Mejía Alcantar Yara Yazmín - Universidad de Guadalajara

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Estudio del perfil de expresión proteico bidimensional de tejido neural
Yara Yazmín Mejía Alcantar, Graciela Gudiño Cabrera
y Daniel Ortuño Sahagún ([email protected])
Laboratorio de Desarrollo y Regeneración Neural.
Instituto de Neurobiología. Edificio L, 1er piso.
Departamento de Biología Celular y Molecular, CUCBA.
Universidad de Guadalajara
Introducción
El término “proteoma” se refiere a la totalidad de las proteínas que están
presentes en un organismo, órgano, tejido o célula en un momento determinado o que
son expresadas en una determinada condición (Beber et al. 2007). El estudio del
proteoma, constituye una plataforma metodológica que nos permite realizar un análisis,
en detalle y a diferentes niveles, de la fisiología celular, para obtener información acerca
de procesos biológicos complejos; como la división celular, los mecanismos de
regulación de la expresión génica y los mecanismos de diferenciación celular, entre otros
(Holger y Seth 2001). Las principales metodologías involucradas en este tipo de análisis
son: el isoelectroenfoque, la electroforesis bidimensional y la densitometría (Maurer et
al. 2004).
Debido a la gran cantidad de información que estas técnicas nos permiten
conocer, resulta un abordaje metodológico importante en el estudio de procesos
complejos, como la regeneración en el Sistema Nervioso Central (SNC). En este sentido,
las células de la glía envolvente (GE) localizadas en el bulbo olfatorio del mamífero
adulto, son las más estudiadas en cuanto a sus propiedades promotoras de la
regeneración en el SNC (Gudiño-Cabrera y Nieto-Sampedro 2000). La GE, junto con
otras celulas gliales, pertenecen al tipo particular “Aldainoglía” la cual ha empezado a ser
reconocida como un fenotipo glial (Panicker y Rao 2001).
En nuestro laboratorio se han identificado genes que participan en el proceso de
la diferenciación inducida de las células precursoras neurales multipotenciales (PNM)
hacia el fenotipo de aldainoglía (Rojas-Mayorquín et al. 2008), por lo que ahora nuestro
objetivo es realizar el perfil de expresión proteico, para complementar el conocimiento
de los factores involucrados en cómo las PNM originan células con fenotipo de GE, así
como para identificar las moléculas específicas y diferencialmente expresadas, que
participan en la diferenciación de la GE a partir de las PNM en el adulto.
Metodología
En esta primera etapa, para el estudio del perfil de expresión proteíca en tejido
neural mediante la estandarización de las técnicas de isoelectroenfoque y electroforesis
bidimensional, se utilizaron el bulbo olfatorio y el hipocampo.
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Animales
El tejido neural se obtuvo de ratas de la cepa Wistar (Rattus norvegicus), machos
de 8 semanas de edad, criados y mantenidos en condiciones controladas de bioterio; a
una temperatura de 22-25 ºC, humedad relativa del 50% ± 10%, periodos de luzoscuridad de 12:12 h y acceso libre al agua y alimento.
Extractos de proteínas
Los extractos de proteínas totales obtenidos de diferentes regiones de cerebro
adulto (bulbos olfatorios e hipocampo), fueron homogeneizados con el “Sample
Grinding Kit” (GE Healthcare). Posteriormente, se cuantificaron las muestras con el “2D Quant Kit” (GE Healthcare) y finalmente se agregó “IEF sample loading solution” (GE
Healthcare). Las muestras así preparadas pueden conservarse a -80 oC hasta su
posterior análisis. La cuantificación de la concentración total de proteínas de los
extractos se realizó mediante espectrofotometría.
Isoelectroenfoque
Para la separación de las proteínas por isoelectroenfoque, se colocaron 340 µl del
extracto en tiras de IPG previamente hidratadas (13 cm, pH 3-10), para posteriormente
separar las proteínas en el sistema Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare) durante 5h.
Electroforesis 2-D
Para la electroforesis en segunda dimensión, se realizaron geles de SDS-PAGE en
la cámara de electroforesis con sistema vertical (SE 600 Ruby), en los cuales se
colocaron las tiras de IPG, previamente procesadas (primera dimensión). Se inició la
electroforesis a 70 V (15 mA por gel), cuando el frente rebasó la interfase se incrementó
el voltaje a 200 V (60 mA por gel). Las posiciones relativas de las proteínas se
visualizaron mediante la tinción de Coomassie. El gel se tiñó en agitación con azul de
Coomassie. Se destiñó en agitación con una solución decolorante (10% ácido acético y
10% etanol). El patrón de manchas se analizó con ayuda de un sistema de análisis de
imagen.
Análisis de datos (IMAGE QUANT)
Después de teñido el gel se obtuvo la imagen para el análisis densitométrico.
Realizando una comparación de los puntos observados entre el bulbo olfatorio y el
hipocampo.
Resultados
Luego de obtener los extractos de proteínas, se cuantifican de forma que se
utilizarán 60 a 100 µg de proteína total para realizar el isoelectroenfoque. En la figura 1
se observa el gráfico de voltaje generado por la electroforesis de isoelectroenfoque, en la
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cual se puede observar en azul la curva ideal y en rosa la curva resultante del
procedimiento. El voltaje no debe superar en ningún punto la curva azul.
Posteriormente, se realizó la electroforesis de la segunda dimensión y los geles
obtenidos una vez teñidos, fueron analizados por densitometría. En la figura 2 se
observa el patrón de manchas de proteína obtenido en los tejidos procesados. En el
mismo se señalan algunas de las proteínas más evidentes, tanto aquellas que se
presentaron en ambos tejidos (círculos amarillos), como aquellas que se expresaron de
forma diferencial (flechas rojas).
ISOELECTROENFOQUE
9000
8000
MUESTRAS
7000
ESTANDAR
VOLTAJE
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
0.25
0.5
0.55
1.15
1.4
2.05
2.3
TIEMPO
2.55
3.2
3.45
4.1
4.35
Figura 1. Gráfico de isoelectroenfoque. La línea azul indica el patrón ideal, mientras
que la línea rosa indica las mediciones reales de voltaje durante la electroforesis.
El software empleado (ImageMaster 2D Platinum 6.0) permite el análisis,
cuantificación y comparación de los perfiles proteicos obtenidos, lo cual facilita la
identificación de proteínas que son expresadas de forma común así como de aquellas que
son expresadas de forma diferencial. Una vez identificadas estas, se procede a su
extracción del gel mediante un sacabocados, para proceder posteriormente a su
identificación por secuenciación.
Conclusiones
El análisis de los perfiles de expresión proteicos de diferentes muestras de tejidos
así como de diferentes poblaciones celulares, o bien de tejidos o células sometidos a
diversos tratamientos o en etapas diferentes de diferenciación, permite la identificación
rápida de aquellas proteínas que son comunes, así como de las que son expresadas
diferencialmente, tanto de forma cualitativa como cuantitativa.
La metodología de elaboración y análisis de geles bidimensionales permite el
análisis simultáneo de centenares o incluso miles de proteínas, lo cual favorece un
abordaje experimental integral.
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a)
b)
Figura 2. Perfiles bidimensionales de expresión proteica teñidos con azul de
Coomassie. a) bulbo olfatorio, b) hipocampo. Los círculos amarillos señalan proteínas
comunes en ambos. Las flechas rojas señalan proteínas diferencialmente expresadas.
Agradecimientos
El presente trabajo de investigación es parte de un proyecto apoyado por
CONACyT bajo los acuerdos J33999N para GGC, U48002-M para DOS, además de la
beca Doctoral 185242 para YYMA
Referencias
Beyer, S., Mix, E., Hoffrogge, R., Lünser, K., Völker, U., & Rolfs, A., 2007.
Neuroproteomics in stem cell differentiation. Proteomics Clin. Appl. 1(11):1513–1523.
Gudiño-Cabrera, G. & Nieto-Sampedro, M,. 2000. Schawnn-like macroglia in
adult rat brain. Glia 31(1):49-63.
Maurer, M.H., Feldmann, E.R.Jr, Fütterer, D.C., Buttlin, J., & Kuschinsky,
W., 2004. Comprehensive proteome expression profiling of undifferentiated versus
differentiated neural stem cells from adult rat hippocampus. Neurochem. Res.
29(6):1129-1144.
Panicker, M.M. & Rao, M., 2001. Stem cells and neurogenesis. In Stem Cell Biology.
eds., Marshak DR, Gardner DK and Gottlieb D. Cold Spring Harbor, New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, pp 399-438.
Rojas-Mayorquín AE, Torres-Ruiz NM, Ortuño-Sahagún D and GudiñoCabrera G. 2008. Microarray analysis of striatal embryonic stem cells induced to
differentiate by ensheathing cell conditioned media. Develop. Dyn. 237(4):979-994.
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