Electroforesis

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TIS
FUNDAMENTO
La electroforesis es el transporte bajo la acción de un campo magnético.
Es la técnica más utilizada porque requiere de poco equipamiento y es muy
eficaz.
Su fundamento es que al someter las moléculas a un campo magnético, estas
migraran hacia el cátodo (polo negativo) las moléculas con carga positivas o
hacia el ánodo (polo positivo) las moléculas con carga negativa.
Hablamos de electroforesis libre cuando aplicamos al campo magnético a
disoluciones o suspensiones, Fue desarrollada por Arne Tiselius, 1937.
La electroforesis
de zona: la muestra se aplica en un punto del medio de
soporte, así evitaremos problemas de difusión, resolución. En la actualidad es
la mas utilizada.
Un equipo básico de electroforesis consta de un cubeta donde se encuentra
sumergidos el ánodo y el cátodo por potencial de electrones. Dentro de
tampon se coloca el en medio de suporte (ex. Gel de agarosa).Puede llevar un
refrigerador.
FACTORES QUE AFECTAN A LA MOBLIDAD
1.Campo eléctrico
– Diferencia de potencial eléctrico (voltios): electroforesis de bajo voltaje
cuando aplicamos 500-10000V.
– Intensidad (Amperios):5-50mΔ
– Resistencia (Ohms,Ω):depende de la concentración de tampon y del
soporte.
– Temperatura: Efecto Joule
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2. Muestra
– Al aumentar el tamaño disminuye la movilidad electroforetica: si 2
moléculas tienen igual carga y tamaño, la movilidad electroforetica
dependerá
de
la
forma
(
una
redonda tendrá
mayor
movilidad
electrofelectroforetica que una ovalada, ya que la redonda tienen menor
superficie=
3.Tampon
– Fuerza iónica: 0,5-0,1 M
– Ph:determinara la carga de la muestra. Hay dos tipos de sistemas
dependientes del tampon: de tampon discontinuo (intervendrá en la
electroforesis al menos 2 sistemas de diferente ph y concentración o
tampon continuo ( solo un tampon
4.Medio de soporte
– Adsorcion: retención inespecifica e las moléculas de la muestra sobre el
medio e soporte. Afecta a la resolución (las bandas no quedaran tan bien
definidas).Efecto negativo.
– Electroendosmosis (EEO): se debe a la presencia de cargas negativas en
el soporte ( que son apartadas por los grupos carboxil, en el caso del
almidón, o por los grupos sulfato, en el de la agarosa). Así que en el
fluido se creara un flujo a contracorriente, el EEO, efecto negativo.
– Tamizado molecular: el propio medio de soporte es una especie de matriz
con poros. Si los oros son pequeños impedirá físicamente que pasen
moléculas mas grandes. Efecto negativo, en principio, pero no es así.
ME relativo: cuando comparamos la ME de las moléculas que estamos
estudiado con la ME de la molécula patrón. Siempre relativizaremos los valores
de ME.
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APLICACIONES
– Análisis cuantitativo de sustancias (electroforesis analítica).
– Técnica preparativa (electroforesis preparativa, ex:separa les moléculas
y recupera una parte para continuar trabajando con ella).
– Comprobar la pureza.
– Cuantificar (ex:calcular tamaño molecular)
La electroforesis se puede aplicar para separa cualquier cosa que tenga carga
(ex: células enteras, fármacos, pesticidas,..).Incluso también nos servirá para
separar moléculas sin carga.
ELECTROFORESIS ZONAL
La muestra se aplica en la parte superior del soporte . El tampon es de tipos
continuo y esta definido por su ph.
ISOTACOFORESIS
La separación se realiza en un tampon discontinuo, en la que se crea un ion
líder y un ion terminal, la movilidad de los cuales viene dada por el cambio de
tampon.
Líder-- Mayor movilidad
Terminal--menor movilidad
La muestra migra como un lo que que esta dirigido por el ion líder. Las
moléculas de la muestra se distribuyen entre los iones líder y terminal. Es
como si es creara una repulsión entre las moléculas de la muestra de diferente
movilidad
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La velocidad de migración es constante, así que se creara un gradiente
eléctrico. (v=m.E).
Se aplica para el análisis cuantitativo (el gel empaquetador)
ISOELECTROENFOCAMIENTO
Se da en un gradiente de Ph (que se puede elegir).
La muestra se aplica en el centro porque las sustancias de la muestra se
desplazaran hacia el cátodo o el ánodo en función de su ME y también e su
carga neta (ex:péptido).
Cuando la muestra llega a su punto isoelectrico , se parara. Todavía que por
difusión se moverá un poco y habrá que volver a buscar el punto de carga
beta pI=0.
Se aplica el fraccionamiento de proteínas en estado nativo.
ELECTROFORESIS DE FLUJO LIBRE
Se
trata del único método electroforético continuo. El sistema tampon esta
continuamente entre las placas de vidrio. Así los componentes de la muestra
se van separando de forma horizontal.
Se utiliza para separa orgánulos celulares,..etc.
ELECTOFORESIS CAPILAR
La separación se realiza en un capilar. Los extremos de los capilares están en
recipientes que contienen el tampon y el electrodo. El tampon pasara de un
recipiente al otro por el capilar y así se producirá la separación (al capilar).
El integrador da información sobre las medid como la absorvancia. El capilar
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tiene
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20-30 cm de largo y 50-100μm de diámetro interno, para el que
utilizamos volúmenes muy pequeños (2-4 nl de muestra). Se realiza a altos
voltajes (1 KV/cm) pero a pocos amperios (10-20 mΔ).
Se utilizan para procesos analíticos automáticos y rápidos. Se puede acoplar
antes de un HPLC o después de un espectrometro de masas.
Es rápido porque tiene un autoinyectador.
El capilar puede estar vació (electroforesis libre) poco lleno de poliacrilamida.
Las secuencias de DNA e ultima generación son equipos de electroforesis
capilar.
ELECTROENDOSMOSIS
La presencia de grupos cargados en el soporte o en los capilares o al vidrio
hacen que se pueda dar este fenómenos.
Las cargas negativas están en el soporte, fijas (no se pueden desplazar) y las
cargas positivas si que se pueden desplazar hacia la cátodo, quedara una
contracorriente de cargas negativas al centro que se desplazaran hacia el
ánodo , que sera el flujo EEO. Este hecho puede ser, en algún caso nocivo.
Ejemplos:
1. CMEC: es un método de electroforesis capilar que fue descrito en 1984
por Terae et al. Su ventaja es que permite separar sustancias y
compuestos que no tienen carga y también las de bajo peso molecular.
Se utiliza
una sustancia tensoactiva a una concentración que esta por
arriba de la concentración micelar critica, así las mielas tienen carga neta
negativa el sistema también aprovecha las diferencias hidrofobicidad de
las sustancias. Si la substancia puede atravesar la micela, ese a que no
tenga carga, sera transportada hacia el polo positivo a gran velocidad.
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2. Contrainmunoelectroforesis: desarrollada por Bussard en 1959. el
medio de soporte es gel de agarosa, con un elevado potencial EEO y un
ph 8,6, donde el anticuerpo no esta cargado y el antígeno todavía tiene
carga negativa. Así el antígeno se desplazara por electroforesis hacia el
positivo y el anticuerpo se desplazara por el afecte EEO en dirección
contraria a la electroforesis.
MEDIO DE SOPORTE
Hay
diferentes
tipos
de
soportes,
algunos
ya
en
desuso.
Ejemplos:electroforesis en gel de almidón (análisis multienzimatico) de
agarosa, de poliacrilamida, etc.
Agarosa
Polímero lineal de galactosa 3,6-anhidro L-galactosa. Que se extrae de una
alga. Hay diferentes tipos de pureza, libres de DNasas,etc.
Normalmente gelifican a 35ºC y se funden a 80-90ºC. Se venden en forma de
polvo blanco.
Hay algunas que están modificadas y para fundirse requieren 65ºC (agarosa
de bajo punto de fusión).Se forman por adicción de grupos hidroxietil.
También hay diferencias de potencial EEO, resistencia o poder de resolución
(penetran de forma
igual al separar fragmentos
pequeños sin aumentar la
concentración de agarosa)
La elevada concentración de agarosa, el tamaño de poros es mas pequeño, por
lo que podemos separar moléculas más pequeñas o viceversa.
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Poliacrilamida
Es un polímero sintético de monomero de acrilamida. Ademas también se
gasta bisacrilmida que forma puentes de unión entre los diferentes moléculas
lineales de acilamida. Para que se de la polimerización hay que añadir
catalizadores: persilfato amonico y TEMED. TEMED cataliza la polimerizacion de
radicales libres, así que en presencia de ese no polimerizara. Tampoco
polimerizara si la temperatura esta por debajo de los 20ºC.
El tamaño de los poros se puede regular variando los parámetros T y C. C es la
dureza y la proporción de bisacrilamida sera la que determine C.
Si disminuye la concentración de bisacrilamida y acrilamda aumenta el tamaño
de los poros o viceversa.
Tendremos que utilizar un valor de C constante inferior al 1% y T es el que va
variando, para evitar que se formen agregados. Así:
Valores T(%)
A
2,5
800
7,5
50
30
20
C=cte< 1%
La bisecrilamida es cancerígena en polvo o liquida. En solido no. Así que
comercialmente existen geles prefabricados.
Los geles de poliacrilamida vitan la conveccion . A diferencia de los de
acrilamida cambia, estos tienen un alto grado de pureza y intervienen
directamente en la separación ( tamizaje molecular) porque se puede variar
exactamente el tamaño de los poros. Es químicamente inerte y mecánicamente
estable ( se podrán desecar). Son totalmente transparentes. No presentan el
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efecto EEO porque no tiene grupo con cargas. Se pueden preparar
con
muchos tamaños de poros.
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GEL DE AGAROSA
La agarosa , como sustrato para preparar proteínas , no es restrictiva ya que
nunca no impedirá el paso de proteínas a su través.
Una de sus principales aplicaciones es el fraccionamiento de proteínas , que se
separaran por su densidad de carga (las que más tengamos, mayor velocidad
de migración tendrán).
Otra aplicación es la inmunoelectroforesis, que permite separa sustancias
(antigenicas) que se encuentran en menor concentración en una mezcla
compleja. El único problema que presentan es el estandarzacion, pero el nivel
de sensibilidad es muy bueno, que se manifiesta con una precipitación, la cual
se manifestara mejor si se encuentra en la agarosa que si se encuentran en un
liquido.
Pasos:
1. Separación por electroforesis
2. Reacción inmunologia
Cuando no sabemos nada sobre la muestra, al aplicamos al centro.
Gracias a este sistema se identificaran aproximadamente 30 proteínas en el ser
humanos.
Método de crebas
Es la típica inmunoelecroforesis.
Cuando la agarosa ya esta liquida se deja caer sobre el porta: capa fina que
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solidifica: hacemos un pocillo donde aplicamos la muestra, lo introducimos en
una cubeta de electroforesis; al traerlo, escarbamos 2 “trincheras”; aparecen
las bandas de precipitación rodeando las diferentes proteínas separadas.
Pocillo:proteína: es la muestra
Trinchera:anticuerpos
Inmunoelecroforesis en coet
Antes de colocar el gel al porta introducimos los anticuerpos ( los anticuerpos
están incluidos al gel). Dara una bandas de precipitacion en forma de coet se
ha de elegir un ph elevado (básico) donde los anticuerpos todavía tengan carga
y así podrán migrar esta técnica puede ser cuantitativa aunque banda que se
forma proporcional cantidad de proteína:ventaja
Inmunoelecroforesis bidimensional
La muestra se ha preparado en una electroforesi en 2 direcciones (se ha hecho
2 electroforesis) . Una
primera electroforesis preparativa en la que les
proteínas se separar en una dirección. Después se corta la carrera. A
continuación colocamos ese gel (carrera) adosado a otro gel donde se
encuentra los anticuerpos y en la que separare en dirección perpendicular a la
anterior (para cuantificar).
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Podemos elegir que las condiciones sean disociantes o no disociantes (proteína
desnaturalizada o nativa, respectivamente)
La que mas se utiliza para desnaturalizar es la SDS.
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Para que la proteína mantenga sus actividades biologías, se deben de separa
por densidad de carga.
Respecto a las condiciones disociantes, hay diferentes tipos e agentes
dissociantes/desnaturalizantes.
– Urea: interfiere en las interacciones hidrofobicas de las proteínas. Se
utiliza para separa histonas, proteínas nucleasa o ribosomales y también
para el análisis conformacional de proteínas. Muchas veces es combinan
con detergentes.
– Detergentes: hay de diferentes tipos
– No ionicos:trito-XIUO
– Ionicos: cationicos (CTAB: se gasta para separa proteínas
muy
básicas o muy ácidas) y anionico (SDS:es el mas utilizado)
– Anfóteros:
CHAPS
(es
débilmente
desnaturalizante:
se
utiliza
sobretodo para proteínas de membrana)
El SDS, da lugar al sistema mas utilizado, el SDS-PAGE. Ejemplo de agentes
reductores son el β-mercaptoetanol y ditiometiol (DTT). Se utiliza cuando
hablamos de condiciones desnaturalizantes y reductores.
SDS
Cuando las proteínas se encuentran a 1,4 g SDS/g (pr), [SDS]>8mM, cuando
actuá el SDS. Los SDS se unen a los grupos hidrofobicos y la que se desenrolle
la proteína. El SDS se quedara recubriendo la proteína ( una molécula de SDS
cada 2 aminoácidos) se quedara cargado negativamente. La densidad de carga
de las proteínas tratadas con SDS es constante (carga/masa=cte) todas
migran en la misma dirección. Así que las debemos de separa, exclusivamente,
por tamaño (PM).
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En principio, para una T del 15 % podemos separara proteínas que tienen
entre 12-45 Kda , del 10 % entre 15-70 Kda y del 5 % entre 25-200 Kda.
Estas electroforesis, para formar el gel se utilizan 2 cristales, uno sobre el otro,
y entre 2 se colorea un separar, que sera el que del tamaño que queramos al
gel. Uno de los cristales es cuadrado y l otro tiene forma de U, y esta es la
parte por la que se colorea la tinta para forma lo pocillos.
Tendremos 2 receptáculos ( donde se encuentran los electrodos) comunicados
por el gel, el cual nos servirá para utilizar sistema continuo.
La proporcionalidad entre la migración y el peso molecular se da tan solo e un
rango de PM.
Ventajas del SDS:
1. Se puede utilizar para cualquier tipo de proteina ( es universal)
2. Tienen una gran movilidad.
3. Todas migran en la misma dirección ( porque la carga neta negativa)
4. Al estar desnaturaliza menor difusión y mayor resolución.
5. No hace falta emplear ácidos fuertes para fijarlos.
6. Se puede calcular PM de proteínas.
7. Si se trata de isoenzimas (enzimas con la misma función pero diferente
carga) se anulara la pequeña diferencia de carga propia.
8. Se ven/difunden mejor los colorantes
9. Si queremos hacer inmunoblot, solo en una levadura el SDS le quitara de
la membrana.
En función del PM y del gradiente de poliacrilamida aplicaremos el rango de PM.
ELECTROFORES CONTINUA I DISCONTINUA
En la continua solo se gasta un tampon y en la discontinua mas de 2. De este
ultimo tipo es la de Ornstein. El gel esta
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esta formado por dos geles
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(empaquetador y separador) y cada uno de ellos tienen 2 tampones.
Una vez que ha polimerizado el gel
separador se aboca el empaquetador y
después se pasa la pinza.
El sistema tampon es 0,37 M tris Hcl ph 8,8: separador
El sistema tampon es 0,125 M tis Hcl ph 6,8: empaquetador
En el empaquetador se da la isotacoforeisi (todas migrar al mismo tiempo pero
se irán ordenándose)
EL tampon de cubeta es el ion glicina.
A ph 6,8 el ion cloruro tiene mayor movilidad electroforetica que el ion glicina
(el cloruro ira por delante) una vez que entran al gel empaquetador el ion
glicina ira por delate, detrás del cloruro y finalmente las proteínas.
En 1970 , Coemli va utilizar el sistema discontinuo de Ornstein y le introdujo
SDS:hecho que ha tenido mucha trascendencia.
El gradiente de concentración de poliacrilamida en el gel se consigue con un
formador de gradiente, que se trata de un sistema de vasos comunicantes, en
los cuales se encargan de ir diluyéndose la muestra, por lo que se creara un
gradiente, la ventaja es que dará unas bandas mas finas.
ELECTROFORESIS BIDIMENIONAL
En los sistemas anteriores se pode separa hasta 50 proteínas en una carrera,
pero las muestras pueden tener muchas mas. La ventaja del la electroforesis
bidimensional es que se pueden separa hasta a 2000 proteínas de una misma
muestra.
La primera separación se realiza por isoelectroenfocamiento (gradiente de ph)
aspecto de fideo: el gel se colorea sobre otro gel: aquí se trata con SDS y con
agentes desnaturalizantes suaves (ejemplo urea, algun detergente no ionico)
para que no pierda su carga y después se tratara con SDS: obtendremos un
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mapa de puntos: tincion con plata.La electroforesis bidimensional es la base de
la electroforesis proteomica porque los mapas de puntos que se obtienen son
comparables: se comparara un gel con otro gel,ya que todo el gel corresponde
a una única muestra.
SISEMAS DE DETCCCION DE LAS PROTEINAS SEPARADAS
Adicción de sustrato
Condiciones desnaturalizantes para ver las condiciones normal.
Actividad enzimática sobre el sustrato que se detectara como colores sobre el
gel cuando cogemos sustrato.
Tincion
Azul de Cormassie: compuesto polar con grupos SO3-: carga negativa para la
que se une (puentes de hidrógeno, van der wals: no enlaces covalentes:para
unirse a las proteínas.
Es universal. También se puede utilizar en les inmunoelecroforesis.
Protocolo:primero se tiñe en una elevada concentración y después se va
destiñendo con menores concentraciones, siempre
poniendo acético. Se
obtienen, como limite inferior 0,1-0,5Зμg proteína/banda. Pero esos también
podemos teñir con plata que es mas sensible ya que podremos llegar hasta a 1
ng proteína/banda. La plata no es especifico de proteína , también tiño ácidos
nucleicos. Se da la reacción
Ag+---Ag0. La tincion con plata no es de tipo
cuantitativa, ya que no hay relación directa entre la cantidad de proteína que
hay y lo que precipita. Se puede utilizar después de una tincion de coomassie y
así aumenta mucho la resolución. Se verán bandas.
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Marcaje fluorescente
La unión el colorante/fluorocromo es covalente.
Marcaje radiactivo
Es la técnica mas sensible de todas. Se suele limitar a la utilización de
isotopos.
La muestra se tiñe antes de separa las por electrolisis. Después , la detección
se hace por autorradiografia. Si que es cuantitativa:resolución directa.
Reacción inmunoenzimatica
El anticuerpo esta marcado con algún tipo de enzima que dará una reacción de
color:ejemplo peroxidasa de rave.
ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
Es la técnica mas habitual para identificar, separa, etc... ácidos nucleicos.
A principios de la década de los 70 se dieron cuenta de su utilizada. Es más
simple que la de proteínas ya que los ácidos nucleicos a ph neutro tienen carga
neta negativa debida a los grupos fosfato, lo cual es proporcional a la cantidad
de nt que los forman,
Los geles de agarosa se utilizan en configuración horizontal y tienen menor
poder de resolución que los de poliacrilamida.
Los fragmentos de menor PM tienen mayor movilidad que los de mayor PM. Asi
que los geles de agarosa no se podrán separa moléculas de similar PM pero si
que podrán preparar moléculas que tienen 200 pb hasta 50 Kb. Por lo tanto,
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siempre que separamos moléculas grandes utilizaremos agarosa y utilizamos
poliacrilamida para separa en rangos de 5-500 pb (hasta 1000 pb).
Los geles de poliacrilamida se hacen en configuración vertical, donde se
pueden forma pocillo muy grandes si lo deseamos, para poder separar
moléculas que difiere en 1 pb, independientemente que de tengan un PM alto o
bajo.
La electroforesis de ADN en gel de agarosa es subamarina. Se ha de bloqueara
las esquinas. La agarosa se hierbe—liquido--se pone en el molde con tinte—
solidificara. Como es submarina, los pocillos estarán llenos de tampon por lo
que la muestra tendrá que tener tampon de muestra ( que suele ser glicerol)
para aumentar la densidad de la muestra. De Este también parte un colorante,
el azul de bromofenol o el xileno de cianol (color verde). El BFB migra
aproximadamente el doble que el xileno de cianol. Gastaremos uno o otro o los
dos dependiendo del tipo de muestra.
Para detectar los ácidos nucleicos se utiliza la tincion con bromuro de etidio,
que es un agente intercalante, este al unirse al ADN emite fluorescencia,
obsorbe si iluminamos la muestra con luz ultravioleta: dará una emisión en el
rojo-naranja.
Conforme vamos aumentando la concentración de agarosa, el rango de
separación eficiente se va acortando.
A mayor superenrollamiento, mayor movilidad electroforetica.
Circular oscat: una de les dos cadenas esta cortada en un punto, lo cual hace
que pierda
el superenrollamiento (se desenrollara) la que tiene menos
movilidad electroforetica.
A mayor voltaje, mayor migración. El rango de aplicación disminuye al
aumentar el voltaje. Así que para obtener una buena resolución, deberemos
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aplicar un voltaje bajo (así la migración era proporcional al tamaño)
Las moléculas que tienen mas de 50 Kb
no se separan si teneos el campo
eléctrico contante.
Electroforesis de campo pulsante :variar la dirección del campo electrónico y
posterior reordenación en la nueva dirección.
El EtBr se va incorporando al ADN así que podremos observar el ADN durante
la carrera, si lo iluminamos con luz ultravioleta, ventaja, todo y que disminuye
su movilidad, ya que es un agente intercalante que la que aumenta el PM de la
molécula.
Tanto en TAE como en TBE, corren igual. Si queremos recuperar el ADN es mas
conveniente TAE porque daña menos el DNA. Si se trata de una electroforesis
larga es mas conveniente TBE porque tienen una mayor capacidad tampon.
Antes también se ponía el tampon fosfato, pero actualmente esta en desuso.
Tampon—50mM
NaOH+
1
mM
EDTA—mantendrá
la
condiciones
desnaturalizantes porque parte sosa. La agarosa no se deshace la sosa, así que
primero deberemos disolver la agarosa y después añadir sosa.
La elecroforesis de ADN en geles de policrilamida se puede hacer tanto en
condiciones desnaturlizantes (en la composición en bases si que afecta la ME)
como en condiciones no desnaturalizantes, se puede cargar mayor cantidad de
ADN
por
pocillo.
So
suelen
hacer
a
voltaje
bajo
para
prevenir
la
desnaturalizacion de fragmentos pequeños (1-8V7cm).
Determinadas secuencias pueden dar a la molécula de ADN un cierto
plegamiento (estructura secundaria) que la que en el gel de poliacrilamida la
composición en bases afecta a la ME—habremos de gastar en condiciones
desnaturalizantes (urea o formamida—favorecen que durante toda la carrera la
molécula de ADN este desnaturalizada).
Tiene un elevado grado de pureza, ya que los componente de los geles
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poliacriamida tienen mucha pureza porque están muy purificados.
Si lo que queremos calcular os PM---condiciones desnaturalizantes.
Aplicaciones en condiciones desnaturalizantes:
•
Calcular el PM de los cebadores
•
Secuenciacion de ácidos nucleicos
Aplicaciones en condiciones no desnaturalizantes:
•
Técnica separativa
•
Geles de retardo---estudiar la unión de ADN a proteínas.
DETECCION DE LOS FRAGMENTOS SEPARADOS
Tinción con EtBr
S4BR GreenI--- es una nueva opción a parte de EtBr. Da una fluorescencia
verde al iluminarla con luz ultravioleta, es también un agente intercalante.
Con EtBr podemos detectar entre 1 y 10 ng de Adn/banda. La solución sebe
contener un mínimo de 0,5 μg de EtBr/ml.
Tinción con plata
La plata se une tanto a proteína como a ácidos nucleicos. Solo se puede aplicar
a geles de poliacrilamida.
Se puede detectar < 50 pg DNA/banda, permite separar o distinguir
poblaciones bacterianas por su RNA.
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Marcaje radiactivo
También se realiza antes de cargar la muestra en el gel y este limitado a los
geles e poliacrilaida.
Según el isotopo utilizado podrá estar un tiempo determinado.
Es la técnica mas sensible (pg), es cuantitativa, pero se trata de evitar
(gastando fluorocromos o colorantes en lugar de isotopos para marcar las
sondas que se utilizan en la secuenciacion.
APLICACIONES Y TECNICAS
Entre las aplicaciones (en el gel de agarosa), encontramos la separación
de
ácidos nucleicos bacterianos, el calculo de peso molecular, la separación de
productos de restricción y el análisis y aislamiento de productos de PCR.
Fragmentos de 50 KB o mas se orienta pero no llegan a separarse( en un
campo eléctrico contante). Cambiando la dirección del campo eléctrico
conseguimos separarlos---electroforesis en campo pulsante (PFGE—Pulsed
Field Gel electrophoresis)--En esta técnica van produciéndose polos con
diferentes campos eléctricos--sucesivos cambios de campo eléctrico que harán
separar las moléculas de ADN. Las moléculas de ADN mas pequeñas serán las
que mas migraran.
Los primeros en desarrollar esta técnica fueron Scgwart y Cantas, en 1984. Los
diferentes campos eléctricos eran bajos. Era capaz e resolver hasta 2000 KB.
Combinado los siguientes factores podremos llegar a 7000-8000Kb:
– Grado de uniformidad de los 2 campos eléctricos
– Longitud absoluta de los polos eléctricos (tiempo en el que se mantienen
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las misma condiciones de campo eléctrico)
– Razón de las longitudes de los pulsos eléctricos utilizados para a generar
campos eléctricos.
– Ángulos e los 2 campos eléctricos respecto al gel.
– Fuerza relativa de los 2 campos eléctricos.
Tipos de PFGE:
•
FIGE: invertir los campos eléctricos. Descrito por Carle et al. en 1986.
el rango máximo son 2000 KB. La gran ventaja de este sistema es que
se obtienen perfiles completamente rectos ya que el campo eléctrico
siempre tenia el mismo sentido pero diferente dirección ( al cambiar la
polaridad) En b.
•
Caso C: tiene una plataforma giratoria que la que cambia de dirección
del gel. En c.
•
Campos transversales en geles verticales:descrita por Gardiner, en
1986. los campos eléctricos, uno respecto al otro tienen 90 º y respecto
el gel son transversales. El ADN hace un zig-zap dentro del peso. El
máximo de solución son 9000 Kb. En d
•
CHEF: Contour-clemped homogenus Electric Fiels. Es el más utilizado. El
gel esta en el interior de un hexagon, que es donde están los electrodos
(cada punto es un electrodo). Podemos variar el campo eléctrico en cada
polo, así que en un polo tendremos diversos
campos eléctricos, se
puede jugar con el angulo y diferentes fuerzas del campo eléctrico, se
puede llegar hasta 5000-7000Kb, se usa para separar cromosomas
enteros. También se pueden cortar con enzimas de restricción que tienen
baja frecuencia de corte, y después separar esos fragmentos. En e.
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Preparación: incluir las células en agarosa, bloques a la tabla, o dentro del
pocillo, el cromosoma sale
del bloque al someterlo al campo eléctrico y
entrara al gel. El cromosoma sale de la cella gracias a la utilización de la
solución de lisis. Podemos jugar con el factor angulo para separarlo.
El CHEF sigue un protocolo muy largo (mas de un día), para que el tampon se
ha de renovar.
La agarosa que se usa para incluir las células , son las las agarosa de bajo
punto de fusión.
RAPD
Randanly Amplified Polmorphic DNA. La amplificación no puede ser al azar, el
que es al azar es la secuencia de cebador. Solo utilizamos un cebador.
Como a consecuencia de la amplificación por PCR obtenemos una serie de
fragmentos que podremos ver por electroforesis en agar.
Los RAPDs nos ayudan a distinguir entre diferentes cepas e incluir entre
individuos de un mimo biotipos, diferencias entre individuos las bandas unen,
de estar bien sueltas para poderlo observar.
Si tenemos un perfil con muchas bandas, transferir a membranas, hibridacion
con la sonda que esta dirigida a geles de RNA ribosomico (ribotipat),
obtenemos una reducción de las bandas.
Imprenta dactiles del DNA
Son técnicas de genética molecular que se basan en la presencia de cepas
repetidas ( en numero variable o en tandem—VNTR (Variable Numbe Tandem
Reapeate).Se han descrito familias de VNTR.
Se trata e buscar esas secuencias VNTR, mediante la utilización de enzimas de
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Curso 2008/09
Electroforesis
TIS
restricción.
Lo podemos realizar también para PCR pero deberemos saber las secuencias
contiguas a la secuencia VNTR, siempre para
hace una separación con
agarosas.
Secuenciacion de ácidos nucleicos
Hay 2 métodos: Dideoxi
Sanger et al.(enzimatic) y Mexem i Gilbert(quimic)
los dos del 1977.
Ambos casos se generaban fragmentos de ADN que se diferenciaban en unos
pocos pb, es en lo que se basas la técnica . Por eso el gel ha de ser de
poliacriamida.
El método enzimático consiste en una reacción de copia del ADN, requiere un
cebador y una polimerasa que ira copiando. También se requiere los
desoribonucletidostrifosfato, 4 tubos, en cada tubo hay 1nt que es didesoxi y el
resto serán normales. Así en el tubo que hay ddA, cuando entre A, se parara la
reacción. Todos los fragmentos de un tubo acaban en el mismo nt. Se suele
marcar el cebador con
un colorante o un fluorocromo, así que podremos
detectar los fragmentos porque darán color. Obtendremos segmentos de
diferentes tamaños que todos acaban en el mismo nt. Los mas cortos migraran
más o viceversa
Ahora, la secuenciación por electroforesis ya no se la hace en gel, se hace por
capilar, y así e obtienen un mayor rendimiento.
En el método químico, e lugar de 4, cada reacción se hace por 5. Se hacen
tratamientos con diferentes productos químicos. El ADN que se quiere
secuenciar se marca con isotopos radiactivos, tratamientos en la tabla 13,2. se
generan fragmento que difieren en 2-3 bases.
Se utiliza para estudios muy concretos.
Sussane Ayed Carmona
Curso 2008/09
Electroforesis
TIS
DGGE
Denetuning
Gradient
desnaturalizantes
Gel
Electrophoresis.
(gradientes)
en
el
Se
propio
gel
aplican
que
en
es
condiciones
de
urea.
Al
desnaturalizarlo cambia su ME, la desnaturalizacon depende de la secuencia.
Si el porcentaje de G-C es más alta, tardara más en desnaturalizarse. Permite
separar moleculas de igual tamaño pero diferente secuencia. El gradiente de
poliacriamida puede formarse de bajo a arriba (menos a más concentración) o
de un lado al otro ( el gel tiene un único pocillo y toda la muestra entra al
mismo tiempo). Permite detectar mutaciones de una única base.
TTGE (TGGE)
Temperature-Time Gel Electrophoresis. El agente desnaturalizante es la
temperatura (va cambiando a lo largo de la electroforesis). Conseguimos
también la separación de fragmentos que tienen el mismo tamaño pero
diferente secuencia.
SSCP
Simple Strand Conformation Polymorphism. Se trata de buscar polimorfismo
de cadena simple. Se realiza con gel de urea de poliacriamida, pero antes de
introducir la muestra al gel se desnaturaliza por calor y se introduce también
un agente desnaturalizante, como la formamida para mantenerlo. Dará
movilidad diferente porque tienen diferente composición.
Ejemplo:técnica
para
detectar
fraudes
alimentarios,
latas
de
atún,
amplificación por PCR de un gen que tenia variación en el numero de pb de los
diferentes peces y después SSCP, obtendré una o dos bandas ( que son las 2
hebras).
Sussane Ayed Carmona
Curso 2008/09