JAPÓN MANUAL DE ENSAYOS DE EFICACIA DE'PLAGUICIDAS Ing. Kazumi Sagayama (JOCV)* Ing. Danilo Dardón (ICTA)** Chimaltenango, febrero de 2001 * Investigadora Científica Voluntaria Japonesa ** Investigador Científico del ICTA, Guatemala Area de Productos de Exportación JAPóN MANUAL DE ENSAYOS DE EFICACIA DE PLAGUICIDAS Ing. Kazumi Sagayama (JOCV) * Ing. Danilo Dardón (ICTA) ** Chimaltenango, febrero de 2001 * Investigadora Científica Voluntaria Japonesa ** Investigador Científico del 1CTA, Guatemala , Area de Productos de Exportación INTRODUCCION En Guatemala existen problemas de plagas (insectos, nema todos, bacterias, hongos, virus, malezas y otras) en los diferentes cultivos que se producen en el país. Para el control de las plagas, los productores usan diversos plaguicidas aplicados en forma irracional y unilateral, que ponen en riesgo la salud de los guatemaltecos y que además contaminan el ambiente, que ocasiona otros daños ecológicos. Un ejemplo de los escasos estudios documentados sobre el uso de plaguicidas en Guatemala, específicamente de un área hortícola (tomate, sandía y otras hortalizas) y de granos básicos (maíz, frijol, SOl"gO y arroz) es el municipio de El Progreso, del departamento de Jutiapa, donde Way Medrano en su estudio, indica en el cuadro 1, las cantidades y tipos de plaguicidas que usaron los agricultores de ese municipio, durante el año de 1994. Cuadro 1 Cantidad y tipo de plaguicidas que usaron los agricultores municipio de El Progreso, Jutiapa, durante 1994. Tipo de Plaguicida de el Cantidad Kiloaramos Litros xxxx 5,400.0 Cloro xxxx 313.0 Desinfectantes en polvo 142.7 xxxx Detergentes 426.3 xxxx Fertilizantes foliares 67,500.0 3,500.0 Fertilizantes granulados 450,000.0 xxxx Fungicidas 8,910.0 1,000.0 Herbicidas 6,818.0 36,240.0 Insecticidas 6,150.0 21,660.0 Insecticidas caseros + creolina xxxx 1,250.0 34721.7 Jabones xxxx Fuente: Way Medrano, F.J. 1994. Deterioro, contaminación y posibilidad de mejoramiento, El Progreso, Jutiapa. Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Arquitectura, Tesis de maestría en Diseño, Planificación y Manejo Ambiental. Adherentes Para tratar de evitar .el uso desmedido de plaguicidas, el Instituto Agrícolas (JCTA) y otras organizaciones han impulsado programas Plagas (MIP). de Ciencia y Tecnología de Manejo Integrado de Sin embargo, la falta de apoyo político, el desconocimiento para su aplicación en el sector gubernamental y en el sector privado organizado o no, los programas "MIP" no han sido masivamente aplicados entre los productores nacionales, sino más bien han sido aplicados selectivamente en cultivos No Tradicionales de Exportación CArveja China, Bróculi y otros). Además la falta de un control adecuado por parte de los Ministerios de Agricultura y el de Salud Pública, para determinar los plaguicidas que se venden libremente en el mercado guatemalteco. ha fomentado el contrabando de plaguicidas que no aparecen registrados legalmente en el país. Con ello se tienen otros riesgos para los usuarios y el medio ambiente, entre algunos se pueden tener: productos de mayor toxicidad, productos prohibidos en otros países por sus efectos nocivos, productos sin eficacia comprobada y otros no determinados. Po!"ello es que el JCTA, con la colaboración de los voluntarios japoneses ha iniciado una serie de investigaciones sobre algunos plaguicidas con énfasis en los ya autorizados y con registro, para contribuir a usar éstos enforma más raciona! a! estima!"su eficacia, después de transcurrido algún período en su uso y una plaga en particular. Este manual espera contribuir a! conocimiento para desarrollar investigaciones de laboratorio, invernadero y campo, para estimar la eficacia de los plaguicidas y que su uso sea el más adecuado y de esta forma se disminuyan las cantidades de plaguicidas que se aplican en el país para minimizar los riesgos en la salud de los guatemaltecos y bajar los niveles de contaminación ambiental de Guatemala. INDICE INTRODUCCION 1. SECCION DE LABORATORIO 1. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 FUNGICIDAS Preparación del medio de cultivo de papa dextrosa de agar (PDN Aislamiento de patógenos de las plantas Aislamiento del micra-organismo del suelo Densidad del patógeno Manejo para la elaboración de un herbario de enfermedades Ensayo de la inhibición del crecimiento del micelio Ensayo del papel filtro del disco Manejo para la cultivación del patógeno de Phytophthora infestans 8 10 12 2. 2.1 (1) (2) 2.2 (1) (2) 2.3 (1) (2) INSECTICIDAS Aislamiento de nematodos Manejo para el aislamiento de raíz Manejo para el aislamiento de tierra Mecanismo de la epidermis del insecto y la permeabilidad Mecanismo de epidermis Permeabilidad de epidermis Ensayo del fisiológico de la columna vertebral del insecto Revelación de la columna vertebral del insecto Acción de los insecticidas a la columna vertebral de insecto 13 13 13 14 15 15 17 18 18 18 3. REGULADORES DEL CRECIMIENTO 19 4. HERBICIDAS . 21 II. SECCION DE INVERNADERO 1. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 (I) FUNGICIDAS Ensayo de efecto preventivo Ensayo de efecto residual Ensayo de efecto curativo Ensayo de penetración Ensayo de patógenos del suelo Vaporización artesanal 2. 2.1 2.2 2.3 2.4 INSECTICIDAS Manejo para la cría de insectos Ensayo de efecto contacto Ensayo de penetración Ensayo de efecto por alimentos 1 1 3 5 6 7 22 22 22 24 25 26 27 28 29 30 III. SECCION DE CAMPO 29 1. FUNGICIDAS 31 2. INSECTICIDAS 34 l. SECCION DE LABORATORIO 1. FUNGICIDAS En caso de que alguna planta este enferma, a causa de un patógeno se tiene que investigar. Sí el patógeno puede ser cultivado artificalmente, se procede a aislar el patógeno. En la superficie de la lesión generalmente hay varios gérmenes. Primero Se eliminan, después aislar el patógeno que es el objetivo. Tenga cuidado con el manejo de la asepsia especialmente. 1.1 Preparación del medio de cultivo de papa dextrosa de agar (PDA) Ingredientes: 20g de agar, 20g de dextrosa, 200g de papa y 10001111 de agua destilada. Procedimiento: l. Se debe pelar y lavar las papas (200g). 2. Se debe cortar las papas en cuadrados pequeños de 2 cm aproximadamente. Y coiocaria en 1000 mI de agua destilada. 3. Se debe tapar la olla hasta que la papa este cocida. 4. Se procede a colar con la tela sobre el Erlenmeyer frasco. Y se filtra el agua de la papa. 1 5. Se debe medir el agua de la papa y si es necesario aforar hasta los 1000 mi con agua destilada. 7. Se caliente en una olla que contenga agua hirviendo. Luego se coloca el beaker dentro. Se debe mezclar continuamente. 9. Se procede a taparlos con aluminio para evitar accidentes. 6. Posteriormente se añade el agar (20g) y la dextrosa (20g) 8. Luego se coloca en un Erlenmeyer, pero no se debe llenar a su totalidad. 10. Se esteriliza en autoclave. 2 1.2 Aislamiento de patógenos de las plantas ~ / Alcohol etílico al 80% ~ 1. Cortar la lesión de la planta 5 mm de la infección con tijeras. / . " 2. Colocar pedazos (añicos) de las hojas en alcohol etílico al 80% durante unos segundos. 'e ~ Solución Agua esterilizada ~deSOlimán Pedazo 3. Además se ponen en la solución de Solimán (x 1000) durante un minuto. 4. Esterilizar las pinzas con la llama de un mechero. Después mover pedazos (añicos) de las hojas en agua esterilizada. 6. Sacar los pedazos (añicos) de las hojas con pinzas esterilizados. 5. Agitar el Erlenmeyer frasco y lavar pedazos (añicos) de las hojas. Medio de cultivo IF¿¿??l1l4¡ 7. Pegar pedazos (añicos) de las hojas en el medio de cultivo preparado, la caja de Petrí se deja de forma invertida. 8. Cerrar la tapa y poner la caja de Petrí invertida. 3 u \1 9. Colocar la caja de Petrí en la incubadora. y cultivar durante unos días, 20 a 25 "C. 10. Las hifas de hongo crecen alrededor de pedazos (añicos) de las hojas. Tapón de algodón 11. Raspar las hifas con inoculador. (El manejo de la asepsia) 12. Inocular de fondo el medio de cultivo en tuvo de ensayo en declive a este lado tranquilamente. (El manejo de la asepsia.) Etiqueta Patógeno 13. Cultivar 20 a 25 Manera de preparar "C durante 14. El patógeno que haber aislado puramente. ( Pegar la etiqueta y lo conservar. unos días. el agua esterilizada: Agregar agua destilada en el Erlenmeyer minutos.) frasco y esterilizar con autoclave (I20"C, 15 A 1.3 Aislamiento del micro-organismo del suelo Ingredientes: lSg de agar, 30g de dextrosa, 3.0g de NaNO], 1.Ogde KH2P04, O.Sgde KCI, 0.5g de MgS04-7H20, O.Olg de FeS04-7H20 (CZAPEK-DOX agar ), 1.0 mI de 0.1 N-Hel esterilizado y 1000ml de agua destilada. Procedimiento: l. Agregar un poco de suelo en 5 mI de agua esteri lizada. 3. Colocar 1.0 mi de (2) con pipeta esterilizada en la caja de Petrí esterilizada. Se debe colocar 1.0 mi de O IN-HCI en acerca. S. Lo remover muy bién. Darle vuelta al derecho, izquierdo y oblicuamente. 7. Sacar patógeno individual con inoculador. Y cultivar en CZAPEK-DOX agar aún más. 8. Observar color, la formación de espora, si hay micelio de aire o no, y otras características como color, forma en el patógeno aislado. 6. 2. Debe mezclar muy bien. 4. Agregar CZAPEK-DOX agar solucionado (lSml, 40-S0 °C). Cuajar el medio de cultivo. Después se coloca los petrís a la inverza y cultivar durante 3 a 4 dias. 5 1.4 Densidad de patógenos Investigar l. utilizando la cámara de Neubauer. Preparar la suspensión Cámara de Neubauer de patógenos. Cubreobjeto Vista lateral {. r==-v ~ i1 rnrn de profundidad 2. '==l 4 Hacer caer la suspensión de patógenos en el lugar juntamente con inoculador. 3. Esperar 2 a 3 minutos hasta que los 0.05 mm patógenos se hundan en la suspensión. c"'""' .~ I \. 4. 5. Observar al microscopio con 150 a 200 aumentos. / Contar número de patógenos que están en 4 muestras. Para contar el número de patógenos que están en las4 muestras hacerlo 10 veces. Y calcular su promedio. Con viene volver a cambiar la suspensión de patógenos 5 veces más. Finalmente calcular promedio de todo. Si existen patógenos en la línea, se cuentan solo 2 líneas que son de arriba y abajo o izquierda y derecha. En la suspensión adecuada presentará los patógenos que están en cada muestra. Si no está, comienza diluir de nuevo y empiece el proceso. 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 Promedio Suspensión1 2 3 4 5 z= nX 106 X d (el número I ml) Z: Densidad de patógeno en 1mI, n: Promedio en 4 medidas, d: Porcentaje de dilución !PRINCIPIO EVO. O.lmm J mm O.lmm de profundidad 1muestra es 0.05 mm de ancho. L= O.IX O.IX 0.1=0.001 mI L: Volumen de 4 muestras 1 ml =1,000 mm" Para cambiar el volumen de 4 muestras en 1ml, multiplicar el promedio en 4 muestras por 106. 6 1.5 Manejo para la elaboración de un herbario de la enfermedad. Las enfermedades de las plantas proceden de muchas especies de patógenos. Por eso se tiene que investigar la causa de la enfermedad y que el patógeno la produce. Para eso se tienen muchos formas de identificación .. Una es elaborar el herbario de la enfermedad como método eficaz para proporcionardatos básicos, A continuación se presentan los pasos a seguir para la elaboración de un herbario. 1. Agregar la misma cantidad de ácido acético glacial yagua. (La solución ácido acético al 50%.) 2, Agregar acetato de cobre básico al beaker donde está al ácido acético en solución y mover constantemente, al final se hace la solución saludada. 3. Agregar el agua tres veces el volumen esta solución. 4. Agregar la hoja que tiene el síntoma. 5. Calentar el recipiente a fuego lento. 6. Primero el color de la hoja cambia de verde a amarilla. Pero después cambia :a';,"~j:~otr¿;7 sesaca 7. Lavar la hoja que tiene algún síntoma inmediatamente. 9. Pegar la etiqueta y conservarlo. 8. Agregar la hoja en la solución diluido de formaldehído 20 veces más en agua. 7 1.6 Ensayo de inhibición del crecimiento del micelio Ingredientes: PDA (Es deseable que se use el medio de cultivo de PDA comercial), fungicidas, 100 mI del ErIenmeyer, el tubo de ensayo, la caja de Petrí esterilizada, 1 mi de pipeta, inoculador, agua destilada y el patógeno que se investiga. Procedimiento: 1. Preparar 49.5 mi del medio de cultivo de PDA en 100 mI del Erlenmeyer yagua esterilizada en tubo de ensayo para que diluya la solución. Al mismo tiempo esterilizar pipetas. 3. Diluir un décimo y un centécimo. (Por ejemplo : agregar lml de solución en un tubo de ensayo que tiene 9 mI de agua esterilizada.) 5. Agregar 0.5 ml de solución de fungicida en 49.5 mi de PDA (40-50 'C). O sea que diluir un centécimo finalmente. Y mezclar muy bien. 2. Agregar el fungicida en un tubo de ensayo que tiene 10 ml de agua esterilizada. 4. Preparar las soluciones diluidos de fungicida que se investiga. 6. Agregar 50 mi de PDA que tiene fungicida en las 3 cajas de Petrí esterilizadas con uniformidad. Cuajar el medio de cultivo durante 2 a 3 horas. 8 -7. Sacar la punta de la colonia con los patógenos cultivados de antemano con un sacabocado de 5 mm de diámetro. 8. 9. Contar la proporción de inhibición de crecimiento con base a la siguiente fórmula: para cada uno de los ingredientes Inhibición Colocar las hifas individuales de patógeno s cortados en disco del medio de 5 mm a los extremos de la caj a de Petrí durante unos 3 a 10 dias. Y medir el diámetro de las hifas. de fungicida , de Crecimiento en Porcentaje (%)= (l-B/A)X 100 A: Diámetro de la colonia de hifas en mm sin aplicación B: Diámetro de la colonia de hifas en mm con aplicación En caso de un fungicida A 50WP que contiene 50% de ingrediente Fungicida A 50WP 0.2 g + 10 mI de Agua esterilizada 9ml 9ml 1 mi 1 mi 9 rnl l ml • 10000 ppm 0.5 mi + 1000 ppm 0.5 mI + 100ppm 0.5 mI + gggg 49.5 rnl de PDA 100 ppm de ingrediente 49.5 mI 10ppm 10ppm 0.5 mI + 49.5 ml 49.5 mI 1.0 ppm 0.1 ppm 9 1.7 Ensayo del papel filtro del disco Tapón de algodón Patógeno 1. Preparar el patógeno aislado puramente que se investiga. 2. Diluir el fungicida en la concentración que se investiga. Tapón de algodón Papel filtro Medio de cultivo 3. Preparar PDA. 200m! del medio de cultivo de 4. Preparar el papel filtro homogéneo. v 1. Estampar el círculo que tiene un diámetro de 6 a 8 mm con el saca corcho. 6. 7. Empapar el papel filtro del disco con suficiente fungicida preparado (2). 8 . Colocar el papel filtro del disco en la tabla de vidrio esterilizada. 9. Tapar con el papel filtro del disco de arriba unas veces ligeramente para que se elimine la solución. Ponerlos en la caja de Petrí, luego se esterilizan (170"C, 30 min.). 10. Con ello termina la preparación del papel filtro del disco ya impregnado de fungicida. 10 11. Quemar el medio de cultivo de 'PDA preparado (3) con agua caliente. 12. Enfriar en unos 50 a 55 'C. A "-<0 14. Mezclar PDA inoculado rápidamente teniendo cuidad que no tenga contacto el tapón de algodón. ~ 13. Inocular patógeno en PDA con inocula dar unas veces. (El manejo de la asepsia). Ibz77//777777zJI 16. Cerrar la tapa y dejar hasta inoculado hasta que solidifique . • 15. Agregar 15 a 20 ml de PDA inoculado en la caja de Petrí esterilizada. «>:<, ~ 18. Dejar durante 10 a 20 minutos hasta fungicida se difunde en PDA inoculado suficientemente. Diámetro de círculo 17. Pegar 4 papeles de filtro del disco que absorbe el fungicida preparado CIo) en PDA inoculado. ~ V \ 19. Cultivar durante unos días en 20 "C.( Poner III ~Iljll de Petrí invertida.) PDA (.1" '~"-r"--r--,~ O 20. Si un fungicida tiene eficacia, en el círculo se observará el micelio que se inhibe. Después se podrá medir el diámetro del círculo. (Si es eficaz, tamaño del diámetro del micelio del inhibido SE' observará.) a > ¡P > eficacia 11 1.8 Manejo para la cultivación del patógeno de Phytophthora infestans Cultivar el patógeno de Phytophthora infestans se utilizan tubérculos de papa o hojas de tomate, luego se inoculan, porque el patógeno selecciona el medio de cultivo adecuado para su cultivo y crecimiento. Ingredientes : Papas, atomizador, recipiente plástico, toalla de papel, maya, beaker yagua destilada. Procedimiento: l. Los tubérculos fueron pelados y cortados en rodajas de lOmm, posteriormente, se lavan y se dejan reposar para secarlas. Luego se colocan en cajas plásticas para mantener la humedad. 2. Inocular con los zoosporangios. Estos se obtienen de las hojas que presentaban los síntomas de la enfermedad en cultivos y se depositan en un beaker con agua destilada y se agitan para que los zoosporangios contenidos quedaran en el agua. 3. Las cajas plásticas quedan cerradas durante unos 7 días, donde crecieron los zoosporangios. Luego se vuelve a agitar los tubérculos en agua destilada para realizar el mismo procedimiento con nuevos tubérculos y así mantener el patógeno en el laboratorio. El ejemplo de evaluación de los fungicidas usando el procedimiento de anterior. l. Mojar la hoja en la solución diluida de fngicida que se investiga. Inocular zoosporangios despues de secar, y cubrirlos. 2. Dentro de unos 7 días se aparece el síntoma. Medir porcentaje de la hoja dañada. 12 2. INSECTICIDAS 2.1 Aislamiento de nematodos Nematodos pertenecientes a nematelmintos, dañan los cultivos agrícolas frecuentemente. Los nematodos tienen muchas especies, por ejemplo Meloidogyne sp., Pratylenchus sp., Aphelenchoides sp. y otras. Realizar el aislamiento para observar nematodos con el microscopio. (1) Manejo para el aislamiento lo de raíz Escoger raíces que contengan nematodos que están en desarrollo y los nudos que se manifiesten en la muestra. Los nema todos son parásitos de los cultivos agrícolas, pueden obtenerse por ejemplo la zanahoria y otros. 2. Lavar con agua las raíces, sacando cuidadosamente los restos de tierra. @ o b o , 4. Colocar dentro de la caja de Petrí. 3. Cortar cada una de los partes con tijeras. / @ ¡-\! "" 1:) 5. del nudo ~~' ',' .'.:: .' r: " "" ) 6. Agregar unas gotas de agua y dejarlas durante un determinado tiempo, c>, Romper el nudo con pinzas. @.~~ .. .. , ' 7. Tomar un poco de la muestra con pipeta y moverla a vidrio de reloj. 8. O Observar la solución con un estereoscopio, 13 I (2) Manejo para el aislamiento de tierra Composición del aparato tipo Bearman para aislar nematodos. Tamiz Embudo '"t Llave de mariposa Vidrio de [J :6r Pedestal 2. Extraer tierra que contenga nematodos vivientes en el campo. hule ~ 1. Pegar el embudo grande al tubo de goma, y parar la punta con abrazadera de pinza. Poner el tamiz o la cesta de bambú en el embudo. (Poner debajo vidrio de reloj.) 4. Envolver la tierra con tela. (Es mejor que tipo de la tela blanqueada de algodón.) 3. Pesar 50g de tierra. Agua 5. Poner la tierra que se envolvió con tela en el tamiz o la cesta de bambú que está dentro del embudo. tl ~ 7. Abrir la abrazadera de pinzas, hacer caer unos gotas de agua sobre el vidrio de reloj. 6. Agregar agua hasta llenar el embudo y dejarlo. o 8. Observar la solución con un estereoscopio. 14 I 2.2 Mecanismo de la epidermis del insecto y la permeabilidad La permeabilidad de la epidermis del insecto depende de el mecanismo de epidermis y cantidad de cera. Además tiene relaciones estrechas con la resistencia del insecto. Generalmente en los insecticidas de epidermis, puede demostrar la eficacia de insecticidas. Investigar sobre las partes de epidermis del insecto y la permeabilidad. (1) Mecanismo de epidermis CD El ejemplo 1 Mosca parafina liquida y metanol 1. Agregar parafina liquida y metanol en vidrio de reloj y conservar la mosca en esta solución. 2. Observar una mosca con un estereoscopio. 3. Aparecer espumas innumerables desde la superficie de epidermis de la mosca. 4. La espuma* continua ocurriendo durante unos minutos hasta que el agua, del cuerpo se pierda. 5. Entender que la cera de epidermis es eliminada por parafina. /NOTA) Es mejor que utilice agua y metanol como una prueba. En caso de que esos no ocurra indica que no hay presencia de ceras. * : Agua que sale de la mosca y parafina líquida más metanol diferencian la densidad. Por eso se puede ver como la espuma ópticamente. 15 @ El ejemplo 2 o: .•.. . ~ i ~ ~.~-: ;t;:../ t:J ~ 1. Agregar alúmina en polvo en el tubo de ensayo. 2. Introducir una mosca en el tuvo de ensayo. y sacudirlo durante 10 minutos. Agua 3. Sacar una mosca e introducirla en el tubo que contiene veneno, y de último matarla. 5. Agregar la mosca en amoniaco de plata solución. * 4. Lavar una mosca con agua. 6. Exponer la mosca a la luz durante unos minutos. 2. Observar con un estereoscopio. (Comprender que la epidermis se tiñe de negro y la capa de cera de la epidermis es eliminado') !ATENCION! El Fenol de la capa interior de cera toca el amoniaco de plata solución. Ocurre la reacción que tiñe de negro y se precipita porque la plata es reducida. En caso que la epidermis del insecto posea la capa de cera gruesa se tarda mucho más tiempo en teñirse. ¡NOTA) Es mejor que siempre se elabore el testigo ya que a este no se le agrega el polvo de alúmina. * : Amoniaco de plata solución : Tocar un poco de nitrato de plata soluciona con 20 ml de agua destilada. transparente. Además agregar amoniaco líquido poco a poco hasta que el líquido sea 16 CID El ejemplo 3 A A 8 1. Agregar una o dos larvas en el tubo de ensayo A y B. (El tubo de ensayo A se coloca en el beaker que con tiene hielo para bajar la temperatura. Entonces la larva está inmóvil. ;¡;¡ ~1?~@10~ 3. Dejar durante un determinado tiempo, luego se coloca en cada caja de Petri A final decide si vive o no. (2) Permeabilidad 2. Si la larva esta inmóvil, agregar la materia de inactivo como Sílice en el tubo de ensayo. Sílice no tiene actividad como insecticidas jamás. Pero la parte de la capa de cera de la epidermis es quitado por el polvo, porque el insecto se mueve. Entonces los insectos mueren porque el agua se pierde rápidamente. En caso del tubo de ensayo A, insectos no mueren porque los insectos están inmóviles. de epidermis """, "" 2. Preparar el tubo de vidrio delgado que se le introduce un poco de fenolftaleÍna en la punta. , Epidennis del insecto 1. Cortar la epidermis del insecto ancho todo lo posible. Epidermis del insecto Solución alcalina Epidermis del insecto Fenolftaleína 3. Cubrir la punta que contiene fenolftaleÍna con la epidermis insecto y atar con el hilo delgado. 4. Introducir la punta del tubo de vidrio en la solución alcalina que hizo por amoniaco o otros. !NOTA) la de 5. Comprender que solución alcalina penetra en la epidermis del insecto por el color de líquido que cambia el rojo. Los insectos de otra clase tienen deferencia en el mecanismo de la epidermis y el grosor de la capa de cera. Por eso la penetración es diferente (En caso de este decidir el cambio de color de solución alcalina.) Es interesante que se traten varios insectos. 17 2.3 Experimento fisiológicode la columna vertebral del insecto La columna vertebral de los insectos es un aparato circulatorio. Es importante que se investigue está fisiología para comprender el mecanismo de acción de insecticidas. Investigar sobre el mecanismo del pulso utilizado en los saltamontes. (1) Revelaci6n de la columna vertebral del insecto Pierna Cabeza ..--.'AJ~I.1!¿~ Alas 1. Preparar los saltamontes con un alfiler. 2. Primera vez cortar la cabeza, pierna y alas. Luego despejar el lado del abdomen a lo largo de estómago. Y quitar la tabla de abdomen. 4. Observar del la columna vertebral de insecto. Alfiler Columna vertebral Músculo \0,••• - 3. -r-r-r-r-r-r- Plato de anatomía Colocar la tabla de la espalda abajo, y fijar con alfiler en el plato de la anatomía. Luego sacar el aparato digestivo, el órgano reproductor y otras partes cuidadosamente. Revelar la columna vertebral que está a lo largo de la tabla de espalda. IATENCIONl A veces es mejor que se agregue gota a gota la solución de Ringer (0.65% de NaCl, 0.014% de KCl, 0.012% de CaC12,0.012% de NaHC03 y 0.001 % de NaH2P04) para saltamontes. (2) Acci6n de los insecticidas a la columna vertebral de insecto. 2. 1. Investigar el cambio del pulso de la columna vertebral. Luego aplicar la solución preparada sobre la columna vertebral. 18 3. REGULADORES DEL CRECIMIENTO En el regulador del crecimiento está involucradas varias hormonas vegetales como Oxycina, Giberelina y Cinetina, como ejemplo para investigar el efecto hormonal sobre la crecimiento de la hoja de nabo. Sí se podrá comprender la acción de la Giberelina o Cinetina. U ~ 1. Sembrar 300 semillas de nabo en la maceta. Y regar la planta cada día. 3. Si se deja 24 horas en el lugar oscuro, la hoja primaria llegará a tamaño de 0.6 a 0.8 cm". 2. Dentro de 10 a 20 días. cuando las hojas primarias crecen 0.4 a 0.5 cm", se traslada la maceta a un lugar oscuro. 4. Estampar las hojas cuando alcancen el tamaño de 0.5 cm de diámetro con el saca corcho y cortar pedazos de hoja. 6. Mezclar en agua destilada floten las hojas. / 5. 7. Las hojas en pedazos obtenidas flotan en agua destilada. Se necesita 15 muestras aplicadas con el regulador del crecimiento. 1.50 g de Ca(N03)2-4H20 0.25 gde KCl 0.25 g de MgS04-7H20 0.05 g de KH2P04 20.0 g de Dextrosa Hacer la solución para cultivar. ~ 8. ¡ ~eagua para que destilada ~ Solucionar el regulador del crecimiento en la solución para cultivar. !ATENCIONj La concentración de Cinetina usada para investigar puede ser 0.01 a 10 mgll, Giberelina es 0.1 a 100 mgll. Y hacer 4 tipos de concentración generalmente. Otras hormonas vegetales se puede consultar literatura. 19 / (¡ Hoja del disco 9. Agregar 10 ml de la solución en la caja de Petrí. 10. Sacar las hojas del disco de agua destilada (6). y quitar el exceso de agua del papel filtro. Luz de 1000 Lux 28·C 11 I 11u""",11 11. Pesar las 15 hojas (muestras) de disco según la dilución de investigar hasta los grados de mg. 11. Cerrar la tapa y dejar en el lugar que tiene unos 28 'C, la luz de 1000 Lux durante 20 horas. (Cuidar las hojas que no se hundan) Medida 1. La cantidad de producción Sacar las hojas (muestras) de la caja de Petrí y quitar el agua del papel filtro. Después medir las 15 hojas (muestras) según el regulador del crecimiento usado o su concentración. 2. La superficie de la hoja Copiar las hojas (el mismo tamaño) en otro papel filtro. Luego cortar para obtener el peso de 15 hojas (muestras). Hoja del disco ®®®(]) ®®®©0 00®0© ••••• ••••• e •••• !ATENCION! Sobre la superficie de la hoja, se hace igualmente antes de hacer el ensayo. Resultado de la consideración ( Diferencias en el crecimiento) 1. Sí tiene la significación comparado con el testigo, se puede pensar que la acción se debe a la Giberelina o Cinetina. 2. Si el aumento del peso fresco es más grande que la superficie, se puede pensar que la acción en de Cinetina. 3. Si el aumento de la superficie es más grande que el peso fresco, se puede pensar que la acción es de la Giberelina. 20 4. HERBICIDAS Es importante conocer el efecto del herbicida en la germinación, así como en la raíz, además la selección del tóxico que puede tener o no efecto en las gramíneas y plantas de hojas anchas, también puede verse el efecto hormonal o no del herbicida. Para probar el manejo de los herbicida se hizo un resumen de como debe hacer el experimento. 1. Diluir el herbicida en la concentración que se investiga. 2. Colocar2 o 3 gotas de la dilución con herbicida sobre el papel filtro en una caja de Petrí. Deje que el papel filtro absorba la solución a investigar. "" J e .. .. .. @ .. . ... . 3. Sembrar 10 a 20 semillas (de las gramíneas o de plantas con hojas anchas puede ser nabo, tomate y otro) en la caja de Petrí. v \j 4. Cerrar la tapa, y colocar en la incubadora, este a temperatura adecuada (aproximadamente 20'25"C) para germinar de semilla durante 2 a 5 días. Resultado de la consideración 1. Comprender que el efecto sobre la germinación se mide por el porcentaje de germinación. 2. Comprender que el efecto sobre la raíz se mide por el porcentaje de crecimiento de la raíz. 3. Comprender que la selección toxicológica es en base a la forma que actúa el herbicida sobre las gramíneas y plantas de hojas anchas. 4. Comprender que la acción hormonal de herbicida puede verse si tiene o no la aparición de síntomas de deformidad de tejidos vegetales. IATENCIONj Se necesita el testigo absoluto (sin aplk~rión) P:¡l':¡ r.om!':¡l':¡l' ron Pllo~ 21 1. FUNGICIDAS Procedimiento: Preparar las plantas en macetas. Se les aplica cada fungicida o inocular los patógenos a investigar. Evaluar los efecto de prevención, residualidad, curación y penetración, respectivamente, el control de los fungicidas con base a la siguiente fórmula para medir el efecto preventivo, curativo y residual : Control (%) = (l-B/A)X 100 A: Porcentaje de hifa dañado sin aplicación. B: Porcentaje de hifa dañado con aplicación. 1.1 Ensayo de efecto preventivo Aplicación de fungicidas Inoculación de patógenos I 1 días I 7 días 1.2 Medidas de resultado I Ensayo de efecto residual Inoculación de patógenos Aplicación de fungicidas I 7 días El ejemplo de Mildiú polvoriento (Sphaerotheea ensayo de maceta invernadero. I Medidas de resultado 7 días I sp.) en el cultivo del pepino (Cucumis Sativumy en el l. Aplicar cada fungicida en la concentración la casa fabricante recomiende ( básico) y un décimo de esta, usar 2 plantas I atomizador en cada fungicida. Dejar las macetas un día para que se sequen. En caso de residualidad, dejar las macetas durante 7 días. 2. Preparar patógenos anticipadamente o previo al ensayo. 3. Colocar la hoja que presenta Mildiú en 100ml de agua destilada. Y hacer suspensión de esporas. 22 4-a. 5. Luego inocular con atomizador hasta que todas las hojas se mojen uniformemente. o 4-b. Colocar las macetas en camas dentro de invernadero hasta Mildiú polvoriento aparezca en hojas del testigo (sin aplicación). 6. Medir el control de los fungicidas según el porcentaje de hifa dañado. Aplicar esporas sobre las hojas directamente,uniformemente. !ATENCIONj Dejar las macetas sin plástico cubierto en el invernadero después de inocular patógenos, porque Mildiú polvoriento quiere condicion es de saturación de humedad. 7. Medir fítotoxicidad también. 23 1.3 Ensayo de efecto curativo Inoculación de patógenos Aplicación de fungicidas Medidas de resultado I 1 días I 6 días I El ejemplo de Tizón tardío iPhytophthora infestans) en el cultivo del tomate (Lycopersicum esculentumi. J. Preparar tomate en macetas de 12 cm de diámetro y patógenos anticipadamente o previó al ensayo. 2. Colocar las macetas en bandejas que permiten almacenar agua. Después inocular zoosporagios de Phytophthora infestans en suspensión con atomizador hasta que las hojas se mojen. 4. Sacar las plantas de plástico transparente y se las colocan en el exterior de la habitación hasta que las hojas se sequen naturalmente. 5. Aplicar cada fungicida según la concentración que la casa fabricante recomiende, 2 plantas para cada fungicida y aplicar individualmente con un atomizador. Dejar las macetas unas 5 horas para que se sequen. 6. Colocar las macetas en bandejas que permiten almacenar agua y cubrir las plantas con plástico transparente igual que paso 3, hasta que el Tizón tardío aparezca en las hojas del testigo (sin aplicación). Al fin medir el control de los fungicidas según el porcentaje de hifa dañado y fitotoxidad. 3. Cubrir las plantas con plástico transparente para que aparezca el Tizón tardío que de quiere una condición de saturación de humedad, durante un día. 24 1.4 Ensayo de Penetración ( con papel aluminio) Aplicación de fungicidas 1 días I Inoculación de patógenos días Medidas de resultado I I 1. Cubrir cada parte de la hoja: completa, la mitad y el revés con papel aluminio y luego aplicar los fungicidas. 2. Inocular zoosporangios de Phytophthora infestans en suspensión. 3. Cubrir las plantas con plástico. 4. Observar si el síntoma de tizón tardío se presenta aluminio. o no en cada parte cubierta con papel a; Hoja totalmente cubierta, b; Hoja cubierta a la mita, c; Hoja cubierta en el envés 25 1.5 Ensayo de patógenos del suelo Ingredientes: 500g de tierra negra, 500g de afrecho, 100g de dextrosa, de PDA, 1000ml de beaker y papel aluminio. 1000m1 de agua destilada, el medio de cultivo Procedim iento: l. 2. Mezclar 500 g de tierra negra, 500 g de afrecho y 300 mI de agua dextrosa 10% ( 100g de dextrosa 1I OOOmlde agua destilada) en 1000 mI del beaker muy bién.Y tapar con papel aluminio. Esterilizar con el autoclave durante 2 horas (121°C). 3. Colocar el patógeno del suelo que se investiga previamente cultivado saque con la punta de un sacabocado, en el medio de cultivo de suelo(2). Y cultivar durante unos 10 días. 4. Mezclar un décimo del suelo infecto con substrato una mezcla de tierra: arena blanca: broza en proporción de 2 : 1 :1, respectivamente. Esta mezcla se desinfestó usando la técnica de Vaporización artesanal del Proyecto JCT A-UNIDO *ver (l ). y cultivar unos 5-10 días hasta crecer los micelios, 5. Sembrar cada 5 semillas o transplantar el producto agrícola en cada maceta que se reparte al suelo preparado (4) en macetas. Luego aplicar los fungicidas según su descripción, respectivamente. 6. Colocar en camas dentro del invernadero hasta que la planta del testigo se muera. 7. Medir porcentaje de germinación dañada y la fitotoxicidad. (1) Vaporización o planta artesanal .~ 1. Calentar (45 a 200'(:) el substrato una mezcla de tierra: arena blanca: broza en proporción de 2 : 1 : 1, respectivamente. 2. Luego cubrir con plástico naylon y dejar bajo sol durante 3-5 días. 26 2. INSECTICIDA Los insecticidas tienen 2 tipos de acción. l. El efecto del veneno que acuta por contacto que muestran la acción después de que los insecticidas entren en contacto con la superficie de la piel del insecto. 2. El efecto de penetración del veneno que muestra la acción del veneno en los insectos que respiran esa solución, se traslada al interior del cuerpo del insecto después de absorber en las hojas y raíces de las plantas. Seguidamente; los insecticidas de otra clase de acción tienen diferencias en el grado de efecto sobre la mortalidad en los insectos. Para investigar cada uno de los efectos, se hizo la concentración que se diluyo en la solución y se espera que la mitad de insectos muera llamada DL 50. 2.1 Manejo para criar del insectos El ejemplo de Gusano del follaje (Plutela xylostella) en el cultivo del repollo (Brassica oleracea var capitatay. 1. Cubrir las hojas de la planta parásita con el parafilm comercial hasta que los insectos que se hace objeto de la investigación pongan huevos sobre parafilm. 3. 2. Guardar los parafílmes que tienen los huevos en el refrigerador ( menos de ]O"C) hasta que se reunieron los todos huevos obtenidos para investigar un número suficiente. Colocar los parafílmes guardados sobre las hojas de repollo preparado en maceta dentro de la caja. Después las larvas que salen de los huevos que unen para. tener las larvas de la misma edad. 27 2.2 Ensayo de efecto contacto 1. Diluir el insecticida en la concentración que se investiga. 2. Preparar el cilindro de vidrio (viales) según el tamaño de insecto. Tela Larvas Tela 3. Agregar 20 a 50 insectos en el cilindro de vidrio y pegar la tela en la parte de arriba y abajo. -. -------- 4. Conservar en la solución durante 2 minutos. Papel filtro 5. Poner los insectos mojados en el escapelo y eliminar la solución. 6. Agregar los insectos en la caja de Petrí y cubrirlo con tapa de alambre para que no escapen. 7. A los 2 días contar número de los insectos que mueren. 28 2.3 Ensayo de penetración 2. Cultivar la planta parásita en la solución de insecticida así como el hidropónico que fijen en el tocón con algodón. 1. Diluir el insecticida en la concentración que se investiga. Inocular /~Afidos, Larvas etc. ----. Th !! 3. - ,.' Pinzas pulgo ~ nes etc. 1- - Pincel delgado Inocular 20 a 50 insectos en la planta. En caso de insectos grandes se inoculan con pinzas. Los más pequeños inoculan individualmente con un pincel delgado. « 5 mm) se 4. A los 2 días contar número de los insectos que se mueren. Al fin calcular la mitad de insectos muera llamada DL 50 que se usa la prueba de Pro bit. 29 2.4 Ensayo de efecto por alimentos El ejemplo de Falso medidor (Tricnoplllsia ni) en el cultivo del repollo (Brassica oleracea var capitata). l. Buscar las plagas que se hace objeto de la investigación. Y criar las plagas en una caja artifícialmente. 3. Conservar cada 3 hojas en insecticidas de la concentración que el fabricante recomienda( básico) y un décimo, durante unos minutos. 5. Colocar 3 hojas en un recipiente plástico que contenga el agua en algodón. Después inocular unos 10 larvas con pinzas. .A~~ ••• _ 2. Cortar la hoja de repollo preparado en maceta con la tijera. 4. Sacar las hojas de vasos y colocar fuera hasta que las hojas se sequen naturalmente. Cubrir con tela para que las larvas no se escapen y dejar unos 3 días. 7. Medir número de las larvas que se mueren a los 3 diás. 30 111. SECCION DE CAMPO 1. FUNGICIDAS El ejemplo de Tizón tardío (Phytophthora infestansv en el cultivo del papa (Solanum tuberosumi. 1. Decidir el producto agrícola y la enfermedad que se hace objeto de la investigación fungicidas que se evaluan. Luego lea la recomendación comercial a investigar. Cuadro los 1 Productos utilizados en Guatemala y su descripción Nombre Comercial ACROBATMZ 69WP Aliette 80WG Antracol 70WP BRAVO 50SC CHAMPION 77P.M. CURZATEM 72WP DITHANE 80WP Folpan 80WP Positron Duo 69 WP Previcur 72SL Dosis de Aplicación Nombre Genérico DIMETOMORF 9% + MANCOZEB 60% 0.75kg/200l Intervalo de Aplicación 7-10 días FOSETfL-AL 3-6g11 8 días 1.5-2.5kg/300-6001 0.75-11/2001 2-3.251/ha 0.45kg/200l 7 días 7 días RHONEPOULENC Baver ZENECA 7-14 días SUPERB 2-3kglha 3-5 días DUPONT 2.0-3.0kglha 1.0-1.5kg/2001 l.5 gf1 2-2..5 kg/ha 5-8 días 7 días 5-12 días ROHM HAAS INCISA Bayer 5-10 días AgrEvo 7-14 días NOVARTIS 80% PROPINEB 70% CLOROT ALONlLO 50% HIDROXIDO DE COBRE 77% CIMOXANIL 8% + MANCOZEB 64% MANCOZEB 80% FOLPET 80% [PROV ALICARB 9% + PROPINEB 60% PROPAMOCARB 72% 1.5-2.5 cm" /l + Derosal 50SC lcm3/l 2-2.5kg/ha MET ALAXIL-M 8% RlDOMfL + MANCOZEB 60% GOLDMZ68 .. La dOSISde aplicación utilizada fue base a 1,000l/ha 2. y seleccionar Casa que Distribuye CYANAMID Preparar el terreno y sembrar semillas de producto agrícola de la variedad sensible al Tizón tardío y en la época que la enfermedad que se hace objeto de la investigación aparece en forma natural. Sembrar 30 semillas (tubérculos entre 50-1 OOg) de papa variedad: se usó Catalina ( sensible al Tizón tardío) sembrada en un surco durante la época de lluvia, para cada tratamiento se tuvieron tres repeticiones surco). para un total de 45 surcos (8m X lm/ 31 3. Medir cada fungicida utilizando exactamente 25 cc del producto y aplicar cada fungicida continuamente en cada surco según su descripción, además se deben aplicar en todo el follaje de la planta cuidadosamente. Se puedenmejorar las aplicaciones de los productos, si tienen pipetas, el pesa de campo y el uso pantallas protectoras (barreras protectoras). 4. Finalmente se evalua la severidad del daño causado por la enfermedad en unos hojas /planta, con base en porcentaje, se usa la escala de severidad. o: No hay lesión o tejido sano. m~~R-;;;;::[;;::-;J J: Lesión inferior al 20%. 2: Lesión inferior al 40%. 3: Lesión inferior al 60%. 4: Lesión inferior al 80%. 5: Lesión o tejido dañado al 100% Contar el control valor según la severidad. Control (%) = (l-B/A)X 100 A: Severidad de hifa sin aplicación. B: Severidad de hifa con aplicación. Ver resultados obtenidos en Chimaltenango, Guatemala, año 2000. Cuadro 2 Eficiencia de los fungicidas para el control de Tizón tardío en el cultivo de papa Primero dato Segundo dato Severidad Control Severidad Control Nombre Genérico (! Hoja) (%) (1Hoja) (%) (Producto Comercial) 0.14 0.19 0.32 1.87 1.91 2.14 0.32 0.45 1.24 0.86 0.44 3.32 (Daño Cimoxanil 8%+Mancozeb 64% Clorotalonilo 50% Dimetomorf9%+Mancozeb 64% Folpet 80% Fosetil- Al 80% Hidróxido de Cobre 77% Iprovalicarb 9%+Propineb 60% Mancozeb 80% Metalaxil-M 8%+Mancozeb 60% Propamocarb 72% Propineb 70% Sin Aplicación (Testigo) 95.8 94.3 90.4 43.7 42.5 35.5 90.4 86.4 62.7 74.1 86.7 66.4%) 0.28 94.1 0.59 87.6 0.82 82.8 3.84 19.5 3.80 20.3 3.50 26.6 0.92 80.7 1.71 64.2 2.88 39.6 2.64 44.7 1.74 63.5 4.77 (Daño 95.4%) '" Se evaluó 5 hojas/planta, cada surco 30 plantas. 32 Fotografías Eficiencia de los fungicidas aplicados en papa variedad Catalina en campo. (lCTA Chimaltenango, Cuadro 3 Septiembre, 2000) A continuación se presenta la distribución de los fungicidas aplicados en cada surco en el campo DITHANE 80 WP RIDOMIL GOLD MZ 68 ACROBAT MZ 69 WP TESTIGO Antracol 70 WP Previcur 72 SL Positron Duo 69 WP CHAMPION 77 P.M. ." Aliette 80 WG Folpan 80 WP BRAVO 50SC CURZATE M 72 WP Folpan 80 WP BRAV050SC Aliette 80 WG DITHANE 80 WP CURZATE M 72 WP TESTIGO Antracol 70 WP ACROBAT MZ 69 WP RIDOMIL GOLD MZ 68 Positron Duo 69 WP Previcur 72 SL CHAMPION 77 P.M. Previcur 72 SL Antracol 70 WP Positron Duo 69 WP CHAMPION 77 P.M. Folpan 80 WP ACROBAT MZ 69 WP BRAV050SC CURZATE M 72 WP Aliette 80 WG DITHANE 80 WP TESTIGO RIDOMIL GOLD MZ 68 33 2. INSECTICIDAS El ejemplo de Minador de la hoja (Liriomyza huidobrensist en el cultivo del cebolla IAllium cepa) l. Decidir el producto agrícola y la plaga que se hace objeto de la investigación y seleccionar insecticidas que se evaluan. Luego lea la recomendación comercial a investigar. Cuadro 4 Productos utilizados en Guatemala Nombre Comercial AMBUSHIOEC Confidor 70 WG Lannate 90 WP Malation VERLAQ 1.8 EC VYDATE24SL La dOSiS de aplicación y su descripción Nombre Genérico PERMETRINA 10% IMIDACLOPRID 70% METOMIL90% MALATION % ABAMECTINA 1.8% OXAMll..24% .. utilizada fue base a I,OOOl/ha 2. Transplantar plantas de cebolla preparadas variedad: en tablas durante la época de sin lluvia, para cada tratamiento se tuvieron dos repeticiones m/tabla): los para un total de 14 tablas (10m X 2 Dosis de Aplicación Intervalo de Aplicación 0.7-1.51/ha 250 giba 5-8 días 14-21 días 240-600 giba 1.5-2.01/ha 0.6-1.21/ha 2-5I/ha 7 días ---7 días 7-14 días 7 días 3. Medir cada insecticida utilizando exactamente 25 cc del producto y aplicar cada insecticida continuamente en cada surco según su descripción, además se deben aplicar en todo el follaje de la planta cuidadosamente. 4. Finalmente se evalua la severidad del daño causado por la plaga en unos hojas /planta y porcentaje de la planta dañada Pero la hoja dañada que es causado por la plaga hay que confirmar. Cuadro 5 A continuación se presenta la distribución en cada tabla en el campo AMBUSHIOEC Confidor 70 WP Testigo Malation VYDATE24SL VERLAQ 1.8 EC Lannate 90WP de los insecticidas aplicados VYDATE24 SL Lannate 90 WP VERLAQ 1.8 EC Testigo AMBUSH IOEC Malation Confídor 34 Ver resultados obtenidos en Chimaltenango, Guatemala, año 2000. Cuadro 6 Eficiencia de los insecticidas para el control de Minador de la hoja en el cultivo del cebolla Nombre Genérico (Producto Comercial) Planta dañada / Total planta Abamectina 1.8% Imidacloprid 70% Malation % Metomíl 90% Oxamil80% Permetrina 10% Sin Aplicación (Testigo) 90/l40 77/140 89/139 90/146 109/143 100/138 106/135 Daño (%) 64.3 55.0 64.0 61.6 76.2 72.5 78.5 Severidad (/ Planta) 1.6 1.3 1.5 1.5 1.8 1.6 2.1 Control (%) 23.8 38.1 28.6 28.6 14.3 23.8 Minador de la hoja (Liriomyza huidobrensis¡ t. Gusano cortador (Spodpotera sp. ) Huevos de Gusano cortador (Spodpotera sp.) Mancha púrpura (Alternaría porri ) 35 Aditamentos necesarios para mayor eficacia en las aplicaciones de plaguicidas. (IeTA) ICTA: INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA AGRICOLAS .~ JAPÓN JOCV : VOLUNTARIOS JAPONESES EN COOPERACION TECNICA CON EL EXTRANJERO (AGENCIA DE COOPERACION INTERNACIONAL DEL JAPON) Adi tamen tos necesarios para mayor eficacia en las aplicaciones de plagicidas. ICTA: ISTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA AGRICOLAS JAPÓN JOCV: VOLUNTARIOS JAPONESES EN COOPERACION TECNICA CON EL EXTRANJERO (AGENCIA DE COOPERACION INTERNACIONAL DEL JAPON)