hPV - JORGE BASILETTI

VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV):
Etiopatogenia
Diagnóstico molecular y utilidad clínica
de la tipificación viral
Vigilancia
Vacunas
Bioq. Jorge A. Basiletti
Servicio Virus Oncogénicos
Laboratorio Nacional de Referencia de Papilomavirus
Laboratorio Regional de Referencia de Papilomavirus- OPS/OMS
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas- ANLIS "Dr. Malbrán"
Virus papiloma humano (HPV)
• Familia Papilomaviridae
• Tropismo epitelial: infecta piel y mucosas
100 nm
Cápside proteica,
sin envoltura
Genoma: ADN circular
(8.000 pb)
(Adaptado de Burd EM. Clin Microbiol Rev 2003; 16:1–17. )
VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV)
Familia Papillomaviridae
Cápside proteica, sin envoltura
Partículas virales
(Microfotografía Instituto Malbrán)
Genoma: ADN circular
Organización genómica
Ciclo de vida del HPV en el cérvix
Canal cervical
Las partículas del virus
se ensamblan y el virus
se libera. INFECCION
PRODUCTIVA
Capa
escamosa
madura
El virus utiliza células del
hospedador para replicar
el ADN viral y expresar
las proteínas codificadas
Capa
escamosa
Células
parabasales
El VPH infecta la capa
basal epitelio cervical.
Células basales
Membrana basal
Epitelio
Normal
Epitelio
Infectado
(Adaptado de Frazer IH. Nat Rev Inmunol 2004; 4:46–54)
CICLO DE LA INFECCIÓN POR HPV EN EL EPITELIO.
POTENCIAL ONCOGÉNICO VIRAL.
A
B
Formación de la verruga
o condiloma
Virus epiteliotropo: infecta piel y mucosa
Cuello uterino: la unión escamo-columnar
Trompas de Falopio
El punto donde se unen
las células escamosas y
las células columnares se
denomina la ‘unión
escamo-columnar’'
Ovario
Matriz
Endocervix
Útero
Cuello uterino
La zona de transformación
Ectocervix
Unión escamo-columnar
Epitelio escamoso
Epitelio columnar
Unión escamo-columnar
Unión escamo-columnar: blanco preferido del HPV
CLASIFICACION DE LOS HPV
Los HPV se clasifican en genotipos
en base a diferencias en su secuencia de DNA
Tipo viral
divergencia en > 10% de
homología en L1
(de Villiers y col, Virology, 2004)
HPV: 100 genotipos y vienen más ...
POTENCIAL ONCOGÉNICO DE LOS HPV
Tracto anogenital: 40 tipos de HPV
No todos los tipos virales
son igualmente oncogénicos
HPVs de Bajo riesgo: 6,11,40,42, 43, 44,
54, 61, 70, 72, 81 y CP6108
HPVs de Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58 y 59
(Muñoz et al, Vaccine 2006)
PATOGENIA DE LAS INFECCIONES
POR HPV
Tropismo epitelial
Piel
Verrugas
Epidermodisplasia verruciforme (EV)
Cáncer cutáneo no melanoma (CCNM)
Mucosa
Condilomas anogenitales
Lesiones preneoplásicas
Cáncer anogenital
INTERRELACIÓN ENTRE E6 Y E7
EN LA INTERFERENCIA CELULAR
HPV E7
Captura pRB y
libera E2F
HPV E6
Captura p53 y
la degrada
Progresión de G1 a S
Estabiliza p53
Activación de los genes para la replicación del ADN celular
E6 y E7 de los HPV de alto riesgo pueden inmortalizar
células humanas en forma independiente, pero
muestran complementariedad y sinergismo
(Münger y Howley, 2002)
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD
AGENCIA INTERNACIONAL DE INVESTIGACIÓN SOBRE CANCER
Los HPV de alto riesgo son carcinogénicos en humanos .
HPV
agente etiológico del cáncer de cuello uterino
La carcinogénesis por los HPV de alto riesgo está sustentada en evidencias
experimentales que indican que proteínas de esos virus interfieren en el
control de la proliferación celular
Human Papillomaviruses. Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans.
International Agency for Research on Cancer (IARC-WHO) Vol 64 (1995).
El cáncer de cuello de útero en el mundo
• 500.000 mujeres diagnosticadas por año1
• A nivel mundial, cada 2 minutos muere una
mujer por cáncer de cuello de útero1
– 270.000 muertes (GLOBOCAN 2002)1
– En regiones menos desarrolladas, el cáncer de
cuello de útero continúa siendo la principal causa de
muerte por cáncer en mujeres
– Las proyecciones indican para 2050 > 1 millón de
nuevos casos de cáncer de cuello de útero cada año2
1. Ferlay J, et al. GLOBOCAN 2002 Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide. IARC CancerBase; Lyon, 2004;
2. Parkin DM, et al. Eur J Cancer 2001; 37(Suppl 8):S4-S66.
DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓ DE
HPV EN MUCOSAS
Tipos de muestra para el
estudio virológico de HPV
Material fresco
Biopsia
Células
Tejido fijado
Portas
Tacos
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE HPV
EN EL LABORATORIO VIROLÓGICO (I)
Detección de ácidos nucleicos virales
por hibridación
Hibridación in situ
Captura de híbridos (HC II)
DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DE HPV POR
HIBRIDACIÓN IN SITU
(Servicio Virus Oncogénicos, Instituto Malbrán)
Detección de HPV por
captura de híbridos
Mezcla A (5 HPV BR): HPV 6, 11, 42, 43 y 44
Mezcla B (13 HPV AR): HPV 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68
Se mide luz emitida: proporcional a la cantidad de
DNA viral
Técnicas de estudio de HPV
para la vigilancia laboratorial
Detección de ácidos nucleicos virales
mediante PCR
Primers consenso
Primers tipo-específicos
Detección y tipificación de HPV por PCR consenso
6582 6646
6722 6764
6904
SPF1 SPF2 MY11 GP5
GP6
7170
Posiciones
nucleotídicas
MY09
Primers consenso
consenso::
MY 09, 11 / PGMY (450 pb)
GP 5+, 6+ (140 pb)
SPF (65 pb)
Requieren un paso posterior a la PCR
para la tipificación viral
(Bernard y col, 1994; Jacobs y col., 1997;Gravitt y col, 1998; Kleter y col, 1999)
Estrategias de tipificaión de HPV a traves de primers consenso
ADN amplificado por PCR
Hibridación
por Dot-blot
RFLP
Dot-blot
Electrophoresis
of amplified
products
Patrones de restricción
Hibridación reversa
Secuenciación
Probe
Probe
Probe Probe Probe Probe
Detección y tipificación de HPV por
PCR tipo específica
Primers tipo-específicos
– Regiones blanco: fragmentos
de E6 o E7
– PCR convencional o
PCR en tiempo real
Requiere una reacción de
PCR para cada tipo viral
(Gravitt y col., J. Virol Methods 2003)
ATENCIÓN
PARA UN DIAGNÓSTICO MOLECULAR CONFIABLE, SE
DEBE TENER EN CUENTA EL CONTROL DE CALIDAD:
Muestras patrones
Reactivos validados
Protocolos estandarizados
Operadores entrenados
Paneles de control de calidad
APLICACIÓN CLINICA DE LA
TIPIFICACIÓN DE HPV:
CONCEPTOS ACTUALES
DIAGNÓSTICO DE LESIONES ANOGENITALES
INDUCIDAS POR HPV.
EVALUACION CLINICA
COLPO / PENESCOPIA
CITO – HISTOLOGIA
ESTUDIOS VIROLOGICOS
DETECCIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DE HPV
¿CUÁNDO TIENE VALOR CLÍNICO?
AYUDA AL DIAGNÓSTICO: discordancia o duda
clínico-cito-histo-colposcópica.
ESCLARECIMIENTO DE ASCUS
ORIENTACIÓN TERAPÉUTICA Y DE SEGUIMIENTO
CONTROL POST-TRATAMIENTO
MEJORA EL SCREENING
PERSPECTIVAS EN LA PREVENCIÓN:
VACUNAS CONTRA VIRUS PAPILOMA HUMANO
Vacunas contra HPV
Antígenos
AS04 adyuvante
+
Sal
Aluminio
(Al(OH)3)
+
MPL
Inmunoestimulante
VLP HPV16 VLP HPV18
AS04 – contenido en vacuna
Antígenos
Adyuvante
+
VLP HPV16
VLP HPV18
VLP HPV6
CervarixTM es una marca del grupo de compañías GlaxoSmithKline.
Gardasil® es una marca registrada de Merck & Co. Inc.
Sal Aluminio
(Hidroxifosfato sulfato
de aluminio amorfo
[AAHS])
VLP HPV11
AAHS-contenido en vacuna
Las vacunas contra HPV son eficaces
(Seguimiento promedio de 7 años)
(Kohen, Science, 2005)
Cuadrivalente (Gardasil; Merck): licenciada por ANMAT en octubre 2006
Bivalente (Cervarix; GSK): licenciada por ANMAT en marzo 2008
(Villa y col, Lancet, 2005; Harper y col, Lancet 2006; Joura y col., Lancet 2009)
VACUNAS CONTRA HPV:
MODO DE ACCION
• La vacuna induce Ac
neutralizantes
IgG anti L1, tipo-específico,
que evitan que el virus
ingrese a la célula ⇒
IMPIDEN LA NFECCIÓN.
Anticuerpo
neutralizante
VPH
Canal cervical
TRANSUDACIÓN
Epitelio
cervical
Vaso sanguíneo
• No es una vacuna
terapéutica, NO tiene
acción sobre infecciones
preexistentes
Daño epitelial
Membrana basal
1. Parr EL, et al. J Virol 1997; 71:8109–8115; 2. Nardelli-Haefliger D, et al. J Natl cáncer Inst 2003; 95:1128–1137; 3. Schiller JT, et al. Nat Rev
Microbiol 2004; 2:343–347; 4. Kemp TJ, et al. Clin vacuna inmunol 2008; 15:60–64; 5. Poncelet, et al. ESPID, Poto, Potugal, 2007;
Resumen 37, Sesión ES2; 6. David MB, et al. Poster presentado at ESPID, 2008; 7. Fraser C, et al. vacuna 2007; 25:4324–4333;
8. Stanley M. VPH Today 2007; 11:1–16; 9. Einstein M. Cancer Inmunol Inmunother 2007; 57:443–451.
10,000
(Escala log10)
VPH 16
Serum cLIA GMT (mMU/ml)
Gardasil® Estudio fase II: niveles de
anticuerpos hasta 7 años.
Gardasil®
Infección natural
1,000
Nivel del anticuerpos más
alto que el de la infección
natural
100
10
* *
67
12
18
24
30
36
54
60
10,000
Escala (larga)
VPH 18
Serum cLIA GMT (mMU/ml)
0 123
* vaccination
Gardasil®
Infección natural
1,000
Nivel del anticuerpos
similar al nivel de la
infección natural
100
10
* *
0123
* vaccination
67
12
18
24
30
36
54
60
meses
Adaptado de Olsson SE, et al. Vaccine 2007; 25:4931–4939; Villa LL, et al. Vaccine 2006; 24:5571–5583.
Cervarix® Estudio fase IIb: niveles de
anticuerpos hasta 9,4 años
Seropositividad ≥98% en todo los puntos de tiempo
10,000
Nivel de anticuerpo
≥13 veces mayor que
el nivel de una
infección natural
VPH 16
EU/ml
1,000
100
10
1
0
7
12
18
25–32
33–38
39–44
45–50
51–56
57–62
63–68
69–
–74
75–
–76 77–
–82
83–
–88
Seropositividad ≥98% en todo los puntos de tiempo
VPH 18
EU/ml
10,000
Nivel de anticuerpo
≥11 veces mayor que
el nivel de una
infección natural
1,000
100
10
1
0
7
12
18
25–32
33–38
39–44
45–50
51–56
57–62
63–68
69-74
75-76
77–
–82
83–
–88
Meses
( Naud P et al, 27th International Papillomavirus Conference, 2011).
VACUNA CONTRA HPV:
Algunas respuestas pendientes
Población a vacunar
o
Edad óptima
Ideal: antes de la exposición al virus.
Edad de IRS: variaciones entre países y culturas
ANMAT aprobó: Cuadrivalente: Mujeres 9-26 años
Bivalente: Mujeres 10-45 años
Prioridad en salud pública: niñas 9-13 años
En Argentina: niñas de 11 años
(Wright y col, Vaccine, 2006; CDC´advisory committee recomends HPV vaccination)
VACUNA CONTRA HPV:
Algunas respuestas pendientes
Población a vacunar?
Otros grupos etarios
Vacunación de mujeres sexualmente activas
(“Catch-up vaccination”)
Beneficio demostrado para mujeres negativas para
HPV-DNA y serología para los HPVs vacunales.
No se decarta la vacunación en mujeres adultas mayores
(Wright y col., Vaccine, 2006; CDC´advisory committee recomends HPV vaccination)
VACUNA CONTRA HPV:
Algunas respuestas pendientes
Reemplazo de gentipos: Ocupación de los “nichos” de los
virus vacunales por otros hasta ahora menos diseminados ?
Virus estable, larga coevolución con su hospedador
La competencia por nichos es poco probable
↓
En un mismo individuo, las infecciones por distintos tipos
virales son independientes unas de otras
La vigilancia post-vacunal dará la última palabra
(Stanley y col, Vaccine, 2006)
VACUNA CONTRA HPV:
Algunas respuestas pendientes
Impacto en los programas de screening?
Una vez iniciada la vacunación, se requerirán décadas para
poder observar los efectos sobre la incidencia del cáncer
cervical
No todos los tipos virales carcinogénicos están incluidos en
las vacunas
⇓
SE DEBE CONTINUAR EL SCREENING, PERO REDISEÑADO
Nuevo rol laboratorial de la detección de DNA de HPV
(Franco y col, Vaccine, 2006)
PREVENCION SECUNDARIA:
tamizaje
Se propone reducir la incidencia y mortalidad
por CC a través de la detección temprana,
mediante la implementación de estrategias
para lograr la alta cobertura de la población
objetivo, la alta calidad del test de tamizaje, y
el adecuado seguimiento y tratamiento de las
lesiones precancerosas y cáncer.
Principales etapas en el desarrollo del cáncer de cérvix
Infección transitoria
Infección
Cérvix normal
Eliminación
Infección persistente
Progresión
Cérvix
infectado
Invasión
Lesión
Precancerosa
Regresión (HSIL ó CIN 2/3)
Cáncer
(Adaptado de Schiffman y col., 2007)
PREVALENCIA DE HPV E INCIDENCIA
DE CANCER CERVICAL POR EDAD
Prevalencia de HPV (%)
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64
Edad (años)
Prevalencia HPV alto riesgo:
- < 30 años: ~ 25-40 %
- > 30 años: 3-7 %
65
Incidencia Cáncer de cérvix
(Casos por 100.000)
25
Métodos virológicos de alta sensibilidad clínica [5.000
copias] (Captura Híbrida)
principal herramienta para el rediseño del tamizaje
о
Beneficio adicional: registro de prevalencia de
HPV y enfermedades asociadas. Tipificación viral
selectiva sobre muestras HPV +.
о
Ayudaría a determinar la duración de la
protección
о
Deben desarrollarse algoritmos adaptados a las
situaciones locales
RED DE LABORATORIOS DE HPV:
una perspectiva regional en
la vigilancia epidemiológica
Red Argentina de Laboratorios de HPV
Actualmente son parte de esta Red 11 provincias argentinas.
Red Global de
Laboratorios de HPV:
Misión
“Generar una Red Mundial de Laboratorios
que puedan realizar una efectiva vigilancia
y monitoreo del impacto de la vacunación
contra HPV, a través de la actualización,
capacitación y el establecimiento de un
programa de control de calidad”
(http://www.who.int/vaccines-documents/DocsPDF06/845.pdf)
Red Global de Laboratorios de HPV:
Estructura
Inicio: 2006
3 niveles de
responsabilidad
2 Labs
Labs..
Mundiales de
Referencia
Suecia y EEUU
8 Laboratorios Regionales
de Referencia
Argentina, Australia, India, Japón
Sudáfrica, Suiza, Tailandia y Túnez
Laboratorios Nacionales
de Referencia
Centro colaborador: Inst. Nac. de Estándares Biológicos y Control, UK
HPV LabNet Laboratories
GLOBAL WHO HPV REFERENCE LABORATORIES
Prof. Joakim Dillner
University of Lund
SE-20502 Malmö, SWEDEN
Dr. Elizabeth Unger
Centers for Disease Control
Atlanta, GA 30333, USA
REGIONAL WHO HPV REFERENCE LABORATORIES
Prof. Anna-Lise Williamson
Institute of Infectious Disease and Molecular Medicine
Faculty of Health Sciences
University of Cape Town
Cape Town, SOUTH AFRICA
Region: Africa
Dr. Maria Alejandra Picconi
Oncogenic Viruses Service
National Reference Laboratory for Papillomavirus
Natl. Institute of Infectious Diseases - ANLIS "Dr. Malbran"
Buenos Aires, ARGENTINA
Region: America (PAHO) (Since March 2009)
Dr. Emna Ennaifer-Jerbi
Tunis Pasteur's Institute
Belvédère, TUNISIA
Region: Eastern Mediterranean
Assistant Prof. Denise Nardelli-Haefliger
Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV)
Lausanne, SWITZERLAND
Region: Europe
Dr. Alok Chandra Bharti
Division of Molecular Oncology
Institute of Cytology and Preventive Oncology
Noida - 201 301, INDIA
Region: South-East Asia
Dr. Sukhon Sukvirach
National Cancer Institute
Rajthewe, Bangkok 1040, THAILAND
Region: South-East Asia
Prof. Suzanne Garland
Department of Microbiology and Infectious Diseases
The Royal Women's Hospital
Parkville, VIC 3052, AUSTRALIA
Region: Western Pacific
Dr. Iwao Kukimoto
Center for Pathogen Genomics
National Institute of Infectious Diseases (NIID)
Tokyo 208-0011, JAPAN
Region: Western Pacific
Red Global de
Laboratorios de HPV:
Actividades
1) Asesoramiento científico y técnico
2) Garantía de Calidad (QA/QC)
3) Entrenamiento
4) Comunicación (HPV LabNet Newsletter)
5) Vigilancia virológica
El trabajo se desarrolla en estrecha relación con las
autoridades sanitarias locales.
Vigilancia laboratorial de la infección por
HPV en la era vacunal
La genotipificación requiere métodos de
alta sensibilidad analítica
[1-10 copias] (basados en PCR)
Evaluación del impacto de la vacunación sobre la
prevalencia de los genotipos relacionados con la
vacuna (tipos incluidos en la fórmula y protección
cruzada contra virus relacionados)
Discriminación de los tipos presentes en
infecciones múltiples
Monitoreo de un potencial reemplazo de genotipos
(Stanley y col, Vaccine 2006; Pagliusi y col, Dis Markers, 2007; Meeting Report, OMS, 2007, Eklund et al 2010 )
HPV WHO position paper
La vacuna contra HPV sebe ser
introducida como parte de una estrategia
coordinada que incluya educación,
información, tamizaje, etc.
1º Taller de genotipificacion de HPV
en el marco de la HPV LabNet de OMS
Buenos Aires, 26-26 abril 2010
20 participantes de
14 países latinoamericanos
CONCLUSIONES
Todo cáncer de cérvix es precedido por una infección persistente con tipos de
HPV de alto riesgo oncogénico.
El comportamiento biológico de los HPVs de alto y bajo riesgo es DIFERENTE:
HPV de alto riesgo ⇒ > tendencia a PERSISTIR
El HPV utiliza la maquinaria biosintética de la célula: NO hay antivirales
específicos NO se trata la infección, sino la enfermedad asociada
HPV
amplia distribución: > 70% de mujeres tendrán contacto
durante su vida sexual
Infección TRANSITORIA: autolimitada,
SIN secuelas oncopatogénicas
Infección PERSISTENTE: condición previa para lesiones
preneoplásicas
Mujeres con HSIL están en riesgo de desarrollar cáncer cervical,
esta progresión no suele ser inmediata, sino que demora años
CONCLUSIONES
Vigilancia laboratorial de la infección por HPV en la
era vacunal
Métodos de alta sensibilidad analítica permitirán
evaluar con seguridad que las vacunas prevengan
infecciones por tipos virales específicos y sus
enfermedades asociadas
Tamizaje poblacional en la era vacunal
Métodos de alta sensibilidad clínica para detectar
enfermedad. Algoritmos adaptados a las situaciones
locales
La historia natural de la infección por HPV y de sus
enfermedades asociadas brinda elementos para optimizar
los programas de prevención de cáncer de cérvix
Prevención PRIMARIA: VACUNACIÓN
Edad blanco: niñas (antes de IRS)
Evita la infección
Prevención SECUNDARIA: TAMIZAJE
Edad blanco: mujeres > 30 años
Mayor valor predictivo positivo en la detección
de lesiones preneoplásicas CURABLES
Laboratorio de Virus Oncogénicos
Instituto Malbran, Buenos Aires (Argentina)
Visita del Prof. Harald zur Hausen, premio Nobel en Medicina 2008 Nov. 2009
GRACIAS POR SU ATENCION