La psorosis viral de los cítricos

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La psorosis viral de los cítricos .
Maruchi Alonso E.
Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical
Introducción
Psorosis es una de las enfermedades virales más antiguas descritas en los cítricos. En
1896, cuando la enfermedad fue desrita y nombrada en Florida (USA) por Swingle y
Webber, la etiología viral aún no se conocía. Una enfermedad similar fue identificada en
California en 1908 por Smith y Butler, la cual nombraron descamamiento de la corteza
(scaly bark). Parecía ser la misma enfermedad identificada años anteriores en Florida
basada en la similitud de los síntomas y los efectos a largo plazo en los cítricos. Pero no
fue hasta 1933, que se reconoce la etiología viral de la psorosis. Fawcett observó
síntomas de mosaico en hojas jóvenes de árboles de cítricos y estableció su parentesco
con las lesiones corticales, a partir de aquí sugirió que la enfermedad era causada por un
virus (Roistacher, 1993).
En un tiempo una serie de enfermedades las cuales incluyen psorosis A, psorosis B,
concavidad gomosa, abolladuras en las hojas y variegación infecciosa se denominaron
complejo o grupo de psorosis debido a que eran transmisibles por injerto e inducían
manchas y flecos cloróticos en hojas jóvenes de las plantas indicadoras inoculadas en
invernadero. La impietratura y cristacortis, otras dos enfermedades de los cítricos,
también fueron en ese tiempo consideradas dentro del grupo de psorosis (Roistacher et
al.,2000).
Roistacher (1993) plantea que Wallace en 1945, descubre que la inoculación de yemas
infectadas con psorosis en plantas indicadoras como naranjo dulce reduce el tiempo de
detección de psorosis, a un período de 6-10 semanas basado en la presencia de síntomas
en hojas jóvenes. Esta evidencia abrió el camino en la detección de la psorosis y
enfermedades asociadas a ellas.
El diagnóstico de psorosis A y psorosis B fue determinado por el desarrollo de una
reacción de shock necrótica en las hojas de naranjo dulce inoculadas, apareciendo este
síntoma a las 5 semanas después de la inoculación. Sin embargo, las enfermedades del
complejo (concavidad gomosa, variegación infecciosa y abolladuras en las hojas)
manifestaron solamente los síntomas en hojas jóvenes de las plantas indicadoras en un
período de 6-10 semanas. Con los resultados de los ensayos biológicos, varios científicos
comenzaron a investigar las relaciones entre las enfermedades del complejo psorosis,
empleando para esto la protección cruzada.
Una de las primeras investigaciones (Garnsey and Timmer, 1988) mostró que cuando se
inoculaba con corteza descamadas de árboles con psorosis B, plantas de naranjo dulce
preinoculadas con trozos de corteza de árboles con psorosis A; éstas últimas no
mostraban lesiones en la corteza ni síntomas en las hojas maduras. De modo que se pudo
establecer una relación entre los tipos A y B, donde la psorosis A protege contra la
infección de psorosis B.
En 1968, Wallace y Drake describen por primera vez la enfermedad ringspot de los
cítricos (citrus ringspot: CRSV), la cual producía síntomas en la corteza y en las hojas
muy similares a los de psorosis A y B. Fueron consideradas enfermedades diferentes
debido a que la psorosis A producía solamente flecking en las hojas jóvenes mientras
que psorosis B y CRSV producían manchas anulares y líneas necróticas que persistían en
las hojas maduras. Sin embargo, las pruebas de protección cruzada con varios aislados,
indicaban que la psorosis B era una forma severa de psorosis A y que CRSV y psorosis B
eran muy similares pudiendo ser sinónimos de una misma enfermedad (Derrick et al.,
1991).
En experimentos similares, los cítricos inoculados con psorosis A no mostraron
protección cruzada contra concavidad gomosa, variegación infecciosa y abolladuras en
las hojas (Levy and Gumf,1991).
Timmer y Beñatena en 1977 plantean que los virus de abolladuras en las hojas y
variegación infecciosa no pueden ser incluidos en este complejo, pues las partículas
virales purificadas eran esféricas y de un diámetro de 26 a 32nm, distintas a la reportadas
para psorosis (Roistacher, 1993). Por otra parte, se evidencia que las enfermedades
conocidas como: concavidad gomosa, impietratura y cristacortis producían patrones de
hojas de roble en las hojas de árboles de campo y en las plantas indicadoras, síntoma no
característico de la psorosis así como, rara vez, inducían la reacción de shock en la
primera brotación. Además, da Graca et al (1991;1993) mostraron que aislados de estas
tres enfermedades no contenían la proteína de 48 Kda comúnmente asociada a los
aislados de psorosis y ringspot.
Debido a la diversidad de síntomas que ocasionan estas enfermedades en campo y a que
se ha podido establecer la etiología de algunos de ellos, estos síntomas se consideran , en
estos momentos, producidos por enfermedades diferentes.
En un tiempo, psorosis fue la enfermedad más destructiva de los cítricos. Actualmente,
debido a la diseminación natural de formas severas de la enfermedad, la psorosis es aún
una enfermedad seria y destructiva en algunos campos. Se encuentra distribuida por todo
el mundo causando una disminución del vigor, de la producción y la reducción de la vida
útil de los árboles de cítricos en muchas regiones incluyendo América del Sur, áreas del
Mediterráneo y probablemente Asia (Roistacher, 1993; Martelli and D’ Onghia, 1998).
Es objetivo de este trabajo brindar la mayor información posible de los estudios más
recientes sobre citrus psorosis virus, enfermedad viral de los cítricos.
1. Psorosis
La psorosis, como originalmente fue descrita por Swingle y Webber es una enfermedad
asociada con el descamamiento típico de la corteza en troncos y ramas de naranjo dulce
(Citrus sinensis (L.) Osb), mandarina (Citrus deliciosa Ten) y toronja (Citrus paradisi
Macf).
Según Roistacher (2000) la historia de la psorosis ha sido revisada por varios autores y
plantea que en sus primeros estudios, Fawcett y Klotz (1938) diferenciaron dos tipos
sintomáticos de psorosis, los cuales llamaron “psorosis A”, que se caracteriza por una
descamación lenta del tronco y ramas principales y “psorosis B”, que se desarrolla más
rápido afectando incluso a ramas delgadas. Ambos tienen síntomas similares en las
lesiones de la corteza pero en hojas viejas y maduras, el tipo B muestra grandes manchas
anulares cloróticas (larger chlorotic ring spot) así como síntomas en los frutos desde
anillos circulares a semicirculares que son raros en el tipo A (Roistacher, 1993;
Guerri,1999).
Posteriormente, Wallace en 1957 demuestra que existe protección cruzada entre ambos
tipos de psorosis. Se puso de manifiesto que al injertar trozos de corteza de las zonas
descamadas de árboles con psorosis A en plantas de naranjo dulce en invernadero, éstas
mostraban síntomas de psorosis B. Sin embargo, cuando se inoculaba con psorosis B o
con corteza descamadas de psorosis A, plantas de naranjo dulce preinoculadas con
psorosis A, los síntomas de psorosis B no aparecían. Lo que indica que la psorosis A
protege contra la infección del tipo B y esta es una forma severa de la psorosis A. En
1978, este mismo autor planteaba que la psorosis A contiene los componentes o razas de
la psorosis B pero la protección cruzada interna retarda la expresión de las lesiones en la
corteza y que ambas razas (A y B) son sistémicas en todos los árboles infectados. A la
vista de estos resultados se concluyó que la psorosis A y B debían ser producidas por el
mismo patógeno (Roistacher, 1993; Roistacher et al, 2000).
Otra raza más severa considerada dentro de la enfermedad psorosis, se describió en
California en 1896 y se denominó manchas anulares (citrus ringspot), cuyos síntomas
característicos eran la producción de flecos, manchas y anillos cloróticos en las hojas.
Estos síntomas afectaban, a veces, a los brotes y a los frutos. Síntomas similares a los
observados en varios países según Navas-Castillo and Moreno (1993).
Por otra parte, en plantas indicadoras inoculadas con aislados de ringspot, las hojas
jóvenes sufren reacción de shock y se necrosan los primeros brotes, después de la
inoculación. Esta observación y el hecho de que tanto la psorosis como la enfermedad de
las manchas anulares fuesen transmisibles mecánicamente a Chenopodium quinoa y de
que a partir de varios aislados se purificasen partículas virales idénticas, han llevado a
que actualmente se consideren síndromes distintos de una misma enfermedad (Derrick et
al, 1991; da Graca et al, 1991; García et al, 1994).
2.Agente causal
La psorosis fue la primera enfermedad de los cítricos a la que se atribuyó una etiología
viral. Recientemente, se ha caracterizado a su agente causal, como un nuevo virus: citrus
psorosis virus (CPsV) ubicado en un nuevo género Ophiovirus (Milne et al, 2000), en
referencia a la palabra griega ophis que significa serpierte debido a la apariencia de las
partículas virales.
El CPsV es un virus multicomponente, sin envoltura, con un genoma constituido por 3
RNAs, RNA 1,2 y 3, de polaridad negativa (Milne et al, 1996; 2000; García et al, 1997).
El RNA1 tiene aproximadamente 8,2 kbases de longitud y contiene dos “open reading
frames” (ORF) que se expresan de la misma cadena (Garcia, comunicación personal).
Uno de los ORF codificaría para la RNA polimerasa viral y el otro más pequeño de
función desconocida. El RNA 2, de aproximadamente 1,6 kbases codifica para una
proteína de 54K cuya función no se conoce. EL RNA 3 codifica la proteína de cubierta de
48K (Sánchez de la Torre et al., 1998).
Las partículas virales observadas por microscopía electrónica son finos filamentos
circulares con un diámetro de 3 nm y de 2000 nm de longitud la mas grandes y otras mas
pequeñas que son de 400-600 nm (García et al., 1994; Milne et al., 1997).
Mediante centrifugación en gradiente de sacarosa las partículas virales pueden ser
separadas en lo que se ha denominado dos componentes (top y bottom) de acuerdo a su
ubicación en el gradiente. Cada uno de estos componentes por separado no es infeccioso
en C.quinoa mientras que la mezcla de ambos induce las lesiones locales características
en este indicador (Derrick et al, 1988; 1991; García et al, 1991; da Graca et al. 1993;
Navas-Castillo et al, 1993; Navas-Castillo y Moreno, 1993; 1995). El componente “top”
contiene el RNA 2 y RNA 3 y el componente “bottom” el RNA 1 (Sánchez de la Torre
et al, 1998; Naum et al, 1998). Los dos componentes contienen partículas de tamaños
diferentes pero de morfología similar y en ambos se detecta la proteína de 48 kDa, que es
la proteína capsídica del virus (García et al, 1997).
3.Sintomatología
La presencia de descamaciones en la corteza del tronco y ramas de los árboles afectados
es el síntoma más caracterís tico que sirvió para denominar la enfermedad. Los síntomas
se inician generalmente cuando el árbol tiene 10-15 años con pequeñas lesiones en la
corteza (foto 1), que se agrandan paulatinamente hasta cubrir parcial o totalmente el
tronco y ramas. Estas lesiones se levantan, se secan y finalmente se van desprendiendo
dando lugar a descamaciones (Roistacher, 1991;1993; Navas-Castillo y Moreno, 1995;
Roistacher,2000).
La psorosis A puede ser identificada en el campo, cuando se producen descamaciones
muy localizadas que afectan al tronco y ramas principales mientras que la psorosis B
causa descamamiento exuberante en ramas delgadas de los árboles (Roistacher, 1993;
Guerri,1999) (foto 2). A veces puede encontrarse descamación en ramas de menos de
1cm de diámetro.
Las lesiones corticales comienzan como gránulos o pequeñas escamas sobre la corteza
exterior, los cuales acaban por desprenderse de la corteza. Según las lesiones avanzan ,
las capas más profundas de la corteza se desorganizan y algunos de los tejidos se
impregnan de goma. La escamadura es más o menos continua y las lesiones aumentan en
tamaño. Porciones de la corteza mueren entonces como resultado de ser aisladas por
capas de felógenos que forman por debajo células portadoras de las materias gomosas. A
medida que el crecimiento avanza, la corteza muerta se fractura y eventualmente se
descascara en escamas de diversos tamaños y grosor, creciendo gradualmente el área de
la lesión. Algunas veces las lesiones exudan goma, particularmente de los límites de las
zonas descamadas (Roistacher, 1993; Guerri,1999).
Inmediatamente después que las lesiones corticales se hacen visibles, comienzan a
formarse capas de goma debajo de la madera, la goma aparece en algunos de los vasos
leñosos (xilema) y se acumula en la vecindad de las placas perforadas de los vasos
conductores (Roistacher, 1993;).
Al realizar un corte transversal a un tronco o ramas a través de la zona afectada, se
observa en la madera zonas de color pardo de forma irregular (foto 3). Las cuales se
corresponden con exudaciones de goma que invaden los vasos del xilema y bloquean la
conducción de agua y nutrientes. Esto trae como consecuencia que se produzcan un
decaimiento progresivo del árbol, se sequen las ramillas y una reducción de la
producción. En casos extremos, el árbol puede llegar a morir (Guerri,1999).
En las hojas jóvenes de los árboles afectados por psorosis, se presentan flecos cloróticos
que se observan a trasluz (foto 4) y que se sitúan normalmente entre los nervios laterales
de las hojas y paralelas a ellos. A veces, aparecen puntos cloróticos o manchas difusas en
los brotes jóvenes y esta gama de síntomas suele desaparecer a medida que las hojas
maduran.
En el caso de los árboles de campo afectados por psorosis B, algunas veces se observa la
aparición de necrosis en los brotes jóvenes (reacción de shock). Además suele aparecer
manchas amarillentas en el haz de las hojas adultas, que se corresponden con pequeñas
lesiones de color pardo y aspecto gomoso en el envés (foto 100) (Roistacher, 1993;
Guerri, 1999). Además, la psorosis B puede mostrar variación en los síntomas de las
hojas y frutos incluyendo los patrones de ringspot (manchas anulares) en las hojas. En
aislados de California y Sudáfrica obtenidos de árboles de campo con descamaciones en
la corteza característico de psosrosis no muestran los síntomas típicos en las hojas
jóvenes y maduras (Roistacher, 1993) excepto cuando hay en el árbol más de una
infección. Por tanto, con la simple observación de los síntomas en las hojas no se
recomienda el diagnóstico de psorosis.
Los árboles infectados con los aislados de manchas anulares (ringspot) presentan la
típica descamación en tronco y ramas y se caracterizan por la presencia de manchas
cloróticas en hojas y frutos que posteriormente se vuelven amarillentas y pueden tomar
forma de anillos (foto 101)(Roistacher, 1993; Navas-Castillo y Moreno, 1993;
Guerri,1999; Roistacher et al, 2000).
La mayoría de las especies y variedades comerciales de cítricos pueden infectarse con
psorosis. Los grupos más sensibles a la descamación son naranjo dulce (Citrus sinensis
(L.) Osb), toronja (Citrus paradisi Macf), y mandarina ( Citrus deliciosa Ten) aunque
dentro de estas últimas los clementinos parecen ser menos sensibles (Roistacher, 1991;
1993).El naranjo agrio (Citrus aurantium L.), limoneros (C itrus limon (L.) Burm. F. ) y
pomelos estando infectados, rara vez, muestran síntomas de descamación.
Muchas variedades de cítricos pueden estar infectadas con el virus de la psorosis sin
mostrar descamación en la corteza o síntomas en las hojas de los árboles de campo,
siendo en este caso, portadores asintomáticos de la enfermedad (Roistacher, 1993; Guerri,
1999). La presencia o ausencia del virus puede ser verificado por indexing biológico en
plantas de cítricos indicadoras y últimamente por otros métodos serológicos y de
detección de los ácidos nucleicos virales.
4.Detección de citrus psorosis virus
Indexing biológico
El diagnóstico de la psorosis se ha efectuado tradicionalmente mediante ensayos de
infectividad sobre plantas de semilla cultivadas en invernadero. Las plantas indicadoras
más utilizadas son las variedades de naranjo dulce Pineapple, Olivelands (Citrus sinensis
(L.) Osb) y Madame Vinous (Citrus sinensis (L.) Burm). Por otra parte, el cidron, Tangor
Dweet, ciertas mandarinas y limón agrio son excelentes indicadores para psorosis A
((Roistacher, 1993; Martín et al, 2000; Roistacher et al, 2000).
Estas plantas se inoculan por injerto con dos trozos de corteza de la planta a diagnosticar,
se podan para forzar la brotación y se incuban en invernaderos a 18-26°C. Como control,
se incluyen plantas autoinoculadas y plantas inoculadas a partir de un aislado bien
caracterizado de psorosis. A las 3-4 semanas de la inoculación aparecen los primeros
síntomas, que normalmente consisten en una reacción de shock que hace que los nuevos
brotes se curven, pierdan las hojas, se sequen progresivamente y terminen necrosándose
en su totalidad (foto 4). En las brotaciones siguientes normalmente no se induce la
reacción de shock y las hojas jóvenes muestran flecos o manchas cloróticas que van
desapareciendo conforme envejecen. A veces la reacción de shock no se manifiesta y en
estos casos las hojas jóvenes de estas plantas muestran manchas y flecos cloróticos que
no se distinguen de los inducidos por otras enfermedades (Roistacher, 1993; NavasCastillo y Moreno, 1993; Guerri, 1999).
La temperatura durante las primeras cuatro semanas después de la inoculación es
fundamental para la expresión de los síntomas. Las temperaturas frías favorecen la
manifestación de la reacción de shock en los nuevos brotes jóvenes mientras que las altas
temperaturas pueden inhibir esta reacción y los síntomas en las hojas (Roistacher, 1993;
Roistacher et al, 2000).
Navas-Castillo and Moreno (1993) encontraron que el efecto de la temperatura de
incubación depende de la combinación hospedero-aislado. En algunas combinaciones, los
síntomas en altas temperaturas son más intensos que en temperaturas frías mientras que
en otras combinaciones ocurre lo contrario.
Protección cruzada
Para confirmar el diagnóstico de la enfermedad se utiliza el ensayo de protección
cruzada. Este consiste en sobreinocular
las plantas que previamente mostraron los
síntomas foliares con dos trozos de corteza de una fuente de psorosis B. Como control se
incluye plantas sin sobreinocular y plantas inoculadas sólo con psorosis B. Solo las
plantas sanas y las preinoculadas con un virus distinto a psorosis muestran a los 2-6
meses de la inoculación con psorosis B pústulas en los nuevos brotes (foto 102) y
manchas foliares características de psorosis B (foto 5)(Levy and Gumpf, 1991;
Roistacher, 1993; Guerri, 1999; Roistacher et al, 2000).
Microscopía electrónica
La microscopía electrónica, a pesar de ser un método que permite detectar el virus de la
psorosis, constituye una vía para el estudio de la enfermedad. Primeramente, nos ayuda a
entender el tipo de virus involucrado en el sentido taxonómico. Esto es importante porque
por analogía con otros virus conocidos, se puede sugerir muchas de las propiedades que
posea el virus, como sus características moleculares y su comportamiento en el campo.
La habilidad desarrollada por el investigador para reconocer las partículas virales en sus
diferentes formas podría ser una ayuda en el diagnóstico usando microscopía electrónica
así como contribuir a identificar un tipo de virus a partir de otras enfermedades con
síntomas similares pero con virus no relacionados (Byadgi et al, 1993; Navas-Castillo et
al, 1993; Navas-Castillo and Moreno,1995).
Por ejemplo, en el caso del CPsV, el componente bottom fundamentalmente presenta
partículas largas y superenrrolladas formando estructuras a manera de ovillos y el
componente top presenta
partículas más pequeñas y
enrrolladas en forma circular
(Milne et al, 1996; Milne et al, 2000).
El indexing biológico es un ensayo lento y muy costoso, requiere del control de la
temperatura en las casas de invernadero y de un período de 2-4 meses para la evaluación
del material que se pruebe. En ocasiones, bajo condiciones óptimas, muchos aislados de
CPsV dan negativos, los síntomas en las hojas de las plantas indicadoras son transitorios
por lo que se hace difícil la detección biológica. De modo que, se hace necesario
desarrollar métodos de diagnóstico más rápidos, simples y de gran valor para entender la
extensión y la dinámica de la enfermedad así como para la evaluación de los indexing de
rutinas y las replantaciones de material libre de psorosis (Alioto et al, 1999).
Técnicas serológicas y moleculares
El desarrollo de ensayos serológicos para detectar todos los aislados de CPsV requieren
de la obtención de anticuerpos para varios aislados diferentes. Los mismos han sido
limitados debido a la dificultad en la purificación de los viriones para la producción de
antisuero y la considerable diversidad de aislados. En un inicio se obtuvo un antisuero
policlonal para el aislado CPV 4 pero solamente reaccionaba con pocos aislados (da
Graca et al, 1991; 1993).
García et al (1997) usaron un antisuero para CPsV en un ELISA sandwich de doble
anticuerpo (DAS-ELISA). Los resultados obtenidos fueron totalmente correlacionados
con los datos de los indexing biológicos. Esto es importante porque demuestra que la
presencia de CPsV está fuertemente asociado con los síntomas clásicos de psorosis. El
mismo antisuero fue usado para mostrar que CPsV está ampliamente diseminado en
Apulia al sur de Italia (Djelouah y D'Onghia, 1998; D'Onghia et al, 1998). Sin embargo,
el método no fue muy sensible y solamente pudo ser usado en las hojas de la primera
brotación, preferiblemente en el material del invernadero.
Recientemente, en Italia, han sido preparados anticuerpos monoclonales (mabs) de
aislados de CPsV (Djelouah et al, 1999) para su uso en un ELISA sandwich de triple
anticuerpo (TAS-ELISA), permitiendo detectar y diferenciar aislados de CPsV de
diversas partes del mundo.
Los resultados muestran que el empleo del Mabs IgG (13C5) en el TAS-ELISA es una
poderosa herramienta para la detección del CPsV y podría ser usada en el diagnóstico y
programas de cuarentena. El ensayo ofrece suficiente sensibilidad para detectar el virus
en bajas concentraciones, en estaciones no favorables del año o en muestras compuestas
que incluyen algún material sano. El hecho es que este detecta todos los aislados
disponibles sugiriendo que este Mabs reconoce un epítope universal, distribuido en un
amplio rango de variantes (Alioto et al, 1999).
Por otra parte, el Mabs IgM (2A3) aunque no detecta todos los aislados disponibles
podría ser usado con otros mabs tales como aquellos de Djelouah et al (1999) en la
diferenciación de razas de CPsV.
Los protocolos desarrollados para el DAS- ELISA y el uso de anticuerpos monoclonales
(Mabs) en TAS-ELISA han permitido la detección segura del virus en material de campo
en todas las estaciones del año( García et al, 1997; Legarreta et al, 1998). Estos resultados
y aquellos de Djelouah y D'Onghia (1998) y D'Onghia et al (1998) dan la importancia de
establecer un programa de certificación y erradicación para el CPsV (Alioto et al, 1999,
2000).
Para lograr sistemas de detección más rápido y efectivo se han usado secuencias de la
proteína de cubierta (CP) de un aislado de psorosis (CPV-4) para desarrollar RT-PCR e
hibridación para CPsV.
Para los ensayos de detección basados en RT-PCR, porciones del RNA 1 han sido
clonadas y fueron obtenidas secuencias a partir de las cuales, fueron diseñados primers
para el RT-PCR (García et al, 1997). Los primers (CPV1 y CPV2) permiten la
amplificación de un producto de 600 pb entre los núcleotidos 654 y 1253 de la CP
(Barthe et al, 1998) así como los primers (CPV3 y CPV4) son
usados para la
amplificación de la CP de varios aislados de psorosis de diferentes localidades
geográficas.
En ambos casos, el RT-PCR es capaz de detectar en árboles de campo infectados y en
condiciones de invernadero, CPsV en concentraciones sustancialmente bajas que aquellas
requeridas para la detección por inmunoensayos y microscopía electrónica (García et al,
1997). Sin embargo, la sensibilidad no ha sido la suficientemente alta para detectar
aislados heterologos de psorosis usando los primers diseñados a partir del CPV-4 (aislado
de USA), indicando que los primers pueden estar amplificando alguna región variable del
genoma. Sin embargo, otro factor es que CPV-4 alcanza concentraciones relativamente
altas en tejidos infectados, respecto a muchos otros aislados de psorosis (García et al,
1997).
Los resultados obtenidos hasta el momento (García et al, 1997; Barthe et al, 1998)
muestran que el RT-PCR ha sido capaz de detectar CPsV en preparaciones crudas. Sin
embargo, los primers diseñados a partir del aislado CPV-4, podrían detectar aislados de
virus homólogos en árboles de cítricos infectados pero la prueba podría ser menos
sensible para aislados heterologos.
En la investigación del CPsV,
muchos esfuerzos se han realizado para obtener un
procedimiento simple y eficiente para la extracción del ácido nucleico viral a partir de
diferentes tejidos de cítricos y para evitar interferencias con reacciones enzimáticas por
sustancias inhibidoras presentes en las muestras de cítricos. Para la detección del RNA de
CPsV en tejidos de cítricos se ha desarrollado un ensayo de heminested RT-PCR, el cual
es altamente sensible y reproducible, es capaz de detectar CPsV en diluciones de 1010 de
la muestra original (Legarreta et al, 2000).
A partir del RNA1 de diferentes aislados, se obtuvo un segmento amplificado de 313 pb,
el cual fue clonado y secuenciado. Las secuencias obtenidas fueron usadas para el diseño
de los primers del ensayo heminested PCR. Los resultados mostraron que esta región está
conservada en todas las secuencias detectadas a partir de los aislados de Argentina,
sugiriendo que son muy similares (Legarreta et al, 2000). Esto corresponde con lo
encontrado por Djelouach et al (1998) indicando que poblaciones de una misma región
geográfica muestran muy poca variación, cuando analizó 24 epitopes con mabs.
El virus de la psorosis en el campo puede variar considerablemente, de modo que
solamente una prueba no puede detectar todo. De esta forma, todos los métodos de
diagnóstico descritos constituyen una herramienta para la detección del CPsV (Martín et
al, 2000).
5.Transmisión
El virus se disemina por el uso de yemas infectadas, o sea, se transmite principalmente
por injerto siendo el material vegetal propagativo la vía primaria
de dispersión de
psorosis (Roistacher,1991, 1993). En árboles menores de 10 años, rara vez aparecen las
descamaciones en el tronco y es probable que esta situación fa vorezca la propagación de
yemas infectadas por los productores, los cuales asumen que están libres del patógeno.
Esto puede explicar gran parte de la alta incidencia de la enfermedad en algunas áreas
del mundo (Martín et al, 2000).
Muchos aislados de psorosis pueden ser transmitidos a especies herbáceas,
principalmente
Chenopodium quinoa y Gomphrena globosa. Los síntomas pueden
aparecer a los 4-6 días, después de la inoculación y se caracterizan por lesiones locales
cloróticas que luego se necrosan y adquieren color pardo (Garnsey y Timmer, 1980). Las
lesiones de G.globosa suelen tener un halo rojizo alrededor (Roistacher, 1993).
Garnsey y Timmer tuvieron buenos resultados trasmitiendo mecánicamente aislados de
ringspot de Florida, Texas y California de cítricos a C.quinoa. La transmisión mecánica
de los aislados que mostraron síntomas en C.quinoa a nuevas plantas de cítricos no se
logró pero si pudieron transmitir aislados de ringspot a partir de C.quinoa a G.globosa.
Experimentalmente, la transmisión mecánica de algunos aislados a especies de cítricos
sanas ha sido demostrada, puede ser diseminado por utensilios usados en el vivero o en
campo (cuchilla, injertadores o tijeras) pero la diseminación en el campo no ha sido
reportada (Roistacher, 1991; Guerri, 1999).
Según Roistacher (1993), Bouhida en 1984, logra transmisión del virus a partir de cidron
infectado con psorosis a C.quinoa y Nicotiana benthamiana. Este aislado fue ps-203-M
derivado del Kao Panne Pummelo, el cual fue introducido de Thailandia e inducía
síntomas de shock severos en las hojas jóvenes al ser transmitido a cidron y naranja
dulce. De esta manera, se logra que el virus sea transmitido mecánicamente de cidron a
cidron.
Por otra parte, Levy y Gumpf (1991) trabajando con esta misma fuente de psorosis (ps203-M) fueron capaz de transmitir mecánicamente el virus a un número de hospederos
herbáceos. Además, lograron transmitir por cúscutas el virus de cidron a Capsicum
annum y de este hospedero nuevamente a cidron, induciendo los síntomas característicos
de psorosis en las hojas de cidron.
El cidron, es en ambos casos un excelente hospedero y planta receptora. Es importante
reconocer que aislados de psorosis A son díficiles de transmitir mecánicamente o quizás
no hay transmisión mecánica a partir de naranja dulce o cidron infectado a otros cítricos u
hospederos herbáceos (Roistacher, 1993, 2000).
No hay evidencias experimentales de que la psorosis pueda ser transmitida a través del
polen y las semillas (Roistacher, 1993, Roistacher et al, 2000).
En algunos países como Argentina, Uruguay o Texas se ha encontrado evidencias de que
existe una dispersión natural de la enfermedad en campo, pero aún no se conoce el vector
(Roistacher, 1993; Roistacher et al, 2000). El decline de los árboles por infección natural
de psorosis es un grave problema en Argentina y Uruguay.
La hipótesis de que la difusión natural de la enfermedad se debería a la acción de un
insecto vector, fue enunciada por Rodríguez Pujol y Beñatena (1965). Posteriormente,
Timmer y Beñatena (1977) dan el porcentaje de plantas infectadas naturalmente con un
virus parecido a la psorosis, de un total de 621 plantas de distintas especies injertadas
sobre Troyer y trifoliados así como de un block de 342 plantas de semillas, en Concordia,
Argentina.
Timmer y Garnsey (1980) en inspecciones a huertos de pomelo de origen nucelar, en
Texas, observaron difusión natural de citrus ringspot virus (CRSV). Los árboles
presentaban lesiones en la corteza y/o síntomas de ringspot. Determinaron, después de
ocho años de observaciones, un incremento muy lento de la enfermedad que no superó el
2% en ninguno de los huertos. Las pruebas realizadas para transmitir CRSV a plantines
de naranjo dulce y/o lima Mexicana (Citrus aurantifolia Swingle) con insectos dieron
resultados negativos después de un año de observación.
Portillo y Beñatena (1981) obtuvieron resultados negativos hasta ese momento, en los
intentos de transmitir psorosis a plantines de Citrus spp. por medio de los áfidos
Toxoptera citricidus. Finalmente, en 1989 logran experimentalmente la transmisión de
psorosis de plantas enfermas a plantines sanos de cítricos con T.citricida, T.aurantii y
Aphis citricola. Pero al considerar el amplio período de incubación de la enfermedad y el
comportamiento errático de la manifestación de los síntomas foliares, se hace evidente la
necesidad de contar con nuevos trabajos que demuestren la transmisión por áfidos u otro
vector.
6.Control de la enfermedad
La termoterapia ha sido el método terapéutico utilizado para eliminar la psorosis
(Roistacher, 1993). Puede ser aplicada a material de la planta en reposo o a plantas en
crecimiento activo. En el primer caso, suele usarse tratamiento con agua caliente a
temperaturas comprendidas entre 35 y 54ºC y durante períodos que oscilan desde pocos
minutos a varias horas; en el segundo, normalmente se emplea aire caliente. En general,
el tratamiento por aire permite incrementar supervivencia de las plantas y es más eficaz
en la eliminación del virus y el tratamiento sobre plantas en crecimiento es más efectivo
sobre material en reposo. Pueden ser empleados en este ensayo, los patrones lima
Rangpur y naranja trifoliada así como citrange Troyer o Carrizo, que son altamente
tolerables al calor. Sin embargo, la naranja dulce y el limón rugoso no son tolerantes al
calor, por lo que no se recomienda su uso (Roistacher, 1993).
Es el método más comúnmente empleado para la obtención de material libre de virus en
cítricos. Para ello, las plantas en macetas se mantienen en un ambiente a temperatura
contínua entre 35 y 37ºC, que limita la multiplicación de los virus en los extremos de los
brotes en crecimiento, durante 30-40 días. A continuación, pueden separarse los ápices de
2 a 10mm, indemnes de virus, los cuales son injertados sobre plantas sanas obtenidas de
semilla. Posteriormente, es necesario verificar su estado sanitario.
Para incrementar las posibilidades de obtención de plantas libres del CPsV en casos
difíciles, especialmente cuando hay más de un aislado, se ha utilizado la termoterapia y el
cultivo de meristemos de forma combinada. Se aplica un tratamiento por termoterapia
antes de iniciar el proceso de cultivo de meristemos, con el cual se consigue una
reducción de la concentración del virus y/o una aplicación de la zona libre de virus
(Roistacher, 1993).
La técnica del microinjerto, también, ha sido utilizada para eliminar la psorosis. Según
Monteverde et al (1991), el cultivo de ápice de los árboles leñosos, como una forma de
obtener plantas libres de virus o similares, es una técnica difícil, de allí que Murashigue
et al en 1972, idearon microinjertar patrones de cítricos de pocas semanas de germinados
con ápices caulinares (meristemos más 2-3 hojas de primordio). En esta oportunidad, el
porcentaje de prendimiento varió entre 5-40%. Luego, Navarro et al en 1975
determinaron exactamente las condiciones ambientales más favorables para un mayor
prendimiento del microinjerto, logrando elevarlo entre un 30-50%. Posteriormente se
comprobó que la mayoría de las plantas producidas quedaron libres de virus (Monteverde
et al (1991).
Por esta técnica es posible eliminar patógenos como: Tristeza, Variegación Infecciosa,
Psorosis A, Psorosis B, Exocortis ,Cachexia entre otros. Pero, Monteverde et al (1991)
plantean que en trabajos realizados por Navarro et al en 1976 sostienen que en el caso de
Psorosis el número de plantas cítricas libres de estos patógenos, obtenidas a través de
microinjertación de ápices in vitro, puede variar de acuerdo al tamaño del ápice,
conformado por el área meristemática más el número de primordios. Así que, cuando el
número de primordios se incrementa de 2-4 el número de plantas libres de Psorosis se
reduce.
Por otra parte, plantea que Navarro et al en 1980, también han encontrado que cuando
los retoños para los microinjertación son tomados durante la primavera u otoño, o de
inviernos fríos (18-25ºC), el porcentaje de plantas libres de síntomas de psorosis se
reduce a un 20%. Por el contrario, cuando éstos se toman de invernaderos calientes (2732ºC) se obtiene hasta un 88% de plantas libres de síntomas. Además, añaden que en
países donde las temperaturas son altas durante la emisión de retoños, no es necesario
usar invernadero caliente. Por consiguiente, es posible obtener mayor porcentaje de
plantas libres de psorosis, virosis que puede ser inactivada con temperaturas entre 2840ºC (Monteverde et al, 1991).
Después de la aplicación de la termoterapia o la técnica del microinjerto, se hace
necesario la realización del indexing, ya que de esta manera se logra un cierto control de
la psorosis. El indexing puede ser hecho por inoculación de injertos en plantas de cítricos
indicadoras y examinando los síntomas resultantes bajo condiciones controladas.
También, las pruebas de protección cruzada son posibles (Roistacher, 1993; Guerri,
1999).
El control es de tipo preventivo y consiste en propagar yemas libres del virus mediante un
programa de certificación sanitaria (Roistacher et al, 2000) donde los indexing
biológicos, las técnicas serológicas y moleculares son pruebas que permiten determinar la
presencia o ausencia de psorosis y de esta forma asegurar la propagación de patrones
libres del patógeno (Martín et al, 2000).
El material de propagación debe ser obtenido a partir de plantas sanas y debe ser objeto
de inspección, al igual que el material de partida, estableciendo esquemas de certificación
que permitan asegurar que está sano. Las plantas madre deben ser cultivadas en
condiciones de aislamiento para protegerlos contra infecciones posteriores y sometidas a
controles y análisis periódicos para verificar que permanezcan sano.
La utilización de material de propagación libre de virus es la base de los métodos de
control y en muchos países se han establecido programas de producción, certificación y
distribución de dicho material.
En los países con dispersión natural esta medida de los programas de certificación
debería complementarse con la supresión de fuentes de inóculo y con un control estricto
de las plantas de vivero y plantaciones jóvenes para permitir un crecimiento vigoroso de
la planta antes de que se infecte (Guerri, 1999).
7. Antecedentes de la psorosis en Cuba.
La primera referencia que se conoce de la psorosis en Cuba, le corresponde a Johnston y
Bruner (1918) quienes ofrecieron una descripción de sus síntomas destacando su
propagación en las provincias de Pinar del Río, Habana, Camagüey y Oriente, indicando
que no era muy extensa. A pesar de estas informaciones de la psorosis, que en sentido
general se refiere sólo a la sintomatología externa, no encontraron datos experimentales
de su aparición.
En 1969, Paulechová et al realizan inspecciones a 6 provincias de Cuba e incluyendo a
la Isla de la Juventud y corroboran la presencia de psorosis en todas las plantaciones de
cítricos visitadas. Los síntomas fueron apreciados sólo en árboles que tenían de 25-30
años de sembrados.
En los cítricos de Cuba, el tipo de infección viral con más frecuencia encontrada por estos
autores fue la psorosis A. Los troncos o las ramas viejas mostraban indicios de la
enfermedad, notable por los ligeros hendimientos de la corteza y la tonalidad parda de
los tejidos. A medida que la infección avanzaba se producía la unión de las hendiduras o
pústulas, las cuales se enrrolloban hacia arriba dejando al descubierto la madera. El
rápido deterioro de los árboles resultaba evidente. La especie de cítrico C.reticulata o
mandarina, parecía resistir más al ataque de la psorosis A, porque raras veces apreciaron
sus síntomas en los frutos. Cuando aparecían en la corteza, se manifestaba en forma de
rayas de color verde oscuro. Otras enfermedades de tipo viral como la concavidad
gomosa aparecían asociados en ocasiones con la psorosis, produciendo daños en el tronco
del mismo árbol de naranjo dulce o mandarino.
En nuestro país, este tipo de patología no se considera muy destructiva, sin embargo, se
encuentra en variedades sensibles de las viejas plantaciones, en árboles dispersos y en
grupos de plantas de una variedad determinada. Es por eso, que se hace necesario el
estudio y caracterización de estas fuentes de psorosis para el establecimiento de métodos
de diagnóstico de esta enfermedad para su utilización en los programas de saneamiento,
cuarentena y certificación.
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ANEXOS
Foto 1. Descamación restringida a la parte
interior del tronco en un naranjo dulce
afectado por psorosis A (P. Moreno)
Foto 3. Corte transversal de un tronco de
naranjo dulce con manchas en la madera
producidas por psorosis (J.Guerri).
Foto 5. Manchas
cloróticas y pñustulas
inducidas por psorosis
B en hojas adultas de
naranjo
dulce
(P.Moreno)
Foto 2. Descamación
extensiva en tronco y
ramas de un naranjo
navel
afectado
por
psorosis B (P.Moreno)
Foto 4. Reacción de
shock
en brotes
jóvenes de naranjo
dulce
de
semilla
inoculado con psorosis
en
invernadero
(L.Navarro)