
el valor nutricional de los alimentos. Las hierbas se utilizan en muchos dominios,
incluyendo la medicina, la nutrición, aromatizantes, bebidas, teñido, repelentes,
perfumes, cosméticos (Djeridane A, y col., 2006).
1.2. Plantas Labiadas
Las Lamiáceas (Lamiaceae), también llamadas labiadas, son una familia que
comprende unos 210 géneros y alrededor de 3.500 especies, perteneciente al
orden Lamiales. Tradicionalmente, esta familia era conocida por el nombre de Labiadas,
pero siguiendo las recomendaciones del Código de Nomenclatura Botánica, su nombre
ha sido substituido por Lamiaceae en alusión al género tipo de la familia: Lamium.
Incluye varias especies muy utilizadas como condimento en alimentación, como
la menta, albahaca, orégano, mejorana, tomillo y romero.
Son hierbas perennes, algunos subarbustos y raramente árboles o trepadoras, que
contienen aceites esenciales en todas las partes de la planta. El nombre original de esta
familia era labiadas debido a la peculiar forma de la flor (generalmente de color
violáceo), 5 pétalos fusionados en forma de boca con un labio superior, generalmente
bilobulado y más corto, y uno inferior, trilobulado, los 5 sépalos también están unidos,
sus estambres (4) conforman un androceo didínamo (2 estambres más largos y 2 más
cortos). Las flores son bisexuales y surgen en ramilletes terminales de 5 ó 6 (a veces
más o menos) florecillas cada uno. Los tallos son generalmente cuadrangulares
con hojas aovadas, opuestas y decusadas.
En el presente estudio se utilizaron tres tipos de plantas labiadas: Romero
(Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum basilicum)
y mejorana (Origanum
majorana).
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1.2.1. Romero (Rosmarinus officinalis L.)
Romero (Rosmarinus officinalis L.) es una hierba típica de la región y cocina
Mediterránea, que se ha estudiado como un producto natural con diversas actividades
biológicas
tales
como:
anti-inflamatoria,
anti-tumoral,
quimiopreventiva,
hepatoprotectora, contra la diabetes, antioxidante, anti-proliferativa, antiviral,
antimicrobiana, anticonceptiva y antidepresiva, entre otros (Vicente G. y col., 2010).
Hojas de romero y extractos de las hojas se utilizan cada vez más como alimento
y gracias a
su contenido en sustancias antioxidantes se los utiliza para remplazar
antioxidantes sintéticos como
butilado Hidroxianisol (BHA) y butilhidroxitolueno
(BHT) (Etter, 2005).
La composición química del aceite esencial de romero varía ampliamente
dependiendo de las condiciones agrícolas de cultivo, así como con las técnicas de
extracción utilizadas.
Las sustancias principales asociadas con la actividad antioxidante son los
diterpenos fenólicos tales como: carnosol, rosmanol, ácido carnósico, metil carnosato, y
los ácidos fenólicos como los ácidos rosmarínico y cafeico (Ibáñez y col., 2003;
Terpenic y col., 2009; Napoli y col., 2010; Zaouali y col., 2010). En particular, el
ácido carnósico y carnosol han sido reconocidos como los compuestos antioxidantes
más abundantes presentes en los extractos de romero.
1.2.2. Albahaca (Ocimum basilicum)
La albahaca Ocimum basilicum es una hierba que se utiliza muy comúnmente
como condimento en la comida; también es muy valiosa debido a sus propiedades
farmacéuticas, por ejemplo, el aceite volátil producido de sus hojas se utiliza como
antioxidante (Harsh y col., 2002). Muchos estudios científicos demostraron que el
extracto de albahaca es un fuerte eliminador de radicales y puede considerarse como
una buena fuente de antioxidantes naturales (Javanmardi y col., 2003; Lee y col., 2005;
Abas y col., 2006).
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Estudios realizados por Javanmardi y col., (2003) sugirieren que el 71% de la
capacidad antioxidante de la albahaca no se origina únicamente por los compuestos
fenólicos sino que también puede provenir de la presencia de metabolitos secundarios,
tales como aceites volátiles, carotenoides, vitaminas y otras sustancias. Jayasinghe y
col., (2003) mostraron la existencia de un efecto sinérgico antioxidante en el extracto
de albahaca entre el ácido rosmarínico y α-tocoferol.
En el trabajo de Yamasaki y col., (1998) se reporta que extractos acuosos de
albahaca dulce tienen un efecto anti-VIH.
Además estudios realizados por Pérez-
Gutiérrez y col., (1992) sugieren que los extractos acuosos de albahaca poseen una
acción sobre el sistema cardiovascular y los extractos alcohólicos una actividad similar
a la de la atropina.
La albahaca (Ocimum basilicum) contiene altos niveles de ácidos fenólicos que
contribuyen a su capacidad antioxidante (Javanmardi, Khalighi y col., y Vivanco, 2002,
Lee & Scagel, 2009, 2010). Las concentraciones del ácido rosmarínico, en particular se
han asociado con las cualidades medicinales de la hierba (Petersen y Simmonds, 2003).
El ácido rosmarínico se observa en la literatura como compuesto fenólico prevalente en
la albahaca (Javanmardi y col., 2002, Lee & Scagel, 2009), pero otros derivados del
ácido cafeico, tal como ácido chicorésico (Lee, 2010; Lee y Scagel, 2009, 2010),
también se encuentran en altas concentraciones.
La albahaca es conocida por su gran diversidad genética que tienen entre 65 y
150 especies reportadas, que son basadas en variaciones de características morfológicas
tales como: hábitat de crecimiento, color de la hoja, el tamaño, la forma y la
composición aromática (Kintzios y Makri, 2007). Varios estudios realizados por (Labra
y col., (2004); Javanmardi y col., (2002) reportan que existen variaciones en la
composición del aceite esencial, compuestos fenólicos y actividad antioxidante entre las
distintas variedades de albahaca debido a su diferentes rasgos genéticos.
Estudios realizados por Kwee y Niemeyer (2011) demuestran la influencia de los
cultivares en la composición fenólica y propiedades antioxidante de 15 cultivares
comunes de albahaca (ver Tabla 1).
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Tabla 1. Concentraciones promedio de ácidos fenólicos (mg / g peso seco) en las
variedades de albahaca estudiadas.
Fuente: Kwee E.M., Niemeyer E.D. Food Chemistry 128 (2011) 1044–1050
1.2.3. Mejorana (Origanum majorana L.)
La mejorana aromática comprende varias hierbas que pertenecen a distintas
especies, el más conocido es el Origanum majorana L. (syn. Majorana hortensis
Moench, M. Vulgaris Miller),
nativo del sur de Chipre y Turquía. También se
cultiva extensivamente como mejorana dulce, que es una hierba anual, en varias zonas
de Europa, Norte de África, América y Asia. Las hojas secas de mejorana dulce son
ampliamente utilizadas en
la industria alimentaria como agentes aromatizantes
de aderezos, sopas, en la formulación de vermut y amargos, entre otros (Kokkini S.
1993).
Desde la antigüedad
ha sido conocida la actividad biológica de su aceite
esencial en particular sus propiedades antibacterianas, antimicóticas y antioxidantes, por
lo que la investigación de la composición y sabor de esta materia prima es de gran
interés (Baratta, M y col., 1998). Su aceite esencial y extractos alcohólicos se aplican
en productos farmacéuticos, perfumes y los cosméticos (Bauer, Garbe y Surburg, 1990;
Price 1995)
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Algunos estudios han demostrado que la composición y aroma puede variar con
el origen de las plantas y las condiciones de cultivo (Vera R. y col., 1995). Por ejemplo,
algunos aceites esenciales de mejorana se han obtenido con altos contenidos de
alcoholes monoterpénicos mientras que en otros los
fenoles son los principales
constituyentes. En algunos aceites, el componente principal, es el 4-terpineol solo o
junto con otros alcoholes monoterpénicos tales como el cis y trans-sabineno hidrato y
α-terpineol; timol y carvacol se detrminaron en pequeñas cantidades (Vági E. y col.,
2004).
El aceite esencial posee propiedades antimicrobianas contra enfermedades
transmitidas por bacterias y hongos micotoxigénicos (Baratta y col., 1998; Daferea y
col., 2000; Decanos y Svoboda, 1990; Ezzeddine y col., 2001).
Según los estudios realizados por Vági y col., (2004) tanto en la extracción
alcohólica y supercrítica el componente principal del aceite esencial de mejorana es el
4-terpinenol, además de otros compuestos minoritarios como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Composición del aceite esencial de mejorana, obtenidos por extracción
alcohólica y supercrítica (% área pico analizó por GC y métodos de GC-MS)
Fuente: E. Vági y col., Food Research International 38 (2005) 51–57.
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Los extractos etanólicos y supercríticos mostraron una composición similar,
aunque en el extracto supercrítico el contenido de 4-terpineol es casi dos veces superior
al del extracto etanólico.
1.3. Procedimientos tradicionales e innovadores para la extracción de
compuestos fenólicos a partir de plantas labiadas.
Actualmente una de líneas más importantes de la investigación en la tecnología
de los alimentos es el aislamiento de compuestos naturales con propiedades funcionales
a partir de fuentes naturales. Aislamiento de compuestos puros o incluso grupos de
compuestos con propiedades terapéuticas, tales como antioxidantes, normalmente se
hace por HPLC a escala preparativa (Esaki H., y col., 1998).
Las tecnologías tradicionales para la producción de extractos de plantas incluye
la extracción sólido-líquido (solid-liquid extraction, SLE), utilizando diferentes tipos de
disolventes: variando el disolvente de la extracción de acuerdo a los compuestos que se
quiera obtener. Por ejemplo, los carotenoides son fácilmente extraídos por medio de
disolventes no polares (hexano, pentano, éter de petróleo) o disolventes moderadamente
polares (tetrahidrofurano, diclorometano) incluyendo sus mezclas con disolventes
polares tales como alcoholes (Rodríguez-Bernaldo de Quirós y Costa, 2006). Por otro
lado, los compuestos fenólicos se extraen generalmente utilizando agua (Bergman y
col., 2003) y los lípidos usando etanol o metanol (Maeda y col., 2010).
La SLE o lixiviación es un proceso por el cual se extrae uno o varios solutos de
un sólido, mediante la utilización de un disolvente líquido. Ambas fases entran en
contacto íntimo y el soluto o los solutos pueden difundirse desde el sólido a la fase
líquida, lo que produce una separación de los componentes originales del sólido; es una
técnica utilizada tradicionalmente para la extracción de determinados compuestos en
matrices vegetales, con diferentes tipos de disolventes según la clase de analito que
se quiera obtener; por ejemplo en
la industria alimenticia las aplicaciones más
frecuentes son: extracción de aceites y grasas animales y vegetales, lavado de
precipitados, obtención de extractos de materias animales o vegetales, obtención de
azúcar, fabricación de té y café instantáneo, entre otras.
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Esta técnica tradicional de extracción tiene ciertos problemas como son lentitud,
laboriosidad, empleo de grandes cantidades de disolventes tóxicos, poca selectividad,
entre otras; por lo que la creciente demanda de mayor productividad en los laboratorios,
análisis más rápidos y métodos más automatizados ha llevado al estudio y creación de
nuevas técnicas de extracción que permitan mayor rapidez, eficacia, fiabilidad,
sencillas, sin empleo de disolventes tóxicos, etc.
El desarrollo de nuevas técnicas de separación para las industrias química y
alimentaria ha recibido mucha atención últimamente debido a las nuevas restricciones
del Reglamento para el medio ambiente, salud pública y la necesidad de minimizar los
costos de energía (Coelho L.A.F. y col., 1996). El uso de disolventes orgánicos para
obtener extractos de plantas, además de las dificultades asociadas con la restricción de
los mismos para ser utilizados por la industria alimentaria tiene la desventaja de la
transformación oxidativa durante la separación del disolvente (S.L. Sebastián y col.,
1998).
Técnicas de extracción alternativas con mejor selectividad
y eficacia son
altamente deseadas, con el fin de eliminar o disminuir el uso de disolventes, evitar la
degradación o la pérdida de sustancias sensibles, reducir la energía y la mano de obra
de los procesos convencionales.
La extracción acelerada con disolventes (Accelerated Solvent Extraction, ASE),
es una nueva técnica de extracción que usa los disolventes habituales a presiones y
temperaturas elevadas, lo que permite extracciones rápidas y efectivas de muestras
sólidas; las altas temperaturas producen efectos interesantes como mejor solubilidad de
los analitos en líquidos y aumento de las cinéticas de desorción de los compuestos de la
matriz.
Está basada en una técnica más antigua denominada "soxhlytic extraction" que
reduce el consumo de disolvente y el tiempo de preparación de muestra. El disolvente es
bombeado hacia un recipiente de extracción que contiene la muestra a extraer. La
muestra es calentada y presurizada. El disolvente presurizado se mantiene en forma
líquida a una temperatura por encima de su punto de ebullición y así se acelera la
cinética de desorción del analito de la matriz de la muestra; tiene varios beneficios como
son: ahorro de tiempo: 10-15 minutos es el tiempo típico en realizar una extracción,
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reducción de coste de disolvente: el equipo utiliza alrededor de 15 ml de disolvente por
cada gramo de muestra, reducción de disolventes de desechos; principalmente.
La extracción asistida con ultrasonidos (Ultrasound Assisted Extraction, UAE)
se considera
una prometedora tecnología para la
industria de procesamiento de
alimentos (The Sonochemistry Centre, 2006). Son señales de alta intensidad que se
utilizan para modificar un proceso o un producto (Mulet et al., 1999). Con una
frecuencia más baja y mayor potencia producen cambios físicos y químicos en el medio
a través de la generación y subsiguiente colapso de burbujas de cavitación, las cuales
aparecen, crecen y colapsan dentro del líquido. Esto ocurre asimétricamente cerca de
las interfases y golpes sobre la superficie sólida. Se requiere de un medio líquido, un
generador de energía y un transductor, el cual convierte energía eléctrica, magnética o
cinética en energía acústica (Mulet et al., 2003).
La ventaja de utilizar ultrasonido en la extracción de plantas ya se ha aplicado a
un sin número de compuestos de interés, tanto en la farmacología y la industria
alimentaria (Vinatoru y col., 1999 ). La mejora observada en la extracción de
compuestos orgánicos por ultrasonido se atribuye a una intensificación de la
transferencia de masa, debido al fenómeno de cavitación producido en el disolvente por
el paso de una onda ultrasónica o sonora.
Las ondas sonoras son ondas de presión que se transmiten a través de un medio
material, en ausencia de este es imposible su transmisión. Precisamente por ello las
ondas sonoras provocan la contracción y posterior expansión del medio en el cual se
propagan. Cuando este medio es un disolvente pueden formarse burbujas o cavidades en
el líquido que terminen por explotar en un proceso que se conoce como cavitación.
Estas burbujas explotan violentamente produciendo un incremento local de presión y
temperatura muy notable que no es perceptible en el sistema como un conjunto debido
al pequeño tamaño de las burbujas
El ultrasonido también ejerce un efecto mecánico, permitiendo una mayor
penetración de disolvente en el cuerpo de la planta. Esto, junto con una mayor
transferencia de masa y la ruptura significativa de las células, a través del colapso de
cavitación de la burbuja, tiene el efecto de liberar el contenido de las células en el
volumen del medio (Albu y col., 2004 ).
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Además puede producir algunos efectos químicos debido a la producción de
radicales libres dentro de las burbujas de cavitación. La sonicación de agua resulta en la
formación de radicales hidroxilo altamente reactivos que pueden combinarse para
formar peróxido de hidrógeno que puede o no ser beneficioso para el proceso de
extracción en sí (Paniwnyk y col., 2001). No obstante, otros disolventes como etanol,
acetato de etilo o butanona producen menos radicales libres que el agua bajo
condiciones similares de sonicación, y ya se ha observado que la extracción de ácido
carnósico se mejora significativamente por sonicación (Albu y col., 2004).
La extracción con fluidos supercríticos (Supercritical Fluid Extraction, SFE), es
una técnica que ha tenido un gran desarrollo en los últimos años en las industrias
química, farmacéutica y alimentaria debido a sus numerosas aplicaciones y ventajas. Es
una técnica de extracción benigna con el medio ambiente, eficiente para materiales
sólidos, elimina el problema del disolvente tóxico residual en los productos, permite el
uso temperaturas más bajas que conducen a una menor deterioro de los componentes
térmicamente lábiles, retiene las características organolépticas de las materias a partir de
especias, entre otras (Simandi, 1998).
La SFE es una operación unitaria que aprovecha el poder disolvente de fluidos a
temperaturas y presiones por encima de su punto crítico. Un fluido supercrítico es
cualquier fluido que a temperatura y presión superior a sus valores críticos tiene
propiedades intermedias entre un líquido y un gas; es decir poseen densidades similares
a la de los líquidos pero su viscosidad es mucho menor (entre 5 y 20 veces menor), lo
que hace que los coeficiente de difusión de los solutos sean mucho mayores que en un
disolvente líquido.
Es por ello que las extracciones llevadas a cabo con fluidos supercríticos son en
primer lugar tan completas como las llevadas a cabo con disolventes líquidos, ya que
ambos presentan similares características solvatantes y, en segundo lugar, mucho más
rápidas y eficientes, ya que su baja viscosidad favorece los fenómenos de transferencia
de materia y la penetrabilidad en los poros de la matriz de la muestra.
Entre las tecnologías de procesos innovadores, la extracción con fluidos
supercríticos
(SFE) es en efecto, la aplicación más ampliamente estudiada; en la
práctica la SFE se lleva a cabo generalmente utilizando dióxido de carbono (CO2) por
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varias razones prácticas: tiene moderadamente baja presión crítica (74 bar) y
temperatura (32°C), no es tóxico, no inflamable, disponible en alta pureza a un coste
relativamente bajo, es reconocido como GRAS (Generally Recognized as Safe), y se
elimina fácilmente a partir del extracto. El CO2 supercrítico tiene una polaridad similar
al líquido pentano y por lo tanto es adecuado para la extracción de compuestos lipófilos.
Por ejemplo, teniendo en cuenta las características lipofílicas de los aceites esenciales
de las plantas, por todas estas razones el CO2 es el más utilizado (Fornari T. y col.,
2012).
Uno de los inconvenientes que presenta el CO2 supercrítico es su baja polaridad
lo que dificulta la extracción de solutos polares; para la extracción de esta clase de
compuestos se utiliza un cosolvente que es un disolvente orgánico que se añade al
fluido supercrítico en pequeñas cantidades (hasta un 10% v/v). Algunos cosolventes
utilizados son: dimetil sulfóxido, hexanol, 2-propanol, 2-metoxietanol, agua, ácido
fórmico, etc.
El parámetro más relevante en el proceso de SFE de la planta matriz es la
presión de extracción, que puede ser usada para ajustar la selectividad del disolvente
supercrítico. La regla general es: cuanto mayor es la presión, mayor es el poder
disolvente y menor es la selectividad de la extracción (B. Simandi y col., 1998). Con
respecto a la temperatura de extracción, en el caso de compuestos termolábiles los
valores se debe establecer en el intervalo de 35-50°C, en las proximidades del punto
crítico, y tan bajo como sea posible para evitar degradación (Fornari T. y col., 2012).
Varios estudios reportan el uso
del etanol y otros alcoholes de bajo peso
molecular en la SFE de plantas y hierbas. En estos casos, los compuestos antioxidantes
eran el blanco de estudio. Leal y col., (2008); estudiaron la SFE de albahaca con agua
como codisolvente a diferentes concentraciones (1, 10 y 20%); los autores concluyeron
que el rendimiento de extracción aumenta a medida que aumenta el porcentaje de
cosolventes, con una reducción del contenido de compuestos terpénicos y un aumento
del contenido de los ácidos fenólicos en los extractos.
Menaker y col., (2004); y Hamburger y col., (2004); también observaron un
incremento en el rendimiento de extracción cuando se emplea etanol como codisolvente
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en la SFE de albahaca; se observó una disminución sustancial de los componentes de
aceites esenciales cuando aumenta la cantidad del codisolvente y la densidad del CO2,
por el contrario el extracto es enriquecido en compuestos de tipo flavonoide.
Fornari T. y col., (2012) estudiaron el efecto de etanol como codisolvente en la
extracción supercrítica de hojas de romero a diferentes presiones de extracción como se
muestra en la Tabla 3. La cantidad de aceite esencial extraído, el cual está representado
en la tabla por sus principales constituyentes no se incrementa significativamente
cuando el etanol se emplea como codisolvente, aunque si se observa un aumento en la
cantidad de ácido carnósico y el carnosol. El principal efecto de emplear etanol como
codisolvente en la SFE de romero se observa en la recuperación de sus compuestos
fenólicos antioxidantes, pero no en la extracción de sustancias del aceite esencial.
Tabla 3. Efecto del cosolvente en la extracción supercrítica de hojas de romero
Fuente: Fornari T. y col., Journal of Chromatography A, 1250 (2012) 34–48
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Objetivos
2. OBJETIVOS
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Objetivos
2.1. Objetivo General
•
Estudiar el efecto del uso de ultrasonidos como etapa previa a la Extracción con
Fluidos Supercríticos de hojas de romero (Rosmarinus officinalis), albahaca
(Ocimum basilicum)
y mejorana (Origanum majorana), para potenciar la
extracción de compuestos fenólicos y minimizar la cantidad de etanol empleada
en el proceso.
2.2. Objetivos Específicos
•
Comparar diferentes técnicas de extracción, en términos de rendimiento,
relación etanol/planta utilizada, tiempo de extracción y concentración de
compuestos fenólicos obtenidos en los extractos.
•
Analizar mediante cromatografía de líquidos (HPLC) los extractos obtenidos
para identificar y cuantificar los compuestos fenólicos.
•
Explorar la posibilidad de obtener extractos con altos contenidos de ácido
rosmarínico.
•
Determinar el contenido de polifenoles totales en los extractos obtenidos para
valorar la eficacia de las distintas técnicas de extracción.
.
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Materiales y Métodos
3. MATERIALES Y MÉTODOS
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Materiales y Métodos
3.1. Material vegetal
Las hojas secas de las plantas labiadas utilizadas en el presente estudio son
romero (Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum
majorana), proceden de Herboristería MURCIANA. La molienda de las hierbas se
realizó en un molino de cuchillas Grindomix modelo GM200; logrando un diámetro
final de partícula homogéneo.
3.2. Productos químicos y reactivos
El dióxido de carbono CO2 (N38) utilizado en el presente estudio tiene una
pureza de 99,5% en relación (w/w) suministrado a partir de Carburos Metálicos Madrid.
El disolvente polar utilizado es el etanol de grado espectroscópico.
Los patrones de A. Carnósico (≥ 96%) y carnosol (≥ 98%) fueron adquiridos
de Bioquímica de Alexis (Madrid, España). El ácido rosmarínico (97%) proviene de
Sigma-Aldrich (Madrid, España). El ácido fosfórico de grado HPLC de Panreac.
Acetonitrilo grado HPLC fue del Laboratorio de exploración (Gliwice, Polonia).
3.3. Métodos de Extracción
3.3.1. Extracción sólido-líquido (SLE).- Los experimentos se llevaron a cabo
utilizando 1 g de muestra con 100 ml de etanol a 50 º C, presión de 1 bar en un agitador
orbital aparato de Stuart S150 durante 24 h. Después de la extracción se separó el
disolvente por evaporación bajo vacío usando un rotavapor. Finalmente, el extracto se
secó en una corriente de N2 hasta peso constante. Todos los experimentos se realizaron
por duplicado. Las muestras secas obtenidas se almacenaron a 4°C en la oscuridad
hasta su análisis.
3.3.2. Extracción acelerada con disolventes (ASE).- Las extracciones se
realizaron con etanol como disolvente en un sistema de ASE 350 Dionex Corporation
(Sunnyvale, CA, EE.UU.) equipado con una unidad controladora de disolvente.
Cada celda de extracción (10 ml de capacidad) se llenó con 1 g de muestra
sólida y 1 g de arena de mar como un emparedado, y luego se ubicó en un horno.
Posteriormente
se llenó la celda con disolvente hasta alcanzar
una presión
correspondiente a 103 bar y se calentó hasta alcanzar la temperatura deseada. Se
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Materiales y Métodos
realizaron extracciones estáticas a 150 ºC durante 10 min. Después de la extracción las
celdas se lavaron con el disolvente y posteriormente el disolvente se purgó desde la
celda utilizando gas N2 hasta que la despresurización completa se llevó a cabo.
Los extractos fueron recuperados en viales de vidrio y el disolvente se eliminó
por evaporación bajo vacío y se secó en una corriente de N2. Todos los experimentos se
realizaron por duplicado. Las muestras secas se almacenaron a 4ºC en la oscuridad hasta
su análisis.
3.3.3. Extracción Asistida con Ultrasonidos (UAE).- Las extracciones se
realizaron en un baño de ultrasonidos marca JP Selecta modelo 3000513. Las hojas
secas de cada una de las plantas labiadas molidas previamente (5g) se colocaron en un
matraz erlenmeyer de 250 cm3; se añaden 100 cm3 de etanol. El matraz y su contenido
se sumergieron en un baño de ultrasonidos y se realizó el sonicado durante 5, 15 y 30
min; el rango de temperatura se mantuvo a ≤ 30 0C y presión de 1 bar.
Se efectuó la extracción con ultrasonidos con el mismo procedimiento arriba
mencionado para la materia prima vegetal remanente (hojas secas de romero, albahaca y
mejorana) luego de ser extraída por el procedimiento SFE combinado con ultrasonidos
que se describe en la sección 3.3.5.
Los extractos obtenidos fueron filtrados al vacío y recuperados en viales de
vidrio, el disolvente se eliminó utilizando un rotavapor y se secó en una corriente de N2.
Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Las muestras secas se almacenaron
a 4ºC en la oscuridad hasta su análisis.
3.3.4. Extracción con fluidos supercríticos (SFE).- Las extracciones con
fluidos supercríticos se llevaron a cabo en una planta a escala piloto modelo (Thar
Technology, Pittsburgh, PA, USA, model SF2000). La planta tiene una celda de
extracción con una capacidad de 2 L y dos separadores diferentes (S1 y S2), cada uno
de 0,5 L de capacidad. Todos ellos tienen controladores independientes de presión y
temperatura. La celda de extracción tiene una relación altura / diámetro de 5,5 (0,42 m
de altura, 0.076 m de diámetro interior). La planta de extracción también incluye un
sistema de recirculación en el cual el CO2 se condensa y se bombea hasta la presión de
extracción deseada.
18
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Materiales y Métodos
Las extracciones se realizaron a una temperatura de 400C y a una presión de
150 bar; el caudal de inyección del CO2 fue de 30 g/min y 60g/min dependiendo del
tipo de experimento. El tiempo de extracción para los experimentos fue de 3 horas
aproximadamente.
Los extractos obtenidos fueron filtrados al vacío y recuperados en viales de
vidrio, el disolvente se eliminó utilizando un rotavapor y se secó en una corriente de
N2. Las muestras secas se almacenaron a 4ºC en la oscuridad hasta su análisis.
3.3.5. Extracción con fluidos supercríticos combinada con etapa previa de
ultrasonidos (US-SFE).- En el caso de la extracción con fluidos supercríticos
combinada con ultrasonidos se efectuó una etapa previa a la SFE en donde las hojas
secas de romero, albahaca y mejorana previamente molidas, se mezclaron en un vaso de
precipitación con etanol en una relación 2:3 (peso de materia prima/ volumen de
disolvente); luego se sometió la mezcla a sonicado durante 30 min cuidando que la
temperatura del baño se mantenga ≤ 300C; el pastiche obtenido se sometió a SFE a las
mismas condiciones arriba mencionadas.
3.3.6. Análisis por HPLC.- La cuantificación de ácido carnósico, carnosol y
ácido rosmarínico de los extractos se analizaron empleando un HPLC equipado con un
MICROSORB-MV-100, columna C18 (Varian) de 250 mm x 4,6 mm y 5 µm de tamaño
de partícula. La fase móvil consistió en acetonitrilo (disolvente A) y 0,1% de ácido
fosfórico en agua (disolvente b) aplicando la siguiente gradiente: 0-8 min, 23% A y 825 min, 77% de A. Esta última composición se mantuvo durante 15 minutos y las
condiciones iniciales fueron ganadas en 5 min.
Tiempo total de análisis fue de 45 minutos. La velocidad de flujo fue constante a
0,7 mL / min. Volumen de inyección fue de 20 µL y la detección se llevó a cabo
mediante el uso de una red de diodos de detección del sistema de Varian la misma que
almacena la señal a una longitud de onda de 230, 280 y 350 nm.
3.3.7. Estimación del contenido de Polifenoles Totales.- Para esta prueba se
utilizó el Método Folin-Ciocalteu que es un método colorimétrico descrito
anteriormente por Gao y col., (2000). En tubos de ensayo se mezclan en el siguiente
orden 3 ml de H2O Mili Q, 50 µL muestra o patrón y 250 µL de reactivo de Folin19
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Materiales y Métodos
Ciocalteu; se incuban a temperatura ambiente durante 3 min. Luego se añade a la
mezcla 0,75 ml de Carbonato de sodio al 20% y 0,95 ml de H2O Mili Q; se agita en el
vortex y se dejan las muestras en reposo durante dos horas en la oscuridad. La
absorbancia del color azul resultante fue medida en un espectrofotómetro a 760 nm. La
cuantificación se hace con respecto a las curvas de concentración de ácido gálico; los
resultados finales se expresan como mg de ácido gálico / mg muestra.
20
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
21
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
4.1. RESULTADOS
4.1.1. Análisis comparativo de la eficiencia de la extracción de compuestos
fenólicos a partir de hojas de romero (Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum
basilicum) y mejorana (Origanum majorana) utilizando diferentes técnicas de
extracción.
Las Tablas 4, 5 y 6 muestran el resumen de los resultados obtenidos al aplicar
diferentes técnicas de extracción (SLE, ASE y UAE) utilizando etanol como disolvente
líquido de extracción para recuperar compuestos fenólicos a partir de hojas de romero,
albahaca y mejorana. Algunos resultados corresponden a trabajos previos del grupo de
investigación (tal como se indica en las tablas correspondientes) pero se incluyen en
esta memoria a efectos de establecer una comparación fundamentada de las diferentes
técnicas de extracción.
Tabla 4. SLE con etanol a 50°C, a presión ambiente, durante 24 horas. AC:
ácido carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico.
Planta
%
rendimiento
% peso
% peso
% peso
AR
total AC
extraído
(mg / g
planta)
mg AC
/ mL
etanol
mg AR
/ mL
etanol
AC
CAR
Romero
20,66
12,36
1,29
2,43
25,54
0,3
0,05
Albahaca
11,60
-
-
1,18
-
0,01
Mejorana
11,90
-
-
3,13
-
0,04
Fuente: Datos previos del grupo de investigación.
Tabla 5. ASE con etanol a 150°C, a 103 bar y tiempo de extracción 10 min. AC: ácido
carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico.
Planta
%
rendimiento
% peso
% peso
% peso
AR
total AC
extraído
(mg / g
planta)
mg AC
/ mL
etanol
mg AR
/ mL
etanol
AC
CAR
Romero
63,83
4,63
1,29
2,49
29,63
1,5
0,80
Albahaca
14,90
-
-
2,88
-
0,22
Mejorana
39,25
-
-
5,29
-
1,04
Fuente: Datos previos del grupo de investigación.
22
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
Tabla 6. UAE con etanol a temperatura ≤ 30°C y presión de 1 bar. AC: ácido
carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico.
Planta
Tiempo
%
rend.
% peso
AC
% peso
CAR
% peso
AR
mg AC /
mL etanol
mg AR /
mL etanol
5
9
20,44
2,20
1,25
0,92
0,06
15
12,8
18,52
1,76
1,36
1,19
0,09
30
25,6
12,94
0,59
2,09
1,66
0,27
5
1,50
-
-
1,66
-
0,01
15
1,84
-
-
1,74
-
0,02
30
1,66
-
-
1,51
-
0,01
5
2,19
-
-
3,89
-
0,04
15
7,12
-
-
2,13
-
0,08
30
10,99
-
-
1,85
-
0,10
(min)
Romero*
Albahaca**
Mejorana**
* Datos previos del grupo de investigación.
** Este trabajo.
Las Figuras 1 a 3 muestran los cromatogramas correspondientes al análisis por
HPLC de las muestras obtenidas mediante la extracción con ultrasonidos (30 min) de
cada una de las plantas estudiadas. Se indica en las correspondientes figuras el pico
correspondiente al ácido rosmarínico, uno de los antioxidantes objetivo del estudio de
extracción. Asimismo, en los cromatogramas correspondientes a la albahaca y mejorana
pueden observarse otros picos importantes, muy posiblemente correspondientes a otros
compuestos fenólicos que no ha sido posible identificar en este trabajo. Por esto, se
consideró utilizar la determinación del contenido de polifenoles totales como medida de
la recuperación de antioxidantes fenólicos en los extractos. Por otro lado, en el
cromatograma correspondiente al extracto de romero se indican los picos
23
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
correspondientes a carnosol y ácido carnósico (antioxidantes reconocidos como los
mayoritarios).
Como puede verse en las tablas, los rendimientos de las extracciones ASE (10
min) son considerablemente mayores que en el caso de la SLE (24 h) o de la UAE (5-30
min). Las altas temperaturas de extracción aplicadas en las extracciones ASE, así como
el efecto de la alta presión, incrementa considerablemente la disolución de analitos en el
disolvente, cuando se la compara con las extracciones sólido-líquido a presión ambiente
o incluso con la extracción asistida por ultrasonidos. Sin embargo, la concentración de
los antioxidantes identificados no es mucho mayor en los extractos ASE y,
particularmente, es sensiblemente inferior en lo que respecta a la extracción de ácido
carnósico del romero. Este hecho puede explicarse en términos de los altos rendimientos
obtenidos en las extracciones ASE, lo que implica una importante co-extracción de
compuesto no deseados, que puede disminuir la concentración de antioxidantes en el
extracto.
En cuanto a la extracción de ácido rosmarínico (AR) la extracción ASE es la que
produce extractos con mayor concentración (% en peso) de este ácido fenólico. Este
resultado, sumado a los altos rendimientos ASE obtenidos, hacen que esta técnica sea la
que, indudablemente, permite la mayor recuperación de AR de las plantas estudiadas
(tanto por g de planta como por mL de etanol empleado). En cuanto a la variedad de
planta, los extractos de mejorana son los que presentan mayor contenido de AR
(particularmente en la extracción ASE, dónde se extraen unos 21 mg de AR por gramo
de hojas), seguidos de los extractos de romero (16 mg/g) y de albahaca (4 mg/g).
En el caso del romero el rendimiento global de extracción UAE a los 30 min,
con un total de 25,6%, es el segundo mejor valor luego de la extracción ASE
refiriéndose a las técnicas de extracción; en cuanto al % peso de ácido carnósico (AC)
se observa que disminuye a mayor tiempo de extracción UAE (20,44% en 5 min y
12,94% en 30 min) y en cuanto a la eficiencia en consumo de etanol el mejor resultado
corresponde a la extracción UAE durante 30 min (1,66 mg AC / mL etanol).
Los extractos de hojas de albahaca obtenidos por UAE presentan valores de
rendimiento de extracción considerablemente inferiores (hasta 10 veces menores) en
comparación con las técnicas SLE y ASE. Además, el rendimiento de extracción y el %
24
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
en peso de ácido rosmarínico no se ve afectado al aumentar el tiempo, tal como se
observa en las otras dos plantas en estudio; los resultados obtenidos en los tres tiempos
5, 15 y 30 min se mantienen prácticamente constantes y del mismo orden que los
obtenidos en los extractos SLE y ASE.
Figura 1. Cromatograma del extracto UAE de romero (2.5 mg/ml).
Figura 2. Cromatograma del extracto UAE de albahaca (2.5 mg/ml).
Figura 3. Cromatograma del extracto UAE de mejorana (2.5 mg/ml).
25
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
La extracción UAE de mejorana presenta el segundo mejor valor en cuanto al
rendimiento, con un total de 10,99%. El rendimiento de extracción se incrementa al
aumentar el tiempo de experimentación aunque el % peso de AR disminuye; la mayor
cantidad de AR se extrae en 30 min con una concentración de 1,85% en peso, lo que
equivale a 2 mg AR / g planta (10 veces menor a la recuperada mediante la extracción
ASE).
Por otro lado, en cuanto a la eficiencia en el uso del disolvente, puede observarse
de las Tablas 4, 5 y 6 que las extracciones ASE y UAE son mucho más eficaces por mL
de etanol utilizado, con recuperaciones de ácido carnósico del romero unas 3-5 veces
mayor que la SLE. La eficiencia del uso del disolvente depende no sólo de la variedad
de planta sino también del componente que se desea recuperar. Por ejemplo, en el caso
del romero tanto la extracción ASE como UAE producen similar recuperación de AC
por mL de etanol consumido (mayor concentración de AC y menor rendimiento en la
UAE, resultan en valores similares de mg AC / mL etanol al obtenido en la extracción
ASE). En cambio, tal como se mencionó anteriormente, para la recuperación de AR es
la extracción ASE la que resulta más eficiente, tanto en el caso del romero como en el
de la mejorana y la albahaca.
La Tabla 7 muestra los resultados de repetir la extracción con ultrasonidos
durante 30 min, pero utilizando como materia prima el material remanente en la celda
de extracción, luego de una extracción combinada US-SFE. Estos ensayos se llevaron a
cabo puesto que, tal como se explicará luego, se observó que en la extracción
combinada US-SFE no era posible extraer ácido rosmarínico. Por lo tanto, se esperaba
que al volver a extraer el material ya procesado, se obtendría un extracto con un alto
contenido de ácido rosmarínico. Sin embargo, como puede verse en la Tabla 7, la
concentración de ácido rosmarínico en los extractos sólo aumenta considerablemente (se
duplica) en el caso de la mejorana; para romero y albahaca el %AR se mantiene del
mismo orden de magnitud del obtenido en los ensayos UAE utilizando la materia prima
vegetal original. Además, se puede observar que en el caso del romero y la mejorana el
rendimiento resultante disminuyó, como era de esperar, ya que la materia prima tuvo
una etapa previa de extracción; la albahaca, por el contrario, mantuvo porcentajes de
rendimiento similares al obtenido cuando se procesa la materia prima vegetal original.
26
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
Tabla 7. UAE con etanol a temperatura ≤ a 30°C y presión de 1 bar del material
vegetal previamente extraído por US-SFE. AC: ácido carnósico; CAR: carnosol;
AR: ácido rosmarínico.
Planta
Tiempo
%
rendimiento
(min)
% peso
% peso
% peso
AC
CAR
AR
Romero
30
8,55
8,98
1,82
1,63
Albahaca
30
1,64
-
-
1,37
Mejorana
30
2,02
-
-
3,67
4.1.2. Extracción supercrítica con y sin cosolvente (etanol) de hojas de
romero, albahaca y mejorana
En cuanto a las extracciones utilizando la tecnología de fluidos supercríticos, los
resultados se muestran en las Tablas 8 y 9, correspondientes a la extracción utilizando
CO2 puro (Tabla 8) y CO2 con etanol como cosolvente (Tabla 9).
Tabla 8. SFE de hojas de romero, albahaca y espinaca a 40°C, 300 bar y 60 g/min
de CO2. AC: ácido carnósico.
tiempo
(min)
Rend. %
% peso
Rend. %
% peso
S1
AC
S2
AC
total AC extraído
(mg / g planta)
Romero
360
4,52
10,89
-
-
4,92
Romero*
420
2,83
16,90
1,53
3,12
5,26
Albahaca
300
1,96
Majorana
300
2,03
Planta
*SFE con fraccionamiento del extracto en dos separadores en línea.
Fuente: Datos previos del grupo de investigación.
27
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
Tabla 9. SFE con etanol como cosolvente a 40°C, 150 bar y 60 g/min de CO2.
AC: ácido carnósico.
Planta
peso materia
prima (g)
tiempo
(min)
% etanol
cosolvente
rend.
%
% peso
AC
% peso
CAR
mg AC
/ mL etanol
Romero
400
210
5,02
7,99
30,64
4,77
12,38
Albahaca
400
210
3,77
3,23
-
-
-
Mejorana
300
190
3,16
2,88
-
-
-
Los resultados de las extracciones SFE con CO2 puro, corresponden a trabajos
previos del grupo de investigación, tal como se indica en la correspondiente tabla. Por
otro lado, las condiciones seleccionadas para llevar a cabo las extracciones con
cosolvente (presión, temperatura, porcentaje de cosolvente) se basan en la experiencia
previa del grupo de investigación (Vicente y col., 2012). Las Figuras 4, 5 y 6
corresponden a los cromatogramas obtenidos para los extractos producidos utilizando
etanol como cosolvente.
Figura 4. Cromatograma del extracto de romero obtenido por SFE con etanol como
cosolvente (concentración 2,5 mg/ml).
28
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
Figura 5. Cromatograma del extracto de albahaca obtenido por SFE con etanol como
cosolvente (concentración 5 mg/ml).
Figura 6. Cromatograma del extracto de mejorana obtenido por SFE con etanol como
cosolvente (concentración 5 mg/ml).
Tal como se esperaba, la extracción SFE utilizando etanol como cosolvente (en
bajas concentraciones, < 5 %) mejora los rendimientos de extracción para todas las
plantas estudiadas en comparación con la SFE utilizando CO2 puro. En el caso del
romero el rendimiento aumenta un 75%, para la albahaca un 90% y para la mejorana el
aumento es del orden de 40%.
También, tal como se esperaba, y en base al análisis de la concentración de ácido
carnósico en los extractos de romero, puede observarse que el uso de etanol como
cosolvente mejora considerablemente la recuperación de antioxidantes: en la extracción
SFE sin cosolvente se recuperan unos 5 mg de AC por g de hojas de romero procesadas,
mientras que en la extracción SFE con etanol como cosolvente se recuperan casi 25 mg
29
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
de AC por g de hojas. Este valor es del mismo orden que los obtenidos en la extracción
ASE y UAE de romero (29-33 mg AC / g planta). Por otro lado, es importante destacar
que comparando la eficiencia en términos de cantidad de etanol empleado puede decirse
que la SFE con etanol cosolvente logra recuperaciones de AC por mL de etanol mucho
mayores que la extracción ASE o UAE (12,38 mg vs.1,5-1,66 mg). Como desventaja, se
observa que no ha sido posible extraer ácido rosmarínico de ninguna de las plantas
estudiadas mediante la SFE con etanol cosolvente.
4.1.3. SFE de hojas de romero, albahaca y mejorana combinada con una etapa
previa de extracción con ultrasonidos (US-SFE)
Teniendo en cuenta la alta eficiencia en cuanto al consumo de etanol que
presenta la extracción SFE con etanol cosolvente, se investigó el efecto de combinar una
etapa previa de sonicación con la posterior extracción por SFE (US-SFE). Estos
estudios constituyen una etapa preliminar para preparar la construcción de una celda
de extracción de alta presión acoplada a una sonda de generación de utltrasonidos.
La Tabla 10 muestra los resultados obtenidos de la extracción combinando una
etapa previa de ultrasonidos (30 min con etanol en proporción 2:3 peso planta / mL
etanol) seguida de la extracción SFE con CO2 (40°C y 150 bar). Como puede verse en la
tabla, esta extracción combinada permitió un aumento importante del rendimiento de
extracción de romero y mejorana, aunque no así de la albahaca. La Figura 7 corresponde
al cromatograma del extracto de hojas de romero producido utilizando US-SFE, en
donde se identifican el ácido carnósico y carnosol.
Particularmente, en el caso del romero, se observa una disminución en el %
peso de antioxidantes (ácido carnósico y carnosol) pero un aumento de la cantidad de
AC recuperado por mL de etanol empleado, cuando se compara la US-SFE con la SFE
con etanol. Asimismo, la reducción del flujo de CO2 de 60 g/min a 30 g/min, permitió
obtener un extracto de romero con considerablemente mayor rendimiento (15,03% vs.
7.99%) y mejor eficacia en términos de la cantidad de etanol empleada (23,19 mg vs.
12,38 mg AC por mL de etanol empleado), aunque con un contenido de antioxidantes
algo menor (25.9% vs. 35.4%).
30
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
Por otro lado, y a pesar de la etapa previa de ultrasonidos, la extracción de
ácido rosmarínico no se logró en ninguna de las plantas estudiadas. Evidentemente, es
necesario emplear mayores cantidades de cosolvente polar y, posiblemente, mayores
densidades de CO2 para recuperar ácido rosmarínico mediante SFE.
Tabla 10. Extracción combinada US-SFE.
Planta
CO2
(g/min)
tiempo
(min)
% etanol en
el CO2
rend.
% peso
% peso
CAR
mg AC /
mL etanol
%
AC
Romero
60
210
3,81
11,48
23,69
2,86
18,12
Romero
30
180
4,44
15,03
23,15
2,70
23,19
Albahaca
60
180
4,44
2,47
-
-
-
Mejorana
60
180
3,33
4,61
-
-
-
Figura 7. Cromatograma del extracto US-SFE de romero (flujo de CO2 30 g/min)
(concentración 2,5 mg/ml)
4.1.4. Contenido de polifenoles totales de los extractos obtenidos de
romero, albahaca y mejorana con diferentes técnicas de extracción.
En las Tablas 11 y 12 se muestra los resultados obtenidos de la prueba de
polifenoles totales realizada con el método Folin-Ciocalteu de los extractos obtenidos de
las hojas de romero, albahaca y mejorana con las diferentes técnicas de extracción.
Para el caso del romero el resultado más alto en concentración de polifenoles totales
31
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
corresponde a la extracción realizada con fluidos supercríticos con etanol como
cosolvente (aproximadamente un 5% de etanol) con un valor del 0,25 mg de ácido
gálico por mg de muestra; los datos obtenidos para la US-SFE son ligeramente menores.
Asimismo, se observa una correlación entre el valor FOLIN resultante y el contenido de
antioxidantes determinado para las distintas muestras. Para completar este estudio se
determinará la actividad antioxidante de los distintos extractos.
Los valores FOLIN obtenidos para las hojas de albahaca son de la misma
magnitud tanto en la extracción UAE, SFE con etanol cosolvente y US-SFE. En
cambio, para la mejorana el valor más alto corresponde al extracto US-SFE con un total
del 0,16 mg de A. gálico / mg muestra. Por otro lado, los valores FOLIN de los
extractos de romero son mayores que los de mejorana, y éstos mayores que los de
albahaca. Esto concuerda con el orden de actividad antioxidante (romero > mejorana >
albahaca) determinada en el grupo de investigación para extractos ASE obtenidos para
estas variedades de plantas utilizando distintos disolventes. Nuevamente, se observa que
se completará el estudio que se presenta en esta memoria cuantificando por distintos
métodos la actividad antioxidante de los extractos obtenidos.
Tabla 11. Comparación de polifenoles totales de los extractos de hojas de
romero obtenidos por SFE con etanol cosolvente y US-SFE.
Planta
Romero
Técnica
Absorbancia
a 760nm
Concentración
mg de A. gálico /
mg muestra
(FOLIN)
% peso
antioxidantes
(AC + CAR + AR)
SFE con etanol
cosolvente ( ≈ 5%)
0,903
0,25
35,41
US-SFE caudal CO2
30 g/min
0,687
0,20
26,55
US-SFE caudal CO2
60 g/min
0,731
0,21
25,85
32
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
Tabla 12. Comparación de polifenoles totales de los extractos de hojas de
albahaca y mejorana obtenidos por SFE con etanol cosolvente y US-SFE.
Técnica
Absorbancia
a 760nm
Concentración
mg de A. gálico / mg muestra
UAE (30 min)
0,331
0,11
SFE con etanol
cosolvente ( ≈ 5%)
0,387
0,12
US-SFE caudal CO2
60g/min
0,357
0,11
UAE (30 min)
0,275
0,09
SFE con etanol
cosolvente ( ≈ 5%)
0,412
0,13
US-SFE caudal CO2
60g/min
0,534
0,16
Planta
Albahaca
Mejorana
4.2. DISCUSIÓN
En general, en relación al tipo de técnica, los extractos resultantes de los
diferentes métodos con extracción supercrítica tienen siempre rendimientos inferiores
en relación a las técnicas de extracción sólido-líquido, ASE y ultrasonidos, para todas
las variedades de plantas estudiadas.
En cuanto a los rendimientos de extracción de hojas de romero el Gráfico 1
compara los resultados obtenidos para todos los ensayos. El rendimiento ASE es,
incuestionablemente superior a todos los demás, con un total de 63,83 %. Analizando
los rendimientos donde interviene la extracción supercrítica, la extracción combinada
US-SFE es la que presenta los rendimientos más altos.
En cuanto a las extracciones de albahaca y mejorana, las conclusiones son
similares a las del romero; el rendimiento de extracción de las dos plantas son los más
altos para la extracción ASE con valores de 14,9 y 39,25% respectivamente como se
muestra en la Gráfico 2. Por otro lado, sólo en el caso de la mejorana la extracción
combinada US-SFE presenta mejores rendimientos que la SFE con etanol cosolvente,
tal cómo se observó para el romero. Para la extracción de albahaca, la etapa previa de
33
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
ultrasonidos no es capaz de producir un incremento de los rendimientos
rendimientos de extracción
supercrítica.
Gráfico 1. Rendimiento de extracción de hojas de romero (Rosmarinus
Rosmarinus
officinalis L.)
L. con diferentes técnicas de extracción.
% Rendimiento de hojas de romero con diferentes técnicas de
extracción.
US-SFE CO2 30g/min
US-SFE CO2 60g/min
SFE cosolvente etanol
SFE
UAE materia remanente
UAE (30 min)
ASE
SLE
0
10
20
30
40
50
60
70
Gráfico 2. Rendimiento de hojas de albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana
(Origanum majorana) con diferentes técnicas de extracción.
% Rendimiento de hojas de albahaca y mejorana con diferentes
técnicas de extracción.
US-SFE flujo CO2 60g/min
SFE cosolvente (etanol)
SFE
Mejorana
UAE materia remanente
Albahaca
UAE (30 min)
ASE
SLE
0
5
10
15
20
25
30
35
40
34
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
Con respecto a la recuperación de compuestos fenólicos el Gráfico 3 compara
los resultados para el ácido carnósico (AC) en los extractos de romero, y el Gráfico 4
para el ácido rosmarínico (AR) en las tres variedades
variedades de planta estudiadas.
En el caso de la SLE de romero, el % en peso de AC obtenido tiene un valor
intermedio (12,36%) en comparación con el resto de las técnicas de extracción
analizadas; pero este porcentaje en relación a la cantidad de etanol empleado presenta el
resultado más bajo (0,3 mg AC / mL etanol) como se muestra en el Gráfico 3. Esto
significa que la técnica requiere un alto consumo de etanol, con una relación de etanol
utilizada en este trabajo de 100 ml / g planta. Los costos adicionales que significan la
evaporación y recuperación del disolvente para su reciclado demandan minimizar el
consumo de disolvente. En este sentido, con respecto a la recuperación de ácido
carnósico del romero, en la extracción ASE se obtuvo un total de 1,5 mg ácido
carnósico
arnósico / mL etanol (aunque el % peso era tan solo de 4,63%) mejorando
considerablemente el consumo de etanol con respecto a la extracción sólido-líquido.
sólido
Gráfico 3. Concentración y recuperación de ácido carnósico en los extractos de romero
obtenidos mediante distintas técnicas de extracción.
Concentración de ácido carnósico en extractos de romero
de distintas técnicas de extracción.
US-SFE
SFE (flujo CO2 30g/min)
US-SFE
SFE (flujo CO2 60g/min)
SFE cosolvente (etanol)
UAE materia remanente
UAE (30 min)
ASE
SLE
0
5
% peso ácido carnósico
10
15
20
25
30
35
mg ácido carnósico/ml etanol
35
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
En el caso de los resultados obtenidos en la SFE de hojas romero el rendimiento
de extracción aumenta significativamente de 4,52% a 7,99% al utilizar etanol como
cosolvente. Así, el incremento es alrededor de un 75% en cuanto a los mg ácido
carnósico / g planta; los valores han pasado de 4,92 a 24,29 mg/g, es decir,
prácticamente se ha quintuplicado el total de ácido carnósico presente en el extracto
final. Al combinar la extracción supercrítica con una etapa
etapa previa de ultrasonidos (US(US
SFE) el aumento de rendimiento es aún mayor, como era de esperar, ya que la técnica
de ultrasonidos favorece la liberación de analitos de las células vegetales, tal como se
mencionó anteriormente. En este caso los rendimientos son 11,48% y 15,03% para
extracciones
iones con flujos de CO2 de, respectivamente, 60 y 30 g/ min; es decir una
reducción del flujo de CO2 mejoró la recuperación del ácido carnósico de la materia
prima. Este resultado puede deberse a una solubilización más lenta del etanol en el CO2
supercrítico
ico que, a su vez, favorece la extracción de analitos. Por otro lado, aunque el %
en peso de AC es mayor en la SFE con etanol los resultados finales de mg AC / mL
etanol son considerablemente mayores
mayore para las extracciones US-SFE.
Gráfico 4. Concentración de ácido rosmarínico (% en peso) en extractos de romero
albahaca y mejorana obtenidos con diferentes técnicas de extracción.
Concentración de ácido rosmarínico en extractos de romero,
albahaca y mejorana obtenidos con diferentes técnicas de
extracción
UAE materia remanente
UAE (30 min)
UAE (5 min)
ASE
SLE
0
1
Mejorana
2
Albahaca
3
4
5
6
Romero
36
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Resultados y Discusión
En cuanto al ácido rosmarínico (AR) la extracción ASE presenta las
concentraciones y recuperaciones más altas para las tres plantas analizadas (ver Gráfico
4), con % en peso de AR de 2,49; 2,88 y 5,29 para romero, albahaca y mejorana
respectivamente. Teniendo en cuanta el correspondiente rendimiento de extracción esto
significa 15,89; 4,29 y 20,76 mg AR / g planta. Este resultado se debe no sólo a la
polaridad del disolvente utilizado (que es el mismo que se utilizado en las otras
técnicas) sino también a la posibilidad de aplicar altas temperaturas en esta técnica de
extracción.
Si bien uno de los objetivos planteados en el uso combinado de ultrasonidos con
la extracción supercrítica ha sido la recuperación de ácido rosmarínico, en ninguno de
los tratamientos donde interviene la SFE fue posible su extracción, por lo que es
necesario continuar la investigación analizando otras variables (por ejemplo, mayor
cantidad de etanol y/o mayor densidad de CO2) y procedimientos combinados en los
métodos de extracción.
37
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Conclusiones
5. CONCLUSIONES
38
Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Conclusiones
5. Conclusiones
Se ha obtenido resultados positivos en la extracción supercrítica de hojas de
romero combinada con una etapa previa de ultrasonidos (US-SFE) en lo
que se refiere la optimización de la cantidad de etanol empleada en el
proceso, la concentración de antioxidantes en el extracto y el rendimiento
de extracción.
Los mg de ácido carnósico (AC) extraídos por mL de etanol consumido aumentan
en el siguiente orden: 0,3 para la SLE, 1,6 para ASE y UAE, 5,0 para SFE con CO2
puro, 12,4 en la SFE con etanol cosolvente, y 23,2 en la extracción combinada US-SFE.
Es decir, la US-SFE duplica prácticamente la recuperación de AC por mL de etanol
consumido respecto de la SFE con cosolvente.
En cuanto a la concentración de antioxidantes en los extractos de romero, el % en
peso de ácido carnósico + carnosol + ácido rosmarínico sigue el siguiente orden: 8,4%
en ASE, un 16% en SLE y UAE, 20% en SFE con CO2 puro y fraccionamiento del
extracto, 25,9% en US-SFE y 35,4 en SFE con cosolvente.
Y los rendimientos globales de extracción: 63,8% para la extracción ASE, 25,6%
UAE, 20,7% SLE, 15% US-SFE, 8% SFE con cosolvente y 3% en SFE con CO2 puro y
fraccionamiento del extracto. Es decir, el rendimiento US-SFE es el doble que en la
SFE con cosolvente y 5 veces mayor que en la SFE con CO2 puro y fraccionamiento del
extracto, logrando también un alta concentración de antioxidantes.
Evidentemente, la extracción supercrítica es más selectiva que las otras técnicas para la
extracción de ácido carnósico del romero y los efectos físicos como turbulencia,
aglomeración de partículas y la alteración de la célula que producen los ultrasonidos
favorece la liberación de ácido carnósico de la matriz vegetal, que luego es más
fácilmente extraído con CO2 supercrítico.
También en el caso de la extracción de hojas la mejorana se ha obtenido
resultados positivos con la US-SFE.
Si bien los rendimientos de las extracciones supercríticas son, en general, mucho
menores que los de la extracción ASE, SLE o UAE, se observa en la US-SFE un
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Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
Conclusiones
incremento del rendimiento de extracción de un 47% referente al rendimiento obtenido
en la SFE con etanol cosolvente.
Además, los resultados del análisis de polifenoles totales indican que los extractos USSFE son los que tienen mayor contenido de compuestos fenólicos, con un total de 0,16
mg ácido gálico / mg extracto.
En el caso de la extracción de hojas de albahaca la US-SFE no produce
ventaja alguna frente a las otras técnicas en lo que se refiere a rendimiento
o contenido de polifenoles totales.
Por el contrario, la US-SFE parece producir una pequeña disminución del rendimiento
de extracción respecto de la SFE con cosolvente, y el contenido de polifenoles totales es
similar en todos los extractos analizados.
La extracción acelerada (ASE) con etanol es la técnica que resulta en la
mayor recuperación de ácido rosmarínico para todas las variedades de
plantas estudiadas. La extracción supercrítica (SFE) con CO2 puro, o
utilizando etanol como cosolvente, o combinada con ultrasonidos, no ha sido
capaz de extraer ácido rosmarínico de ninguna de las plantas labiadas
estudiadas. Esto puede afectar negativamente la calidad antioxidante de los
extractos obtenidos, puesto que el ácido rosmarínico es reconocido como un
potente antioxidante. Por esto, para completar este estudio, se llevará a cabo la
determinación de la actividad antioxidante de los extractos utilizando distintos
métodos de análisis.
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Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico
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