PRESENCIA DE FITOPLASMAS ASOCIADOS AL SÍNTOMA DE “YEMA GRANDE” EN CHILE PARA SECADO EN ZACATECAS, MÉXICO Presence of phytoplasmas associated to the “big bud” symptom in dry chile pepper in Zacatecas, Mexico Analí Arredondo-Pérez1, Luis Roberto Reveles-Torres1 y Rodolfo Velásquez-Valle1 Campo Experimental Zacatecas – INIFAP, Km. 24.5 Carr. Zacatecas – Fresnillo, Calera de V. R., Zacatecas, México. CP 98500. e-mail:[email protected] 1 RESUMEN Los fitoplasmas son bacterias diminutas que viven en el floema de las plantas y pueden ocasionar síntomas como amarillamientos, escoba de bruja, declinamiento y distintas malformaciones foliares. Plantas de chile para secado en parcelas comerciales del estado de Zacatecas, mostraban diferentes síntomas asociados a la infección por fitoplasmas; uno de esos síntomas es conocido como “yema grande” (YG) y existe poca información acerca de su expresión y distribución en plantas de chile para secado, consecuentemente, el objetivo de este trabajo consistió en determinar la tendencia de distribución de esas estructuras en plantas de chile para secado. Plantas afectadas fueron colectadas y el número de YG se contó en cada rama y su localización fue registrada en un diagrama. La incidencia general de YG por planta varió entre 5.7 y 75.4%; sin embargo, su distribución en las ramas de una planta puede ser diferente: en plantas bifurcadas y trifurcadas la incidencia de YG osciló entre 0 y 76.9% y de 6.7 a 94.7% respectivamente. En la mayoría de las plantas colectadas la primera YG fue localizada en la porción más joven de las plantas infectadas. De un total de 193 muestras de la parte inmediata superior o inferior de cada YG encontrada por planta, el 43.52% resultaron positivas en la detección de fitoplasmas por PCR. La distribución e incidencia de esta sintomatología, fue irregular en las ramas de una misma planta o a lo largo de ellas, debido posiblemente al movimiento del patógeno, el flujo del floema o la transmisión aleatoria por parte de vectores. Palabras Clave: Capsicum annuum L., expresión de síntomas, incidencia, vectores. SUMMARY The phytoplasmas are small bacteria that live in the phloem of plants and can cause symptoms such as yellowing, witches’ broom, and various foliar malformations as well as plant decline. Dried chile plants in commercial fields of Zacatecas, showed different symptoms associated with phytoplasma infection, one of these symptoms has been named “Big Bud” (BB) and very little is known about their expression and distribution in plants for dried chili, consequently, the aim of this study was to determine the trend of distribution of these structures for dry chile pepper plants. Affected plants were collected and the number of BB was counted in each branch and its location was recorded on a diagram. The overall incidence of BB per plant varied between 5.7 and 75.4%, however, the distribution of BB in the branches of a plant may be different, in bifurcated and trifurcated plants incidence BB ranged from 0 to 76.9% and from 6.7 to 94.7% respectively. In most plants collected the first BB was located in the younger portion of infected plants. Tissue from the branch immediate before and after a BB was PCR-analyzed to detect the phytoplasma presence; a total of 193 samples were taken and analyzed; 43.52% were positive to phytoplasma presence. The distribution and incidence of these symptoms, was irregular in the branches of the same plant or along them, possibly due to movement of the pathogen, phloem flow and random transmission by vectors. Keywords: Capsicum annuum L., expression of symptoms, incidence vectors. INTRODUCCIÓN El estado de Zacatecas es el principal productor de chile seco (Capsicum annuum L.), a partir de los años ochenta. De 1991 a 1996, aportó 29 032 t año-1 de chile mirasol/guajillo y ancho, principalmente, esto es el 51.16% de la oferta nacional. Además, se cultivan otros tipos de chile, entre los cuales predomina el chile puya y pasilla (Reyes-Rivas et al., 2001). A lo largo AGROFAZ 61 AGROFAZ VOLUMEN 13 NÚMERO 3 2013 del proceso de producción, el cultivo se ve afectado por diversos microorganismos que causan enfermedades y así reducen la población de plantas, dañan su potencial productivo y afectan directamente la calidad y cantidad de la cosecha. Aparte de los hongos, virus, bacterias y nematodos como agentes patológicos, en los últimos años a tomado importancia la presencia de una sintomatología conocida como “faroles chinos” (la cual será nombrada en adelante como yema grande: YG), causada presumiblemente por fitoplasmas (Velásquez et al., 2011). Los fitoplasmas son bacterias de tamaño diminuto que habitan en el floema de las plantas y que son diseminados naturalmente por chicharritas y periquitos; la sintomatología provocada por la infección de estos patógenos es altamente variable e incluye amarillamientos, escoba de bruja, declinamiento y distintas deformaciones foliares; sin embargo, se ha encontrado que la identidad de los fitoplasmas es inconsistente con los síntomas que inducen en las plantas infectadas, es decir, síntomas similares pueden ser inducidos por tipos distintos de fitoplasmas (Lee et al., 1998). El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia y distribución de fitoplasmas en plantas de chile con la sintomatología de yema grande. MATERIALES Y METODOS La presente investigación incluyó trabajo de campo, en el que se realizó la colecta de plantas en las parcelas del Campo Experimental Zacatecas con síntomas de YG pertenecientes a las variedades “mirasol”, “ancho Calera” y de “ancho Fresnillo”. Estas plantas se trasladaban al laboratorio de Fitopatología del Campo Experimental Zacatecas (CEZAC), (INIFAP). Las plantas colectadas se dividieron de acuerdo con el tipo de ramificación inicial en bifurcadas o trifurcadas según presentarán dos o tres ramas después del tallo respectivamente. De cada planta colectada se elaboró un diagrama para ubicar las ramas afectadas y localizar dichas estructuras en cada rama. Se tomó una muestra del tejido inmediato anterior y posterior al sito donde aparecía la YG. A cada muestra se le extrajo DNA total por el protocolo de Dellaporta et al., (1983) y posterior a ello, se aplicó la técnica de PCR anidada. La primera amplificación, y la PCR anidada fueron hechas utilizando los pares de primers universales, para amplificar secuencias de rRNA 16S de los fitoplasmas, P1/Tint y R16F2n/R16R2, respectivamente (Gundersen y Lee, 1996; Smart et al., 1996; Lee et al., 1998). Las PCR se realizaron en un termociclador de Applied Biosystems con el programa: 1 ciclo de desnaturalización a 95°C durante 2 min y 30 ciclos adicionales con el siguiente programa: 1 min de desnaturalización a 94°C: 1 min de hibridación a 55°C, 2 min de polimerización a 72°C, y una extensión final de 72°C durante 5 min. Las muestras de extracción de DNA y los productos de PCR, se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio y visualizados mediante luz ultravioleta (Smart et al., 1996). RESULTADOS Y DISCUSION Se colectaron un total de 17 plantas de diferentes tipos de chile para secado dentro de las instalaciones del CEZAC con presencia de YG. De esta total, 11 (64.7%) correspondían a plantas bifurcadas y el resto (35.3%) a plantas trifurcadas. La presencia de YG no resultó uniforme en todas las ramas de las plantas bifurcadas; en 36.4% de ellas solamente se observó ese síntoma en una de las ramas. Por otro lado, todas las ramas de las plantas trifurcadas mostraban al menos una de esas estructuras (Cuadro 1). Cuadro 1. Presencia de yema grande en plantas de chile para secado bifurcadas y trifurcadas. 1 Porcentaje de plantas con presencia de YG en una rama determinada; NA: no aplica. El porcentaje de dicotomías mostrando YG resultó altamente variable en cada planta; en forma general osciló entre 5.7 y 75.4%, independientemente del tipo de chile o tipo de ramificación inicial. En plantas bifurcadas la incidencia de YG por rama varió entre 0 y 76.9% (Cuadro 2) mientras que en plantas trifurcadas osciló entre 6.7 y 94.7% (Cuadro 3). El número total de dicotomías así como el número de YG son variables aún dentro 62 AGROFAZ de las ramas pertenecientes a una misma planta; en el caso de plantas bifurcadas la media para ambas variables resultó de 37.4 y 13.3 respectivamente, pero sus valores individuales son altamente variables; entre 8 y 141 para el número total de dicotomías y entre 0 y 34 para el número de YG (Cuadro 2). En el caso de las plantas trifurcadas la media para el número de dicotomías fue de 22.9 y de 8.9 para el número de YG por rama. PRODUCCIÓNAGRÍCOLA La desviación estándar para el número total de dicotomías en el caso de plantas bifurcadas fue de 26.3, por lo que es similar estadísticamente al número total de dicotomías (22.9) en el caso de plantas trifurcadas. De acuerdo con los valores de des- viación estándar, la media del número de YG por rama en las plantas trifurcadas (8.9) resultó similar a la media de las plantas bifurcadas (13.3). Sin embargo es necesario contar con un número mayor de muestras (plantas) para confirmar lo anterior. Cuadro 2. Presencia de yema grande por rama en plantas de chile bifurcadas. AGROFAZ 63 AGROFAZ VOLUMEN 13 NÚMERO 3 2013 Cuadro 3. Presencia de YG por rama en plantas de chile trifurcadas. La localización de la primera dicotomía presentando una YG es variable entre plantas y entre las ramas de una misma planta; en la mayoría de las plantas bifurcadas la primera YG se ubicó en el segundo o tercer tercio (los más jóvenes) de las ramas respectivas. Aunque el número de dicotomías presentes 64 AGROFAZ en cada rama dentro de una misma planta es variable, también la localización de la primera YG es irregular. La planta 10, donde la primera YG aparece en la cuarta dicotomía en ambas ramas constituye la única excepción a la disparidad en la aparición de YG en cada rama (Cuadro 4). PRODUCCIÓNAGRÍCOLA Cuadro 4. Localización de la primera dicotomía mostrando YG por ramas dentro de plantas bifurcadas de chile. La localización de la primera dicotomía con YG en plantas trifurcadas sigue la misma tendencia mostrada por las plantas bifurcadas, es decir a mostrar las primeras YG en la segunda o tercera porción de la planta; solamente en pocos casos la primera YG aparece en el primer tercio de la planta. Sin embargo, en cinco de las seis plantas trifurcadas la primera dicotomía con YG apareció simultáneamente en dos de las tres ramas mientras que en la sexta planta apareció al mismo tiempo en las tres ramas (Cuadro 5). AGROFAZ 65 AGROFAZ VOLUMEN 13 NÚMERO 3 2013 Cuadro 5. Localización de la primera dicotomía mostrando YG por ramas dentro de plantas trifurcadas de chile. En plantas bifurcadas y trifurcadas una vez que se presentó una dicotomía con YG, las siguientes dicotomías mostraban esas deformaciones florales en todas las dicotomías de una rama o en forma irregular (alternando dicotomías sin YG con dicotomías con YG) y en algunos casos permitiendo que dos o tres de las última dicotomías presenten flores sin deformaciones visibles hasta el momento de muestreo. Este patrón de presencia/ausencia de YG explica las diferencias en la incidencia del síntoma (Cuadros 2 y 3). Los fitoplasmas son diseminados por medio de vectores como las chicharritas pertenecientes a la familia Cicadellidae, entre otros, sin embargo, en Zacatecas se ha identificado la presencia de Neoaliturus tenellus Baker, (previamente Circuli- 66 AGROFAZ fer) la cual es responsable de la transmisión de patógenos virales y bacterianos (Velásquez-Valle et al., 2008; Christensen et al., 2005). Es posible que la distribución irregular de fitoplasmas dentro de una planta o rama pueda deberse a nuevas infecciones provocadas por los patrones de alimentación de las poblaciones del vector. De las 17 plantas anteriormente colectadas y analizadas, se eligieron ocho para diagnosticarlas por PCR. De estas plantas, se tomaron muestras en parte superior e inferior de cada YG encontrado por planta. Se analizaron un total de 193 muestras, de las cuales un 43.52% resultaron positivas para la presencia de fitoplasmas (Cuadro 6) (Figuras 1, 2 y 3). PRODUCCIÓNAGRÍCOLA Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCR anidada de extractos de 12 muestras de YG (líneas 1 a 12) con amplificación de una banda de 1200 pb en las muestras de las líneas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 y 11. M Invitrogen 1kb marcador molecular. Control negativo (pasto). Control positivo (chile) y H2O. Figura 2. Análisis de ocho muestras de hojas de chile (Líneas 1-8) pertenecientes a la planta 1 con sintomatología de YG, resultaron positivas, con amplificación de una banda de 1200 pb con la utilización de pares de primers universales F1/Tint y R16R2/. Se utilizaron tres muestras de nopal como controles positivos. Control negativo (agua) y marcador molecular 1Kb (M). AGROFAZ 67 AGROFAZ VOLUMEN 13 NÚMERO 3 2013 Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCR anidada de extractos de 10 muestras de YG (líneas 1 a 10) con amplificación de una banda de 1200 pb. Control positivo (chile), H2O control negativo. M Invitrogen 1kb marcador molecular. Los fitoplasmas se diversifican conformando grupos que infectan un gran número de plantas e insectos diferentes y que son distintos en su origen geográfico, en las relaciones huésped/vectores, y los síntomas inducidos (Saccardo et al., 2012; Gundersen y Lee, 1996), tal como se puede observar en la figura 2, donde los controles positivos en muestras de nopal no amplificaron con los pares de primers utilizados en este trabajo. Estudios previos (Randall et al., 2011) también en Capsicum, indican el uso de pares de iniciadores P1/P7 con amplificaciones de una banda de 1600 pb en tanto que Santos-Cervantes et al., (2008) utilizan los iniciadores R16mF2/R16mR1 y R16F2n/ R16R2 con una banda amplificada de 1450 pb. De estas ocho plantas, se tomaron muestras en parte superior e inferior de cada YG encontrado por planta. Se analizaron en total 193 muestras, de las cuales un 43.52% resultó positivas a la presencia de esta bacteria (Cuadro 1). Cuadro 6. Porcentaje total de muestras positivas a fitoplasmas . 68 AGROFAZ PRODUCCIÓNAGRÍCOLA CONCLUSIONES La presencia de fitoplasmas parece estar relacionado con la formación de yemas grandes en variedades de chile para secado. Por otra parte, la distribución e incidencia de esta sintomatología, fue irregular en lo que respecta a su presencia en las ramas de una misma planta o a lo largo de ellas, sugiriendo que además del movimiento del patógeno siguiendo el flujo del floema, existen otros factores como la transmisión aleatoria por parte de vectores como Neoaliturus tenellus, que pudieran estar involucrados en la expresión de este síntoma. LITERATURA CITADA. Christensen, N.M., Axelsen, K.B., Nicolaisen, M., Schulz, A., 2005. Phytoplasmas and their interactions with hosts. Trends in Plant Science 10: 526-535 Reyes-Rivas, E., Salinas-Gonzalez, H., Bravo-Lozano, A.G. y Padilla-Bernal, L. E. 2001. Tecnología de producción de chile seco en el estado de Zacatecas, México. TERRA Latinoamericana 19:83-88. Saccardo, F., Martini, M., Palmano, S., Ermacora, P., Scortichini, M., Loi, N., Firrao, G. 2012. Genome drafts of four phytoplasma strains of the ribosomal group 16SrIII. Microbiology 158:2805-2814. Santos-Cervantes, M.E., Chávez-Medina, J.A., Méndez-Lozano, J., Leyva-López, N.E. 2008. Detection and molecular characterization of two little leaf phytoplasma strains associated with pepper and tomato diseases in Guanajuato and Sinaloa, Mexico. Plant Disease 92:1007-1011. Dellaporta, S.L., Wood, J., and Hicks, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter 1:19-21. Smart, C., Schneider, B., Blomquist, C., Guerra, L., Harrison, N., Ahrens, U., Lorenz, K., Seemüller, E., Kirkpatrick, B. 1996. Phytoplasma-specific PCR primers based on sequences of the 16S-23S rRNA spacer region. Applied and Environmental Microbiology 62:2988-2993. Gundersen, D.E. and Lee, I.M. 1996. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested-PCR assays using two universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea 35:144-151. Velásquez, V.R., Medina-Aguilar, M.M., and Creamer, R. 2008. First report of Beet mild curly top vírus infection of chile pepper in north-central Mexico. Plant Disease 96:650. Lee, I.-M., Gundersen-Rindal, D.E., and Bertaccini, A. 1998. Phytoplasma: Ecology and genomic diversity. Phytopathology 88:1359-1366. Velásquez, V.R., Mena, C.J. y Reveles, T.L.R. 2011. Amarillamientos del chile para secado en el norte - centro de México. Folleto Técnico No. 35. Campo Experimental Zacatecas – INIFAP. Calera de V. R., Zacatecas, México, 40 p. Randall, J.J., Bosland, P.W., and Hanson, S.F. 2011. Brote Grande, A new phytoplasma associated disease of chile peppers in the Desert Southwest. Plant Health Progress. AGROFAZ 69