ADITIVOS ENZIMATICOS PARA PIENSOS DE RUMIANTES

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A23K 1/165
11 Número de publicación:
7
51
ESPAÑA
k
2 137 903
A23K 1/18
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 96920670.5
kFecha de presentación: 05.07.1996
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 841 859
kFecha de publicación de la solicitud: 20.05.1998
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Aditivos enzimáticos para piensos de rumiantes.
k
73 Titular/es: Her Majesty The Queen in Right
k
72 Inventor/es: Beauchemin, Karen A.;
k
74 Agente: Sugrañes Moliné, Pedro
30 Prioridad: 05.07.1995 US 497913
of Canada, representend by Department of
Agriculture and Agri-Food Canada
Lethbridge Research Station,
P.O. Box 3000, Main
Lethbridge, Alberta T1J 4B1, CA
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.04.2002
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 137 903 T3
16.04.2002
Aviso:
k
k
Rode, Lyle y
Sewalt, Vincent J. H.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 137 903 T3
DESCRIPCION
Aditivos enzimáticos para piensos de rumiantes.
5
Sector técnico de la invención
Esta invención se refiere a composiciones alimenticias para rumiantes que contienen xilanasa y celulasa.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Antecedentes de la invención
Los forrajes de leguminosas y los alimentos de granos son piensos habituales para animales rumiantes.
Aunque tanto los forrajes de leguminosas como los alimentos de granos contienen un mayor componente de
materia digerible que los forrajes de hierba, tanto los forrajes de leguminosas como los alimentos de granos
contienen una fracción significativa parcialmente digerible o difı́cil de digerir, constituida principalmente
por paredes celulares vegetales. El componente de pared celular del pienso se describe frecuentemente
como la fracción de fibra total.
Los forrajes de leguminosas contienen hasta un 40 % de fibra total. El componente de fibra total de
los alimentos de granos llega a ser generalmente hasta el 20 % de la materia seca total del pienso (Van
Soest, 1982). El resto de la materia seca del pienso está constituido principalmente por hidratos de carbono no estructurales que son fácilmente digeribles por los rumiantes. Tanto en los alimentos de granos
como en los forrajes de leguminosas, el componente de hidratos de carbono no estructurales del alimento
es digerible o convertible en energı́a entre en un 90 y un 100 % dando como resultado el crecimiento
del animal. En los alimentos de granos el componente de fibra total es digerible sólo aproximadamente
en un 25 % mientras que en los alimentos de leguminosas, el componente de fibra total es digerible en
aproximadamente un 40 % (Van Soest, 1982).
La pared celular, o la fracción de fibra total de los forrajes de leguminosas o los alimentos de granos
es principalmente celulosa, hemicelulosa y lignina que son resistentes a la degradación. Aunque los rumiantes no secretan por sı́ mismos enzimas capaces de digerir estas sustancias, las bacterias y los hongos
en el rumen producen enzimas capaces de degradar las sustancias de las paredes celulares. El alcance de
la digestión ruminal de la fibra es variable y depende del tipo de pienso y de la actividad fibrolı́tica de los
microorganismos ruminales. Los componentes de celulosa y hemicelulosa de la fibra total de los forrajes
de leguminosas y de los alimentos de granos son digeribles por la celulasa y la xilanasa producidas por
las bacterias ruminales. La digestibilidad de la hemicelulosa y la celulosa depende, entre otras cosas, del
grado y la naturaleza de la asociación de la hemicelulosa y la celulosa a las ligninas no digeribles. La
celulasa y la xilanasa solubilizan la celulosa y la hemicelulosa en azúcares que a su vez son metabolizados
por las bacterias del rumen en los ácidos grasos volátiles que el animal rumiante puede utilizar como
fuente de energı́a directa. En el caso de forrajes con un alto contenido de fibra, menos de la mitad
del forraje puede ser digerido y la parte no digerida es excretada. Esta situación da como resultado la
producción de grandes cantidades de estiércol.
Las mejoras en la digestibilidad de los alimentos son deseables ya que dan como resultado un crecimiento más rápido del animal y una reducción en la producción de estiércol. Debido a que la fracción
de hidratos de carbono no estructurales de los forrajes de leguminosas y los alimentos de granos ya es
altamente digerible, existe poco margen para realizar mejoras. Por esta razón las mejores oportunidades
de mejorar la digestibilidad de los alimentos se obtendrán a partir del aumento de la digestibilidad de
la fracción de fibra total menos digerible. Actualmente no existen aditivos alimenticios autorizados que
aumenten la digestibilidad de los alimentos fibrosos para rumiantes.
El suministro al rumen de enzimas capaces de degradar los materiales de las paredes celulares vegetales
constituye un problema complicado debido al entorno ruminal altamente proteolı́tico. Si a los piensos se
les aplican simplemente enzimas fibrolı́ticas tales como celulasa y xilanasa, que son ellas mismas proteı́nas,
las enzimas fibrolı́ticas son digeridas rápidamente en el rumen antes de que puedan aumentar la digestión
de la fibra del pienso ingerido (Chesson, 1994, McAllister y otros, 1994). También es improbable que la
adición directa de enzimas fibrolı́ticas al entorno ruminal produzca ventajas ya que el rumen contiene
bacterias, hongos y protozoos que producen la celulasa y la xilanasa más activas de cuya existencia se
tiene conocimiento en cualquier entorno (Gilbert, 1992). Por esta razón la obtención de cualquier ventaja
por dar enzimas fibrolı́ticas a rumiantes solo se esperarı́a cuando se utilizasen niveles extremadamente
altos de enzimas. Solo con un nivel de enzimas muy alto la pequeña proporción de enzimas añadidas que
no fueron rápidamente hidrolizadas serı́a suficiente para aumentar la actividad fibrolı́tica que se produce
naturalmente dentro del rumen. Dicho enfoque resultarı́a poco práctico y antieconómico.
2
ES 2 137 903 T3
5
10
15
20
La predigestión de forrajes con enzimas se ha utilizado como técnica para preservar y mejorar el valor
nutritivo del forraje durante el ensilaje. La Solicitud PCT No. PCT/FI91/00118 (SSV-Development OY,
registrada el 18 de Abril de 1991) describe la adición de una o más enzimas fibrolı́ticas seleccionadas
de entre el grupo formado por pectinasa, celulasa, xilanasa, amilasa, arabinosidasa, cutinasa, lipasa y
esterasa para humedecer la hierba (contenido de humedad del 50-75 %) en el momento del ensilaje. Esta
operación da como resultado la predigestión de la pared celular vegetal y la consecuente mejora de la
capacidad de producción de ácido de las bacterias del ácido láctico. El pH del forraje se mantiene en
unos valores por debajo de 4 a 4,5, excluyendo el crecimiento de especies bacterianas perjudiciales. De
forma similar, la Solicitud de Patente Alemana No. DD296407 A5 describe la aplicación de una mezcla
de enzimas fibrolı́ticas a la hierba fresca en el momento del ensilaje. La Patente Japonesa N◦ . 6,075,238
da a conocer la adición de una enzima/inoculante microbiano a alimentos que poseen un alto contenido
de humedad almacenados en un envase al vacı́o para posibilitar la fermentación microbiana.
La predigestión de piensos no es deseable debido al alto contenido de humedad (mayor que el 30 %) del
alimento requerido para permitir una actividad enzimática. Los alimentos húmedos son inherentemente
inestables ya que tienen tendencia a la contaminación y a la degradación por el crecimiento de moho. El
aumento de peso del alimento debido al alto contenido de humedad hace que el transporte resulte poco
práctico y el exceso de humedad puede requerir un secado adicional del alimento antes del procesado.
Estas limitaciones hacen que la predigestión del alimento no sea una forma deseable de enfocar el aumento
de la digestibilidad de los alimentos. Serı́a ventajoso aumentar la digestibilidad de los piensos a la vez
que se mantiene el alimento con un contenido bajo de humedad.
25
También se conocen técnicas para proteger las enzimas de la inactivación gástrica o ruminal. La
Patente Canadiense No. 1,322,159 (Ying, publicada el 14 de Septiembre de 1993) da a conocer el recubrimiento y el encapsulado de enzimas con un polı́mero insoluble en ácido para permitir el paso de enzimas
a través del rumen. De forma similar, la Patente U.S. No. 3,492,398 (Marco y otros, publicada el 27 de
Enero de 1970) da a conocer un recubrimiento de resina de aminopoliamida.
30
Para tratar el sı́ndrome de malabsorción en las aves de corral se ha utilizado un aditivo alimenticio de celulasa/xilanasa obtenido a partir de cepas seleccionadas de hongos (Solicitud PCT No.
PCT/DK90/00256 (Novo Nordisk A/S, registrada el 5 de Octubre de 1990)).
35
40
45
50
55
60
Se han realizado intentos, con un éxito limitado, para aumentar la digestibilidad de los piensos para
rumiantes mediante la adición de enzimas fibrolı́ticas directamente al pienso o en forma de un complemento enzimático dado como alimento junto con el pienso. La mayorı́a de los complementos descritos en
la técnica anterior requieren una serie de etapas de procesado, entre las que se incluyen la humectación
del alimento, el tratamiento térmico, el secado, y la adición de otros aditivos y agentes estabilizantes. La
Solicitud de Patente Europea No. 88105409.2 (Suomen Sokeri Oy, registrada el 4 de Abril de 1988) describe la adición de un complemento enzimático no revelado a un alimento para ganado con un contenido
de humedad entre el 15 y el 60 % seguida por un tratamiento combinado hidrotérmico y enzimático a una
temperatura por debajo de los 100◦C. A continuación el material alimenticio se seca para estabilizar las
enzimas y mejorar la calidad de almacenamiento del material alimenticio.
La Patente U.S. No. 5,314,692 (Haarasilta y otros, publicada el 24 de Mayo de 1994) describe una
premezcla de enzimas termoestable que contiene entre un 1 y un 60 % del total de enzimas seleccionadas
de entre el grupo que comprende amilasas, celulasa, hemicelulasa, glucanasas, lipasas, proteinasas, y
similares, y entre un 40 y un 99 % de harina u otro almidón. La premezcla de enzimas está formada en
pellets y diseñada para mezclarse con otros alimentos en concentraciones de entre un 0,01 y un 0,05 %. La
premezcla de enzimas es térmicamente estable y no presenta una degradación significativa de las enzimas
a temperaturas de procesado de los alimentos.
La Solicitud de Patente U.K. No. 2,261,877 (Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., registrada el 18 de Noviembre de 1992) describe un aditivo alimenticio concentrado para animales que contiene una enzima de
destrucción del tejido vegetal y por lo menos un aminoácido esencial, eficaz para aumentar el rendimiento
lácteo, mejorar la calidad de la leche, promover el crecimiento, mejorar la calidad de la carne, y elevar el
rendimiento de la crianza.
La Solicitud de Patente Alemana No. DD296407 A5 describe un proceso para el crecimiento de cepas
especı́ficas de la especie Penecillium de hongos sobre un sustrato de grano triticale. El proceso implica la
prehidólisis a temperaturas entre 15 y 60◦C con un contenido de humedad mayor que el 25 %. El complejo
enzimático resultante contiene celulasa, hemicelulasa, amilasa, pectinasa, proteasa y β-1,4 glucanasa. El
material se tritura para proporcionar un complemento alimenticio.
3
ES 2 137 903 T3
5
10
15
20
Feng y otros (1992, No. 1) J. Anim. Sci., 70, supl. 1, resumen 678 demostraron que la aplicación de
un “nivel alto” no especificado de una mezcla enzimática que contenı́a celulasa, xilanasa y hemicelulasa
a un forraje seco de hierba madura hacı́a que aumentara la digestibilidad in vitro de la materia seca
(DM) y de la fibra neutro detergente (NDF) en un 12 y un 20 por ciento, respectivamente. Un nivel
“inferior” de celulasa y hemicelulasa hacı́a que aumentara la digestibilidad in vitro de la materia DM
en un 8 por ciento. Se midió la digestibilidad de la DM y la NDF in situ pero no se informó sobre los
resultados, presumiblemente porque no se observó ningún efecto. La referencia ilustra que se requirió
una combinación de tres clases de enzimas con un nivel “alto” para mejorar la digestibilidad del heno
seco de hierba madura. Las enzimas se añadieron inmediatamente antes de los estudios de la digestión
in vitro e in situ.
Feng y otros (1992, No. 2) J. Anim. Sci. 70, supl. 1, resumen 679 da a conocer la aplicación de una
mezcla enzimática comercial que contiene celulasa, hemicelulasa y xilanasa a heno seco de hierba madura
inmediatamente antes de darlo como alimento. A través de comunicaciones personales con los autores, los
inventores han determinado que la mezcla enzimática utilizada fue un producto comercial denominado
Grass-Zyme que, además de celulasa, hemicelulasa y xilanasa, incluye otras clases de enzimas tales como
glucosa oxidasa y amilasa. Este tratamiento previo hizo que aumentará el consumo de DM de heno
en un 12 % con respecto al heno no tratado. La digestibilidad de la DM y la NDF se mejoró también
mediante el tratamiento previo de las enzimas. La velocidad de la digestión de la NDF in situ se aumentó
mediante el tratamiento previo del heno seco con la mezcla enzimática inmediatamente antes de darlo
como alimento. Cuando el heno no tratado se incubó in situ en el rumen de novillos que consumieron
el heno tratado previamente, no se observó ninguna ventaja. Estos resultados sugieren en lugar de un
aumento de la actividad enzimática ruminal el tratamiento previo de las enzimas dio como resultado una
digestión parcial del heno de hierba antes de la ingestión.
25
El documento WO-A-9201389 se refiere a la complementación de pienso que va a ser ensilado con
endoxilanasa para producir una materia ensilada con un aumento de hidratos de carbono solubles en
agua para ser utilizados por las bacterias del ácido láctico o como nutrientes para animales que ingieran
la materia ensilada. Se describe también la utilización de celulasa.
30
35
40
A la vista de la técnica anterior, está claro que continúa existiendo una necesidad de un complemento
enzimático para mejorar la digestibilidad de alimentos de granos y leguminosas para rumiantes. Dicho
complemento deberı́a ser fácil de aplicar a los alimentos, y no deberı́a requerir unas etapas de procesado
complejas, costosas o que consuman mucho tiempo. Idealmente, dicho aditivo se podrı́a añadir al alimento bien en un momento próximo al momento de dar el alimento, o bien en algún momento anterior,
para permitir el procesado del alimento en formas comercialmente aceptables. De este modo dicho complemento no deberı́a predigerir o hidrolizar el alimento, sino formar un complejo estable con el alimento,
permitiendo la preservación y el almacenamiento de la composición alimenticia. El complemento deberı́a
optimizar la digestibilidad del forraje con unos niveles bajos o moderados de enzimas de manera que
resulte práctico y económico.
Resumen de la invención
45
50
55
60
Los inventores han descubierto que cuando se utilizan relaciones y niveles de actividad especı́ficos de
enzimas degradantes de fibra, a saber enzimas de celulasa y xilanasa, para tratar forrajes de leguminosas
o alimentos de granos (material alimenticio) con un método descubierto por los inventores, se obtienen
como resultado unos aumentos sorprendentes en la digestibilidad del material alimenticio y el crecimiento
del animal. Cuando se utilizan cantidades de enzimas comprendidas entre ciertos márgenes preferidos se
consiguen resultados superiores que si se aplican cantidades excesivas de enzimas. Se ha demostrado un
efecto sinérgico inesperado entre las actividades de la xilanasa y la celulasa al mejorar la digestibilidad
del material alimenticio y el crecimiento del animal ya que las mejoras en la digestibilidad del material
alimenticio y el crecimiento del animal resultantes de la aplicación de las composiciones enzimáticas de la
presente invención son mayores que la mejora sencilla del aditivo de xilanasa y celulasa aplicado de forma
separada. Los resultados sinérgicos, superiores, no se observan cuando la mezcla enzimática de la presente
invención se aplica al material alimenticio con un método diferente al correspondiente descubierto por los
inventores.
La presente invención proporciona un método de producción de una composición alimenticia mediante
la aplicación de enzimas que degradan la fibra a materiales alimenticios secos, procesados o no, de manera
que se produce una composición alimenticia estable para rumiantes según se define en las reivindicaciones
11 a 17. Este método mejora la digestibilidad de los materiales alimenticios cuando se dan como alimento
a rumiantes. La invención abarca complementos enzimáticos que contienen mezclas especı́ficas de enzi4
ES 2 137 903 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
mas que degradan la fibra según se define en las reivindicaciones 1 a 5 y composiciones alimenticias que
contienen un material alimenticio y una mezcla de enzimas según se define en las reivindicaciones 6 a 10.
Tal como se utiliza en el presente documento “rumiantes” incluye ganado bovino, ovejas, cabras, ciervos,
bisontes, búfalos de agua y camellos. El aumento de la digestibilidad del material alimenticio da como
resultado un aumento del rendimiento animal caracterizado por una mejora en la velocidad del aumento
de peso y el rendimiento lácteo, una conversión más eficaz de la energı́a de los alimentos en carne o leche,
menos alimento requerido para mantener el mismo nivel de productividad, un mayor consumo alimenticio
ingerido por los animales que requieren un mayor consumo de energı́a, una disminución de la necesidad
de fuentes de energı́a complementarias tales como granos y grasas, y una reducción de la producción de
estiércol.
En una realización preferida, las enzimas de la presente invención se disuelven en solución acuosa y
se aplican al material alimenticio seco en el momento del procesado del alimento. Las enzimas se pueden
aplicar como soluciones separadas o se pueden aplicar como una única solución que contenga una mezcla de enzimas. Preferentemente, la solución acuosa es un tampón débil que posee un pH comprendido
entre 4,5 y 7,0. La solución enzimática acuosa se aplica al material alimenticio para recubrir dicho material alimenticio y para proporcionar una distribución uniforme de la solución acuosa sobre el material
alimenticio. Tı́picamente, la solución enzimática se pulverizará sobre el material alimenticio mientras
que el material alimenticio se mezcla simultáneamente para promover una distribución uniforme de la
solución enzimática. Las enzimas no hidrolizan o predigieren el material alimenticio sino que se adhieren
al material alimenticio, formando un complejo enzimático/alimenticio estable (composición alimenticia).
Las enzimas solo se adherirán al material alimenticio si dicho material alimenticio está suficientemente
seco para permitir una absorción sustancial de la solución acuosa que contiene las enzimas disueltas en
el material alimenticio. Se ha determinado que para que se produzca una absorción adecuada el material
alimenticio deberı́a poseer un contenido de humedad no mayor que el 15 % (p/p). La humedad ocupa
espacio en los piensos. Cuando la humedad se evapora, en el pienso se forman poros en los cuales se
absorben los complementos alimenticios de la presente invención, ocupando de este modo el lugar de la
humedad evaporada. Si el contenido de humedad del pienso está sustancialmente por encima del 15 %, el
complemento enzimático no será absorbido en el pienso. Además, si el contenido de humedad del pienso
se mantiene por encima de aproximadamente el 18-20 %, es susceptible de verse perjudicado por el moho.
Los forrajes de leguminosas o alimentos de granos secados en el campo poseen tı́picamente contenidos de
humedad de aproximadamente el 12 %. La absorción de la solución enzimática acuosa y la formación del
complejo enzimático/alimenticio estable requiere la incubación del material alimenticio con la solución
enzimática acuosa a temperaturas comprendidas entre 5 y 80◦ C durante por lo menos 3 horas, más
preferentemente por lo menos 8 horas. El complejo enzimático/alimenticio resultante es estable durante
hasta por lo menos un año. El material alimenticio se puede procesar antes o después del tratamiento
mediante un proceso de aplastado, picado, templado, triturado mecánico, triturado por aplastamiento,
hinchado, extrusión, micronizado, tostado, formación de copos, cocción o hinchado mediante vapor, o se
puede procesar después del tratamiento de formación de pellets, prensado o empacado. Los materiales
alimenticios incluyen henos de leguminosas, rastrojos y granos cereales.
El complemento enzimático incluye celulasa y xilanasa en determinadas relaciones y concentraciones.
También puede incluir pectinasas, esterasas, arabinosidasas y β-1,3 glucanasas, pero no requiere proteasas, lipasas o amilasas. La celulasa y la xilanasa pueden consistir en cualquier celulasa y xilanasa de
amplio espectro, preferentemente de fuentes microbianas, aplicadas con niveles de actividad estandarizados. La actividad de la celulasa se estandariza sobre la base de la degradación del papel de filtro,
expresada en unidades de papel de filtro (FPU) de actividad (µmoles de glucosa producidos a partir del
papel de filtro por unidad de enzima por minuto). La actividad de la xilanasa se basa en la hidrólisis del
xilano de espelta avena en xilosa y se expresa en unidades internacionales (IU) (µmoles de azúcares reductores producidos por unidad de enzima por ml por minuto). Los ensayos para determinar la actividad
de la celulasa y la xilanasa se exponen en los Ejemplo 6, 7 y 8. Tal como se ha descrito anteriormente, la
actividad de la celulasa se refiere a las exocelulasas, y se mide en unidades FPU. Las endocelulasas, que
también pueden ser adecuadas para ser utilizadas como celulasas según la presente invención, se miden
en unidades IU tal como se expone en el Ejemplo 7. 25 IU de actividad de endocelulasa es equivalente a
1 FPU de actividad de exocelulasa.
Los inventores descubrieron que el aumento de la digestión de la fibra y del rendimiento del animal
depende tanto de la cantidad total de enzimas añadidas al material alimenticio (expresada como la actividad enzimática total por Kg de materia seca alimenticia) como de la proporción relativa de celulasa
con respecto a la xilanasa. Se observó que la relación entre la concentración enzimática y la respuesta
del animal era no lineal y diferente para los forrajes de leguminosas y los alimentos de granos. Para los
forrajes de leguminosas, tales como el heno de alfalfa, una concentración enzimática comprendida entre
5
ES 2 137 903 T3
5
10
15
20
25
30
35
16 y 120 más preferentemente entre 18 y 72 FPU de celulasa y entre 800 y 6000 más preferentemente
900 y 3600 IU de xilanasa por Kg de materia seca alimenticia aumenta al máximo el rendimiento. Para
alimentos de granos, el rendimiento máximo de los animales se obtiene con concentraciones enzimáticas
comprendidas entre 10 y 200, y más preferentemente entre 40 y 160 FPU de celulasa y entre 500 y 10.000
y más preferentemente entre 2000 y 8000 IU de xilanasa por Kg de materia seca alimenticia. Tanto para
los forrajes de leguminosas como para los alimentos de granos, la relación de la actividad de la celulasa
con respecto a la actividad de la xilanasa está comprendida preferentemente entre 2 y 5 FPU de celulasa
por 100 IU de xilanasa.
En relación con otro amplio aspecto, esta invención abarca composiciones alimenticias especı́ficas para
rumiantes. En lı́neas generales, las composiciones alimenticias consisten en un material alimenticio con un
bajo contenido de humedad asociado ı́ntimamente a una mezcla de celulasa y xilanasa para proporcionar
un complejo alimenticio/enzimático estable. En una realización preferida, la composición alimenticia es
un complejo enzimático/alimenticio estable en el cual las enzimas proporcionan entre 60 y 120, más preferentemente entre 18 y 72, FPU de actividad de celulasa y entre 800 y 6.000, más preferentemente entre
900 y 3600 IU de actividad de xilanasa por Kg de material alimenticio, y en el cual el material alimenticio
es un forraje de leguminosas seco. En otra realización preferida, la composición alimenticia es un complejo
enzimático/alimenticio estable en el cual las enzimas proporcionan entre 10 y 200, y más preferentemente
entre 40 y 160 FPU de actividad de celulasa y entre 500 y 10.000, y más preferentemente entre 2000 y
8000 IU de actividad de xilanasa por Kg de material alimenticio, y en el cual el material alimenticio es
un alimento de granos seco. Estas composiciones alimenticias se pueden presentar en forma prensada, de
pellets, picada, empacada, aplastada, templada, triturada mecánicamente, triturada por aplastamiento,
hinchada, en extrusión, micronizada, tostada, en copos, cocida o hinchada mediante vapor.
Todavı́a en otra realización, la invención proporciona un complemento enzimático para ser utilizado
en los métodos y las composiciones alimenticias anteriormente mencionados. El complemento enzimático
es una mezcla de celulasa y xilanasa en la que las enzimas se incluyen en cantidades tales que la relación
de la actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa está comprendida entre 2 y 5 FPU
de celulasa por 100 IU de xilanasa. El complemento enzimático se puede disolver en una solución acuosa
para su aplicación a materiales alimenticios. Preferentemente la solución acuosa es un tampón débil con
un pH comprendido entre 4,5 y 7,0.
Sin limitarse al mismo, los inventores creen que el mecanismo mediante el cual la presente invención
provoca una relación sinérgica entre la xilanasa y la celulasa suministradas en los complementos enzimáticos no se obtiene como resultado de la simple actividad fibrolı́tica de dichas enzimas. Las mejoras
en la relación de conversión del alimento (consumo de materia seca (DMI)/aumento de peso medio diario
(ADG)) demostradas en los Ejemplos en el presente documento eran demasiado grandes con respecto a
las cantidades proporcionalmente pequeñas de fibra total contenidas en los forrajes de leguminosas y los
alimentos de granos como para atribuirlas a los bajos niveles de la actividad enzimática aplicada.
40
45
50
55
60
Se podrı́an esperar mejoras en la digestibilidad del alimento si a los forrajes de hierba se les aplicasen
niveles enzimáticos altos (como en las referencias de Feng y otros). Los henos de hierba tales como los
correspondientes probados por Feng y otros son superiores en cuanto a la fibra total a los forrajes de
leguminosas o los alimentos de granos. Aproximadamente el 50 % de la fibra total en los henos de hierba
es hemicelulosa (es decir xilano). El 50 % restante de la fibra total es lignina y celulosa (van Soest, 1982).
Por ejemplo, el heno de fleo de los prados curado al sol (Referencia Internacional No. 1-04-885) contiene
un 70 % de fibra total que comprende un 29 % de hemicelulosa y un 34 % de celulosa (National Research
Council, 1982).
Tal como se ha expuesto anteriormente, la composición de fibra de los forrajes de leguminosas y los
alimentos de granos es diferente con respecto a la correspondiente de los henos de hierba. Los forrajes
de leguminosas tales como la alfalfa (Referencia Internacional No. 1-00-068) contienen un 50 % de fibra
total, constituida por un 11 % de hemicelulosa y un 28 % de celulosa. Como los forrajes de leguminosas
contienen proporcionalmente menos hemicelulosa que los henos de hierba, no se espera que el suministro
de celulasa y xilanasa a un forraje de leguminosas mejore significativamente la digestibilidad del forraje
o la velocidad de crecimiento en los rumiantes.
De forma similar, los alimentos de granos tales como la cebada (Referencia Internacional No. 400-549) contienen cantidades relativamente pequeñas de fibra (un 19 % de fibra total del cual el 5 % es
hemicelulosa) y son digeridos muy rápidamente en el rumen. No se esperarı́a que los rumiantes que
consumen dietas con un alto contenido de alimentos de granos obtuvieran ventajas significativas a partir
del suministro de enzimas.
6
ES 2 137 903 T3
5
10
15
20
25
Los forrajes de hierba son diferentes con respecto a los forrajes de leguminosas y los alimentos de
granos tanto en la estructura morfológica como en la composición quı́mica (Nelson y otros, 1994). Las
hojas de hierbas proporcionan funciones tanto estructurales como metabólicas mientras que en las leguminosas, las hojas proporcionan solo una función metabólica. La estructura morfológica de los alimentos
de granos es muy diferente a los henos de hierba y que las cantidades relativamente pequeñas de fibra en
los granos están situadas en el cascabillo y rodean el endospermo amiláceo.
Los métodos de tratamiento previo que mejoran el valor nutritivo de los henos de hierba no son eficaces
para mejorar el valor nutritivo de los forrajes de leguminosas. Por ejemplo, en 24 estudios con rastrojos
monocotiledóneos (hierba), el consumo de DM aumentó en un 22 % como resultado de un tratamiento de
hidróxido de sodio mientras que en dos estudios de rastrojos dicotiledóneos (leguminosas), el consumo de
DM aumentó en solo un 6 % (Berger y otros, 1994).
La composición de celulosa de hierbas y forrajes de leguminosas es en lı́neas generales similar. No
obstante, en relación con los forrajes de leguminosas, las celulosas de hierbas poseen una alta concentración de enlaces xilano-lignina. En los forrajes de leguminosas, los polisacáridos (xilano y celulosa)
y las ligninas están compartimentados más discretamente. Como resultado, la lignina actúa como una
barrera fı́sica más grande a la digestión de la fibra en los forrajes de leguminosas que en las hierbas.
Otras diferencias en la quı́mica de la fibra provocan que las hierbas sean más sensibles al tratamiento
quı́mico que los forrajes de leguminosas. No se esperarı́a que los tratamientos enzimáticos que mejoran
el valor nutritivo de la hierba sean eficaces en los forrajes de leguminosas o en los alimentos de granos.
La relación de hemicelulosa:celulosa en forrajes de hierba templada está comprendida entre 0,57 y 0,70
en contraposición con 0,32 y 0,40 en las leguminosas. Los polisacáridos hemicelulósicos en los forrajes
de leguminosas son arabinoxilanos, xiloglicanos, arabinanos y galactanos, mientras que los polisacáridos
hemicelulósicos principales en las hierbas son xiloglucanos y arabinoxilanos. La xilosa constituye un 30 %
de los azúcares en la hemicelulosa de la hierba y un 20 % de los azúcares en la hemicelulosa del forraje
de leguminosas. Como la hemicelulosa de los forrajes de leguminosas es una mezcla más compleja de
azúcares que la hemicelulosa de hierbas, se esperarı́a que para la degradación de la hemicelulosa del
forraje de hierbas se requerirı́a un régimen más complejo de enzimas fibrolı́ticas.
30
35
40
45
50
55
60
Tal como se ha descrito anteriormente, sobre la base de los resultados de la técnica anterior, se esperarı́a que serı́an necesarios niveles muy altos de enzimas fibrolı́ticas para provocar un aumento sustancial
en la digestibilidad del material alimenticio, particularmente en los forrajes de leguminosas y los alimentos
de granos con un contenido inferior de fibra total, ya que el rumen es un entorno altamente proteolı́tico
y ya posee un complemento altamente desarrollado de microbios que producen enzimas fibrolı́ticas de
actividad elevada. Todavı́a serı́a menos probable con respecto a los forrajes de hierba que los forrajes
de leguminosas y los alimentos de granos, que ofrecen proporciones relativamente menores de fibra total,
mostraran mejoras en la digestibilidad.
A pesar de lo anterior, los inventores han demostrado mejoras sustanciales en la digestibilidad del
forraje de leguminosas y el alimento de granos con niveles de adición de enzimas relativamente bajos.
La relación de conversión del alimento observada para el grano alimenticio de cebada aumentó un 12 %
(Tabla 3 en los Ejemplos) sugiriendo un aumento del doble en la digestibilidad del componente de fibra
total del grano. La relación de conversión del alimento observada para la alfalfa (un forraje de leguminosas) aumentó un 17 % (9,92 Kg de alimento/Kg de aumento de peso para el heno no tratado; 8,48 Kg
de alimento/Kg de aumento de peso para heno de alfalfa tratado con 3600 IU de xilanasa y 148 FPU de
celulasa por Kg de materia seca) indicando una mejora sustancial de la digestibilidad de la fibra total.
Estas mejoras sorprendentes en la digestibilidad no se deberı́an haber obtenido como resultado de los
simples efectos enzimáticos aditivos de la celulasa y la xilanasa añadidas. Sin limitarse a los mismos,
los inventores creen que los complementos enzimáticos de la presente invención crean lugares de fijación
para las bacterias de los rumiantes sobre las partı́culas del alimento tratado mejorando de este modo la
colonización y la subsiguiente digestión de las partı́culas de alimento por parte de las bacterias ruminales
indı́genas.
Es sabido que para que resulten útiles como alimentos, los vegetales deben ser resistentes a los ataques
microbianos mientras crecen en el campo, pero deben ser susceptibles a la penetración, colonización y
digestión por microorganismos dentro del rumen. Las barreras protectoras y las sustancias que defienden
contra los ataques microbianos en el campo (es decir, la cutı́cula cérea o los ácidos fenólicos) impiden la
digestión del material vegetal dentro del rumen. Los microorganismos ruminales burlan estas defensas a
través de estructuras vegetales menos resistentes tales como los estomas o a través del rompimiento de
las barreras protectoras debido a la masticación o un proceso mecánico (McAllister y otros, 1994).
7
ES 2 137 903 T3
5
Una vez que se ha obtenido el acceso, las bacterias del rumen se fijan a los tejidos internos, forman
biopelı́culas y comienzan la digestión. Los colonizadores iniciales liberan productos de digestión que a su
vez atraen bacterias adicionales hacia el lugar de digestión formando un consorcio complejo de bacterias
capaces de digerir tejidos vegetales internos. De este modo, la digestión de alimentos en el rumen actúa
desde dentro y la velocidad y el grado de digestión de un material alimenticio viene dictado frecuentemente por la extensión según la cual los microorganismos ruminales pueden acceder a los tejidos internos
(McAllister y otros, 1994).
15
Los complementos enzimáticos de la presente invención son absorbidos en el material alimenticio
donde son protegidos de la solubilización en el entorno ruminal proteolı́tico. Los inventores creen que en
el interior del material alimenticio, las enzimas crean lugares de fijación para la colonización inicial por
parte de microbios ruminales. Además se establece la hipótesis de que niveles superiores de tratamiento
enzimático son ineficaces ya que los lugares de fijación formados están bloqueados por un exceso de enzimas fibrolı́ticas. El exceso de moléculas enzimáticas se adhiere sobre la parte superior de los lugares de
fijación, creando una barrera para la actividad y la fijación de microbios.
20
El sorprendente descubrimiento de los inventores es de gran utilidad ya que permite la obtención
de mejoras en la digestibilidad de la fibra total para materiales alimenticios que de otro modo serı́an
relativamente insensibles al tratamiento enzimático utilizando cantidades rentables de enzimas con unas
relaciones y unos niveles de actividad muy especı́ficos aplicados con un método sencillo y práctico.
10
Breve descripción de los dibujos
25
30
35
40
La Figura 1 es un gráfico que representa el aumento de peso medio diario (ADG) en Kg por dı́a de
novillos alimentados con una dieta de forraje de alfalfa seca como una función del nivel de actividad enzimática por Kg de material alimenticio. Solo se muestra el nivel de xilanasa. La relación de la actividad
de la celulasa con respecto a la xilanasa fue constante con 4 FPU de actividad de celulasa por 100 IU de
actividad de xilanasa.
La Figura 2 es un gráfico que representa el aumento de peso medio diario (ADG) en Kg por dı́a de
novillos alimentados con una dieta de forraje de fleo de los prados seco como una función del nivel de
actividad enzimática por Kg de material alimenticio. Solo se muestra el nivel de xilanasa. La relación de
la actividad de la celulasa con respecto a la xilanasa fue constante con 4 FPU de actividad de celulasa
por 100 IU de actividad de xilanasa.
La Figura 3 es un gráfico que representa el aumento de peso medio diario (ADG) en Kg por dı́a de
novillos alimentados con una dieta de cebada ensilada seca como una función del nivel de actividad enzimática por Kg de material alimenticio. Solo se muestra el nivel de xilanasa. La relación de la actividad
de la celulasa con respecto a la xilanasa fue constante con 4 FPU de actividad de celulasa por 100 IU de
actividad de xilanasa.
La Figura 4 es un gráfico que representa la desaparición de la fibra neutro detergente (NDF) del heno
de alfalfa seco incubado en fluido ruminal como una función de la relación de la actividad celulasa:xilanasa
del complemento enzimático en dos conjuntos de relaciones de enzimas.
45
La Figura 5 es un gráfico tridimensional que representa la desaparición de la NDF del heno de alfalfa
seco incubado en fluido ruminal como una función tanto de la relación de la actividad celulasa:xilanasa
del complemento enzimático expresada como IU de xilansa:1 FPU de celulasa, como del nivel de enzimas
añadido, expresado como IU de actividad de la xilanasa por Kg de materia seca alimenticia.
50
La Figura 6 es un gráfico que representa la digestibilidad de la materia seca (desaparición de la NDF)
del heno de alfalfa seco incubado en fluido ruminal como una función del tiempo de incubación de la
alfalfa tratada con enzimas después del tratamiento enzimático.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
55
60
La presente invención proporciona complementos enzimáticos para mejorar la digestibilidad de los
forrajes de leguminosas secos y los alimentos de granos secos cuando se dan como alimento a animales
rumiantes y un método para tratar los forrajes de leguminosas y los alimentos de granos con un complemento enzimático de manera que se forma un complejo enzimático/alimenticio estable.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “seco” aplicado a un material alimenticio,
significa un material alimenticio con un contenido de humedad no mayor que el 15 % (p/p).
8
ES 2 137 903 T3
5
10
Tal como se utiliza en el presente documento, “forraje de leguminosas” significa la parte aérea cortada
y curada de una planta utilizada como pienso para animales la cual es una especie vegetal dicotiledónea
que es miembro de la familia botánica Leguminosae. Entre los ejemplos se incluyen, sin limitación, alfalfa,
esparceta, tréboles y vezas. Los “forrajes de leguminosas” incluyen forrajes que comprenden una cantidad
mayor que el 50 % de material vegetal de la familia Leguminosae y hasta un 49 % de material vegetal de
otras especies.
Tal como se utiliza en el presente documento, “alimentos de granos” significa semillas de vegetales
que tı́picamente se dan como alimento a animales rumiantes que pueden incluir o no el cascabillo, la
vaina o la espata exterior de la semilla. Entre los ejemplos de alimentos de granos se incluye, sin que
sean limitativos, cebada, trigo, maı́z, sorgo, triticale, centeno, canola y habas de soja.
Tal como se utiliza en el presente documento, “celulasa” significa una enzima que solubiliza azúcares
de celulosa y “xilanasa” significa una enzima que solubiliza azúcares de hemicelulosa.
15
Tal como se utiliza en el presente documento, “material alimenticio” significa un forraje de leguminosas o alimento de granos.
20
25
30
35
40
Tal como se utiliza en el presente documento, “estable”, en las composiciones alimenticias de la presente invención, significa que la xilanasa y la celulasa permanecen activas y el material alimenticio no se
enmohece, no se pudre, no experimenta una predigestión o como alternativa no se deteriora durante al
menos aproximadamente un año después del tratamiento.
Tal como se utiliza en el presente documento, “recubrimiento”, como se aplica a la solución de enzimas aplicada a materiales alimenticios, significa que la solución de enzimas se distribuye sobre el material
alimenticio de forma sustancialmente uniforme. El cubrimiento del material alimenticio con la solución
de enzimas puede ser discontinuo. No obstante, por término medio, la distribución de la solución de
enzimas es sustancialmente uniforme.
El complemento enzimático incluye celulasa y xilanasa en determinadas relaciones y concentraciones
preferidas. También puede incluir pectinasas, esterasas, arabinosidasas y β1-3 glucanasas. No se requieren proteasas, lipasas o amilasas.
Se ha determinado que los complementos enzimáticos son más eficaces en el aumento de la digestibilidad del pienso cuando la xilanasa y la celulasa se proporcionan en relaciones preferidas de actividad y
concentración enzimáticas. Tal como se utiliza en el presente documento, “concentración” referida a la
concentración de enzima añadida a un material alimenticio significa el nivel de actividad de una enzima
por Kg de materia seca de una composición alimenticia que comprende un material alimenticio tratado
con el complemento enzimático. La actividad de la celulasa se estandariza sobre la base de la degradación
del papel de filtro, expresada en actividad de unidades de papel de filtro (FPU) (µmoles de glucosa producidos a partir del papel de filtro por unidad de enzima por minuto). La actividad de la xilanasa se
basa en la hidrólisis del xilano de espelta avena en xilosa y se expresa en unidades internacionales (IU)
(µmoles de azúcares reductores producidos por unidad de enzima por ml por minuto). En los Ejemplos
se exponen ensayos de la actividad de la celulasa y la xilanasa.
45
50
55
60
Cuando la celulasa y la xilanasa están presentes en el complemento enzimático dentro de los márgenes
de relación y concentración preferidos, se observa un efecto sinérgico entre las actividades de la celulasa y la xilanasa sobre la digestibilidad de los materiales alimenticios tratados con los complementos
enzimáticos. Las mejoras resultantes en la digestibilidad son mayores que las que se preverı́an incluyendo
simplemente la mejora en la digestibilidad esperada al tratar materiales alimenticios con xilanasa y celulasa aplicadas de forma separada. El efecto sinérgico no se observa cuando la celulasa y la xilanasa se
suministran al complemento enzimático en unas relaciones y una concentración por debajo o por encima
de las correspondientes de la presente invención.
Para forrajes de leguminosas, tales como heno de alfalfa, se observa la máxima mejora en la digestibilidad de materiales alimenticios tratados cuando la celulasa y la xilanasa están presentes en el complemento
enzimático en una relación comprendida entre 2 y 5 FPU de celulasa por 100 IU de xilanasa. La cantidad
preferida de actividad de celulasa y xilanasa en el complemento enzimático es tal que, cuando se aplica a
un forraje de leguminosas seco según el método de la presente invención, se suministran entre 16 y 120,
más preferentemente entre 18 y 72, FPU de actividad de celulasa y entre 800 y 6000, más preferentemente
entre 900 y 3600, IU de actividad de xilanasa por Kg de materia seca de alimento.
9
ES 2 137 903 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Para alimentos de granos, la relación óptima de celulasa con respecto a la xilanasa está comprendida
entre 2 y 5 FPU de celulasa por 100 de xilanasa. El complemento enzimático contiene preferentemente
cantidades suficientes de la celulasa y la xilanasa como para proporcionar entre 100 y 200, y más preferentemente entre 40 y 60 FPU de actividad de celulasa, y entre 500 y 10.000 y más preferentemente 2000
y 8000 IU de actividad de xilanasa por Kg de materia seca alimenticia.
Para conseguir los efectos sinérgicos y la mejora deseados en la digestibilidad de los materiales alimenticios, las enzimas de celulasa y xilanasa se deberı́an aplicar a los materiales alimenticios según ciertos
procedimientos y parámetros. De este modo, la presente invención abarca un método de tratamiento de
un material alimenticio con las enzimas para mejorar la digestibilidad del material alimenticio. La mejora
en la digestibilidad y el efecto sinérgico de la xilanasa y la celulasa alcanza un valor máximo cuando las
enzimas se disuelven en una solución acuosa de un tampón con un pH entre 4,5 y 7,0. Las enzimas
pueden estar en soluciones separadas, más preferentemente en una mezcla, en una solución acuosa. La(s)
solución(es) acuosa(s) se aplica(n) uniformemente al material alimenticio seco que posee un contenido de
humedad menor que aproximadamente el 15 %, a una temperatura ambiente comprendida entre 5◦C y
80◦C. A continuación el material alimenticio humedecido se deberı́a incubar durante por lo menos 3 horas,
más preferentemente por lo menos 8 horas para estabilizar el complejo alimenticio/enzimático resultante
(composición alimenticia).
El tratamiento de los alimentos de granos o los forrajes de leguminosas secos con el método de la
presente invención se puede combinar con varias etapas tı́picas de procesado de los alimentos que se pueden producir antes o después del tratamiento enzimático. Dichas etapas de procesado incluyen, de una
manera no limitativa, el templado, el hinchado, el tostado, la cocción o el hinchado mediante vapor del
alimento. Cuando la etapa de procesado fuera a dar como resultado una compactación o densificación del
alimento de tal manera que inhiba la adsorción del complemento enzimático en el material alimenticio, el
tratamiento enzimático se lleva a cabo preferentemente antes del procesado. Dichas etapas de procesado
incluirı́an, de una manera no limitativa, la formación de pellets, el prensado o el empacado del alimento.
Cuando las etapas de procesado incluyen temperaturas altas, las enzimas se aplican preferentemente
después del procesado.
La celulasa y la xilanasa utilizadas según el método de la presente invención están disponibles bien en
forma de polvo o bien en forma lı́quida. Si se dispone de ellas en forma lı́quida, las enzimas se suministran
preferentemente en solución acuosa, por ejemplo disueltas en una solución acuosa de un tampón con un
pH comprendido entre 4,5 y 7,0. Según el método de la presente invención, se proporciona un forraje de
leguminosas o un alimento de granos en un estado seco, con preferentemente un contenido de humedad
menor que el 15 % (peso/peso). Generalmente el secado en el campo consigue ese nivel de secado, aunque
puede que sean necesarios un secado adicional en secadores de grano y similares. En relación con la masa
del forraje de leguminosas o el alimento de granos, se diluyen en agua o en una solución tampón xilanasa
y celulasa en polvo o lı́quidas suficientes para proporcionar la relación deseada de celulasa con respecto
a la xilanasa y el nivel de actividad deseado de celulasa y xilanasa por Kg de material alimenticio. Las
enzimas se pueden añadir de forma separada o se pueden suministrar en una forma mezclada previamente
con ciertas relaciones preferidas. El volumen de agua o tampón utilizado para diluir las enzimas no es
crı́tico siempre que no se utilice un volumen tan grande como para aumentar el contenido de humedad
del material alimenticio por encima de aproximadamente el 15-18 %.
A continuación la solución enzimática diluida se aplica de forma uniforme de modo que se distribuya
sobre el material alimenticio (por ejemplo, pulverizándola). A continuación la composición alimenticia
tratada de este modo se incuba a una temperatura comprendida preferentemente entre 5◦ C y 80◦ C durante por lo menos aproximadamente 3 horas, más preferentemente por lo menos de forma aproximada 8
horas, para permitir que las enzimas sean absorbidas en y se adhieran al material alimenticio, de manera
que se permita la evaporación de la humedad sobrante, y de manera que se permita la formación de
un complejo alimenticio/enzimático estable. La composición alimenticia resultante deberı́a permanecer
estable durante por lo menos un año.
Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran otras realizaciones especı́ficas y la utilidad de esta invención.
Ejemplo 1
60
La aplicación de relaciones especı́ficas de xilanasa y celulasa a forrajes secos de leguminosas da como
resultado una mejora en el rendimiento de los animales
Setenta y dos novillos en crecimiento, con un peso de 300 Kg (comprendido entre 235 y 367 Kg), alojados en rediles individuales para alimentación, se asignaron a tres dietas de forraje (24 animales/dieta):
10
ES 2 137 903 T3
1. cubos de heno de alfalfa;
2. cubos de heno de fleo de los prados;
3. cebada ensilada.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Estos forrajes se escogieron de manera que representan tres tipos de dietas de forraje: heno de leguminosas (alfalfa), heno de hierba (fleo de los prados) y hierba ensilada (cebada ensilada).
Para cada dieta, se añadieron niveles graduados de una mezcla acuosa de exocelulasa (Spezyme CP,
Genencor, Rochester, N.Y.) y xilanasa (Xylanase B, Enzyme Development Corporation, New York, N.Y.)
comerciales en una disposición factorial de 3 x 6 (3 dietas x 6 concentraciones de enzimas). En cada dieta,
se asignaron 4 animales a cada nivel de enzima (n=4). Se añadieron enzimas a los henos de alfalfa y de
fleo de los prados durante el proceso de prensado en varios niveles (Tabla 1). Las enzimas se aplicaron
a los forrajes durante un mı́nimo de 7 dı́as antes de darlos como alimento. Para la cebada ensilada, las
enzimas se añadieron en las concentraciones adecuadas y se mezclaron justo antes de darla como alimento. A cada dieta se le añadieron complementos de proteı́nas/minerales para proporcionar un mı́nimo
de un 12 % de proteı́na cruda, una proteı́na adecuada no degradable en el rumen, Ca, P, y microminerales
(NRC, 1984). Como el contenido de proteı́na cruda de los cubos de alfalfa era sustancialmente mayor que
el correspondiente a los cubos de fleo de los prados o a la cebada ensilada, el consumo de proteı́na cruda
total de estos animales era mayor, pero el consumo de proteı́na no degradable en el rumen era similar.
Se les ofreció alimento a los animales una vez al dı́a a las 10:00 h. La tolerancia de alimentación era de
un 5 a un 10 % superior al consumo voluntario.
Los animales se pesaron a las 08:00 h a intervalos bien de 7 ó bien de 14 dı́as. Durante todo el
experimento se determinó el consumo voluntario de alimento individual. Los animales que recibı́an cubos
de heno se alimentaban a mano, los animales que recibı́an cebada ensilada se alimentaban utilizando un
mezclador de alimentos automatizado. El alimento rechazado se recogı́a y se pesaba antes de alimentar
a los animales cada lunes, miércoles y viernes. Los compuestos rechazados semanales se secaban a 55◦C
durante 72 horas para determinar la materia seca (DM).
Se calculó el aumento del peso medio diario (ADG) a partir de los pesos vivos mediante regresión
lineal. Los datos se sometieron a un análisis de varianza de dos factores con la dieta y la adición de enzimas como efectos principales. Debido a las interacciones consistentes de dieta x enzima, se examinaron
los efectos de las enzimas en cada forraje mediante análisis de varianza de un factor con la adición de la
enzima como el efecto principal y el peso inicial como covariante. Se probaron los siguientes contrastes
no ortogonales: niveles bajos de enzimas (niveles 1, 2 y 3) contra el control y el nivel alto de enzimas
(nivel 5) contra la totalidad del resto de niveles de enzimas (incluyendo la enzima cero de control).
La composición quı́mica de los forrajes se resume en la Tabla 2. La adición de enzimas fibrolı́ticas
redujo ligeramente la NDF y la ADF de los cubos de fleo de los prados, pero no de los cubos de alfalfa,
indicando una hidrólisis de la fibra parcial antes de la ingestión de hierba pero no del heno de leguminosas.
El aumento de peso medio diario mejoró con la adición de enzimas para la alfalfa (P=15) y los cubos
de fleo de los prados (P=0,065), pero no (P=0,67) para la cebada ensilada (Tabla 1). No obstante, la
respuesta de la dosis a la adición de enzimas fue no lineal (ver Figuras 1, 2 y 3).
Para la alfalfa, un forraje de leguminosas, el ADG aumentó con los niveles bajos de enzimas fibrolı́ticas.
Los niveles altos de enzimas fibrolı́ticas fueron ineficaces. La respuesta máxima en el ADG se observó
con 3.600 IU de xilanasa/Kg de DM (Figura 1). El ADG con este nivel fue significativamente mayor
(P=0,021) que el correspondiente al control (1,34 contra 1,03 Kg/d), pero fue similar (P=0,57) al ADG
con niveles inferiores de enzima. Cuando se contrastó conjuntamente con respecto al control, las tres
concentraciones bajas de enzimas aumentaron (P=0,015) el ADG.
Para el fleo de los prados, un forraje de hierba, la respuesta máxima en el ADG se obtuvo con la
mayor concentración de enzimas (12.000 IU de xilanasa/Kg de DM) (Figura 2). El ADG con este nivel
(1,66 Kg/d) fue mayor (P<0,01) que para el control (1,22 Kg/d) y todos los niveles inferiores de enzimas.
Los resultados para el heno del fleo de los prados son consistentes con los correspondientes observados en
la técnica anterior.
Tal como se esperaba, el consumo de DM (“DMI”) fue considerablemente diferente (P<0,001) entre
los forrajes (Tabla 1) y presentó el valor menor para la cebada ensilada y el valor mayor para la alfalfa.
Los aditivos enzimáticos no afectaron al DMI de la alfalfa (P=0,60) ó de la cebada ensilada (P=0,23).
Para el fleo de los prados, los animales que recibieron la mayor concentración de enzimas presentaron una
DMI mayor (P=0,043) que la correspondiente al control y a la totalidad del resto de los niveles de
11
ES 2 137 903 T3
enzimas. En contraposición, los animales alimentados con cebada ensilada no obtuvieron ventajas de las
enzimas fibrolı́ticas añadidas justo antes de ser alimentados (Figura 3).
TABLA 1
Efecto del nivel de enzimas sobre el aumento de peso medio diario (ADG;
Kg/d) y el consumo de materia seca (DMI; Kg/d) en novillos
que consumen forrajes diferentes
5
10
Forraje
Niveles de
enzimas
Alfalfa
Fleo de los prados
Cebada ensilada
ADG
DMI
ADG
DMI
ADG
DMI
0
1,03
10,2
1,22
8,8
1,11
7,4
900 IU∗
37 FPU∗∗
1,27
10,8
1,31
8,3
1,16
8,2
1.800 IU
74 FPU
1,28
10,6
1,12
7,5
0,99
6,8
3.600 IU
148 FPU
1,34
11,5
1,24
9,3
1,03
7,9
7.200 IU
296 FPU
1,19
11,1
1,27
8,6
1,11
7,0
14.400 IU
592 IU
1,11
10,3
1,66
9,4
1,12
7,4
15
20
25
30
35
∗
IU = Unidades internacionales de xilanasa/Kg de materia seca;
∗∗
40
FPU = unidades de papel de filtro de celulasa/Kg de DM
TABLA 2
Fibra ácido detergente (ADF) y fibra neutro detergente (NDF) en
alfalfa y fleo de los prados tratados con diferentes niveles de enzimas
Nivel de enzimas por Kg de
materia seca
ADF(%)
NDF(%)
ADF(%)
NDF(%)
50
0
29,8 ± 1,0
44,7 ± 1,6
28,2 ± 0,3
55,0 ± 1,1
32,2 ± 0,03
44,1 ± 0,1
26,3 ± 0,0
53,6 ± 0,1
55
1.800 IU de
xilanasa
74 FPU de
celulasa
14.400 IU
de xilanasa
592 FPU de
celulasa
28,4 ± 3,0
42,6 ± 4,0
26,0 ± 0,5
52,8 ± 0,8
45
60
Alfalfa
Fleo de los prados
12
ES 2 137 903 T3
Ejemplo 2
La aplicación de relaciones especı́ficas de xilanasa y celulasa a alimentos secos de granos da como resultado una mejora en el rendimiento de los animales
5
Diecinueve novillos con un peso de 410 Kg, se alojaron en rediles individuales para alimentación, y se
asignaron a tres dietas de engorde:
1. Grano de cebada - sin enzimas;
10
2. Grano de cebada con 6.000 IU de xilanasa y 200 FPU de celulasa/Kg de DM.
3. Grano de cebada con 2.400 IU de xilanasa y 420 FPU de celulasa/Kg de DM.
15
20
25
30
35
Las dietas consistı́an en un 93 % de concentrado de cebada y un 7 % de cebada ensilada (DM base). Al
menos 24 horas antes de darlo como alimento al grano seco de cebada se le añadieron mezclas acuosas
de exocelulasa (Spezyme CP, Genencor, Rochester, N.Y.) y xilanasa (Xylanase B, Enzyme Development
Corporation, New York, N.Y.) comerciales. El grano de cebada se aplastó al vapor y seguidamente se
mezcló con la cebada ensilada justo antes de darlo como alimento. A cada dieta se le añadieron complementos de proteı́nas/minerales para proporcionar un mı́nimo de un 12 % de proteı́na cruda, una proteı́na
adecuada no degradable en el rumen, Ca, P, y microminerales (NRC, 1984). Se les ofreció alimento a los
animales una vez al dı́a a las 10:00 h. La tolerancia de alimentación era de un 5 a un 10 % superior al
consumo voluntario.
Los animales se pesaron a las 08:00 h a intervalos bien de 7 ó bien de 14 dı́as. Durante todo el
experimento se determinó el consumo voluntario de alimento individual. Los animales que recibı́an cubos
de heno se alimentaban a mano, los animales que recibı́an cebada ensilada se alimentaban utilizando un
mezclador de alimentos automatizado. El alimento rechazado se recogı́a y se pesaba antes de alimentar
a los animales cada lunes, miércoles y viernes. Los compuestos rechazados semanales se secaban a 55◦C
durante 72 horas para determinar la DM.
Se calculó el aumento de peso medio diario (ADG) a partir de los pesos vivos mediante regresión lineal
después de 98 dı́as de alimentación. Los datos se sometieron a un análisis de varianza de un factor con la
adición de enzimas como el efecto principal. Los resultados (Tabla 3) muestran que la complementación
de los alimentos de granos con enzimas incrementaron el aumento de peso medio diario en un 6,3 % y el
rendimiento de la conversión del alimento en un 12,3 % (P<0,05). Con el complemento de 3,3 FPU de
celulasa:100 IU de xilanasa se consiguieron resultados superiores a los del complemento de 17,5 FPU de
celulasa:100 IU de xilanasa.
TABLA 3
40
Aumento de peso medio diario en novillos de engorde consumiendo dietas conteniendo un 93 % de grano de cebada (DM base) tratado con enzimas fibrolı́ticas
45
Tratamiento
Aumento de peso medio
diario (Kg/d)
Rendimiento del alimento
Kg de alimento/Kg de
aumento de peso
0
1,43
7,11
6.000 IU∗
200 FPU∗
1,52
6,33
2.400 IU
420 FPU
1,40
7,13
50
55
∗
60
IU = Unidades internacionales de xilanasa/Kg de DM;
∗∗
FPU = unidades de papel de filtro de celulasa/Kg de DM.
13
ES 2 137 903 T3
Ejemplo 3
5
10
15
20
25
Relaciones especı́ficas de xilanasa y celulasa dan como resultado una mejora en la digestión de los alimentos. La utilización de relaciones diferentes a estas da como resultado una mejora nula o efectos negativos
sobre la digestibilidad
En los dos primeros de tres experimentos, después de 24 h de incubación se determinó la desaparición
de la fibra neutro detergente (NDF) in vitro del heno de alfalfa seco. Muestras de heno triturado de
alfalfa, secadas al horno, se incubaron en fluido ruminal con un tampón (20 % de fluido del rumen, 80 %
de tampón) a las cuales se les añadieron enzimas fibrolı́ticas tal como se ha descrito anteriormente. La
concentración total de enzimas (endocelulasa + xilanasa) fue de 6.000 IU/Kg, con relaciones cambiantes de endocelulasa:xilanasa (0:100, 25:75, 50:50, 75:25 y 100:0). En el segundo experimento, se utilizó
el mismo protocolo excepto que se utilizaron relaciones diferentes de endocelulasa:xilanasa (0:100, 5:95,
10:90, 15:85, 20:80, 25:75 y 100:0). En el tercer experimento, se utilizó el mismo protocolo excepto que en
lugar de endocelulasa CEP se utilizó exocelulasa Spezyme CP. Los niveles de enzimas correspondientes
a este experimento se presentan en la Tabla 5.
En todos los experimentos, el tampón ruminal fue el tampón de fosfato/bicarbonato de Goering y Van
Soest (1970). Al tampón se le añadieron macrominerales, microminerales, peptona, y agentes reductores
y el tampón se sometió a un procedimiento de burbujeo con CO2 hasta que se redujo completamente
antes de mezclarlo con fluido ruminal. Después de 24 h de incubación a 39◦ C, el contenido del tubo se
extrajo durante 1 h en una solución neutro detergente hirviendo y el residuo se secó durante la noche a
105◦ (Experimento 1) ó después de 24 h de incubación a 39◦ C, el contenido del tubo se filtró a través
de crisoles previamente pesados y se secó durante la noche a 105◦C para medir la digestión de DM. Los
resultados in vitro se examinaron estadı́sticamente utilizando un ANOVA de dos factores con el forraje
y el tratamiento enzimático como efectos principales. Los efectos enzimáticos se separaron mediante el
contraste con el control (sin enzimas) contra las enzimas (independientemente de la relación).
Experimentos 1 y 2
30
35
40
La adición de enzimas fibrolı́ticas hizo que aumentara significativamente (P<0,01) la desaparición de
la NDF. La desaparición de la fibra aumentó con la disminución de la relación celulasa:xilanasa, siendo
la respuesta a la mezcla de celulasa:xilanasa de 25:75 mayor (P<0,01; Tabla 4) que para otras relaciones
enzimáticas. La aplicación de la enzima de xilanasa sola resultó menos eficaz para mejorar la desaparición
de la NDF siendo más eficaz un 100 % de celulasa. No obstante, entre la aplicación de celulasa y xilanasa
se produjo un efecto sinérgico asociativo. Mientras que la celulasa sola fue más eficaz que la xilanasa sola,
la combinación de una cantidad pequeña de celulasa (de un 5 a un 25 % de actividad enzimática total)
dio como resultado el mayor aumento de la digestión de la NDF (Figura 4). En conjunto, una mezcla de
enzimas fibrolı́ticas, comprendiendo la endocelulasa un 25 % y la xilanasa un 75 % de la actividad total,
dio como resultado una mejora de un 26 % y un 8,2 % en los Experimentos 1 y 2 respectivamente.
TABLA 4
Efecto de la xilanasa y la celulasa sobre la digestibilidad (24 horas)
de la NDF in vitro de alfalfa
45
50
55
60
Celulasa (IU de
CMCase por Kg de DM)
Xilanasa
(IU por Kg de DM)
Digestibilidad de 24 horas
(%)
0
0
39,1
6.000
0
47,8
4.500
1.500
46,0
3.000
3.000
47,3
1.500
4.500
49,3
0
6.000
44,9
14
ES 2 137 903 T3
Experimento 3
5
10
Los resultados de este experimento demuestran adicionalmente el efecto asociativo de la xilanasa y
la celulasa (Tabla 5 y Figura 5). La metodologı́a fue idéntica a la correspondiente utilizada para los
Experimentos 1 y 2 excepto que se utilizó una exocelulasa (Spezyme CP). Se incubó in vitro alfalfa
triturada con diferentes combinaciones y niveles de xilanasa y celulasa. Tabla 5; la Columna 4, contiene
valores correspondientes a la digestión de la DM que se observaron cuando se utilizó xilanasa sola. La
Columna 5 contiene valores observados cuando se utilizó celulasa sola. La Columna 6 contiene la digestión
esperada de la DM que se esperarı́a si la xilanasa y la celulasa fueran aditivas en cuanto a su efecto sobre
la digestión de la DM de alfalfa (suma de la mejora en la digestión observada a partir de la celulasa sola
más la xilanasa sola). La Columna 7 contiene la digestión observada real de la DM. La diferencia entre
la digestión de la DM observada y la esperada (Columna 8) expresada como un porcentaje, es el cambio
debido a la acción de la celulasa y la xilanasa actuando de una manera asociativa, sinérgica.
TABLA 5
15
Efecto asociativo de la adición de combinaciones de xilanasa y celulasa en comparación con la adición
de enzimas individuales sobre la digestión de la DM in vitro de alfalfa
20
Xilanasa
IU/Kg
Celulasa
FPU/Kg
Relación
xilanasa
celulosa
% de DMD
esperado de
la xilanasa
% de DMD
esperado de
la celulosa
% total
de DMD
esperado
% de DMD
observado
% de mejora
debido a la
sinergia
25
0
0
0
0
0
40,11
40,11
0
500
10
50:1
41,19
42,37
43,45
45,02
3,9122851
500
12,5
40:1
41,19
42,45
43,53
46,45
7,2763519
500
16,66667
30:1
41,19
42,09
43,17
50,29
17,742337
500
25
20:1
41,19
43,56
44,64
51,62
17,393471
1000
20
50:1
42,44
44
46,33
48,86
6,3045103
1000
25
40:1
42,44
43,56
45,89
54,61
21,72938
1000
33,33333
30:1
42,44
44,87
47,2
58,09
27,136805
1000
50
20:1
42,44
45,6
47,93
57,61
24,121605
1500
30
50:1
43,98
44,09
47,96
53,82
14,602542
1500
37,5
40:1
43,98
44,67
48,54
59,11
26,339397
1500
50
30:1
43,98
45,6
49,47
63,14
34,064291
1500
75
20:1
43,98
47,54
51,41
63,25
29,504112
2000
40
50:1
44,79
45,31
49,99
56,85
17,094443
2000
50
40:1
44,79
45,6
50,28
64,95
36,556192
2000
66,66667
30:1
44,79
46,27
50,95
65,16
35,409918
30
35
40
45
50
55
60
15
ES 2 137 903 T3
TABLA 5 (continuación)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Xilanasa
IU/Kg
Celulasa
FPU/Kg
Relación
xilanasa
celulosa
% de DMD
esperado de
la xilanasa
% de DMD
esperado de
la celulosa
% total
de DMD
esperado
% de DMD
observado
% de mejora
debido a la
sinergia
2000
100
20:1
44,79
49,11
53,79
63,91
25,218041
4000
80
50:1
45,82
48,62
54,33
60,48
15,325193
4000
100
40:1
45,82
49,11
54,82
66,39
28,831298
4000
133,3333
30:1
45,82
50,24
55,95
66,53
26,364316
4000
200
20:1
45,82
51,32
57,03
64,71
19,137802
8000
160
50:1
44,05
50,65
54,59
56,77
5,4323449
8000
200
40:1
44,05
51,32
55,26
56,31
2,6164964
8000
266,6667
30:1
44,05
53,02
56,96
53,64
-8,273112
8000
400
20:1
44,05
54,28
58,22
53,35
-12,13556
A medida que aumentaba el nivel de xilanasa y celulasa (la Figura 5 muestra solo el nivel de la actividad de la xilanasa) aumentaba el efecto asociativo de las enzimas. El efecto asociativo de máximo valor
se produjo cuando la xilanasa se añadió con un nivel de 2.000 IU/Kg de DM. El efecto asociativo estaba
influido también por la relación de xilanasa:celulasa. El efecto asociativo de máximo valor se produjo
cuando la relación de xilanasa:celulasa (IU:FPU) estaba entre 30:1 y 40:1 (de 2,5 a 3,3 FPU de celulasa
por 100 IU de xilanasa). Por ejemplo, la aplicación de 1.500 IU de xilanasa y 50 FPU de celulasa por
Kg de DM dio como resultado una digestibilidad de la DM del 63,1 % en comparación con el 40,1 % para
la alfalfa no tratada, el 43,98 % para 1.500 IU de xilanasa/0 FPU de celulasa y el 45,6 % para 0 IU de
xilanasa/50 FPU de celulasa de la alfalfa tratada. En realidad la adición de actividades altas de xilanasa
y celulasa redujo la digestibilidad. Por ejemplo, la aplicación de 8.000 IU de xilanasa y 400 FPU de
celulasa por Kg de DM (relación 20:1) dio como resultado una digestibilidad de la DM del 53,4 % en
comparación con el 40,1 % para la alfalfa no tratada, el 44,05 % para 8.000 IU de xilanasa/0 FPU de celulasa y el 54,3 % para 0 IU de xilanasa/400 FPU de celulasa de la alfalfa tratada. Estos descubrimientos
demuestran que existe un nivel y una relación óptimos de xilanasa y celulasa para mejorar la digestión de
la alfalfa. La utilización de relaciones y niveles inadecuados fuera de los correspondientes especificados
dará como resultado una respuesta nula o incluso efectos negativos.
Ejemplo 4
50
55
60
Las enzimas se deben aplicar a materiales alimenticios secos y deben ser absorbidas en y se deben adherir
al material alimenticio antes de la ingestión. Se requiere una duración mı́nima de tiempo para estabilizar
el complejo enzimático-alimenticio
Se realizó un experimento para determinar los efectos de la adición de una mezcla enzimática fibrolı́tica
a alfalfa ensilada sobre el consumo y la digestibilidad de la materia seca, y para determinar si la mezcla
enzimática es igualmente eficaz sobre el forraje seco en comparación con el húmedo.
Se cortó alfalfa de segundo corte y se preservó como materia ensilada utilizando tres pequeños silos
verticales experimentales que contenı́an cada uno aproximadamente 700 Kg de materia ensilada. Se secó
una parte de la materia ensilada utilizando un secador de tambor giratorio de pequeña escala construido
con fines experimentales por el Alberta Farm Machinery Research Institute en Lethbridge. Se secaron
aproximadamente 850 Kg de materia ensilada húmeda (contenido aproximado de materia seca del 33 %)
entre 60◦C y 70◦ C durante aproximadamente entre 6 y 8 horas hasta obtener un contenido de humedad
menor que el 15 % en tres lotes diferentes.
16
ES 2 137 903 T3
5
10
15
20
25
Se utilizaron cinco carneros castrados en un experimento diseñado como un cuadrado latino modificado de 5 x 5 con cinco periodos experimentales de 14 d. Las dietas se asignaron de tal manera que
todos los ovinos habı́an recibido todas las dietas antes del final del experimento. Las cinco dietas eran:
1) alfalfa ensilada, 2) alfalfa ensilada con enzimas fibrolı́ticas, 3) alfalfa ensilada seca, 4) alfalfa ensilada
seca con enzimas fibrolı́ticas, y 5) cubos de alfalfa ensilada.
La mezcla enzimática fibrolı́tica utilizada en este estudio fue una mezcla de xilanasa (Xylanase B, Enzyme Development Corporation, New York, N.Y.) y celulasa (Spezyme CP, Genencor, Rochester, N.Y.)
aplicada en 3,75 unidades internacionales (IU) de xilanasa y 0,25 unidades de papel de filtro (FPU) de
celulasa por gramo de materia alimenticia seca. La mezcla enzimática se aplicó en el momento de dar el
alimento.
Las dietas de alfalfa húmeda se ofrecieron durante los dos primeros periodos para evitar la degradación. El alimento se ofreció dos veces al dı́a a un 110 % del consumo voluntario. El alimento rechazado
se recogió diariamente y se conservó para análisis quı́micos de manera que se determinara el consumo
voluntario. Los ovinos se alojaron en jaulas de recogida durante los últimos 10 d de cada periodo para
facilitar la recogida diaria total de heces.
Se analizaron los datos correspondientes al consumo diario de materia seca y la digestibilidad de la
materia seca total de forraje utilizando un modelo lineal general con ovinos y dietas en el modelo. Los
efectos de los periodos no se incluyeron en el modelo ya que las dietas realmente no se realizaron de forma
aleatoria según un diseño de un cuadrado latino.
La eficacia de las enzimas añadidas dependı́a de si la materia ensilada estaba húmeda o seca. La
adición de la mezcla enzimática hizo que aumentara la digestibilidad de la materia seca en un 2,9 % (63,1
contra 61,3 %; P<0,04; Tabla 6) en el caso de la materia ensilada seca, pero no tuvo ningún efecto sobre
la digestibilidad de la materia ensilada húmeda. Los animales alimentados con materia ensilada seca
consumieron más que los alimentados con materia ensilada húmeda, pero la adición de enzimas no tuvo
ningún efecto (P>0,05) sobre el consumo de materia seca. El consumo de materia seca digerible aumentó
marginalmente debido a la adición de enzimas.
30
35
40
Estos resultados indican que el aditivo enzimático hace que aumente la digestibilidad del forraje
cuando se aplica de una manera que permite la adherencia de las enzimas al sustrato. En el caso de la
materia ensilada seca, la mezcla enzimática lı́quida fue absorbida inmediatamente cuando se aplicó al
forraje, mientras que el alto contenido de humedad de la materia ensilada húmeda puede haber impedido
la absorción de la enzima. Las enzimas pueden haber sido solubilizadas desde el forraje húmedo más
fácilmente al producirse la insalivación por parte del animal o al entrar en contacto con el fluido ruminal.
En el Ejemplo 1 en el que al ganado se le dio como alimento cebada ensilada, las enzimas aplicadas
antes de dar el alimento no tuvieron ningún efecto sobre el rendimiento de los animales. En ese estudio,
las enzimas aplicadas al alimento seco (es decir, cubos de fleo de los prados y de alfalfa) en el momento
del procesado resultaron eficaces. Tanto el Ejemplo 1 como el Ejemplo 4 indican que las enzimas se deben
aplicar al alimento seco.
TABLA 6
45
50
Efecto de las enzimas fibrolı́ticas sobre la digestibilidad de la materia seca
(DM) de alfalfa ensilada
Alfalfa
ensilada
Enzima
Consumo (Kg/d)
DM
DM digerible
Digestibilidad
(%)
Húmeda
+
1,50
1,58
0,93
0,97
61,8
61,8
Seca
+
1,75
1,73
1,07
1,09
61,3 a
63,1 b
55
60
a, b El efecto de la enzima añadida a la materia ensilada seca fue significativo
(P<0,04)
17
ES 2 137 903 T3
Ejemplo 5
El complejo enzimático/alimenticio requiere un periodo mı́nimo de incubación para resultar estable
5
10
15
20
25
30
35
Se realizó un experimento para determinar el efecto del tiempo de estabilización para una mezcla
enzimática fibrolı́tica sobre la digestibilidad del heno de alfalfa.
Se trituraron muestras compuestas de heno de alfalfa seco de manera que pasaron a través de un
tamiz de 2 mm. Sobre cada alimento se pulverizó una solución de enzimas fibrolı́ticas consistente en
xilanasa (Xylanase B, Enzyme Development Corporation, New York, N.Y.), celulasa (Spezyme, Genencor, Rochester, N.Y.) y 10mM de tampón de acetato (pH 4,8). La solución se aplicó en la proporción
de 0,09 mL/g de alimento (se mantuvo la base). Para la alfalfa, se añadieron 2.000 IU de xilanasa y
67 FPU de celulasa por Kg de materia seca. Las enzimas se estabilizaron sobre el alimento durante 0,
0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 y 32 h. Los forrajes tratados se incubaron en fluido ruminal con un tampón
(pH 6,8) (20 % de fluido del rumen, 80 % de tampón) según el método de Goering y Van Soest (1970).
El fluido ruminal con el tampón se añadió al tratamiento de 0 h a los 5 minutos de aplicar la solución
enzimática. Un tratamiento final consistió en añadir la solución enzimática después de haber añadido
el fluido ruminal al alimento. En cada tiempo de estabilización, se incubó una muestra de forraje sin
enzima y se utilizó como control para ese tiempo de estabilización. Estos controles se necesitaban para
eliminar la naturaleza variable del inóculo del fluido del rumen entre las réplicas. Todas las incubaciones
se realizaron por triplicado durante 24 h a 39◦ C. Después de la incubación, se filtraron las muestras para
determinar la digestibilidad de la materia seca. Se analizaron los residuos por fibra neutro detergente
(NDF) para determinar la digestibilidad de la fibra. Los resultados correspondientes a la digestibilidad
se presentan como un porcentaje de la incubación del control respectivo.
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 6. La desaparición de la materia seca aumentó por encima del control no tratado en cada incremento del tiempo de incubación hasta 24 horas. Estos resultados demuestran claramente la necesidad de un periodo de modo que el complejo enzimático/alimenticio se pueda estabilizar. Para periodos de hasta 2 horas se produjo un aumento nominal
de la digestibilidad de la DM. En 3 horas se consiguió una estabilización satisfactoria. La mayor parte
del efecto de estabilización se habı́a conseguido antes de 8 horas produciéndose la estabilidad máxima y
la digestión de la DM con 24 horas de estabilización. La alfalfa estaba seca de manera que no se realizó
ninguna predigestión. La respuesta observada fue debida a los enlaces de la enzima al alimento y se
necesitó tiempo para formar este complejo estable.
Ejemplo 6
Ensayo de la actividad de la exocelulasa expresada en unidades de papel de filtro
Principio
40
La celulasa en la muestra hidroliza el sustrato, el papel de filtro, y los azúcares reductores liberados
de este modo se someten a ensayo con un espectrofotómetro utilizando ácido dinitrosalicı́lico.
Unidad de actividad
45
La unidad de actividad del papel de filtro es la FPU (ver cálculo)
Condiciones del ensayo
50
55
60
Sustrato
pH
Temperatura de incubación
Tiempo de incubación
Papel de filtro
4,8
50◦ C
60 min.
Baño marı́a
Baño marı́a
Mezclador de tubos de ensayo (vortex)
Espectrofotómetro
50◦ C
100◦C
Equipo
18
ES 2 137 903 T3
Reactivos
Todas las soluciones se preparan en agua desionizada, Milli-Q o equivalente.
5
10
1. Tampón de citrato (0,05M, pH 4,8)
Preparar soluciones 0,05M tanto de ácido cı́trico (C6 H8 O7 · H2 O · 10,51 g/l) como de citrato de
sodio (C6 H5 Na3 O7 · 2H2 O, 14,71 g/l) en agua. Ajustar el pH de la solución de citrato 0,05M a 4,8
con la solución de ácido cı́trico 0,05M (deberı́a necesitar aproximadamente 667 ml de solución de
ácido cı́trico por 1 litro de solución de citrato de sodio).
2. Sustrato
15
Tira de papel de filtro Whatman N◦ . 1, 5 mm de ancho x 120 mm de largo (49,6-50,5 mg). Nota:
Es importante conseguir este peso y se puede obtener recortando la esquina de la tira y pesándola.
3. Reactivo DNS
20
25
Disolver 5,0 g de ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico (conocido también como ácido 3,5 dinitrosalicı́lico - Merck 800141) en aproximadamente 4 litros de agua. Con una agitación magnética
continua, añadir gradualmente 8,0 g de NaOH y dejar que se disuelva. Añadir 150 g de Sal de Rochelle (Kna-tartrate, Merck 8087) en porciones pequeñas con una agitación continua. La solución
se puede calentar cuidadosamente a una temperatura máxima de 45◦C. Enfriar a la temperatura
ambiente y diluir con agua hasta obtener 500 ml en un matraz volumétrico. Si la solución no
queda clara, filtrar a través de un papel de filtro Whatman 1. Almacenar en una botella oscura a
temperatura ambiente.
4. Glucosa estándar
30
Disolver 1,00 g de glucosa (Merck 8337; almacenada en un desecador) en un tampón de citrato y
completar el volumen hasta obtener 250 ml en un matraz volumétrico. Esta solución contiene 2,0
mg de glucosa en 0,5 ml.
Muestra
35
40
45
50
55
60
La muestra se diluye en un tampón de citrato. Se deben realizar por lo menos dos diluciones de cada
muestra de enzima investigada. En las condiciones de la reacción una dilución deberı́a liberar un poco
más y otra un poco menos (cantidad absoluta) que 2,0 mg de glucosa (azúcares reductores equivalentes
como glucosa).
Ensayo
Enrollar de forma ajustada en un rizo pequeño la tira de papel de filtro, situarla en el tubo de ensayo
seco (25 ml) y añadir 1,0 ml de tampón de citrato utilizando la pipeta para mantener el papel sumergido.
Equilibrar a 50◦ C durante 5 minutos. En el instante de tiempo cero añadir 0,5 ml de la muestra al
tubo de ensayo y mezclar (la tira debe quedar por debajo de la superficie del lı́quido). Después de una
incubación de exactamente 60 minutos a 50◦ C añadir 3,0 ml de reactivo DNS y mezclar. Situar todos los
tubos (todas las muestras, formas iniciales de las enzimas, glucosa estándar y forma inicial del reactivo)
en un baño Marı́a hirviendo de uno en uno. Después de hervir durante exactamente 5 minutos, retirar
los tubos y enfriar a temperatura ambiente. Añadir 20 ml de agua. Mezclar invirtiendo completamente
el tubo varias veces. Cuando la pulpa se haya depositado bien, es decir, después de por lo menos 20
minutos, la solución se transfiere a una cubeta con una pipeta y el color formado se mide con respecto a
la forma inicial del reactivo a 540 nm.
Forma inicial de
la enzima
Glucosa estándar
1,0 ml de tampón
0,5 ml de muestra
3,0 ml de DNS
Forma inicial del
reactivo
1,0 ml de tampón
0,5 ml de estándar
3,0 ml de DNS
19
1,5 ml de tampón
3,0 ml de DNS
ES 2 137 903 T3
Hervir durante 5 minutos, añadir 20 ml de agua, etc. Medir la absorbancia de las muestras, las formas
iniciales de las enzimas y la glucosa estándar con respecto al reactivo a 540 nm.
Cálculo
5
La unidad de FPU se basa en la Unidad Internacional (Nota: el ensayo de FPU es no lineal, la utilización de unidades internacionales de por sı́ es incorrecta).
1 IU
10
15
= 1 µmol min−1 de sustrato convertido
= 1 µmol min−1 de producto formado (azúcares reductores como glucosa, el peso molecular
de la glucosa es 180 g mol−1)
La cantidad absoluta de glucosa liberada en el ensayo de FPU en la dilución crı́tica es 2,0 mg. Esta
cantidad de glucosa es producida por 0,5 ml de enzima en 60 minutos en la reacción de hidrólisis y es
equivalente a:
2,0 mg
= 0,37 µmol min−1 ml−1
0,18 mg µmol−1·0,5 ml·60 min
20
25
Representar la absorbancia de la muestra (después de la sustracción de las formas iniciales de las
enzimas) con respecto a la dilución de la enzima (volumen total de la dilución dividido por el volumen
de la enzima en la dilución) sobre un papel de gráfica semilogarı́tmica. Leer la dilución crı́tica para cada
muestra correspondiente a la absorbancia del estándar.
FPU/ml = dilución crı́tica 0,37
Ejemplo 7
30
Ensayo de la actividad de la endocelulasa (carboximetil celulosa) expresada en unidades internacionales
Principio
35
La CMCase en la muestra hidroliza el sustrato, carboximetil celulosa (CMC), y los azúcares reductores
liberados de este modo se someten a ensayo con un espectrofotómetro utilizando ácido dinitrosalicı́lico.
Unidad de actividad
40
Las unidades se expresan como Unidades Internacionales (IU). Una IU de actividad libera 1 umol
de azúcares reductores (expresados como equivalentes de glucosa) en 1 minuto bajo las condiciones del
ensayo.
Condiciones del ensayo
45
50
Sustrato
pH
Temperatura de incubación
Tiempo de incubación
carboximetil celulosa
4,8
50◦C
60 min
Baño marı́a
Baño marı́a
Mezclador de tubos de ensayo (vortex)
Espectrofotómetro
50◦C
100◦C
Equipo
55
60
Reactivos
Todas las soluciones se preparan en agua desionizada, Milli-Q o equivalente.
20
ES 2 137 903 T3
1. Tampón de citrato (0,05M, pH 4,8)
5
Preparar soluciones 0,05M tanto de ácido cı́trico (C6 H8 O7 · H2 O · 10,51 g/l) como de citrato de
sodio (C6 H5 Na3 O7 · 2H2 O, 14,71 g/l) en agua. Ajustar el pH de la solución de citrato 0,05M a 4,8
con la solución de ácido cı́trico 0,05M (deberı́a necesitarse aproximadamente 667 ml de solución de
ácido cı́trico por 1 litro de solución de citrato de sodio).
2. Sustrato - 1 % de carboximetil celulosa
10
15
20
25
Disolver 1,0 g de CMC; viscosidad media (Sigma No. C-4888) en aproximadamente 80 ml de tampón
de citrato 0,05M utilizando preferentemente un agitador magnético de calentamiento. Calentar
hasta el punto de ebullición y enfriar con agitación continuada, cubrir y agitar lentamente durante
la noche. Completar el volumen hasta 100 ml con el tampón de citrato. Se puede almacenar a 4◦C
durante un máximo de una semana.
3. Reactivo DNS
Disolver 5,0 g de ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico (conocido también como ácido 3,5 dinitrosalicı́lico - Merck 800141) en aproximadamente 4 litros de agua. Con una agitación magnética
continua, añadir gradualmente 8,0 g de NaOH y dejar que se disuelva. Añada 150 g de Sal de Rochelle (Kna-tartrate, Merck 8087) en porciones pequeñas con una agitación continua. La solución
se puede calentar cuidadosamente a una temperatura máxima de 45◦C. Enfriar a la temperatura
ambiente y diluir con agua hasta obtener 500 ml en un matraz volumétrico. Si la solución no
queda clara, filtrar a través de un papel de filtro Whatman 1. Almacenar en una botella oscura a
temperatura ambiente.
Muestra
La muestra se diluye en un tampón de citrato de sodio 0,05M. Una dilución adecuada producirá una
absorbancia de 0,3-0,5.
30
35
40
Ensayo
Añadir 1,8 ml de solución del sustrato a dos tubos de ensayo y equilı́brelos a 50◦C durante 5 minutos.
Añadir 200 µl de solución enzimática adecuadamente diluida a uno de los tubos y mezclar con el mezclador vortex. Después de exactamente 5 minutos a 50◦ C añadir 3,0 ml de reactivo DNS a ambos tubos
y mezclar. Añadir 200 µl de la solución de la muestra al tubo incubado sin la muestra (forma inicial de
la enzima). Situar ambos tubos en un baño Marı́a hirviendo de uno en uno. Después de hervir durante
exactamente 5 minutos retirar los tubos y enfriar en agua frı́a hasta la temperatura ambiente. Medir la
absorbancia de la muestra con respecto a la correspondiente de la forma inicial de la enzima a 540 nm.
Leer la actividad de la lı́nea estándar y multiplicar por el factor de dilución.
Estándar
45
Preparar una solución madre 0,01M de glucosa disolviendo 0,180 g de glucosa (Merck 8337; almacenado
en un desecador) en 100 ml de tampón. La solución madre se puede congelar en pequeñas fracciones
alı́cuotas a -20◦C; después de descongelarlos los tubos se deben mezclar cuidadosamente. Realizar las
siguientes diluciones a partir de la solución madre en un tampón de citrato:
Dilución
Glucosa µmol/ml
1:1
1:2
1:4
1:5
10,0
5,0
2,5
2,0
50
55
60
Realizar ensayos por triplicado de cada dilución estándar de la misma manera que la forma inicial de
la enzima: introducir con la pipeta en los tubos de ensayo 1,8 ml de sustrato, realizar la incubación 5
minutos a 50◦C, añadir 3,0 ml de DNS y 200 µl de dilución estándar. Preparar la forma inicial del reactivo
añadiendo 200 µl de tampón de citrato en lugar de la dilución estándar. Hervir los tubos exactamente 5
minutos, enfriarlos y medir la absorbancia con respecto a la forma inicial del reactivo a 540 nm. Construir
una lı́nea estándar para cada serie de ensayos.
21
ES 2 137 903 T3
Ejemplo 8
Ensayo de la actividad de la xilanasa expresada en unidades internacionales
5
Principio
La xilanasa en la muestra hidroliza el sustrato, el xilano de espelta avena, y se determina la cantidad
de hidratos de carbono reductores por medio de un espectrofotómetro utilizando ácido 0dinitrosalicı́lico.
10
15
Unidad de actividad
Una unidad de xilanasa (Unidades Internacionales; IU) se define como la cantidad de enzima que
produce hidratos de carbono reductores con un poder de reducción correspondiente a un µmol de xilosa
(como equivalentes de azúcar reductor) del xilano de espelta avena en un minuto en las condiciones del
ensayo.
Condiciones del ensayo
20
25
Sustrato
pH
Temperatura
Tiempo de Incubación
xilano de espelta avena
5,3
50◦ C ± 0,5◦C
5 min.
Baño marı́a
Baño marı́a
Mezclador de tubos de ensayo (vortex)
Espectrofotómetro
50◦ C
100◦C
Equipo
30
Reactivos
1. Tampón de citrato de sodio 0,05M, pH 5,3
35
40
45
Preparar soluciones 0,05M tanto de ácido cı́trico como de citrato de sodio pesando 10,5 g de ácido
cı́trico (C6 H8 O7 x H2 O) en 1 litro de agua desionizada y 14,7 g de citrato de sodio (C6 H5 O7 Na3 x
2H2 O) en 1 litro de agua desionizada. Se añade la solución de ácido cı́trico a la solución de citrato
de sodio hasta que el pH de la mezcla es 5,3.
2. Sustrato - 1 % de xilano de espelta avena
Disolver 1,0 g de xilano (Sigma N◦ . X-0627) en aproximadamente 80 ml de tampón de citrato
0,05M utilizando preferentemente un agitador magnético de calentamiento. Calentar hasta el punto
de ebullición y enfriar con una agitación continuada, cubrir y agitar lentamente durante la noche.
Completar el volumen hasta 100 ml con el tampón de citrato. Se puede almacenar a 4◦ C durante
un máximo de una semana.
3. Reactivo DNS
50
55
Realizar una suspensión de 20,0 g de ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico (Merck 800141) en aproximadamente 400 ml de agua desionizada. Con una agitación magnética continua, añadir gradualmente a esta suspensión 300 ml de solución de NaOH (32,0 g de NaOH en 300 ml de agua
desionizada). La solución se puede calentar cuidadosamente en un baño Marı́a a una temperatura
máxima de 45◦ C hasta que quede completamente clara. Añadir 600 g de Sal de Rochelle (Knatartrate, Merck 8087) en porciones pequeñas con una agitación continua. Finalmente, diluir la
solución con agua desionizada hasta 2000 ml. Si la solución no queda clara, filtrar a través de un
papel de filtro (Whatman N◦ . 1). Almacenar en una botella oscura a temperatura ambiente.
Muestra
60
La muestra se diluye en un tampón de citrato de sodio 0,05M. Una dilución adecuada producirá una
absorbancia de 0,3-0,5.
22
ES 2 137 903 T3
Ensayo
5
10
Añadir 1,8 ml de solución del sustrato a dos tubos de ensayo y equilibrar a 50◦C durante 5 minutos.
Añadir 200 µl de solución enzimática adecuadamente diluida a uno de los tubos y mezclar con el mezclador vortex. Después de exactamente 5 minutos a 50◦ C añadir 3,0 ml de reactivo DNS a ambos tubos
y mezclar. Añadir 200 µl de la solución de la muestra al tubo incubado sin la muestra (forma inicial de
la enzima). Situar ambos tubos en un baño Marı́a hirviendo de uno en uno. Después de hervir durante
exactamente 5 minutos retirar los tubos y enfriar en agua frı́a hasta la temperatura ambiente. Medir la
absorbancia de la muestra con respecto a la correspondiente de la forma inicial de la enzima a 540 nm.
Leer la actividad de la lı́nea estándar y multiplique por el factor de dilución.
Estándar
15
Preparar una solución madre 0,01M de xilosa disolviendo 0,150 g de xilosa (Merck 8689; almacenado
en un desecador) en 100 ml de tampón. La solución madre se puede congelar en pequeñas fracciones
alı́cuotas a -20◦C; después de descongelarlos los tubos se deben mezclar cuidadosamente. Realizar las
siguientes diluciones a partir de la solución madre en un tampón de citrato:
20
25
30
Dilución
Xilosa µmol/l
1:1
1:2
1:4
1:5
10,0
5,0
2,5
2,0
Realizar ensayos por triplicado de cada dilución estándar de la misma manera que la forma inicial de
la enzima. Introducir la pipeta en los tubos de ensayo 1,8 ml de sustrato, realizar la incubación 5 minutos
a 50◦C, añadir 3,0 ml de DNS y 200 µl de la dilución estándar. Preparar la forma inicial del reactivo
añadiendo 200 µl de tampón de citrato en lugar de la dilución estándar. Hervir los tubos exactamente 5
minutos, enfriar y medir la absorbancia con respecto a la forma inicial del reactivo a 540 nm. Construir
una lı́nea estándar para cada serie de ensayos.
35
Ejemplo 9
40
Se utiliza una solución enzimática que proporciona 90 FPU de actividad de celulasa y 4300 IU de
actividad de xilanasa por ml para tratar 1000 Kg de heno de alfalfa con un 10 % de contenido de humedad. Se diluyen 250 ml de la mezcla enzimática en 50 l de agua y se pulveriza sobre el heno de alfalfa
justo antes del empacado. La composición alimenticia final tendrá un contenido de humedad del 15 % y
contendrá celulasa y xilanasa suficientes como para proporcionar 25 FPU de actividad de celulasa y 1194
IU de actividad de xilanasa por Kga de DM de alimento.
45
50
55
60
Ejemplo 10
Se completan doscientos ml de una solución enzimática que contiene 8000 IU de xilanasa y 200 FPU
de celulasa por ml en un tampón de acetato (100 mM de acetato de sodio; pH 5,0) hasta obtener 1,0 l con
un tampón de acetato. La solución final contiene 1600 IU de xilanasa/ml y 40 FPU de celulasa/ml. La
solución se pulveriza sobre todo el grano de cebada en una proporción de 1,0 l/tonelada. El alimento de
granos tratado contendrá la celulasa y la xilanasa suficientes para proporcionar 40 FPU de celulasa/Kg
de alimento de granos y 1600 IU de xilanasa/Kg de alimento de granos. Seguidamente el grano se puede
procesar aplastándolo en un molino laminador comercial.
Ejemplo 11
Se mezclan cuatro partes de un polvo con 10.000 IU de actividad de xilanasa/g con 1 parte de un
polvo con 1000 FPU de actividad de celulasa/g. La mezcla final contiene 8000 IU de xilanasa/g y 200
FPU de celulasa/g. Se disuelven 400 g del polvo en 5,0 l de un tampón de citrato (50 mM de citrato de
sodio; pH 4,5). La solución enzimática se pulveriza sobre el heno de alfalfa (contenido de humedad del
8 %) en una proporción de 5,0 l/tonelada. La composición alimenticia resultante contendrá celulasa y
xilanasa suficientes como para proporcionar 80 FPU de celulasa/Kg y 3200 IU de xilanasa/Kg de forraje
de alfalfa. A continuación la composición alimenticia resultante se hace pasar a través de unas matrices
23
ES 2 137 903 T3
en un molino de prensado de forraje comercial para formar cubos.
5
10
Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de conocimientos
de aquellos expertos en la técnica a los cuales se refiere esta invención. Todas las publicaciones se incorporan en el presente documento a modo de referencia con el mismo alcance que si se indicara especı́fica
e individualmente la incorporación de cada publicación individual a modo de referencia.
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y como ejemplo
con el propósito de clarificar su comprensión, resultará evidente que se pueden poner en práctica ciertos
cambios y modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
Referencias
15
20
1. Feng, P., C. W. Hunt, W. E. Julien, K. Dickinson y T. Moen. 1992. “Effect of enzyme
additives on in situ and in vitro degradation of mature cool-season grass forage”. J. Anim. Sci. 70
(Suppl. 1):309.
2. Feng, P., C. W. Hunt, W. E. Julien, S. C. Haeny y G. T. Pritchard. 1992. “Effect of enzyme
additives to cool-season grass forage on voluntary intake and digestive function in mature beef steers”.
J. Anim. Sci. 70 (Suppl. 1):310.
3. Chesson, A. 1994. “Manipulation of fibre degradation - an old theme revisited”. Páginas 83-98
en T. P. Lyons y K. A. Jacques (Eds.). Biotechnology in the feed industry, Nottingham University Press.
Loughborough, UK.
25
4. McAllister, T. A., H. D. Bae, L. J. Yanke, K. -J. Cheng y J. K. Ha. 1994. “A review of the
microbial digestion of feed particles in the rumen”. Asian J. Animal Sci. 7:303-316.
30
5. Gilbert, H. J., G. P. Hazlewood, J. I. Laurie, C. G. Orpin y G. P. Xue. 1992. “Homologous
catalytic domains in a rumen fungus xylanase: evidence for gene duplication and prokaryotic origin”.
Molec. Microbiology 6:2065.
6. Soest, P. J. van 1982. “Nutritional Ecology of the Ruminant”. O&B Books. Corvallis, OR.
35
7. National Research Council. 1982. “United States-Canadian Tables of Feed Composition”.
National Academy Press. Washington, D.C.
8. Nelson, C. J. y L. E. Moser. 1994. “Plant factors affecting forage quality”. Páginas 115-154 en
G. C. Fahey (ed.) Forage Quality and Utilization. American Society of Agronomy Inc., Madison, WI.
40
9. Berger, L. L., G. C. Fahey, L. D. Bourquin y E. C. Titgemeyer. 1994. “Modification of
forage quality after harvest”. In G. C. Fahey (ed,) Forage Quality and Utilization. American Society of
Agronomy Inc., Madison, WI.
45
10. Bailey, M. J. y K. Poutanen. 1989. “Production of xylanase by strains of Aspergillus”. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 30:5-10.
11. National Research Council. 1984. “Nutrient Requirements of Beef” Cattle (6a¯ ed.) National
Academy Press. Washington, D.C.
50
12. Goering, H. K. y P. J. van Soest. 1970. “Forage Fiber Analyses”. Agriculture No. 379.
Agriculture Research Service. United States Department of Agriculture.
55
60
24
ES 2 137 903 T3
REIVINDICACIONES
5
10
15
20
25
30
35
1. Complemento enzimático para añadir a forrajes secos de leguminosas o alimentos secos de granos
para rumiantes que comprende: una mezcla de enzimas de celulasa y de xilanasa en la que la celulasa y
la xilanasa están incluidas en cantidades tales que la relación de la actividad de la celulasa con respecto
a la actividad de la xilanasa está comprendida entre aproximadamente 2 y 5 unidades de papel de filtro
(FPU) de actividad de la celulasa por 100 unidades internacionales (IU) de actividad de la xilanasa.
2. Complemento enzimático según la reivindicación 1 en forma de unidad de dosificación adaptada
para ser administrada a forrajes secos de leguminosas, conteniendo el complemento enzimático celulasa
y xilanasa suficientes para proporcionar entre aproximadamente 16 y 120 FPU de actividad de celulasa
y entre aproximadamente 800 y 6000 IU de actividad de xilanasa por Kg de forraje seco de leguminosas,
y en el que la relación de la actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa está comprendida entre aproximadamente 2 y 5 FPU de actividad de la celulasa por 100 IU de actividad de la
xilanasa.
3. Complemento enzimático según la reivindicación 1 en forma de unidad de dosificación adaptada
para ser administrada a forrajes secos de leguminosas, conteniendo el complemento enzimático celulasa
y xilanasa suficientes para proporcionar entre aproximadamente 18 y 72 FPU de actividad de celulasa y
entre aproximadamente 900 y 3600 IU de actividad de xilanasa por Kg de forraje seco de leguminosas,
y en el que la relación de la actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa está comprendida entre aproximadamente 2 y 5 FPU de actividad de la celulasa por 100 IU de actividad de la
xilanasa.
4. Complemento enzimático según la reivindicación 1 en forma de unidad de dosificación adaptada
para ser administrada a alimentos secos de granos, conteniendo el complemento enzimático celulasa y
xilanasa suficientes para proporcionar entre aproximadamente 10 y 200 FPU de actividad de celulasa y
entre aproximadamente 500 y 10.000 IU de actividad de xilanasa por Kg de alimento seco de granos, y en
el que la relación de la actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa está comprendida
entre aproximadamente 2 y 5 FPU de actividad de la celulasa por 100 IU de actividad de la xilanasa.
5. Complemento enzimático según la reivindicación 1 en forma de unidad de dosificación adaptada
para ser administrada a alimentos secos de granos, conteniendo el complemento enzimático celulasa y
xilanasa suficientes para proporcionar entre aproximadamente 40 y 160 FPU de actividad de celulasa y
entre aproximadamente 2000 y 8000 IU de actividad de xilanasa por Kg de alimento seco de granos, y en
el que la relación de la actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa está comprendida
entre aproximadamente 2 y 5 FPU de actividad de la celulasa por 100 IU de actividad de la xilanasa.
6. Composición alimenticia que comprende:
40
45
50
55
60
(a) un material alimenticio seleccionado de entre un forraje de leguminosas, un alimento de granos, o
una mezcla de los mismos, teniendo el material alimenticio un contenido de humedad no mayor que
el 15 % (peso/peso) de modo que la celulasa y la xilanasa en una solución acuosa son absorbidas
por y se adhieren al material alimenticio; y,
(b) una mezcla de celulasa y xilanasa absorbida en y que se adhiere al material alimenticio, para formar
una composición alimenticia estable para rumiantes, suministradas la celulasa y la xilanasa en unas
cantidades tales que la relación de actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa
está comprendida entre aproximadamente 2 y 5 unidades de papel de filtro (FPU) de actividad de
la celulasa por 100 unidades internacionales (IU) de actividad de la xilanasa.
7. Composición alimenticia según la reivindicación 6, en la que el material alimenticio es un forraje
de leguminosas, por ejemplo alfalfa.
8. Composición alimenticia según la reivindicación 7 que contiene celulasa y xilanasa suficientes para
proporcionar la actividad de la celulasa y la actividad de la xilanasa por Kg de forraje de leguminosas y
la relación de actividad de la celulasa con respecto a actividad de la xilanasa especificadas en la reivindicación 2 ó la reivindicación 3.
9. Composición alimenticia según la reivindicación 6, en la que el material alimenticio es un alimento
de granos, por ejemplo cebada.
10. Composición alimenticia según la reivindicación 9 que contiene celulasa y xilanasa suficientes para
proporcionar la actividad de la celulasa y la actividad de la xilanasa por Kg de alimento de granos y la
25
ES 2 137 903 T3
relación de actividad de la celulasa con respecto a actividad de la xilanasa especificadas en la reivindicación 4 ó la reivindicación 5.
11. Método de producción de una composición alimenticia que comprende las siguientes etapas:
5
10
15
20
25
(a) obtención de una o más soluciones acuosas que contienen enzimas de celulasa y de xilanasa de forma
separada o en mezcla;
(b) obtención de un material alimenticio seleccionado de entre un forraje de leguminosas, un alimento
de granos, o una mezcla de los mismos, teniendo el material alimenticio un contenido de humedad no
mayor que el 15 % (peso/peso) de modo que cuando las soluciones acuosas que contienen celulasa y
xilanasa se aplican al material alimenticio, la celulasa y la xilanasa son absorbidas por y se adhieren
al material alimenticio;
(c) aplicación de las soluciones acuosas que contienen celulasa y xilanasa al material alimenticio para
recubrir el material alimenticio, suministradas la celulasa y la xilanasa en unas cantidades tales que
la relación de actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa está comprendida
entre aproximadamente 2 y 5 unidades de papel de filtro (FPU) de actividad de celulasa por 100
unidades internacionales (IU) de actividad de xilanasa; y,
(d) incubación del material alimenticio recubierto con las soluciones acuosas hasta que la xilanasa y
la celulasa son absorbidas en y se adhieren al material alimenticio, de modo que se obtiene una
composición alimenticia estable para rumiantes.
12. Método según la reivindicación 11, en el que en la etapa (c), se aplican volúmenes suficientemente
pequeños de soluciones acuosas al material alimenticio de manera que el contenido de humedad del material alimenticio no aumenta hasta por encima de aproximadamente el 18 %.
13. Método según la reivindicación 12, en el que en la etapa (d), el material alimenticio se incuba
durante al menos aproximadamente 3 horas, y preferentemente durante al menos 8 horas.
30
14. Método según la reivindicación 13 en el que el material alimenticio es un forraje de leguminosas,
por ejemplo alfalfa.
35
15. Método según la reivindicación 14 en el que al material alimenticio se le aplican celulasa y xilanasa suficientes para proporcionar la actividad de la celulasa y la actividad de la xilanasa por Kg de
forraje de leguminosas y la relación de actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa
especificadas en la reivindicación 2 ó la reivindicación 3.
40
16. Método según la reivindicación 13 en el que el material alimenticio es un alimento de granos, por
ejemplo cebada.
45
17. Método según la reivindicación 16 en el que al material alimenticio se le aplican celulasa y xilanasa
suficientes para proporcionar la actividad de la celulasa y la actividad de la xilanasa por Kg de alimento
de granos y la relación de actividad de la celulasa con respecto a la actividad de la xilanasa especificadas
en la reivindicación 4 ó la reivindicación 5.
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
26
ES 2 137 903 T3
27
ES 2 137 903 T3
28
ES 2 137 903 T3
29