Brucella abortus

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 2003, 22 (3), 1065-1075
Evaluación comparativa del método
inmunoenzimático indirecto en leche para la
detección de bovinos infectados con Brucella
abortus, en hatos del departamento de
Cundinamarca, Colombia
D.Y. Rivera A. (1), O.E. Rueda (2), C.P. Calderon (2), O.C. Mariño J. (2), D. Gall (3)
& K. Nielsen (3)
(1) Universidad Javeriana, Carrera 7, No 40-62, Bogotá, Colombia
(2) Instituto Colombiano Agropecuario, Centro Nacional de Diagnóstico Veterinario, Avenida Eldorado No 42-42,
Santafé de Bogotá, Colombia
(3) Canadian Food Inspection Agency, Animal Disease Research Institute, 3851 Fallowfield Road, Nepean,
Ontario, Canadá
Remitido el 14 de febrero de 2002
Aceptado el 11 de abril de 2003
Resumen
Con el objeto de evaluar comparativamente el método inmunoenzimático (ELISA)
indirecto en leche para la detección de bovinos infectados con Brucella abortus,
se recolectaron 1.523 muestras de leche, distribuidas entre cantinas y animales
individuales pertenecientes a 200 hatos del departamento de Cundinamarca,
Colombia, incluidos dentro del “Programa de hatos libres y determinación de
prevalencia por hatos del departamento de Cundinamarca”. Las muestras de
leche fueron sometidas simultáneamente a la prueba establecida del anillo en
leche y a la prueba de ELISA indirecta. Un total de 584 muestras individuales y 497
muestras de cantina, pertenecientes a hatos libres, fueron consideradas como
población negativa y sirvieron para la determinación inicial del punto de corte
para ELISA. La evaluación optimizada del punto de corte fue efectuada mediante
el análisis operacional, empleando un programa estadístico. Para el análisis se
consideró la totalidad de la población: 756 muestras individuales, positivas y
negativas, definidas por la historia del hato y por condiciones serológicas
previamente establecidas. El punto de corte fue fijado en > 0,20 unidades de
densidad óptica, el cual expresado en porcentaje de positividad correspondió a
20,5% con respecto a los controles de referencia, con una sensibilidad de 95,3%
y una especificidad de 95,1%, a un intervalo de confianza de 95%. La
confirmación indirecta del estado de infección se realizó por ELISA competitiva
en suero de los animales individuales considerados positivos y adicionalmente se
intentó determinar la presencia de la bacteria por aislamiento en cultivo y por
transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa. Los resultados
confirman que la prueba de ELISA indirecta es altamente sensible y específica,
permite obtener resultados respaldados bajo estrictos controles de calidad y
puede ser adoptada para procesar un amplio número de muestras procedentes
de hatos o de individuos y dar un apoyo más eficiente al programa de vigilancia
de la campaña de control.
Palabras clave
Brucella abortus – Brucelosis – Especificidad – Leche – Prueba del anillo en leche –
Prueba inmunoenzimática – Punto de corte – Sensibilidad – Transcripción inversareacción en cadena de la polimerasa.
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Introducción
La brucelosis es una zoonosis que afecta principalmente al
ganado bovino, caprino y porcino. En los animales, la infección
causa abortos, aumento de mortalidad perinatal e infertilidad,
existiendo diversas vías de transmisión intra e interespecíficas.
El hombre contrae la enfermedad por contacto directo, durante
el manejo de animales, o por ingestión de productos lácteos
frescos contaminados (1, 32).
En países de Sudamérica, Brucella abortus presenta una mayor
prevalencia en animales de ganado lechero, con valores que
oscilan entre 0,1% y 20,3%. Se calcula que las pérdidas
económicas causadas por la brucelosis bovina en las Américas
ascienden a 270 millones de dólares norteamericanos (US$);
esta estimación se basa en las pérdidas de producción de crías
(47%), producción de leche (41%) y costos de reposición
(12%). En Colombia, la enfermedad causa pérdidas evaluadas
por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) en cerca de
US$ 46 millones anuales (15).
Actualmente, el diagnóstico de la brucelosis se basa en la
detección de anticuerpos en suero mediante las pruebas de rosa
de Bengala, fijación de complemento, método
inmunoenzimático (ELISA) indirecto y ELISA competitiva,
demostrando estas últimas pruebas una alta sensibilidad y
especificidad (12). Sin embargo, es conocido que las pruebas en
leche agilizan y reducen el estrés durante la toma de muestra
por la fácil manipulación y rapidez, lo cual puede significar una
ventaja económica al ganadero. Por otra parte, las pruebas
realizadas en leche permiten definir el estado de infección a
nivel poblacional.
Para la vigilancia epidemiológica de la brucelosis en ganado
lechero, se cuenta con la prueba del anillo en leche. El
incremento del número de animales en los hatos produce una
mayor dilución de la alicuota de leche que produce cada vaca,
lo cual reduce la sensibilidad de esta prueba; por lo tanto, es
necesario evaluar pruebas más sensibles como la ELISA en
leche para detectar bajos niveles de anticuerpos específicos.
Se propuso entonces realizar la evaluación comparativa, a nivel
piloto, de las pruebas del anillo y ELISA indirecta, con el objeto
de recomendar la que proporcione mayor certeza en la
detección de anticuerpos y que oriente sobre la presencia de
infección activa en el hato, permitiendo apoyar eficazmente el
programa de control vigente destinado a la obtención de hatos
libres de brucelosis, a cargo del ICA.
En el presente trabajo se utilizó antígeno sLPS de B. abortus
inmovilizado en matriz de poliestireno. Se aplicó la prueba de
ELISA indirecta a partir de leche total de ordeño y/o animales
individuales del departamento de Cundinamarca. Se empleó
leche diluida 1:2 en solución amortiguadora con agentes
catiónicos quelantes (EDTA/EGTA) para reducir reacciones no
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específicas (22) y un anticuerpo monoclonal específico para
IgG1 bovina conjugado a peroxidasa. Los animales positivos
fueron confirmados mediante serología con fijación de
complemento y ELISA indirecta y/o competitiva e intento de
aislamiento y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La
metodología confirmó mayor sensibilidad y especificidad que la
prueba del anillo y la factibilidad de su utilización dentro del
programa de seguimiento de hatos libres de la infección. Así
mismo permitió detectar porcentajes de positividad superiores
a los conocidos hasta el momento para esta región.
Materiales y métodos
Material biológico
Se procesaron 1.523 muestras de leche cruda procedentes de
200 hatos del departamento de Cundinamarca. Las muestras
fueron recolectadas asépticamente de animales individuales y
de cantinas en tubos de 15 ml que contenían 0,5 ml de
formaldehído al 37%, que fueron mantenidos en refrigeración
durante 48 horas hasta la realización de la prueba.
Detección de anticuerpos dirigidos contra
Brucella abortus con la prueba del anillo en
leche
La prueba del anillo se realizó con antígeno preparado y
estandarizado localmente según la metodología de Alton y col.
(2). La sensibilidad del lote se comparó respecto a un lote de
referencia y a antisuero estándar internacional contra B. abortus
(ISABS) para proporcionar un mínimo de reacción en dos
unidades internacionales (UI) (26). Se obtuvieron 500 ml de
antígeno coloreado, a una concentración de 4% de paquete
celular, pH 4,0 a 4,3. Se efectuó la prueba de esterilidad e
inocuidad del lote preparado y éste se utilizó como reactivo
único durante todo el trabajo.
La prueba se efectuó según el procedimiento de Alton y col. (2).
Los resultados positivos fueron caracterizados a partir de la
formación de un nítido anillo azul en la superficie o área de
crema. Si la intensidad del color en la capa de crema era menor
que la del resto de la leche, el resultado se consideró negativo;
el resultado se consideró dudoso al observarse una coloración
distribuida por toda la leche sin área definida. Se utilizaron
controles positivo y negativo de leche fresca para cada conjunto
de muestras sometidas a prueba.
Detección de brucelosis por ensayo
inmunoenzimático en leche
Para la prueba ELISA se utilizó el método descrito por Nielsen
y col. (24). Los resultados fueron obtenidos mediante el
programa de computación de la Organización de las Naciones
Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y del
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Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA) “ELISA
Data Interchange Programme (EDI)” versión 2.3.1, 1999. El
programa calcula a partir de las lecturas en unidades de
densidad óptica (DO), el porcentaje de positividad (PP) del
promedio de cada muestra con respecto al promedio del
control positivo de referencia y define el estatus de la muestra
en función del punto de corte previamente establecido sobre la
base de la población negativa. Esta forma de expresión de los
datos permite el procesamiento de un gran número de
muestras, con un excelente nivel de control de calidad interno
(18).
Sensibilidad analítica (condiciones de laboratorio)
Se obtuvieron muestras individuales de leche de vacas
infectadas seguidas durante dos a tres meses por las pruebas de
rosa de Bengala, ELISA indirecta y ELISA competitiva en suero
y ELISA indirecta en leche para confirmar su estado de
infección.
Diluciones progresivas 2× de la leche del animal infectado en
una leche negativa, fueron efectuadas y la prueba indirecta fue
realizada a cada dilución hasta encontrar el valor de extinción
que define la sensibilidad analítica de la prueba.
Sensibilidad diagnóstica (condiciones naturales)
Se utilizaron muestras individuales de leche pertenecientes a
predios positivos y/o negativos en las pruebas del anillo en
leche y ELISA indirecta. Se consideró como hato infectado el
que poseía al menos una vaca positiva por la prueba de ELISA
competitiva en suero. Se determinó la sensibilidad y la
especificidad diagnósticas de cada prueba con intervalos de
confianza (IC) del 95% y estadística Kappa, mediante la
tabulación en tablas de 2 × 2 (33).
Control de calidad del método inmunoenzimático
El total de las placas de ELISA sometidas a prueba (40)
incluyeron sueros de referencia positivo fuerte, positivo
moderado, negativo y control del conjugado, para mantener un
control de calidad interno continuo. La evaluación de las placas
sometidas a prueba se efectuó periódicamente mediante análisis
estadístico y cartas de control (8, 37).
Determinación del punto de corte
Como punto de corte preliminar para el método ELISA
indirecto en leche se utilizó el resultado de la evaluación de 584
muestras de individuos de una población negativa, procedentes
de hatos pertenecientes al programa de hatos libres del
departamento de Cundinamarca. Al promedio de los valores de
DO de los cinco últimos percentiles de la distribución de
frecuencias (95% IC), se le agregó dos veces la desviación
estándar; el valor obtenido se consideró como el punto de corte
preliminar (11). Se empleó la expresión más exacta en PP con
respecto al promedio del control positivo de referencia después
de la evaluación de curva de control de calidad en 40 placas (9).
Posteriormente, basándose en la población total (n = 756)
seleccionada en función de los resultados serológicos e historial
de los hatos, se utilizó el análisis ROC (receiver operation
characteristic) en el programa estadístico MedCalc®, para
optimizar el valor de corte definido previamente (20, 31). Se
realizaron cálculos tanto para individuos como para cantinas.
Diagnóstico directo de Brucella
abortus
De las leches que dieron resultados positivos con las pruebas
inmunoenzimáticas se procedió a intentar aislar B. abortus. Las
muestras de porción grasa y/o leche debidamente
homogeneizadas, fueron sembradas (5% CO2, 37°C) en caldo
triptosa fosfato de pre-enriquecimiento y posteriormente se
sembraron por triplicado en agar Brucella triple azúcar hierro
(TSI) con suplemento selectivo (OXOID SR 083A). A partir de
las colonias dudosas se evaluaron las características
macroscópicas, microscópicas y pruebas bioquímicas. Así
mismo, se efectuó en estas muestras el tratamiento de
extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) siguiendo los
protocolos de Leal-Klevezas y Martínez (29) con algunas
modificaciones, escogidas en función del tipo de
almacenamiento y conservación de las muestras. Los cebadores
empleados para las PCR iniciales correspondieron a secuencias
que identifican en general a todas las especies de Brucella ISP1
(5’-GGT TGT TAA AGG AGA ACA GC-3’); ISP2 (5’-GAC GAT
AGC GTT TCA ACT TG-3’); IS711 SP (5’-TGC CGA TCA CTT
AAG GGC CTT CAT-3’); B. abortus sp. (5’-GAC GAA CGG AAT
TTT TCC AAT CCC 3’) descritas en la literatura (5, 35). Para la
determinación de especie en las muestras PCR positivas, se
emplearon los cebadores específicos (AMOS) segun Bricker y
Halling (6). Los programas del termociclador se diseñaron
sobre la base de las temperaturas de alineamiento de los
respectivos cebadores en cada amplificación (datos no
mostrados).
Resultados
Material biológico
Las muestras de leche una vez recibidas en el laboratorio fueron
procesadas en forma rápida por la prueba del anillo.
Simultáneamente fueron clarificadas y almacenadas en
congelación para su procesamiento por la prueba de ELISA. La
información acompañante fue recopilada magnéticamente
(Excel® y MedCalc®). Las muestras de leche fresca sin aditivos,
con antecedentes de positividad, fueron a su vez procesadas
para cultivo, extracción de ADN y aplicación de la PCR.
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Detección de anticuerpos dirigidos contra
Brucella abortus en leche
Definición del punto de corte
Prueba del anillo en leche
El Cuadro I resume los resultados obtenidos con la prueba del
anillo en leche en las muestras clasificadas como dudosas (99),
que equivalían a un 6,5% del total de las muestras.
Posteriormente estas mismas muestras fueron clasificadas
utilizando el método ELISA, que permitió definir como
positivos a cerca de un 50% de los resultados dudosos.
Se utilizó como punto de corte preliminar para la prueba de
ELISA indirecta en leche, un valor de DO de 0,2156, obtenido
de la evaluación de 584 leches de animales negativos (Fig. 2),
calculado sobre la base de la media de los valores de DO del
percentil 95 (95% CI), más dos desviaciones estándar. El corte
se expresó así mismo, en PP con respecto al promedio de
valores del control positivo en todas la pruebas realizadas, con
un valor resultante de 22,3%.
Cuadro I
Resultados en muestras de leche sometidas a la prueba del
anillo y proporción de positividad tanto para hatos como
individuos en la zona de estudio (Cundinamarca, Colombia)
Muestra
Total
muestras
procesadas
Resultados
positivos
Porcentaje
de
positividad
Resultados
dudosos
Cantinas
766
78
10,18%
64
Individuos
757
127
16,77%
35
1.523
205
13,46%
99
Totales
Método inmunoenzimático indirecto
La distribución (Fig. 1) de valores correspondientes a los
controles de referencia empleados durante el estudio en un
número significativo de 40 placas sometidas a prueba (1.600
muestras) respaldaron (con 99% IC) los resultados obtenidos
(27).
Fig. 2
Frecuencia de distribución de valores de densidad óptica
obtenidos en la población negativa (n = 584) con la prueba
inmunoenzimática (ELISA) indirecta en leche para la detección
de Brucella abortus
Las muestras de cantinas (497 cantinas negativas) fueron
procesadas en forma similar, obteniéndose un valor
equiparable de 0,2236 unidades DO y de 23,12% PP
respectivamente. Sin embargo, dado el mejor conocimiento de
las características de los datos y la mayor posibilidad de
detección de resultados falsos negativos, debida a la mezcla de
leches o a la variación introducida por el factor de dilución, se
consideró oportuno utilizar como base para el trabajo, el valor
obtenido en muestras individuales.
Fig. 1
Gráfico comparativo de controles internos de la prueba
inmunoenzimática (ELISA) indirecta en leche en las placas
sometidas a prueba
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La proporción de reactores positivos encontrada en las
muestras sometidas a la prueba de ELISA (Cuadro II) es muy
superior a la que detectó la prueba del anillo en leche, debido
a la esperada diferencia en sensibilidad. La definición del
estatus de la muestra se estableció utilizando el punto de corte
mencionado y configurado en el programa EDI. La calificación
de la prueba como aceptada dependió del cumplimiento de los
estándares de control de calidad.
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Cuadro II
Resultados de las muestras sometidas a la prueba
inmunoenzimática (ELISA) indirecta en leche para la detección
de Brucella abortus
Muestra
Total
muestras
procesadas
Porcentaje
de
positividad
Resultados
positivos
Cantinas
766
90
11,74%
Individuos
757
170
22,45%
1.523
260
17,07%
Totales
A partir de la leche de vacas positivas con lecturas de DO alta
(Cuadro III), se determinó una sensibilidad analítica de la
prueba de ELISA hasta un promedio de dilución 1:32 con
lectura superior al punto de corte o positiva. Diluciones
equivalentes realizadas para la prueba del anillo en leche no
presentaron reacción positiva sino en la muestra concentrada.
Cuadro III
Valores obtenidos con el método inmunoenzimático (ELISA) en
diluciones progresivas de leches de animales positivos
(porcentaje de positividad)
Muestra
No 9899
Muestra
La U
Muestra
No 160
Referencia
No 530
2
81
71
76
108
4
69
56
68
112
8
53
42
48
108
16
40
27
28
95
32
23
14
16
84
64
13
8
8
64
Dilución
128
6
3
3
44
>256
4
0
0
37
Fig. 3
Curva de análisis ROC para la definición del punto de corte
Corte expresado en unidades de densidad óptica, > 0,20, para la
prueba inmunoenzimática (ELISA) indirecta en leche, con respecto a la
prueba del anillo
Cuadro IV
Valores de sensibilidad y especificidad diagnóstica y
estadística Kappa, calculados para la prueba
inmunoenzimática (ELISA), en las muestras de leche de
individuos y cantinas procesadas, con relación al punto de
corte definido
Valores
Optimización del punto de corte
La evaluación optimizada del punto de corte realizada
mediante el análisis ROC empleando el programa estadístico
MedCalc® (31), consideró la totalidad de la población (756) de
muestras individuales, positivas y negativas, definidas por las
condiciones previamente establecidas. Se observa la curva de
análisis ROC (Fig. 3) para el corte resultante expresado en
unidades de DO > 0,20, el cual en PP equivale a 20,5%. El área
bajo la curva, es igual a 0,973 con un IC de 95% entre 0,959
y 0,983, lo cual denota una excelente definición diagnóstica de
la prueba de ELISA. El análisis simultáneo para cantinas no
presentó diferencias significativas a las anotadas.
La evaluación estadística global (Cuadro IV) de las muestras de
individuos (757) y cantinas (766), demostró 5% más de
positividad en cantinas, sugiriendo una mayor infección a nivel
de hato. Lo anterior no fue observado cuando las pruebas
fueron analizadas independientemente (Cuadros I y II), dado
que no se consideraron los resultados dudosos obtenidos con
la prueba del anillo en leche.
Individuos
(n = 757)
Cantinas
(n = 766)
Prevalencia (ELISA) (%)
19,7
24,9
Sensibilidad (%)
95,3
92,1
Especificidad (%)
95,1
97,6
Valor predictivo positivo (%)
82,67
92,7
Valor predictivo negativo (%)
98,80
97,4
La Figura 4 representa específicamente la distribución de la
población de individuos en función de los resultados positivos
y negativos obtenidos con la prueba de ELISA, con respecto a
los resultados de la prueba del anillo. En el grupo de resultados
positivos obtenidos con la prueba del anillo, diez muestras
dieron resultados negativos con la prueba de ELISA, lo que las
confirmó como reacciones inespecíficas en la prueba del anillo.
Así mismo, se observa que 22 muestras del grupo de animales
negativos con la prueba del anillo, arrojaron lecturas superiores
a 0,20 en la prueba de ELISA. Mediante el seguimiento
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1
2
3
4
5
6
Fig. 4
Distribución comparativa de la población de individuos
sometidos a prueba, en función de la coincidencia de los
resultados entre la prueba inmunoenzimática (ELISA) y la
prueba del anillo, con respecto al punto de corte definido
serológico individual, la evaluación independiente del hato y la
detección del ADN del patógeno, se confirmó que estas 22
muestras eran positivas, estableciéndose la obtención de
resultados falsos negativos con la prueba del anillo, que
corresponden probablemente a fases tempranas de la infección
en que el nivel de anticuerpos en la leche es bajo. No fue
posible el seguimiento similar en muestras de cantina.
Detección directa de Brucella abortus
El aislamiento de Brucella sp. en las muestras procesadas a
partir de leche de animales con serología positiva y presencia de
anticuerpos en leche, no fue exitoso mediante los cultivos
convencionales. Sin embargo, la aplicación de PCR a las
mismas muestras permitió detectar 5 reacciones positivas en un
total de 15 leches procesadas. La Figura 5 presenta los
resultados de una sola de las muestras positivas amplificadas
inicialmente con los cebadores (ISP1, ISP2) y confirmada como
perteneciente al género 2308 con los cebadores diferenciales
(2308, RB51). Algunas muestras se preenriquecieron para la
iniciación del proceso de extracción.
Discusión
La vigilancia epidemiológica de tipo regional es la base para los
programas de erradicación de la brucelosis, sin embargo no se
discuten frecuentemente las investigaciones serias que tratan de
definir dónde, cuándo y por qué un programa no logra operar
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1. Estándar de peso molecular en escala de 100 pb
2. Control positivo Brucella abortus 2308 amplificada con cebadores
IS711, AB
3. Leche Molinos No. 5, amplificada con cebadores del género ISP1,
ISP2
4. Leche Molinos No. 5, amplificada con IS711, AB
5. Control positivo Brucella abortus 2308 amplificada con cebadores
IS711, AB
6. Control negativo
Fig. 5.
Electroforesis en gel de productos de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) que confirman la presencia de B. abortus
2308, en una muestra de leche procedente de un hato
clasificado positivo por serología y método inmunoenzimático
(ELISA) en leche
eficientemente (16). En ausencia de resultados de aislamiento
en cultivo, la infección por Brucella sp. tiene que inferirse a
partir de la serología, orientación ésta muy valiosa dada la
naturaleza contagiosa de la enfermedad. Es por ello que las
metodologías diagnósticas de apoyo a una campaña tienen gran
valor, siempre y cuando posean la mayor sensibilidad y
especificidad posibles para su aplicación estratégica durante las
diferentes fases de la misma (33).
A medida que la prevalencia de la brucelosis bovina disminuye,
el programa de vigilancia y el de erradicación dependerán
marcadamente de la capacidad de los métodos de detección
que operen a nivel de hato; en este caso, se requiere distinguir
eficientemente y a nivel poblacional aquellos hatos con
posibilidad de infección, por baja que ésta sea, ya que de otra
forma sería necesario analizar individualmente al ganado en
forma continua. El análisis en leche a nivel de hato representa
una ventaja económica importante (14).
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La prueba convencional del anillo en leche, aplicada a este tipo
de muestras, ha demostrado a través de los años, una serie de
ventajas sobre las pruebas serológicas y ha sido de gran utilidad
en países que han controlado o mantienen niveles muy bajos
de infección (17). Sin embargo, se ha notificado que los hatos
infectados pueden no ser detectados por esta prueba (al dar
resultados falsos negativos), si se omite de incluir la muestra de
leche o de crema, si la vaca infectada está en período seco en el
momento del muestreo, si no existe infección a nivel de ubre o
si la sensibilidad de la prueba es baja (25). Así mismo, pueden
contribuir a este falso resultado, el factor de dilución en
grandes hatos, la falla en la elevación de la crema en algunas
leches o la influencia de las inadecuadas condiciones de
almacenamiento o conservación de la muestra, sobre las
inmunoglobulinas (7, 13).
En los animales procedentes de hatos con mastitis, también es
posible obtener resultados falsos positivos (28), debidos a altos
niveles de este cuadro clínico en las fases iniciales o finales de
la lactancia o por el daño físico sobre la leche por procesos de
congelación; no obstante, este fenómeno no fue observado en
este muestreo.
En los últimos años, la prueba de ELISA indirecta, como la que
se ha utilizado en este estudio, ha permitido reducir las
limitaciones de sensibilidad de la prueba del anillo en leche, y
ha mostrado ser relativamente sencilla de realizar y aplicable
para una utilización masiva (36). Además, el empleo de
protocolos de ejecución y lectura automática de placas
mediante programas de computación (EDI) con análisis
integrado, permite un extensivo control de la calidad interna
de las pruebas y su fácil establecimiento en el trabajo de rutina.
En el presente trabajo, la reducción efectiva de la subjetividad
observada por otros autores en los resultados de la prueba del
anillo (13, 24) se hizo evidente cuando (Cuadro I) 99 muestras
sometidas a esta prueba no pudieron ser clasificadas
efectivamente hasta que se realizara la prueba de ELISA. Los
datos presentados en este estudio indican claramente que la
prueba de ELISA es más específica y sensible que la prueba
rápida del anillo en leche.
Actualmente, el uso continuo de la prueba de ELISA indirecta
en la vigilancia por sondeo de leches, ha demostrado eliminar
o reducir la incidencia en hatos lecheros infectados por debajo
del 1% (34) siempre y cuando se adopten las medidas
sanitarias recomendadas por la autoridad competente.
Las dificultades presentadas para el aislamiento de Brucella sp.
a partir de las muestras de leche confirman las experiencias
locales y las que varios autores han descrito a través del tiempo
(21, 32). Dado el objetivo principal del trabajo, los esfuerzos
del muestreo fueron orientados a favorecer la calidad de la
muestra para las pruebas del anillo y de ELISA, por lo tanto, a
pesar de emplearse medios específicos enriquecidos y
1071
selectivos para los intentos de aislamiento de Brucella sp., las
muestras solicitadas específicamente para este propósito
pudieron ser deficientes en su conservación (sellado en
aerobiosis, a 4°C), situación altamente desfavorable para los
requerimientos microaerofílicos de Brucella sp. (19); este efecto
es aún mayor cuando el microorganismo se presenta en bajas
concentraciones. Por otra parte, cuando se intentó incrementar
el número probable de bacterias por unidad de volumen, el
proceso de preenriquecimiento en caldo triptosa fosfato
evidenció el crecimiento masivo de microorganismos
diferentes, lo cual pudo limitar, o impedir, la viabilidad del
desarrollo de B. abortus en el medio específico. Es también
importante tener en cuenta que a pesar de los informes (4)
sobre la posibilidad de encontrar concentraciones de B. abortus
desde 104 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en la
leche de animales infectados, la presencia simultánea de
anticuerpos específicos o las condiciones propias de la leche
pueden contribuir a reducir la viabilidad requerida para un
aislamiento exitoso (2).
Otros autores describen aislamientos de B. abortus a partir de
muestras de animales que dan resultados positivos a la prueba
del anillo hasta diluciones 1:8 (28). Desafortunadamente en
nuestro caso, ninguna de las pruebas de anillo realizadas
detectó positividad en diluciones a partir de leche cruda, lo
cual puede interpretarse como señal de ausencia de bacterias
viables en las muestras.
No obstante la incapacidad de recuperar la bacteria viable, fue
posible detectar el ADN específico de B. abortus mediante PCR
en algunas de las muestras de hatos con infección
diagnosticada previamente por la prueba serológica de ELISA
competitiva (23).
En nuestro caso, el proceso empleado para la extracción del
ácido nucleico optimizó la capacidad detectora y evidenció las
secuencias específicas en leche cruda, ya que se ha descrito en
concentraciones hasta de 2,8 × 102 UFC/ml de Brucella sp.
(30). A pesar del carácter preliminar de estos resultados, es
importante destacar en este caso la detección en leche de
secuencias específicas de B. abortus (Fig. 5), comunes tanto a la
cepa patógena 2308 como a cepas vacunales. Debido a
situaciones de campo específicas de la zona estudiada, las
muestras fueron sometidas además (datos no mostrados) a una
clasificación posterior, empleando cebadores diferenciales
entre B. abortus 2308/RB51 y cepa-19 (6, 35) que confirmaron
la presencia de la cepa patógena. Lo anterior demanda estudios
detallados sobre el empleo de esquemas de vacunación bajo las
normas reglamentarias, además de su capacidad
inmunogénica.
El uso de la PCR para el diagnóstico de la brucelosis facilitará
la detección del patógeno, complementará los estudios,
inmunológicos y epidemiológicos, además de apoyar, en el
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1072
caso de los bovinos, la erradicación de la enfermedad
emprendida por los programas nacionales de sanidad animal.
Las normas relativas a los intercambios internacionales
establecidas a nivel mundial tienden a reemplazar las barreras
arancelarias por barreras sanitarias y de calidad, que imponen
cuatro criterios o parámetros tanto para la leche cruda como
para los productos derivados; éstos son: cantidad mínima de
microorganismos saprófitos, ausencia de microorganismos
patógenos, concentraciones permitidas de residuos y
concentraciones permitidas de contaminantes (3). Por
consiguiente el uso de metodologías seguras es una prioridad,
para avanzar en la entrega de productos alimenticios que
cumplan con los estándares y que sean aplicables desde la
primera fase de la cadena de producción, de manera que los
hatos sean declarados libres de infecciones.
El consumo de leche y productos lácteos de mala calidad puede
generar diferentes tipos de enfermedades zoonóticas, por lo que
la salud animal afecta directamente a la salud pública. La leche
desde el sitio de producción hasta el consumo, puede sufrir
contaminaciones y los agentes patógenos como B. abortus
presentes en ella pueden transmitirse por varios mecanismos al
ser humano, ya sea por consumo directo o de sus derivados o
por ingestión de otros productos contaminados. La leche a su
vez puede contaminarse con agentes patógenos presentes en el
organismo del animal o agregados durante el proceso de
transformación del producto. Afortunadamente la tecnología
en producción de alimentos ha progresado en los últimos años
y enfoques como el sistema de análisis de riesgos y control de
puntos críticos (sistema HACCP) brindan una gran ayuda (10).
Lo anterior, requiere de metodologías óptimas para la
conservación de alimentos sanos, la realización oportuna de
diagnósticos que permitan establecer medidas de control y
corrección, el monitoreo y la evaluación del estado sanitario de
los sitios de producción, lo que redunda en mayor eficacia. Es
por ello que para asegurar la calidad de los alimentos debe
estimularse al productor a entregar un producto que cumpla
con todas las normas exigidas que son hoy día respaldadas por
diferentes entidades o empresas que promueven este sistema de
control de calidad (3, 10).
El muestreo correspondiente a 200 hatos de 35 municipios
permitió evaluar las metodologías y proporcionar una
aproximación a la situación de las áreas muestreadas, indicando
una positividad por encima de la esperada (Cuadro IV). Con los
valores de prevalencia obtenidos, se realizaron los cálculos para
la definición del valor predictivo de positivos y negativos. Los
valores de sensibilidad y especificidad encontrados para la
prueba ELISA indirecta en leche de hatos del departamento
colombiano de Cundinamarca son comparables a los definidos
por Nielsen y col. (24) en estudios realizados en Canadá.
Resultados con valores mayores han sido publicados, pero las
diferencias pueden explicarse por el tamaño de la muestra
sometida a prueba. Vanzini y col. (34) obtuvieron para ELISA
en leche, una sensibilidad del 99,6% y una especificidad del
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Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 22 (3)
99,1%, valores bastante altos que podrían ser alcanzados en
estudios más completos y con mejor definición de la población
positiva, y que apoyan la inclusión de la ELISA en leche como
prueba de criba en programas de vigilancia epidemiológica y de
control de la enfermedad.
Conclusiones
La metodología de ELISA indirecta para leche bovina fue
exitosamente establecida y evaluada para ser utilizada como
una herramienta diagnóstica de la brucelosis bovina.
Los valores de sensibilidad y especificidad diagnósticas
obtenidos en la evaluación de la población total estudiada son
comparables a los que se han observado en otras latitudes, lo
cual unido a la confiabilidad y objetividad de resultados,
permite recomendarla como reemplazo de la prueba rápida de
anillo en leche.
Las ventajas de la metodología descrita son las siguientes:
– la obtención de la muestra no es invasiva, lo que evita la
transmisión de infecciones;
– la conservación de la muestra no es crítica, puesto que no se
requieren preservantes y que la muestra puede ser congelada
hasta su procesamiento;
– la reducción de costos, al ser factible efectuar numerosas
pruebas por día, en promedio 200 muestras;
– la posibilidad de una determinación objetiva basada en
resultados numéricos para un estricto control de calidad.
Los valores de positividad obtenidos con la prueba de ELISA
indirecta sugieren que la infección por B. abortus en hatos de la
zona de estudio continúa alcanzando niveles que demandan la
ejecución inmediata de los programas de control.
El diagnóstico definitivo de brucelosis pudo complementarse
mediante la utilización de otras metodologías (ADN, PCR); una
vez estandarizada y validada, esta última compensará las
limitaciones asociadas al proceso de aislamiento del
microorganismo.
Agradecimientos
El presente trabajo se realizó dentro del marco del Proyecto de
Cooperación Técnica COL/05/019 auspiciado por el
Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA) y gracias
a las enseñanzas y aporte de reactivos de referencia brindados
por los Doctores K. Nielsen y G.G. Schurig, integrantes de la
Red latinoamericana de brucelosis de la Universidad de las
Naciones Unidas.
■
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Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 22 (3)
Comparative evaluation of the indirect enzyme-linked
immunosorbant assay in milk for the detection of cattle infected
with Brucella abortus, in herds located in the province of
Cundinamarca, Colombia
D.Y. Rivera A., O.E. Rueda, C.P. Calderon, O.C. Mariño J., D. Gall
& K. Nielsen
Summary
To perform a comparative evaluation of the indirect enzyme-linked
immunosorbent assay (iELISA) in milk, for the detection of Brucella abortus in
cattle, 1,523 milk samples were taken from individual animals and bulk milk
belonging to 200 herds in the province of Cundinamarca, Colombia. All these
herds were part of the official programme of monitoring free herds and
determining herd prevalence in the province. The samples were submitted
simultaneously to the milk ring test and the iELISA. A total of 584 individual and
497 bulk milk samples taken from free herds were considered negative, and
served to determine the initial ELISA cut-off point. An optimised determination of
the cut-off point involved an operational analysis, using a statistical programme.
In the analysis, the total population was considered: 756 individual positive and
negative samples, as defined by herd history and previously established
serologies. The cut-off point was set at > 0.20 optical density units, which,
expressed in percentage positivity, corresponded to 20.5% against the controls,
with a sensitivity of 95.3%, a specificity of 95.1%, and a confidence interval of 95%.
Indirect confirmation of the state of infection was made with competitive ELISA in
the serum of the individual animals considered positive, and an attempt was made
to determine bacterial presence by isolation in culture and by reverse
transcription-polymerase chain reaction. The results confirm that the indirect
ELISA is highly sensitive and specific, provides confirmed results in strict qualitycontrol conditions, and may be used to test a large number of herd or individual
samples, thus enhancing the efficiency of surveillance programmes and control
campaigns.
Keywords
Brucella abortus – Brucellosis – Cut-off point – Enzyme-linked immunosorbent assay –
Milk – Milk ring test – Reverse transcription-polymerase chain reaction – Sensitivity –
Specificity.
■
Évaluation comparative de la méthode immuno-enzymatique
indirecte sur lait pour la détection des bovins infectés par Brucella
abortus, dans des cheptels du département de Cundinamarca,
Colombie
D.Y. Rivera A., O.E. Rueda, C.P. Calderon, O.C. Mariño J., D. Gall
& K. Nielsen
Résumé
En vue d’une évaluation comparative de la méthode immuno-enzymatique
indirecte (iELISA) sur le lait pour la détection de bovins infectés par Brucella
abortus, on a prélevé 1 523 échantillons de lait en vrac et d’animaux individuels,
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Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 22 (3)
participant au « Programme de troupeaux exempts et détermination de la
prévalence par troupeau du département de Cundinamarca, Colombie ». Les
épreuves de l’anneau et iELISA ont été pratiquées simultanément sur les
échantillons. Cinq cent-quatre-vingt quatre échantillons de lait individuel et 497
échantillons de lait en vrac provenant de troupeaux indemnes et considérés
comme négatifs ont été utilisés pour déterminer la valeur limite initiale dans les
épreuves ELISA. Un programme statistique a permis d’obtenir une détermination
optimale de la valeur limite. L’ensemble de la population a été pris en compte
dans l’analyse, soit 756 échantillons positifs et négatifs définis sur la base des
antécédents du troupeau et des sérologies antérieures. La limite a été fixée à
plus de 0,20 unités de densité optique qui, exprimée en pourcentage de positivité,
correspond à 20,5 % par rapport aux témoins, avec une sensibilité de 95,3 %, une
spécificité de 95,1 % et un intervalle de confiance de 95 %. L’état infectieux a été
confirmé indirectement par la méthode ELISA de compétition pratiquée sur le
sérum des animaux considérés comme positifs. Une tentative de dépistage de la
bactérie a été réalisée par isolement sur culture et transcription inverse et
amplification en chaîne par polymérase. Les résultats ont confirmé que l’épreuve
ELISA indirecte était très sensible et spécifique. Elle permet de valider des
résultats dans des conditions de contrôle de la qualité et se prête à l’analyse d’un
nombre élevé d’échantillons de lait individuel ou de lait en vrac ; elle contribue
de ce fait à renforcer l’efficacité des programmes de surveillance et les
campagnes de contrôle de la maladie.
Mots-clés
Brucella abortus – Brucellose – Épreuve de l’anneau – Épreuve immuno-enzymatique –
Lait – Sensibilité – Spécificité – Transcription inverse-amplification en chaîne par
polymérase – Valeur limite.
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