Diagnóstico por la infección del Papilomavirus Humano mediante métodos de biología molecular
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Universidad de Valladolid Facultad de Medicina Área de Microbiología Tesis Doctoral Diagnóstico de la infección por Papilomavirus Humano mediante métodos de biología molecular Marta Domínguez-Gil González Valladolid 2008 Universidad de Valladolid Facultad de Medicina Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense Área de Microbiología Tesis Doctoral Diagnóstico de la infección por Papilomavirus Humano mediante métodos de biología molecular Marta Domínguez-Gil González Valladolid 2008 RAUL ORTIZ DE LEJARAZU LEONARDO, Profesor Titular de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valladolid, JOSE MARIA EIROS BOUZA, Profesor Titular de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valladolid y CRISTINA LABAYRU ECHEVARRIA, Facultativo Especialista de Área (F.E.A) de Microbiología y Parasitología del Hospital General Yagüe de Burgos CERTIFICAN que han dirigido y Co-dirigido el trabajo titulado “Diagnóstico de la infección por Papilomavirus Humano mediante métodos de biología molecular”, de la autora Dª Marta Domínguez-Gil González, y hallándose concluido lo consideran apto para su defensa como Tesis Doctoral. Y para que conste firman en Valladolid a R. Ortiz de Lejarazu Leonardo JM. Eiros Bouza del año 2008. C. Labayru Echevarria A mi hermana Laura “La ignorancia afirma o niega rotundamente; la ciencia duda” Voltaire Agradecimientos Deseo agradecer el apoyo de mis padres, Alfonso y Mari Carmen, a los que admiro profundamente, por compartir y dedicar sus vidas conmigo y por darme aliento en los momentos difíciles. Por orientar y conducir mi formación profesional y personal. Sin su paciencia y amor este trabajo no hubiera sido posible. Gracias a mis hermanos Alfonso, Beatriz y Laura, por el cariño, apoyo, y ánimos que me dieron cuando los necesitaba. Gracias a Mari Ángeles, Mari Nieves e Itziar por su ayuda incondicional en aquellos días en los que necesitaba “un ratito” para poder trabajar en la Tesis. Quiero agradecer los sabios consejos de Raúl Ortiz De Lejarazu, Director de esta Tesis, quien ha venido guiando estos últimos años mi formación, no solamente académica, sino como persona, sin lugar a duda me ha llevado a ver en la constancia y la dedicación una manera de conducir mi vida. Gracias por meterme en este fascinante “lío”, por soportar con paciencia mis dudas y problemas que a lo largo de esta Tesis surgieron. Sus palabras han sido para mi ejemplo de sabiduría y aliento ante la incertidumbre. Agradezco a José María Eiros, Co-director de esta Tesis, su amistad, propuestas, ideas y revisión más que cualificada. Gracias por transmitirme su entusiasmo y confianza durante esta etapa de mi vida y por ser para mí un referente de inquietud y dedicación profesional. La colaboración de “Epi” y Flor, me han facilitado muchas veces esta ardua tarea, les agradezco todo su trabajo y todos los momentos agradables que hemos compartido. Este trabajo no pudo haberse realizado sin la formación que recibí durante cuatro años en el Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario de Valladolid. Gracias a todos los que contribuyeron en mi formación, por sus consejos y sugerencias, su paciencia y en muchos casos amistad. Gracias a todos los compañeros y amigos de “Micro”, de todos ellos me he llevado los buenos recuerdos y de todos he aprendido. Gracias a la amistad brindada, las sugerencias y contribución a este trabajo de Beatriz Hernández, Maria Ortega, Cristina Labayru y Marisa Moreno. Gracias, a Fran Luquero, de Medicina Preventiva, por su ayuda “estadísticamente” significativa. tan Gracias a Elvira, Maria, Isabel y Esther del Centro de Gripe de la Facultad de Medicina, por su amistad y por que siempre pusieron todo de su parte para que el trajín diario fuese más llevadero. Gracias a mis amigos que sin saberlo, muchas veces me han hecho superar malos momentos, han estado desde años y años a mi lado y me han ayudado siempre incondicionalmente. Quiero agradecer muy especialmente a Aitor, que durante más de seis años tiene la paciencia de apoyarme profundamente, por darme su comprensión, su cariño y amor. Gracias por hacerme arrancar tantas veces que no tenia valor ni ganas y por hacer que me supere cada día un poco más. Por último quiero dar las gracias a Jorge, mi hijo, quien sin saberlo hace que el enfrentarse a cualquier dificultad tenga razón de ser. Por su ternura y preciosa sonrisa. Índice Marta Domínguez-Gil González Índice Índice INTRODUCCIÓN................................................................................................... 13 Introducción ............................................................................................................ 14 Situación actual ....................................................................................................... 15 Virus del Papiloma Humano (VPH)...................................................................... 17 Características del VPH. Estructura básica del genoma ........................................ 17 Clasificación de los VPH....................................................................................... 19 Mecanismo de carcinogénesis................................................................................ 22 Epidemiología de la infección por VPH ................................................................ 25 VPH y Cáncer.......................................................................................................... 27 Cáncer de cuello uterino ........................................................................................ 27 Historia natural de la infección cervical por VPH................................................. 29 VPH y otros cánceres............................................................................................. 29 Diagnóstico............................................................................................................... 31 Cribado-Citología................................................................................................... 31 Colposcopia............................................................................................................ 33 Test de detección de VPH y programas de cribado ............................................... 33 Diagnóstico microbiológico del VPH por métodos moleculares........................... 34 Hibridación en solución: Captura de híbridos................................................. 35 Sistemas basados en Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)................ 37 Métodos de detección de productos amplificados........................................... 39 Métodos de detección de anticuerpos frente al VPH....................................... 41 Tratamiento ............................................................................................................. 41 Tratamiento de los condilomas............................................................................... 41 Tratamiento de la infección subclínica................................................................... 44 9 Marta Domínguez-Gil González Índice Seguimiento.............................................................................................................. 45 Vacunas frente al VPH ........................................................................................... 46 Vacunas profilácticas frente al VPH: Situación actual.......................................... 47 Vacuna frente al VPH y cribado de cáncer de cuello uterino ................................ 49 Vacunas terapéuticas frente al VPH....................................................................... 50 OBJETIVOS............................................................................................................ 52 MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................... 54 Muestras procesadas y características .................................................................. 55 Técnicas utilizadas .................................................................................................. 58 Hibridación con sondas diferenciadas y con sonda única mediante Hybrid Capture 2® (HC 2)………………………………………………………. 59 Amplificación del ADN de VPH y tipificación con enzimas de restricción (PVHfast®)............................................................................................ 63 Hibridación reversa en tira (INNO-LiPA VPH Genotyping CE®).......................... 70 ® Microarrays de VPH (Clinical Arrays Papillomavirus Humano)....................... 75 Procedimientos ........................................................................................................ 80 Cribado de VPH por Hibridación con sondas diferenciadas.................................. 80 Cribado de VPH por Hibridación con sonda única................................................ 81 Confirmación e identificación de VPH positivos en la prueba de cribado............ 82 Confirmación de VPH mediante ERpcr................................................................. 82 Confirmación de VPH mediante LiPA .................................................................. 82 Confirmación de VPH mediante Microarrays....................................................... 83 Genotipado por ERpcr ........................................................................................... 83 Genotipado por LiPA............................................................................................. 83 Genotipado por Microarrays.................................................................................. 84 Genotipado global de VPH .................................................................................... 84 10 Marta Domínguez-Gil González Índice Estudio de la concordancia para la detección de los distintos genotipos mediante las distintas técnicas empleadas ............................................................. 84 Cálculo de resultados y análisis estadística............................................................ 85 RESULTADOS........................................................................................................ 86 Demanda analítica de detección de VPH .............................................................. 87 Evolución de la demanda y tipos de muestras ....................................................... 87 Variables de persona y procedencia clínica........................................................... 91 Cribado por Hibridación con Sondas diferenciadas............................................ 97 Otros abordajes del cribado................................................................................... 111 Cribado de VPH por Hibridación con Sonda única............................................... 111 Confirmación e identificación de VPH positivos por la prueba de cribado ...... 115 Confirmación de VPH con Amplificación mediante ERpcr.................................. 115 Confirmación de VPH mediante Hibridación reversa en tira (LiPA).................... 119 Confirmación de VPH mediante Microarrays....................................................... 122 Genotipado de VPH por ERpcr............................................................................. 126 Genotipado de VPH por LIPA ............................................................................... 133 Genotipado de VPH por Microarrays.................................................................... 136 Resultados globales de genotipado de VPH........................................................... 141 Concordancia para la detección de los distintos genotipos de VPH mediante ERpcr, LiPA y Microarrays .......................................................... 146 Comparativo entre técnicas de confirmación y cribado...................................... 153 DISCUSIÓN ............................................................................................................ 155 Evolución de la demanda analítica de detección de VPH y tipo de muestras/Variables de persona y de procedencia clínica ............................... 157 Cribado de VPH ...................................................................................................... 158 Cribado de VPH con técnicas basadas en PCR 164 11 Marta Domínguez-Gil González Índice Confirmación e identificación de VPH positivos por la prueba de cribado ...... 167 Genotipado de VPH ................................................................................................ 169 Coinfecciones de VPH............................................................................................. 174 Concordancia entre las pruebas de diagnóstico utilizadas.................................. 176 CONCLUSIONES................................................................................................... 179 ANEXOS .................................................................................................................. 183 BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................... 186 12 Introducción Marta Domínguez-Gil González Introducción Introducción La naturaleza infecciosa de las verrugas y los papilomas se conoció a principios del siglo pasado1,2. Ciuffo (1907) estableció la naturaleza viral de estas verrugas al demostrar su transmisión a través de filtrados acelulares1. En los años 70 y 80 se empezaron a desarrollar análisis moleculares y se conoció la pluralidad del virus del papiloma, la organización de su genoma y su actividad génica. Pronto surgió la hipótesis que postulaba que algunos de los miembros que pertenecían a la familia del Virus del Papiloma Humano (VPH) o Papilomavirus Humano tenían implicación en el Cáncer de Cuello Uterino (CCU) humano3,4,5 .Tras conocerse nuevos tipos de VPH en el CCU y otros cánceres ano-genitales6,7 y sus precursores8,9, la actividad investigadora en este campo recibió un fuerte impulso. A finales de los años 80, se postuló que la expresión génica viral de células del CCU en estado de infección latente era una condición necesaria para el desarrollo de propiedades de crecimiento y del fenotipo maligno de estas células10. Al inicio de los años 90, se pudo corroborar esta hipótesis mediante estudios epidemiológicos, demostrando que el principal factor de riesgo para el desarrollo de CCU eran las infecciones por VPH de alto riesgo11, 12. Actualmente, está claramente establecido que las infecciones por los VPH de alto riesgo, especialmente el VPH 16 y el VPH 18, son la causa necesaria para el desarrollo del cáncer de cuello uterino10, 13. En estudios recientes se ha evidenciado la presencia de secuencias genómicas de VPH en prácticamente el 100% de los carcinomas invasores del cérvix uterino14, en un porcentaje casi igual de lesiones premalignas de esta localización (neoplasias intraepiteliales cervicales, escamosas y glandulares) y en un elevado porcentaje de otras neoplasias y lesiones premalignas del área ano-genital15 (vulva, vagina y ano). También más recientemente se ha puesto de manifiesto su implicación en algunos cánceres no 14 Marta Domínguez-Gil González Introducción anogenitales (cánceres de la cavidad oral, faringe y laringe16, cáncer de piel 17 y cáncer de conjuntiva18. La etiopatogenia de la enfermedad ha podido ser investigada en forma detallada gracias a avances en biología celular, molecular e inmunología, que han permitido conocer el papel del VPH en el desarrollo de lesiones premalignas y malignas del cuello uterino y han tenido importantes implicaciones en la metodología de cribado, diagnóstico y tratamiento de esta enfermedad19. Las evidencias científicas sobre la asociación entre el VPH, el cáncer de cérvix y sus lesiones precursoras son fuertes, consistentes y específicas para algunos tipos de virus (VPH 16 y VPH 18). Los estudios moleculares y epidemiológicos que incluyen, entre otros, métodos de hibridación del ADN viral, han hecho cada vez más veraz la relación de causalidad20. Situación actual Los programas de cribado mediante tinción de Papanicolaou han demostrado ampliamente su utilidad en la reducción de la incidencia y la mortalidad del carcinoma invasor del cérvix uterino, dada su capacidad de detectar, no solo carcinomas escamosos y adenocarcinomas invasores, sino también sus lesiones precursoras (CIN, del inglés Cervical Intraepithelial Neoplasia o SIL, del inglés Squamous Intraepithelial Lesion y adenocarcinomas in situ). La prueba de Papanicolaou21, 22 se considera específica para la detección de las lesiones de alto grado y cáncer. Sin embargo, a pesar de su amplia aceptación como método de cribado (screening) de población para la detección precoz de lesiones cervicales, el empleo del Papanicolaou tiene una sensibilidad relativamente baja, y no parece ser capaz de detectar algunas lesiones; en un número variable de mujeres en programa de cribado se detecta un carcinoma cervical infiltrante de novo tras una o varias citologías negativas, lo que implica que la prueba detecta un porcentaje bajo de mujeres con displasia22. Un meta-análisis reciente demostró que este método de cribado de cáncer tenía una sensibilidad global de 51% y una especificidad de 98%22,23. Aunque la prueba de Papanicolaou ha tenido una contribución trascendente en la reducción de casos de cáncer, su sensibilidad clínica se aproxima al 60% en los mejores 15 Marta Domínguez-Gil González Introducción casos. Por ello, no puede considerarse el método más adecuado para el cribado primario del cáncer de cuello uterino23. Por otro lado, la citología detecta un gran número de mujeres con alteraciones no progresivas. Así numerosos estudios han evidenciado que la mayoría de mujeres con SIL de bajo grado, e incluso un porcentaje importante de lesiones de alto grado, no progresan a carcinomas invasores o incluso regresan espontáneamente. Otro problema de la citología es su importante variabilidad ínterobservador21, 22. Esto conlleva importantes implicaciones clínicas y ha potenciado el interés por la incorporación de pruebas más precisas para la detección precoz de los factores de riesgo principales asociados al cáncer de cérvix24, 25, 26, con dos objetivos básicos: en primer lugar aumentar la sensibilidad y la especificidad en el diagnóstico de las lesiones premalignas y malignas del cérvix uterino y, en segundo lugar determinar la capacidad evolutiva de las lesiones intraepiteliales, discriminando las lesiones con capacidad de progresar de las lesiones no evolutivas. En los programas de prevención de cáncer cervicouterino de todo el mundo hay cada vez más interés en la prueba de VPH, ya sea como complemento de los procedimientos de cribado citológico o como prueba de cribado primario27. Las pruebas de detección de ADN de VPH muestran una especificidad entre el 97-98% y hasta un 99% para algunos estadios, éstas revelan la presencia de ADN del virus. Los falsos negativos de la citología convencional, se ven reducidos hasta un 1-3%. Además, el valor predictivo negativo es extremadamente importante de manera que podemos decir que una mujer con un Papanicolaou negativo y un test de ADN de VPH negativo, la probabilidad de tener cáncer cervical o una lesión precursora es prácticamente nula28, 29. Esto constituye una enorme ventaja para la mujer, que puede estar segura de que no padece la enfermedad, para el médico porque sus métodos son efectivos y para el citopatólogo que sabe que ese porcentaje de falsos negativos se minimiza. En la actualidad, las pruebas para identificar el VPH han mejorado notablemente y ofrecen buena sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y fácil aplicabilidad. En algunos estudios de cribado cervical llevados a cabo en varios países, la prueba de detección del VPH fue entre un 25 y un 40% más sensible que un único test convencional de Papanicolaou para la detección de CIN3+ 23, y entre un 10 y un 25% más sensible que un test de citología de base líquida. En el estudio denominado “Test de VPH como complemento al cribado rutinario”30 se ratifican los datos de otros estudios previos presentados originalmente a la Agencia Reguladora del Medicamento (Food and Drug 16 Marta Domínguez-Gil González Introducción Administration-FDA), para la aprobación de la combinación de pruebas de detección de VPH y cribado con Papanicolaou en el diagnóstico de cáncer cervical femenino. En todos estos estudios el Valor Predictivo Negativo (VPN) de la combinación de estas pruebas fue entre 99 y 100%, indicando que las mujeres con resultados negativos en las dos pruebas tienen un riesgo muy bajo de desarrollar CIN2, CIN3 o cáncer. Este VPN tan alto combinando ambos test no sólo es válido para la enfermedad actual, sino que también predice un bajo riesgo para años futuros, sustentando el fundamento racional para espaciar algunos años el cribado28, opción facilitada por la Sociedad Americana del Cáncer (American Cancer Society-ACS) y el Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología (American College of Obstetricians and Gynecologist-ACOG) de cribado cada dos o tres años para mujeres que hayan tenido tres Papanicolaou consecutivos negativos o normales, que resultaría en un ahorro sanitario muy importante sin merma de la seguridad para las mujeres. La ventaja de esta propuesta frente a la clásica reside en la seguridad proporcionada por su mayor sensibilidad como prueba única o combinada31. Virus del Papiloma Humano (VPH) Características del VPH. Estructura básica del genoma Los papilomavirus humanos, pertenecen a la familia Papovaviridae, una familia recientemente reconocida como distinta de los poliomavirus por el Comité Internacional para la Taxonomía de los Virus (International Committe on Taxonomy of Viruses-ICTV) 32 . Estos virus están ampliamente distribuidos en la naturaleza e infectan específicamente el epitelio escamoso de más de 20 especies diferentes de mamíferos, así como aves y reptiles33, 34. Constituyen un grupo de virus ADN de pequeño tamaño (45-55 nm de diámetro), desnudos, organizados en una cápside de simetría icosaédrica compuesta por 72 capsómeros (60 hexámeros y 12 pentámeros) que rodean un ADN bicatenario35, 36 (Figura 1). 17 Marta Domínguez-Gil González Introducción Figura 1. Estructura del Virus del Papiloma Humano (VPH) Adaptada de Digene Corporation. El genoma está compuesto por una doble cadena circular de ADN, cuyo tamaño oscila entre 6.800 y 8400 pares de bases (pb). En dicho genoma se distinguen tres regiones: la región reguladora, de unos 1000 pb (Upstream Regulatory Region-URR), no codificante cuya función es la regulación de la replicación y la transcripción vírica, la región temprana con los genes E1 a E7 (del inglés Early) que se transcribe al inicio del ciclo vital del virus y que codifica proteínas necesarias para la replicación y, por último, la región tardía con los genes L1 y L2 (del inglés Late) que codifica proteínas estructurales de la cápside y que se expresa al final del ciclo vital (Figura 2). Los papilomavirus están perfectamente adaptados a su tejido huésped natural, la célula epitelial en vías de diferenciación de la piel o las mucosas, y activan la maquinaria celular en beneficio propio37. 18 Marta Domínguez-Gil González Introducción VPH Figura 2. Representación esquemática del genoma del VPH, mostrando la disposición de los genes E tempranos o no estructurales, los genes de la cápside (L1 y L2) y la región reguladora no codificante (URR) 38 Clasificación de los VPH Se han detectado más de 120 tipos de VPH, secuenciado completamente más de 80 tipos virales e identificado un número mayor de posibles nuevos tipos mediante la amplificación de sus regiones subgenómicas39. Todos los VPH son epiteliotropos y, según el epitelio que infectan, clásicamente se han dividido en cutáneotropos y mucosotropos. Los tipos mucosos infectan preferentemente la mucosa genital, aunque también han sido detectados en la mucosa oral y digestiva. Los tipos cutáneos afectan normalmente a la capa córnea. A pesar de ello, las fronteras entre las diferentes categorías no son rígidas y existen numerosas referencias de tipos mucosos que producen infección en la piel y viceversa40. La clasificación moderna se basa en las diferencias de las secuencias nucleotídicas dentro de las regiones codificadoras de las proteínas E6, E7 y L132. Los VPH se clasifican en tres niveles taxonómicos: género, especie y tipo. Los géneros diferentes comparten menos del 60% de identidad en la secuencia de L1; las especies de un mismo género comparten una identidad de secuencia del 60 al 70% y los tipos virales dentro de una especie comparten del 71 al 89% de identidad de secuencia41. 19 Marta Domínguez-Gil González Introducción Los VPH conocidos que infectan a humanos y animales forman 16 géneros que se identifican por letras griegas (Alfa a Xi). Cinco de estos géneros se componen exclusivamente de VPH y otros papilomavirus (VP) identificados en algunos primates, el resto de géneros contienen tipos encontrados en mamíferos y aves41. El género clínicamente más importante es el conocido como alfa-papilomavirus, el cual contiene todos los VPH asociados con lesiones mucosas y genitales que emergen de grupos originalmente llamados VPH “genitales” o “mucosos”41. Los beta-papilomavirus incluyen todos los tipos de VPH asociados con Epidermodisplasia Verruciforme Cutánea (EV), una enfermedad neoplásica cutánea con componente genético42. En aquellos portadores que no están genéticamente predispuestos a la enfermedad, los VP-beta y los VP-gamma establecen infecciones asintomáticas, en el peor de los casos producen pequeñas lesiones cutáneas benignas. Algunos de los virus de estos dos géneros también se han hallado asociados a cáncer de piel en individuos inmunodeprimidos43. Numerosos estudios epidemiológicos permiten concluir que algunos tipos de VPH anogenitales son la causa necesaria para el desarrollo de cáncer cervical44. Los VPH anogenitales se han dividido en tres grupos: el primero está asociado con alto riesgo de desarrollar cáncer cervical, son los VPH de Alto Riesgo (VPH AR) (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82); el segundo grupo está asociado con un bajo potencial carcinogénico, son los VPH de Bajo Riesgo (VPH BR) (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108). Tres tipos son considerados de probable alto riesgo (26, 53 y 66). Estos grupos epidemiológicos, también difieren entre sí en la composición molecular de algunas oncoproteínas víricas. La Tabla 1 resume la clasificación filogenética y epidemiológica de los tipos de VPH anogenitales. Dentro del género alfa-papilomavirus, hay cinco especies compuestas completamente por VPHs de bajo riesgo. Son la especie 1 (VPH 32 y 42), especie 3 (VPH 61, 62, 72, 81, 83, 84, 86, 87 y 89), especie 4 (VPH 2a, 27 y 57), especie 8 (VPH 7, 40, 43 y 91) y especie 10 (VPH 6, 11, 13, 44, 55 y 74). Sin embargo, un VPH que es sin duda de bajo riesgo por sus asociaciones patológicas, el VPH 70, se encuentra dentro de una especie donde predominan os VPH de alto riesgo, la especie 7. Por lo tanto, las características filogenéticas no pueden predecir si son virus de alto o bajo riesgo, el criterio para tal clasificación es la asociación del virus con el desarrollo de la enfermedad. 20 TABLA 1. Clasificación filogenética y epidemiológica de los tipos de VPH anogenitales. Adaptado de (39) Marta Domínguez-Gil González Introducción Mecanismo de carcinogénesis Los papilomavirus son virus con replicación intracelular, con tropismo por el epitelio escamoso estratificado, ya que la expresión de productos necesarios para su replicación está limitada a células epiteliales terminalmente diferenciadas. El ciclo comienza cuando las partículas infecciosas alcanzan, a través de pequeñas roturas o microlesiones, la capa basal del epitelio donde se unen a las células y penetran en su interior. Se ha sugerido que, para mantener la infección, el virus debe infectar una célula madre epitelial45. El ciclo de replicación en el interior del epitelio puede dividirse en dos partes; en primer lugar, el genoma viral se replica hasta un número de aproximadamente 100 copias y durante periodos variables de tiempo mantiene este bajo número de copias en estas células inicialmente infectadas pero que todavía son competentes y capaces de replicarse. Las proteínas virales E1 y E2 son esenciales para esta fase de replicación basal de ADN. Se puede especular que durante la persistencia viral, el sistema inmunológico mantiene la infección en este estado45. En segundo lugar, una vez las células basales han sido impelidas al compartimento suprabasal, pierden la capacidad de dividirse y, en su lugar, ponen en marcha el programa de diferenciación terminal. Los papilomavirus se replican en este compartimento y, para su liberación al entorno, aprovechan la desintegración de las células epiteliales que se produce como consecuencia de su recambio natural en las capas superficiales. En el proceso de replicación viral resultan críticas las proteínas virales E6 y E7, las cuales interaccionan con varias proteínas celulares. En sistemas experimentales estas interacciones han mostrado inducir la proliferación y, eventualmente, la inmortalización y transformación maligna en las células46. Existen diferencias entre las proteínas E6/E7 de los tipos de VPH de alto y bajo riesgo, pero suele tratarse de diferencias de naturaleza cuantitativa más que cualitativa47. Hasta la fecha, las interacciones mejor caracterizadas se producen con las proteínas pRB y p53, las cuales constituyen moléculas fundamentales en el control del ciclo celular y que, remarcablemente, están mutadas en muchos cánceres humanos. La unión de E7 a pRB activa el factor de trascripción E2F, que desencadena la expresión de las proteínas necesarias para la replicación del ADN46. En condiciones normales la fase S no programada conduciría a la apoptosis mediada por p53; sin embargo, en las células infectadas por el VPH, este proceso se 22 Marta Domínguez-Gil González Introducción bloquea por la proteína viral E6, que provoca la degradación proteolítica de la p5348. Como consecuencia, se anula la dependencia del control del ciclo celular y se retrasa la diferenciación normal de los queratinocitos45. La excepcional capacidad del VPH 16 para persistir e inducir la progresión hacia un estado maligno puede explicarse por la particularidad en esta fase de su ciclo vital. Como aberración de la infección vírica, la actividad constante de las proteínas virales E6 y E7 lleva a una creciente inestabilidad genómica, acumulación de mutaciones oncogénicas, pérdida adicional de control de crecimiento celular, y finalmente, al desarrollo del cáncer49. Durante la progresión tumoral, los genomas virales se integran a menudo en el cromosoma huésped, lo cual produce un nivel constante de proteínas E6/E7 a través de la estabilización de ARNm, mediante la influencia de estructuras modificadas de cromatina o la pérdida de regulación negativa de la transcripción mediada por la proteína viral E2. En la Figura 3 se observa como las células hijas de las células madre epiteliales se dividen a lo largo de la membrana basal y luego maduran verticalmente a través del epitelio sin volver a dividirse (parte derecha). Después de la introducción del VPH en las células madre en la capa basal del epitelio, se produce la expresión de las proteínas virales no estructurales. Bajo la regulación de estas proteínas, la población de células en división se expande verticalmente, se retrasa la diferenciación de las células epiteliales y es menos completa. Las proteínas virales se expresan secuencialmente con la diferenciación, tal como se muestra en la figura y se producen viriones maduros sólo en las capas más superficiales del epitelio. El número de Células Presentadoras de Antígenos (APCs) intraepiteliales se reduce drásticamente en el epitelio infectado por el VPH. 23 Figura 3. Localización en el epitelio escamoso de las principales etapas del ciclo vital del Papilomavirus. Arquitectura de las células epiteliales escamosas cervicales estratificadas y expresión de las proteínas del VPH después de la infección. Reproducido de (50). Marta Domínguez-Gil González Introducción Epidemiología de la infección por VPH El VPH es tan frecuente en la población que, con raras excepciones, sólo las personas que no han tenido relaciones sexuales no han estado expuestas a él. En casi todos los casos la infección es subclínica y de corta duración. Se trata de una infección muy frecuente, pero la mayoría de los individuos eliminan cualquier evidencia de positividad de infección sin desarrollar ninguna manifestación clínica de la enfermedad. Son sólo unos pocos casos de las mujeres infectadas las que van a evolucionar a cáncer de cérvix invasivo (cáncer cervical). Un factor claramente establecido y diferenciado que explica esta diferencia de evolución es el tipo de virus que causa la infección. Hay unos 40 tipos de virus que infectan el tracto genital, 15 tipos son de alto riesgo de desarrollo a cáncer de cérvix, 12 tipos son de bajo riesgo y 3 de riesgo indeterminado39. Prevalencia En el mundo se estima una prevalencia de infección por VPH en mujeres que varía de 2% al 44%51. Las tasas de prevalencia ajustadas por edad son más altas en los países con mayor incidencia de cáncer cervical, como los países africanos por debajo del Sahara, los latinoamericanos e India; las tasas más bajas se han reportado en Vietnam y en España52. En edades de mayor actividad sexual, la prevalencia de infecciones subclínicas por VPH puede afectar hasta un 40% de la población femenina con tasas de infección de un 10-15% anual. El VPH 16 es el más común de todos los tipos de infección y también es el más frecuente entre los casos de cáncer39. La prevalencia es mayor en mujeres jóvenes y tiende a disminuir con la edad; en América Latina se ha observado un segundo pico de infección en mujeres alrededor de la menopausia52, que puede deberse a la reactivación de infecciones latentes o infecciones nuevas en el periodo premenopáusico. La mayor parte de las infecciones ocurren al inicio de la actividad sexual y suelen ser transitorias, resolviéndose, en la mayor parte de los casos de manera espontánea. Solamente, en un 10-20% de las mujeres la infección se cronifica, siendo éstas las que tendrán un alto riesgo de evolucionar hacia cáncer cervical. La infección por VPH en el hombre también es frecuente. La prevalencia varía entre un 4% y 45%, siendo la mayoría de las infecciones ocasionadas por genotipos de alto riesgo y entre ellas el tipo 16 es el más frecuente. La prevalencia aumenta con el número de parejas sexuales. Los hombres que tienen relaciones sexuales con prostitutas y los homosexuales tienen prevalencias más altas53. 25 Marta Domínguez-Gil González Introducción Incidencia La infección se transmite manteniendo relaciones sexuales con una persona infectada por vía vaginal, anal u oral. La primo-infección por VPH es frecuente en jóvenes que se incorporan a una vida sexual activa. La infección es más frecuente por los tipos oncogénicos de alto riesgo, como el 16. Estudios de cohortes, en los cuales mujeres vírgenes son seguidas después de iniciar relaciones sexuales, han demostrado tasas acumuladas de incidencia de más del 40%.54 Las tasas de incidencia tienden a disminuir con la edad, aunque en un estudio realizado en mujeres colombianas se ha observado un segundo pico de infecciones incidentes con los tipos de alto riesgo alrededor de la menopausia55. Hasta un 70% de las mujeres sexualmente activas sufren una infección por VPH a lo largo de su vida55. En algunos países las prostitutas constituyen la fuente de infección más importante de VPH, por ello los hombres que mantienen relaciones sexuales con prostitutas son consideradas personas de alto riesgo en la transmisión de la infección y de desarrollo de cáncer cervical por sus compañeras sexuales, ya que actúan como portadores de infección y de mantenimiento de la misma56. Factores de riesgo de la infección El factor de riesgo más consistente de la infección por VPH es el número de parejas sexuales; cuánto mayor es el número de compañeros sexuales mayor es la probabilidad de infectarse con VPH. El tabaquismo también se ha relacionado con un aumento del riesgo de que las lesiones provocadas por este virus evolucionen hacia cáncer. Evolución de la infección por VPH Solo un 10-20% de las mujeres infectadas por VPH oncogénicos evolucionan a cáncer. Debido a que la infección por VPH es una causa necesaria pero no suficiente57, se considera que otros factores que en asociación con el VPH modularían el riesgo de transición desde la infección por VPH al desarrollo del cáncer de cérvix. Existen factores de riesgo cuya influencia en la carcinogénesis ha sido valorada tales como56: la alta paridad, anticonceptivos orales, tabaco, otras infecciones de transmisión sexual (Chlamydia trachomatis y el virus del herpes simple tipo 2), la dieta y edad de la primoinfección (las mujeres más jóvenes tendrán peor pronóstico y evolución). 26 Marta Domínguez-Gil González Introducción VPH y Cáncer Cáncer de cuello uterino Los estudios epidemiológicos o clínicos que han incorporado técnicas de biología molecular detectan determinados tipos oncogénicos o de alto riesgo de VPH en prácticamente el 100% de los cánceres cervicales, cuando la muestra es adecuada y la tecnología de detección viral es de alta sensibilidad. Igualmente, el ADN viral se detecta en la mayoría (70-90%) de las lesiones precursoras o lesiones intraepiteliales de alto grado y, en una menor proporción (20-50%), en las lesiones de bajo grado11, 57,58. Las lesiones de alto grado incluyen a las llamadas Neoplasias Cervicales Intraepiteliales o CIN2 (displasia moderada) y CIN3 (displasia grave y carcinoma in situ). Las lesiones de bajo grado incluyen los cambios citológicos o histológicos característicos de la infección por VPH y CIN1 o displasia leve. Estas últimas lesiones contienen en su mayor parte virus de bajo riesgo, razón por la que raramente van a progresar. Finalmente en las clasificaciones citológicas acordadas en las reuniones de Bethesda (Anexo I) se definió un categoría de lesiones citológicas de naturaleza incierta (ASCUS y AGUS; -US, Undetermined Significance-; ASC: Células Escamosas Atípicas; AG: Células Glandulares Atípicas) en las que la detección de VPH es cercana al 50%. La variabilidad en las cifras encontradas en la bibliografía es, en gran parte, atribuible a la dificultad de reproducir el diagnóstico citológico en programas poblacionales que incluyen múltiples lectores y grandes volúmenes de citologías30, 59, 60, 61,62. Los mejores estudios de casos y controles de carcinoma invasor indican riesgos relativos (RR: factor multiplicador de la probabilidad de enfermar sobre una probabilidad de referencia) superiores a 50 para la detección de ADN de VPH y riesgos entre 100 y 150 para los tipos 16 y 18. En algunos estudios estas cifras alcanzan valores entre los 500 y los 1.000. La proporción de casos en una población en los que el VPH esta considerado como agente causal calculada a partir de estos estudios oscila alrededor del 90-95%. Las asociaciones observadas entre la infección por VPH y el cáncer de cérvix son las más fuertes de las identificadas en cancerología humana, existiendo un consentimiento creciente en calificarlas como causa necesaria (ausencia de enfermedad en ausencia de infección) e insuficiente (presencia de infección sin presencia de enfermedad) 44,63. Los estudios prospectivos demuestran que la infección vertical persistente por virus de alto riesgo precede a la aparición de las CIN y es necesaria para el desarrollo, mantenimiento y progresión de estas lesiones. Al iniciar su actividad sexual, la mujer 27 Marta Domínguez-Gil González Introducción puede ser contagiada por un virus de alto riesgo que, en la gran mayoría de los casos, dará lugar a una infección transitoria, haciéndose indetectable en 6-8 meses. Ocasionalmente, la infección desarrollará una lesión CIN visible al microscopio óptico. Estas lesiones regresan espontáneamente en la mayor parte de los casos. Cuando el virus no es eliminado y persiste la infección por VPH de alto riesgo, la lesión precursora se mantiene y cierto número de ellas progresarán hasta CIN3, la lesión más grave con mayores posibilidades de progresar a cáncer invasor. Algunos autores han propuesto un paradigma alternativo al modelo convencional de progresión neoplásica. Según esta nueva propuesta, las lesiones CIN1 y, en gran parte, CIN2, serían manifestaciones morfológicas autolimitadas atribuibles mayoritariamente a infecciones por VPH de bajo riesgo o de alto riesgo transitorias. Las lesiones CIN3 y el carcinoma invasivo tendrían una historia natural distinta atribuida a espectros mal definidos de la interacción huésped/VPH. En ciertas circunstancias podría inducirse este tipo de lesiones directamente, si progresar a través de estadios intermedios. La historia natural de las lesiones precursoras podría ser redefinida a la luz de estas propuestas64. Al contrario que los virus de bajo riesgo, que permanecen en el núcleo de la célula infectada en situación episómica, no integrados en el genoma, los VPH de alto riesgo ejercen su actividad oncogénica en gran parte tras integrarse en el genoma celular. Como hemos mencionado anteriormente, el mecanismo mejor conocido de inducción neoplásica por VPH se produciría a partir de la interacción de las proteínas virales E6 y E7 con p53 y pRB, respectivamente, degradándolas o alterándolas funcionalmente. Esta interacción en células proliferativas, como son las del cuello uterino y especialmente de la zona de unión escamocilíndrica, con un epitelio inestable, impide la correcta reparación del ADN, con mutaciones específicas, esenciales para la progresión a cáncer invasor. Ocasionalmente, hay lesiones malignas en las que el virus no está integrado en el genoma celular, sugiriendo la presencia de mecanismos oncogénicos múltiples. La infección persistente por VPH oncogénicos es, por tanto, el primer requisito para la carcinogénesis cervical, aunque son necesarios otros cofactores (ambientales o congénitos) para la persistencia y la progresión. De entre los conocidos cabe citar las deficiencias inmunes adquiridas (infección VIH, tratamientos inmunosupresores en receptores de trasplante) o congénitas (respuestas inmunológicas anormales, HLA, polimorfismos en p53 y otros mal conocidos), factores hormonales endógenos (hormonas esteroideas) o exógenos (anticoncepción oral), otras infecciones de transmisión sexual, el consumo de tabaco y quizás algunos componentes de la dieta39,56. 28 Marta Domínguez-Gil González Introducción Historia natural de la infección cervical por VPH La historia natural de la infección cervical por VPH y los cofactores implicados se resume en la Figura 4. En general, se considera que un 80-90% de las infecciones se resuelven espontáneamente y entre un 10-20% persisten. Cofac tores de regresión: Virales, Genéticos y Me dioambientales Resolución Cofactores de adquisición Infección VPH Transitoria Epitelio Normal Cofactores de Progresión: Virales Tipos de BAJO RIESGO Cualquier Tipo Condiloma LSIL Tipos de ALTO RIESGO de Infección VPH Persistente HSIL Cofactores de Progresión: Genéticos y Medioambientales Cofactores de invasión Cáncer Figura 4. Historia natural de la infección cervical por el VPH; CIN: Neoplasia Intraepitelial; HSIL: Lesiones intraepiteliales de alto grado; LSIL: lesiones intraepiteliales de bajo grado. Modificado de (65). VPH y otros cánceres Los estudios epidemiológicos disponibles indican que en los cánceres de vagina y ano se detecta ADN del VPH en la gran mayoría de los tumores y en sus lesiones precursoras. El 64-91% de los cánceres vaginales y el 82-100% de las neoplasias intraepiteliales vaginales (VaIN) de grado 3 son positivas para ADN del VPH. En los cánceres anales, se detecta ADN del VPH en el 88-94%66. Los cánceres de vulva y pene se han asociado al VPH. Los tumores diagnosticados en individuos jóvenes suelen caracterizarse por tipos histológicos llamados basaloides o verruciformes; la mayoría de ellos (60-90%) son positivos para el VPH y sus lesiones preneoplásicas también se asocian estrechamente al VPH. En los sujetos de mayor edad, 29 Marta Domínguez-Gil González Introducción los tumores suelen ser Carcinomas espinocelulares (CEC) queratinizantes y en raras ocasiones (menos del 10%) se asocian al VPH67. En todos los cánceres anogenitales con presencia de VPH, el genotipo del VPH detectado más comúnmente es el VPH 16, seguido de los VPHs 18, 31 y 33. En la monografía de la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer (International Agency for Research on Cancer- IARC) se concluye que hay evidencias suficientes sobre la carcinogenicidad del VPH 16 en vulva, pene (tumores basaloides y verruciformes), vagina y ano; evidencia limitada sobre la carcinogenicidad del VPH 18 en vulva, pene (tumores basaloides y verruciformes), vagina y ano; y evidencia limitada sobre la carcinogenicidad de los VPH 6 y 11 en vulva, pene y ano (carcinomas verrugosos)68. La presencia de ADN de los tipos fuertemente asociados a cáncer de cuello uterino es muy importante (>85%) en los tumores del canal anal. Esta localización anatómica incluye una región de transición epitelial semejante a la observada en el cuello uterino. Algunas comparaciones basadas en registros de tumores han estimado que la incidencia de cáncer de canal anal en varones homosexuales es semejante a la incidencia estimada de cáncer de cérvix en poblaciones no protegidas por programas de cribado66. Los cánceres de vulva parecen responder a dos modelos etiológicos. El cáncer de vulva de la mujer menor de 50 años estaría etiológicamente ligado al VPH, presentaría morfología basaloide o verrucosa, cursaría con lesiones coexistentes de neoplasia vulvar intraepitelial (VIN) de alto grado y presentaría los factores de riesgo epidemiológicos característicos del cáncer cervical (promiscuidad sexual, edad joven de inicio de relaciones sexuales, antecedentes de otras enfermedades de transmisión sexual y antecedentes de citología anormal). El cáncer de vulva de la mujer de edad superior a los 50 años sería en una proporción importante independiente de la infección viral, estaría asociado a mutaciones de p53 y cursaría sin coexistencia de lesiones VIN. La histología de estos casos correspondería predominantemente al carcinoma escamoso queratinizante. La fracción de casos de cáncer de vulva atribuible al VPH estaría entre el 30 y 70 % de casos, con estimaciones del 50%69. El cáncer de pene muestra marcadores virales en un 70-80% de los casos y el cáncer de vagina en un 40-50% de los casos. Estas estimaciones están, en general, basadas en pocos casos, con tecnología de detección viral variable y en la mayor parte de los casos en ausencia de controles adecuados. 30 Marta Domínguez-Gil González Introducción El VPH está también implicado en la etiología de una fracción de los casos de cáncer de la cavidad oral y orofaringe. La evidencia es todavía poco clara, pero los estudios más recientes sugieren que la intervención viral estaría predominantemente focalizada en los tumores de la amígdala y del anillo de Waldeyer con poca implicación en los tumores escamosos del resto de la cavidad oral70. Los VPH de tropismo cutáneo están claramente implicados en las lesiones cutáneas típicas y en los casos de cáncer de piel de los pacientes con epidermodisplasia verruciforme (EV). Los tipos virales implicados son el VPH 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25. En este modelo, las lesiones neoplásicas se desarrollan predominantemente en zonas expuestas a la luz solar, posiblemente a consecuencia de la interacción entre la radiación ultravioleta de la luz solar y la afectación del sistema de reparación del daño genético por las proteínas del VPH. Los pacientes que han recibido un trasplante y los tratamientos inmunosupresores asociados, desarrollan frecuentemente verrugas cutáneas y cánceres de piel en los que se aíslan VPH de la familia de los identificados en las lesiones cutáneas de los pacientes con EV. En tumores cutáneos no-melanoma, la detección de VPH es variable y de importancia etiológica no establecida. En carcinomas basocelulares la fracción de positividad para el VPH puede alcanzar el 70-80% y en carcinomas escamosos puede alcanzar el 50-60%. La dificultad más importante de interpretación de estos datos reside en la detección frecuente de los mismos marcadores en muestras de piel normal. Posiblemente la distinción entre infecciones asociadas a neoplasia e infecciones por VPH clínicamente irrelevantes requerirá la identificación de otros marcadores de actividad biológica (integración, carga viral, implicaciones de genes celulares) de los que poco sabemos hasta el momento71. Diagnóstico Cribado-Citología El objetivo del cribado para la prevención del cáncer de cuello uterino es la detección de las lesiones escamosas de alto grado (CIN2 y CIN3) el cáncer microinvasivo y el Adenocarcinoma Endocervical in situ-AIS38 (el diagnóstico de CIN1, respuesta aguda a la presencia del VPH, es en el 80-90% de los casos banal y no tiene impacto sobre la mortalidad). 31 Marta Domínguez-Gil González Introducción El test de cribado ideal debe ser fiable, sencillo, reproducible, cómodo y barato y para conseguir reducir la mortalidad debe alcanzar una cobertura mínima y continuada del 70% de la población. La prevención secundaria del cáncer de cuello uterino mediante la detección precoz de lesiones cervicales preinvasoras es fundamental para controlar la enfermedad. La prueba de elección es la citología por la técnica de Papanicolaou, basada en el estudio de la morfología de las células obtenidas por exfoliación del epitelio cervical. Los programas de cribado poblacional mediante citología han demostrado ser eficaces, ya que la incidencia y mortalidad por cáncer de cuello uterino, han disminuido en países donde se han aplicado de forma masiva (por encima del 70-80% de la población), sistemática y continuada72. Existen sin embargo, varios factores que pueden condicionar la efectividad y eficiencia de estos programas de cribado, como son la incidencia del tumor, la historia natural de la enfermedad, la sensibilidad de la citología y las dificultades de captación de los grupos de mayor riesgo de cáncer de cuello uterino. Las recomendaciones sobre los grupos de edad en que la mujer debe ser cribada por citología, siguiendo las directrices de la Unión Europea, incluyen mujeres de 25 a 69 años. La edad de inicio recomendada es a los 3 años después del primer coito vaginal, o los 25 años. La frecuencia más aceptada para la repetición de la prueba es cada 3-5 años tras 2 exámenes anuales con resultados normales. Realizar la citología más frecuentemente aporta escasos beneficios e incrementa notablemente los costes. En el Anexo 1 se expone la modificación de la clasificación citológica de Bethesda, adoptada en el año 2001, en la cual se ha reemplazado la palabra “diagnóstico” por “interpretación” o “resultado” sugiriendo que la citología no da un diagnóstico definitivo. El diagnóstico final, que servirá para orientar la conducta en cada caso, debe integrar los datos clínicos y de laboratorio61. Se ha mantenido la clasificación principal de lesiones intraepiteliales de bajo grado (LSIL) y alto grado (HSIL). En un intento de reducir los casos con células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US), que significaban un 5% o más de todos los diagnósticos citológicos en algunos laboratorios, se ha eliminado la categoría de ASCUS reactivo y estas pacientes se incluyen en la categoría negativa. Se ha añadido una nueva categoría ASC-H, que se emplea si no se puede excluir una lesión de alto grado. El término AGUS ha sido sustituido por “Células Glandulares Atípicas” (AGC) y se ha incluido la categoría de “adenocarcinoma in situ endocervical” (AIS). 32 Marta Domínguez-Gil González Introducción Colposcopia Ante el resultado de una citología anormal debe establecerse, siempre que sea posible, un diagnóstico de confirmación basado en el estudio histológico del tejido en el que se originan las células anormales. Para esta finalidad la colposcopia es la técnica de elección, ya que es un método insustituible en el protocolo de diagnóstico y tratamiento de las lesiones intraepiteliales y del cáncer inicialmente invasivo del tracto genital inferior (TGI)73. El diagnóstico final, siempre debe integrar la información clínica y colposcópica junto con los resultados de laboratorio (citología, biopsia, detección del VPH, etc.). En el cribado del cáncer de cérvix a demanda el objetivo de la colposcopia es aumentar la sensibilidad de la citología. Se sabe desde hace mucho tiempo que el empleo conjunto de la citología y la colposcopia tienen un VPN prácticamente del 100% para detectar CIN2-3 o carcinoma invasivo74,75. Esta situación no es aplicable en el ámbito del cribado poblacional. Test de detección de VPH y programas de cribado La detección viral ha sido propuesta y parcialmente evaluada como técnica complementaria de diagnóstico en tres supuestos76: 1) Como método de cribado de los diagnósticos citológicos ambiguos, catalogados como anomalías de dudosa significación (ASCUS/AGUS). 2) Como sistema alternativo de control de calidad de los programas de citodiagnóstico. 3) Como técnica de cribado general para poblaciones seleccionadas, en particular para poblaciones de edad media y avanzada. 4) Como técnica de cribado primario en poblaciones con escasa protección por los programas de cribado citológico. Algunas de las conclusiones de los estudios comunicados en 1999 y 2000 sugieren que la detección viral es más sensible (entre un 10% y un 15% superior) que la citología convencional o la citología experta en la detección de lesiones de alto grado en muestras citológicas con un primer diagnóstico de ASCUS. La detección viral (y en particular la persistencia de la infección) es un factor necesario para la progresión y el mantenimiento de la lesión neoplásica de alto grado. La 33 Marta Domínguez-Gil González Introducción sensibilidad de la detección viral en programas de cribado es igual o superior a la de la citología convencional, con especificidades menores en los grupos de edad inferior a los 30 años. La toma de muestra para la detección viral admite, en algunas circunstancias, la auto-toma por parte de la mujer. Este interesante desarrollo puede resultar determinante en situaciones de precariedad sanitaria. La tecnología de detección de ADN viral está estandarizada, altamente automatizada y disponible en versión adecuada para la utilización clínica. Las principales ventajas del sistema podrían resumirse en; menor dependencia de la calidad de la muestra recogida, lectura objetiva y cuantitativa de resultados, facilidad de transferencia al laboratorio clínico, automatización del proceso, elevado rendimiento por unidad de persona/tiempo y alta reproducibilidad interlaboratorios. Las limitaciones actuales del sistema son esencialmente, el coste y las derivaciones de la necesidad de modificación de estándares. La incorporación de los test virológicos representa un progreso tecnológico considerable para los programas de cribado y prevención del cáncer. Representa además una adecuación racional de la prevención al progreso conseguido en la comprensión de la etiología de estos tumores y debe ser cuidadosamente considerada76. Diagnóstico microbiológico del VPH por métodos moleculares La detección de ADN del VPH mediante técnicas de biología molecular, independientemente del método utilizado, se basa en la especificidad de la complementariedad entre los ácidos nucleicos. Una secuencia de ADN tiene la capacidad de hibridar específicamente con otros ADNs o ARNs de modo tan específico que, a una determinada temperatura, solamente se formaran híbridos si en 100% de las bases son complementarias. El modo de detección de estos híbridos, la composición de las sondas de ADN y la existencia o no de amplificación de la señal marcaran las diferencias entre las diferentes técnicas de detección. La introducción de métodos moleculares en el diagnóstico del VPH y la caracterización de tipos y variantes han sido de gran utilidad en el conocimiento de la infección, dadas las limitaciones derivadas de la ausencia de sistemas de cultivo in vitro del VPH28. Los métodos aplicados a la identificación de la infección deben ser diseñados de forma que sean capaces de detectar con una elevada sensibilidad el mayor número de tipos. Paralelamente, los métodos aplicados al genotipado y caracterización deben ser lo suficientemente específicos para discriminarlos. 34 Marta Domínguez-Gil González Introducción De manera ideal, un método para la detección de ADN de VPH debe ser capaz de detectar e identificar la presencia de múltiples tipos de VPH. Debe además realizarse con facilidad, con alta reproducibilidad y una elevada especificidad y sensibilidad. La calidad, cantidad y condiciones de almacenamiento de las muestras clínicas son factores que pueden afectar a la sensibilidad de los diferentes métodos de detección del genoma viral de VPH. Los métodos que no requieren la extracción de los ácidos nucleicos para su realización, como es el caso de test de captura de híbridos 2 (Hybrid Capture® HC 2 VPH DNA Test y HC 2 High Risk DNA Test- de Digene Corporation, EEUU), no son tan dependientes de estas variables. En la actualidad se han desarrollado diferentes medios de transporte de muestra que conservan la integridad de las células y, por tanto, de las proteínas, del ADN viral y del ARN. Entre ellos cabe destacar PreserCyt® (Cytyc Corporation, EEUU) y el medio de Specimen Transport MédiumTM STM (Digene Corporation, EEUU), los cuales permiten, a partir de una misma muestra, realizar el análisis patológico y los análisis moleculares de detección de VPH77. Las técnicas de detección del genoma viral mediante amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) requieren la obtención previa de los ácidos nucleicos, ADN y/o ARN. En la actualidad, existen múltiples sistemas de extracción de ácidos nucleicos, muchos de ellos disponibles comercialmente (QI Amp DNA kit, Qiagen, Hilden, Germany; DNA isolation Kit, Roche Applied Science, Suiza, Wizard Genomic DNA Purification kit, Promega, Madison, WI, USA). El método de extracción de ácidos nucleicos es un punto crítico, ya que un bajo rendimiento del método utilizado puede disminuir significativamente la sensibilidad de las técnicas moleculares, tanto desde el punto de vista de la detección del VPH como del análisis de infecciones por múltiples tipos de VPH. La comparación de los diferentes métodos de extracción aplicados al diagnóstico de VPH es compleja debido a la variedad de protocolos y de sistemas de amplificación descritos en la bibliografía77. Hibridación en solución: Captura de híbridos Este método utiliza sondas de ARN que tienen la capacidad de hibridar con el ADN viral en solución y ser detectados mediante métodos luminiscentes78, 79. Los modernos métodos comerciales como el denominado Hybrid Capture® 2, a diferencia de las versiones anteriores que estaban consideradas como subóptimas, tienen una adecuada relación entre sensibilidad y especificidad si se establecen límites de señal lumínica adecuados. 35 Marta Domínguez-Gil González Introducción Esta prueba en la actualidad está disponible en dos formatos. El formato HC 2 VPH DNA Test incluye dos mezclas de sondas, una para la detección de 13 tipos de VPH de alto riesgo (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) y otra para la detección de 5 tipos de bajo riesgo (VPH 6, 11, 42, 43, 44). El ensayo puede realizarse con la sonda de bajo riesgo y/o de alto riesgo. Por su parte, el formato HC 2 High Risk DNA Test incluye sólo la mezcla de sondas para la detección de los 13 tipos de VPH de alto riesgo. Esta metodología fue aprobada por la FDA en el año 2003 80. La captura de híbridos tiene como ventaja adicional la posibilidad de semicuantificar la carga viral, aunque esta cuantificación solamente indica el número de copias virales y no puede ser corregida en función del número de células obtenidas en la toma81. El inconveniente principal es que no permite distinguir entre los diferentes tipos virales ni la presencia de infecciones múltiples, y varios estudios refieren inespecificidades debidas a reacción cruzada entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos virales de bajo riesgo. De forma esquemática el principio de la técnica, incluyen los siguientes pasos79: - Desnaturalización de las muestras biológicas con el ADN diana. Hibridación con mezclas de sondas ARN, dando lugar a la formación de híbridos de ARN-ADN. Estos híbridos son capturados por anticuerpos universales que están unidos a la fase sólida. Los híbridos inmovilizados reaccionan con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina, específicos para los híbridos de ADN-ARN La reacción se detecta mediante la adición de un sustrato quimioluminiscente y la utilización de un luminómetro. Los resultados se expresan como Unidades Relativas de Luz (RLU) y son proporcionales a la cantidad de ADN de VPH presente en la muestra biológica, lo que aporta una medida semicuantitativa de la carga viral. La sensibilidad de la técnica es de 1 picogramo (pg.) de ADN de VPH 16 clonado por mililitro (ml.) de muestra, lo que equivale a 100.000 copias por ml de muestra ó 5.000 copias por ensayo. El límite de detección para los dieciocho tipos de VPH incluidos en las sondas de alto y bajo riesgo según las instrucciones del fabricante varía entre 0,62-1,39 pg por ml de muestra, con un valor promedio de 1,09 equivalente a 109.000 copias82,83. 36 Marta Domínguez-Gil González Introducción La primera generación de captura de híbridos (HC 1) detectaba un rango razonable de tipos de VPH, de bajo y alto riesgo, pero no ofrecía buena sensibilidad y especificidad y su manejo resultaba complicado. La segunda generación (HC 2) puede detectar un mayor espectro de tipos virales, presenta una sensibilidad analítica diez veces mayor y es capaz de utilizarse en grandes programas de detección precoz. El método de determinación del VPH mediante HC 2 VPH DNA Test ha sido utilizado ampliamente en el diagnóstico de la infección, presentando una elevada reproducibilidad. El hecho de ser una técnica estandarizada, validada y con la posibilidad de automatización del proceso – Rapid Capture System (Digene Corporation, EEUU)hace que sea una técnica de elección para el cribado inicial y seguimiento de pacientes84. Sistemas basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La técnica de PCR es el método de amplificación de secuencias diana más frecuentemente utilizado. En la detección y genotipado del VPH se han utilizado diferentes diseños de sistemas de PCR que incluyen los específicos de tipo y los sistemas denominados de amplio espectro. Las PCR específicas de tipo utilizan cebadores que han sido diseñados para detectar un tipo determinado de VPH; por tanto, la detección de diferentes tipos implica la realización de múltiples reacciones de PCR. Los diseños de PCR múltiple (múltiples cebadores específicos de tipo en una única reacción) simplifican la realización de la técnica, pero la estandarización del método suele ser compleja. Las PCR de amplio espectro son más utilizadas en la detección del VPH y la mayoría están diseñados en la región L1, dado que es una de las regiones más conservadas dentro del genoma de los VPH85, 86, 87,88. La Figura 5 muestra los más utilizados. Existen tres diseños diferentes de cebadores consenso. En primer lugar, están aquellos que incluyen una pareja única de cebadores, diseñados sobre una región conservada, pero que sólo se aparean completamente con algunos tipos del VPH. Para compensar los desapareamientos, la PCR se realiza a bajas temperaturas de anillamiento. Los cebadores Primer General (GP) 5+/6+ son un ejemplo representativo87, 89. El segundo tipo de cebadores consenso incorpora varias parejas de cebadores, que contienen una o más posiciones degeneradas para compensar las variaciones intertípicas en los lugares de secuencia a los que se unen los cebadores. Entre ellos cabe destacar el sistema MY09/MY1185. El tercer diseño consiste en combinar una serie de parejas de cebadores 37 Marta Domínguez-Gil González Introducción diferentes que se unen en las mismas posiciones del genoma. A menudo contienen inosina en sus secuencias. Ejemplos de este tipo de cebadores son PGMY86 y SPF1088. E E2 E7 E5 L1 E1 E4 L2 Figura 5. Localización de los diferentes sistemas de cebadores utilizados en la detección por PCR del VPH. Adaptado de (32) y (90) Otros sistemas de PCR de amplio espectro han sido diseñados en diferentes regiones del genoma como E1, aunque su uso no se ha generalizado en los laboratorios. La técnica de PCR a tiempo real se ha introducido en los últimos años en el diagnóstico molecular de VPH como herramienta para la determinación cuantitativa de la carga viral así como para el diagnóstico de la infección 91, 92,93. La detección a tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble como el SYBR Green o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas: sondas Taqman, cebadores fluorescentes o Molecular Beacons y sondas de hidrólisis. La utilización de sondas aumenta la especificidad de la reacción. Tanto los sistemas de amplificación de VPH de amplio espectro como los sistemas específicos de tipo han sido adaptados a PCR en tiempo real. La identificación de tipos de VPH mediante esta técnica es compleja, ya que requiere la utilización de diferentes 38 Marta Domínguez-Gil González Introducción sondas específicas. Diferentes sistemas basados en esta tecnología están o estarán disponibles en el mercado, si bien es necesaria una validación adecuada de los mismos. La detección del ARN viral mediante transcripción inversa (RT-PCR) es una herramienta que puede ser de gran utilidad desde el punto de vista clínico, ya que permite evaluar la expresión de oncogenes de VPH. La compañía “Norchip” ha desarrollado un sistema de RT-PCR de VPH- PreTect VPH Proofer- que detecta la expresión de los oncogenes E6/E7 de los tipos de alto riesgo más frecuentes (VPH 16, 18, 31, 33 y 45) utilizando la tecnología de amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) combinada con detección a tiempo real 94,95. Métodos de detección de los productos amplificados Análisis de los patrones de restricción Esta metodología, empleada clásicamente en biología molecular para la caracterización y tipificación de diferentes patógenos, ha sido aplicada al genotipado de VPH. El análisis de los productos amplificados por PCR se lleva a cabo mediante la digestión de los mismos con diferentes enzimas de restricción, originando patrones específicos para cada uno de los tipos de VPH. El protocolo descrito por Bernard HU et al, en 199426 ha sido el más utilizado, y está basado en la digestión del fragmento amplificado (450 pb) por el sistema de cebadores MY09/11 con siete enzimas de restricción: Bam HI, Dde I, Hae III, Hinf I, Pst I, Rsa I y Sau3AI96. Secuenciación directa de los productos de PCR Existen diferentes métodos de secuenciación genómica, unos utilizan cebadores marcados y otros dideoxinucleótidos marcados que son empleados en la detección de secuencias. Este último es el método más ampliamente utilizado, dado que el marcaje de un elevado número de cebadores aumenta significativamente el coste de la técnica. Actualmente, el avance en las técnicas de biología molecular y la disponibilidad de equipos de secuenciación automáticos, los cuales permiten el procesamiento de un elevado numero de muestras simultáneamente, han simplificado de forma significativa la metodología de secuenciación. El análisis de la secuencia es una tipificación directa e inequívoca que permite distinguir variantes y polimorfismos virales de VPH, pero no es un método adecuado para la detección de infecciones múltiples por VPH porque sólo será detectado el genotipo predominante97. 39 Marta Domínguez-Gil González Introducción En los últimos años se han desarrollado sistemas basados en secuenciación que utilizan múltiples cebadores en la reacción de secuencia, permitiendo el análisis de infecciones múltiples de VPH. Esta metodología requiere la utilización de equipos de detección específicos, no generalizados en la mayor parte de los laboratorios. Hibridación de los productos de PCR La hibridación de los productos de PCR con sondas específicas es un método ampliamente utilizado para la detección y genotipado de VPH. Se han desarrollado diferentes formatos de hibridación, tanto en microplaca como en tira, que facilitan su utilización en la práctica clínica. La mayoría de los sistemas están basados en el marcaje de los productos de PCR con biotina durante el proceso de amplificación y la posterior hibridación con sondas específicas. La compañía “Roche Diagnostics” ha desarrollado Amplicor VPH DNA Test en microplaca para la detección de trece tipos de VPH de alto riesgo. El método está basado en la detección de un fragmento de 165 pb del gen L1, mediante hibridación con una mezcla de sondas específicas. Debido a las características del ensayo permite la detección del VPH, pero no el genotipado98. La hibridación reversa en tira es el método más utilizado para el genotipado y la detección de infecciones múltiples por VPH. En este diseño se realiza la hibridación de los productos de PCR con múltiples sondas específicas de tipo, inmovilizadas en un soporte sólido (tira de nitrocelulosa). Los productos de amplificación, generalmente marcados con biotina, son desnaturalizados en condiciones alcalinas e hibridadas con sondas específicas. Los híbridos son posteriormente detectados mediante una reacción colorimétrica. Las compañías “Innogenetics” y “Roche Diagnostics” han desarrollado dos sistemas representativos de esta tecnología: INNO-LIPA VPH y Linear Array Genotyping VPH Test, respectivamente99. Los microarrays genéticos suponen un nuevo abordaje para la caracterización mediante técnicas de hibridación de productos de PCR. En los últimos años se han desarrollado diferentes sistemas basados en dicha tecnología, algunos de ellos disponibles en el mercado como PapilloCheck (Greiner Ivonne, Alemania) y Clinical Arrays 40 Marta Domínguez-Gil González Introducción Papillomavirus (Genomica SAU, España)100. En el Anexo 2, se representan los genotipos de VPH detectados por los diferentes sistemas moleculares empleados. Métodos de detección de anticuerpos frente al VPH La serología de VPH ha progresado también de forma notable. La infección por VPH es capaz de inducir anticuerpos circulantes y respuesta inmunitaria a nivel celular. En términos generales, se han publicado estudios utilizando tres generaciones de tests serológicos: 1) Tests basados en la detección de anticuerpos frente a péptidos de las proteínas del VPH. En especial se han estudiado péptidos codificados en las regiones de E2, E4, Ll, L2, E6 y E7 de VPH 16 y 18. Estos estudios han evaluado la presencia de anticuerpos en series de casos y controles con relación a la detección de ADN viral en la citología. 2) Tests basados en la detección de anticuerpos frente a las proteínas transformantes E6 y E7 expresadas in vitro por transcripción y transducción. 3) Tests basados en la determinación de anticuerpos frente a la cápside viral Ll y L2 desprovistas de ADN (Virus Like Particles). Este mismo procedimiento de síntesis es el que ha inspirado algunas de las vacunas introducidas en nuestro país. La sensibilidad de estos tests es baja (en torno al 50-70%) comparados con la detección de ADN mediante PCR. No obstante, utilizando tests de segunda y tercera generación, la discriminación serológica entre casos de carcinoma invasor y controles es relativamente satisfactoria. La detección de anticuerpos se interpreta como un marcador de exposición persistente al VPH en mujeres normales y está en evaluación como marcador de diseminación metastásica en pacientes con carcinoma invasor101. Tratamiento El tratamiento de la infección dependerá de los síntomas, el tipo de lesión, la capacidad evolutiva de las mismas a cáncer y la ansiedad que éstas generan. Tratamiento de los condilomas Aunque puede existir una regresión espontánea, la tendencia generalizada es tratar los condilomas con el objetivo de controlar la enfermedad, aliviar la ansiedad de la paciente y mejorar su autoestima. Otro motivo de tratamiento es la posibilidad de que contengan virus oncogénicos, aunque sea poco frecuente. 41 Marta Domínguez-Gil González Introducción En general, en lesiones iniciales, pequeñas y poco extensas, debe efectuarse un tratamiento médico, mientras que en lesiones antiguas, extensas y recidivantes deben emplearse tratamientos quirúrgicos. En lesiones muy extensas y recalcitrantes puede realizarse un tratamiento mixto, quirúrgico y médico102. Tratamientos tópicos Sólo para lesiones genitales externas. La Podofilotoxina al 0.5 % local dos veces al día durante tres días consecutivos, seguido de cuatro días sin tratamiento, pudiendo repetirse hasta cuatro ciclos (cuatro semanas), resulta eficaz en lesiones cutáneas vulvares de extensión limitada. El riesgo de toxicidad sistémica es bajo y puede provocar irritación local leve. Está contraindicada en lesiones mucosas y durante la gestación. La Podofilotoxina al 0.15% en crema es eficaz en condilomas anales, pero en general, presenta recurrencias frecuentes103. 5-Fluorouracilo (5-FU) Es una agente citotóxico, antagonista de la pirimidina que actúa inhibiendo la síntesis del ácido nucleico. Su uso en los genitales externos está limitado debido a la extensa inflamación local que produce, sin embargo su uso puede ser útil en vagina y lesiones de la zona uretral, en pautas con aplicación 1-2 veces por semana. Ácido Tricloroacético Es otra terapia tópica para las verrugas genitales, generalmente se aplica directamente sobre una solución acuosa al 90%, es una terapia localmente destructiva y por lo tanto se produce una irritación local que puede ser dolorosa, lo que limita su uso y hace que deba ser aplicada por un facultativo. No tiene efectos sistémicos por lo que puede se aplicado durante el embarazo. Inmunomoduladores Interferón Entre las citoquinas antivirales se han utilizado en el tratamiento de los condilomas, los interferones, éstos se han administrado de manera tópica, intralesional, subcutánea e intramuscular con resultados variables. Comparado con placebo la terapia con interferón, tras tratamiento con láser de CO2, no parece ser más efectiva en la recurrencia de los mismos, lo que debido a su alto coste y potenciales efectos secundarios hace que no sea una terapia que se recomiende en la práctica clínica rutinaria. 42 Marta Domínguez-Gil González Introducción Imiquimod Es una pequeña molécula perteneciente al grupo de las imidazoquinolinas que actúa como potente modificador de la respuesta inmune, el mecanismo de acción involucra la producción de inmunoferon-α,-β,-γ y el factor α de necrosis tumoral. Se aplica sobre las lesiones, en forma de crema al 5%, en el momento de acostarse, tres veces por semana y durante un periodo máximo de 16 semanas. Debe lavarse con agua y jabón al día siguiente. Suelen desaparecer los CA tras 8-10 semanas de tratamiento o incluso antes. Los efectos adversos son leves y bien tolerados, si bien en algún caso se ha descrito dolor local. Al mantener un estado de inmunidad favorable, las recurrencias son menores que con la Podofilotoxina104. Terapias destructivas/ escisionales Criocoagulación Consiste en el enfriamiento de los condilomas causando una necrosis celular epidérmica. Se han descrito eficacias del 77% con recurrencias de un 30%. Aunque requiere equipamiento especial, es una opción barata y segura, y casi de primera elección en el tratamiento de la mayoría de los condilomas. Cirugía La cirugía, puede estar indicada en lesiones aisladas, exofíticas o en casos de grandes masas condilomatosas. Electrocoagulación Es una técnica que utiliza un electro-bisturí convencional, con anestesia local, puede ser útil en lesiones aisladas y pediculadas. Asa de diatermia Combina electrocoagulación y fulguración. Está fundamentalmente indicada en las lesiones de cérvix uterino, pero su aplicación puede ser también en el área anogenital. Láser Utiliza un emisor de rayos láser que produce una emisión de fotones al excitar moléculas de CO2. Ésta gran emisión de energía por unidad de superficie le confiere un alto poder destructor. 43 Marta Domínguez-Gil González Introducción Tratamiento de la infección subclínica La conducta terapéutica ante las lesiones intraepiteliales depende de su diagnóstico, que a menudo debe integrar los resultados de citología, colposcopia, biopsias y análisis del ADN de VPH, además de la información clínica. La mayor exactitud diagnóstica y el mejor conocimiento de dichas lesiones han motivado los cambios experimentados en el tratamiento. En las últimas décadas se ha pasado de la cirugía agresiva, como la amputación cervical o histerectomía, a un tratamiento selectivo que contempla desde la conducta expectante al tratamiento lesional más conservador105. El objetivo final del tratamiento es la eliminación de la neoplasia intraepitelial para evitar su progresión a carcinoma invasivo. Por ello, y de acuerdo con su historia natural, hay consenso respecto al tratamiento de todas las pacientes con HSIL-CIN2-3. Por el contrario, el tratamiento de todas las pacientes con LSIL-CIN1, la mayoría infecciones transitorias por el VPH, supone un sobretratamiento injustificado. El desarrollo, en los años setenta, de la crioterapia, en los ochenta del láser de CO2 y, actualmente desde los noventa, de asa diatérmica ha desplazado totalmente la conización con bisturí y la histerectomía, hasta entonces técnicas de elección en el tratamiento de la CIN. Los tratamientos destructivos (vaporización con láser, crioterapia electrocoagulación) sólo tienen alguna indicación en el condiloma cervical o en la CIN1-2, siempre que se cumplan las siguientes condiciones: lesión pequeña totalmente visible, confirmada en un examen colposcópico valorable, y con ausencia de lesión endocervical verificada mediante legrado o citología con cepillado, y asegurando su seguimiento. Con estos criterios, los resultados son similares con cualquiera de las técnicas, con tasas de curación del 90-96%. En lesiones extensas o de alto grado (CIN2-3), los resultados son peores con crioterapia y electrocoagulación, con tasas de curación del 40 y el 60%, respectivamente, por lo que no deben utilizarse, mientras que la vaporización con láser consigue curaciones por encima del 90-95%. El tratamiento escisional es de elección en las mujeres con CIN2-CIN3 y actualmente se realiza con preferencia mediante asa diatérmica con anestesia local y de forma ambulatoria. Hay muy pocas indicaciones para realizar una conización clásica con bisturí en quirófano. El tratamiento escisional permite el estudio histológico exhaustivo y diagnostica un carcinoma oculto inicialmente invasivo en aproximadamente un 1% de los casos. 44 Marta Domínguez-Gil González Introducción Seguimiento El control de las pacientes tratadas por CIN2-3 tiene como objetivo el diagnóstico precoz de una posible persistencia o recidiva, con el fin de retratarla y evitar que progrese a cáncer. Tras una conización con asa por CIN2-3 se estima que entre el 5 y el 30 % de los casos presentan una enfermedad residual o recurrente. El cáncer puede aparecer tras un intervalo variable después del tratamiento de la CIN, tanto si se usaron técnicas destructivas como de exéresis. Una paciente tratada por CIN tiene un riesgo mayor de desarrollar cáncer invasivo que una mujer que no ha tenido CIN. A los 8 años después de tratar la CIN, el riesgo de cáncer invasivo es 5 veces mayor que el de la población general. La histerectomía total no excluye del riesgo de recidiva en la cúpula vaginal, incluso a largo plazo. Algunos factores se han asociado a una mayor riesgo de persistencia o recurrencia lesional: tamaño de la lesión, la afección de los márgenes quirúrgicos, la edad, el estado inmunológico y la persistencia de la infección por el VPH postratamiento. Algunos autores han sugerido que la carga viral elevada antes del tratamiento puede ser predictiva de persistencia o recurrencia lesional. Los protocolos de seguimiento aceptados incluyen la citología o la combinación de citología y colposcopia cada 4-6 meses hasta tener 3 valoraciones consecutivas negativas. Después de recomienda el seguimiento anual. Sin embargo, la citología presenta una tasa de falsos negativos que limita su eficacia en el control de la curaron, Además, algún estudio sugiere que la citología pierde sensibilidad tras el tratamiento. Actualmente, las pruebas para la identificación del ADN-VPH de alto riesgo también se han incorporado al seguimiento de estas pacientes. La determinación del ADN-VPH, no antes de los 6 meses del tratamiento, muestra una excelente sensibilidad para la detección de lesión residual. Si la citología y el test de ADN de VPH son negativos a partir de los 6 meses del tratamiento el riesgo de persistencia lesional es prácticamente nulo. La recidiva, en caso de que se produzca, es probable que se deba a una nueva reinfección. Si el test de ADN de VPH es negativo, el nuevo control se puede realizar al año. La incorporación des test permite obviar la repetición innecesaria de citologías y retornar antes a las mujeres al programa de cribado. 45 Marta Domínguez-Gil González Introducción Si los márgenes de la pieza de conización están libres de lesión, se realizará a los 6 meses postratamiento, pero si están afectados, se adelantará a los 3 meses. Se practicará una citología, una colposcopia y eventuales biopsias. Si la colposcopia no es valorable o los márgenes están afectados, se incluirá un estudio endocervical. El análisis de ADN de VPH se realizará a partir de los 6 meses. Con todos los resultados negativos, y tras realizar una citología anual durante 2 años, se puede remitir a la paciente al programa de cribado habitual. En las mujeres con ADN de VPH positivo con citología y colposcopia negativas se repetirá la citología y el test ADN de VPH a los 6 meses. Si ambas pruebas son negativas, se remitirá de nuevo a la paciente al programa de cribado, y si cualquiera de ellas es positiva se realizará colposcopia. En presencia de LSIL en la citología y/o colposcopiabiopsia de CIN1, con estudio endocervical negativo, se planteará un tratamiento escisional o destructivo. Si la citología es de HSIL y/o la colposcopia ≥CIN2 y/o el estudio endocervical es positivo, se indicará una reconización. La histerectomía tiene unas indicaciones muy limitadas, sólo en casos con afección de 2 o 3 márgenes en mujeres sin deseo gestacional o si por circunstancias locales (atrofia o estenosis) es imposible su control. Asimismo, se indicará una histerectomía cuando haya otra enfermedad asociada. En cualquier caso, precio a la histerectomía, se debe valorar exhaustivamente la vagina para descartar VaIN. Vacunas frente al VPH En julio de 2006, la Agencia Reguladora del Medicamento (Food and Drug Administration-FDA) y el Comité Asesor para la inmunización y vacunación (Advisory Committe on Immunization Practices-ACIP) de los Centros para el Control de Enfermedades (Center for Disease Control and Prevention-CDC) aprobaron y regularon la utilización de la primera vacuna contra el cáncer de cuello uterino, conteniendo antígenos de cuatro tipos del VPH. La Agencia Europea de Regulación de Medicamentos (European Agency for the Evaluation of Medicinal Products- EMEA) ha expresado una opinión favorable sobre el producto y ya está autorizada en los estados miembros. La EMEA también ha evaluado y ya está disponible una segunda vacuna bivalente diseñada para la prevención del cáncer de cuello uterino106. 46 Marta Domínguez-Gil González Introducción Vacunas profilácticas frente al VPH: Situación actual Hay dos vacunas en fase inmediata de aplicación clínica. Ambas están elaboradas con Virus-Like Particles (VLP) del fragmento L1 de la cápside del VPH, inmunogénico, no oncogénico: La primera vacuna (Gardasil®, desarrollada y comercializada por Merck Reaserch Laboratories y en Europa por Sanofi Pasteur MSD), incluye VLPs de los tipos 6, 11, 16 y 18. Utiliza una sal de aluminio como adyuvante. El esquema de vacunación recomendado tras el desarrollo clínico incluye tres dosis intramusculares a los 0, 2 y 6 meses. El programa de desarrollo clínico de Gardasil® incluyó mas de 27.000 voluntarios (adolescentes entre 9 y 15 años de edad y mujeres de 16 a 26 años) en 33 países. La eficacia de Gardasil® fue evaluada en 4 ensayos clínicos de Fase II y III, que incluyeron un total de 20.541 mujeres de 16 a 26 años de edad reclutadas y vacunadas sin cribado previo para la presencia de infección por VPH107. Los resultados publicados108, 109, describen, a los cinco años de seguimiento, una eficacia mantenida del 96% (IC95%: 84%-100%) frente a la infección persistente de VPH, una protección del 100% frente a CIN 1 y una eficacia del 100% (IC95%: 12%-100%) frente a CIN 2-3 con confirmación histológica. Este parámetro fue definido por las agencias reguladoras internacionales (FDA, OMS, EMEA) como único marcador clínico subrogado del cáncer cervical y por tanto requisito imprescindible para autorizar la indicación de la vacuna en la prevención del cáncer de cuello uterino110. Recientemente se ha comunicado111, con un seguimiento de 18 meses, una protección del 100% (IC95%: 56%-100%) frente a VIN 2-3, VaIN 2-3 y verrugas genitales. Asimismo, se han presentado datos prometedores de reactividad cruzada de Gardasil®112 para los tipos VPH 45, 31, 52 y 58 del VPH filogenéticamente próximos a los cubiertos por la vacuna. Actualmente se están realizando estudios para demostrar que Gardasil® previene la enfermedad causada por dichos tipos de VPH. También están en marcha estudios de eficacia en varones adultos y en poblaciones especiales (pacientes inmunodeprimidos, portadores de VIH), así como de administración concomitante con otras vacunas. Los resultados de los estudios de inmunogenicidad de la vacuna tetravalente también demuestran que la respuesta inmunitaria de niños y niñas de 9 a 15 años es significativamente superior a la de las mujeres adultas jóvenes (16 a 23 años) 113. 47 Marta Domínguez-Gil González Introducción Un subgrupo de mujeres vacunadas que recibió una dosis de Gardasil® cinco años después de la vacunación, mostró una rápida e intensa respuesta anamnésica que excedía el nivel de anticuerpos observados un mes después de la vacunación inicial114. Esta observación indica la presencia de memoria inmunológica y permite anticipar que la capacidad protectora de la vacuna será de duración muy prolongada. La evidencia científica tan sólida ha hecho posible que la FDA aprobara la comercialización de la vacuna tetravalente Gardasil® en Junio de 2006 y que el ACIP de los CDC115, 116, recomendara administración rutinaria de tres dosis de esta vacuna a niñas de 11-12 años, ampliando la recomendación de licencia al período entre 9 y 26 años. En dicho documento se precisa que la vacuna debe ser administrada antes del comienzo de las relaciones sexuales, pero que las mujeres sexualmente activas también deberían vacunarse. También la OMS ha publicado unas directrices para la implementación de la vacunación en los diferentes países117. En Europa, el Comité de Expertos de la EMEA ha emitido con fecha del 27 de Julio de 2006 107 una opinión positiva del Gardasil®. Dicha recomendación positiva recoge las indicaciones de prevención de CCU (escamoso y glandular), CIN 2-3, VIN 2-3 y verrugas genitales. Además reconoce la efectividad en VaIN 2-3 y CIN 1, y resalta la relación entre prevención de cáncer del cuello uterino y CIN 2-3. Este grupo de expertos recomienda implementar la vacunación en ambos sexos. El 20 de Septiembre de 2006, Gardasil® ha sido aprobado por la Comisión Europea107 y la vacuna ya está disponible en trece países de la Unión Europea. La segunda vacuna (Cervarix®, desarrollada y comercializada por GlaxoSmithKline), incluye VLPs de los tipos 16 y 18. Utiliza como adyuvante AS04, una sal compuesta de aluminio y MPL, un lipopolisacárido, al que se ha atribuido un incremento de la respuesta inmunogénica118. La pauta de vacunación recomendada incluye tres dosis intramusculares a los 0, 1 y 6 meses. Los resultados en fase III119 publicados describen, a los 5.5 años de seguimiento, una eficacia del 100% (95% IC, 30100) frente a la infección persistente de VPH y una protección del 100% (95% IC, 42100) frente a CIN. La vacuna bivalente VPH 16/VPH 18 ha mostrado resultados preliminares sugiriendo protección cruzada frente a infección para los genotipos VPH 31 (54,5% de eficacia) y VPH 45 (94.2% de eficacia) del VPH119. 48 Marta Domínguez-Gil González Introducción El seguimiento de estas cohortes (5.5 años) ha permitido establecer que la inmunogenicidad provocada por la vacuna se sitúa muy por encima de la producida por la infección natural, con niveles estables por el momento, pero no es posible predecir hoy, con la información disponible, si será necesario administrar dosis de recuerdo120 Estudios de proyección matemática, testados con otras vacunas ya comercializadas, sitúan la duración de la respuesta sobre los 15 años121. Estas vacunas son estrictamente profilácticas: las mujeres positivas para algún VPH pueden ser vacunadas, no siendo necesario cribado previo a la vacunación. Los datos disponibles describen que el curso de su presencia viral no está modificado por la vacuna, aunque se ha detectado, en estas mujeres, que la vacuna genera un incremento de su tasa de anticuerpos122. La eficacia en hombres no ha sido evaluada y se desconoce el grado de protección que la vacuna pueda ofrecerles o su capacidad de alterar la transmisibilidad del VPH. Vacuna frente al VPH y cribado de cáncer de cuello uterino. La vacunación no eliminará la necesidad de continuar con el cribado poblacional. Los protocolos habituales deberán mantenerse en aquellas poblaciones no vacunadas. Pero el hecho de que una fracción de cánceres de cuello de útero (≈30%) está producida por tipos no incluidos en la vacuna obliga a que se deba seguir protegiendo con el cribado a las mujeres vacunadas. Será necesario hacer un trabajo de adecuación de las políticas de cribado en las poblaciones vacunadas, que probablemente podrán iniciarlo más tarde (3035 años) y con intervalos entre controles más largos (5 años) 123. Además, en poblaciones vacunadas, con tasas bajas previsibles de resultados cervicales citológicos anormales y prevalencias igualmente bajas de lesiones precursoras, la citología, con problemas de sensibilidad124, no tendría el perfil adecuado para ser usada como test de cribado en primera línea. Es probable que el mejor test inicial de cribado pueda ser la determinación de ADN del VPH, muy sensible125, con la citología en segundo nivel en la selección de conducta de los casos VPH positivos y la colposcopia en tercero, recibiendo los casos con citología positiva. Esta estrategia está siendo evaluada en la actualidad126. Según la evidencia descrita y resumida en los apartados anteriores, y asumiendo que el objetivo final de la vacunación es la prevención primaria de la patología VPH dependiente, fundamentalmente el cáncer de cuello uterino, pero también el de ano, vulva, vagina y probablemente pene y orofaringe, y además, para la vacuna tetravalente, las verrugas genitales y la papilomatosis respiratoria recurrente, el Grupo de 49 Marta Domínguez-Gil González Introducción Consenso sobre vacunas profilácticas frente al VPH ha establecido las siguientes recomendaciones127: − − − − La vacunación debe ser prioritaria en niñas con edades comprendidas entre los 9 y 14 años con objetivo de cobertura universal. El segundo objetivo debería ser la prolongación de edad de vacunación a mujeres hasta los 26 años. Como tercer objetivo debería considerarse recomendar la vacunación a niños de entre 9 y 13 años, teniendo muy presente que su eficacia no está demostrada, aunque si su inmunogenicidad y que la vacunación a niños es coste/eficaz solo en el caso de no conseguir la cobertura descrita en niñas121. Las políticas de cribado de cáncer de cuello uterino aplicadas a las poblaciones vacunadas deben ser, una vez reordenadas y redefinidas, mantenidas. Vacunas terapéuticas frente a VPH El desarrollo de las vacunas terapéuticas frente a VPH, se ha llevado a cabo de forma mucho más lenta que el de las vacunas profilácticas128, 129, 130, 131, 132,133. En un futuro próximo podrían suponer una nueva estrategia en el tratamiento del cáncer cervical. El objetivo sería erradicar o reducir el número de células infectadas por el virus134, 135. Las vacunas terapéuticas frente a VPH están constituidas por péptidos homólogos a determinadas proteínas virales, E6 y E7136, 137. El péptido E7 origina inmunidad celular protectora frente a las displasias cervicales, previene crecimiento tumoral en modelos animales e induce respuesta anticuerpo-específica en el cáncer cervical en estadios iniciales138. Estas vacunas podrían ser aplicadas en aquellas pacientes en las que se hayan diagnosticado displasias, cánceres invasivos de cuello uterino, o como tratamiento adyuvante en recidivas o metástasis. El ensayo clínico de Berzosky et al, estudia la eficacia terapéutica de la vacuna humana recombinante de virus VPH 16 y 18 E6 y E7, cuando se aplica en pacientes con carcinoma de cuello uterino recurrente o avanzado. La interpretación de los resultados es dificultosa, debido a que son pacientes que reciben también otros tratamientos139. Una de las principales limitaciones de las vacunas terapéuticas es que actúan con distinta efectividad según el polimorfismo HLA que tenga el huésped, lo que supondría que en determinados pacientes vacunados no fuera tan eficaz. Además, en pacientes con 50 Marta Domínguez-Gil González Introducción enfermedad avanzada existe una disminución de la respuesta inmunológica, por lo que la eficacia de la inmunoterapia estaría limitada140. Los ensayos clínicos preliminares de vacunación terapéutica tratan de demostrar similar eficacia con respecto a los tratamientos actuales141. Probablemente la combinación de vacunas terapéuticas y otras terapias frente al cáncer de cuello uterino, como antivirales e inmunomoduladores, serán las opciones más a tener en cuenta en un futuro próximo142. 51 Objetivos Marta Domínguez-Gil González Objetivos Objetivos En este estudio se han propuesto los siguientes objetivos específicos: Conocer la evolución en el tiempo, de la demanda clínica de detección de VPH y los resultados obtenidos en el diagnóstico de VPH. Describir las características operacionales de las técnicas virológicas diagnósticas de la infección por VPH incluidas en el actual protocolo diagnóstico. Evaluar la eficacia de las pruebas de diagnóstico empleadas para la confirmación diagnóstica de casos clínicos de VPH en la práctica clínica. Comparar los diferentes métodos para la detección del VPH, tres protocolos basados en PCR y otro de hibridación, en muestras clínicas y evaluar su utilización en la práctica clínica. Conocer la prevalencia de infección por VPH en nuestra población y evaluar los genotipos de VPH más frecuentes en nuestro medio. Proponer el mejor protocolo de diagnóstico de VPH. 53 Material y métodos Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Muestras procesadas y características En este trabajo, entre los años 1996 a 2006, se han procesado para detección de VPH; 4375 muestras genitales o de otra localización, correspondientes a 3978 pacientes, recibidas en el Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario de Valladolid (HCUV). Para el presente estudio se recogieron muestras de exudados de diferentes zonas del tracto ano-genital. La toma de la muestras se realizó en zonas con lesión (condilomas, diferentes grados de displasia CIN 1, 2, 3) y/o en zonas sospechosas de infección. La recogida y conservación de las muestras, se hizo dependiendo del periodo de tiempo estudiado. Durante los años 1996 a 2006 se utilizaron muestras cervicouterinas recogidas en HC Cervical Sampler (Figura 6) (Digene Corporation, EEUU), compuesto por un escobillón cervical de Digene y medio de transporte de muestra (Specimen Transport Médium, STM, Digene Corporation, EEUU). Figura 6. HC Cervical Sampler (Digene Corporation, EEUU), compuesto por un escobillón cervical Digene y medio de transporte de muestra (Specimen Transport Médium, STM, Digene Corporation, EEUU). 55 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Entre los años 2000 a 2004 también se utilizaron muestras recogidas con torundas de algodón o alginato estériles libres de medio de cultivo o medio de transporte (Figura 7), especialmente para evitar posibles inhibiciones en la reacción de amplificación del ADN. Figura 7. Torunda o hisopo de alginato estéril sin medio de cultivo ni transporte, empleada en la toma de muestras de frotis cervicouterino. Y en el último trimestre del año 2006 se utilizaron muestras recogidas con un dispositivo tipo cepillo, y colocadas en solución PreservCyt, de Cytyc (Figura 8). El dispositivo utilizado se desechaba tras la toma de la muestra. Figura 8. PreserCyt® (Cytic Corporation, EEUU) Medio de transporte. Permite a partir de una misma muestra, realizar el análisis patológico y los análisis moleculares de detección de VPH. 56 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Las muestras recogidas con DNA PapTM Cervical Sampler, se congelaron a -20ºC hasta el momento de su procesamiento al igual que aquellas que fueron recogidas con torundas de algodón o alginato estériles. Las muestras en solución PreservCyty se conservaron a 4ºC hasta su procesamiento. Todas las muestras para el estudio de VPH fueron remitidas a la Sección de Virología del Servicio de Microbiología del HCUV. Dichas muestras adjuntaban una ficha de datos personales y clínicos realizada en nuestro laboratorio, completada por el medico solicitante del estudio de detección de VPH. 57 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Se analizó la evolución anual del número de peticiones de detección de VPH al HCUV durante los once años que abarca el estudio. También, se estudió el tipo de muestra que era remitida para su posterior análisis: Frotis de cérvix uterino, frotis uretrales, exudados uretrales, biopsias, frotis de mucosa oral y líquido prostático. También se definieron variables de persona y la procedencia clínica de las muestras. Para determinar la evolución anual del número de peticiones de detección de VPH al HCUV durante los once años que abarca el estudio se calculó el total de determinaciones realizadas desde 1996 a 2006, y se determinó la media de determinaciones mensuales y diarias. Se dividió en tres periodos distintos, un primer periodo que abarca de 1996 a 2001, un segundo periodo de 2001 a 2004 y por último un tercer periodo de 2004 a 2006, para determinar la existencia o no de incremento anual en el número de determinaciones. La clasificación etaria de los pacientes se realizó en cinco grupos: menores de 25 años, de 25 a 34, de 35 a 44, de 45 a 54 y mayores de 54 años. La edad media de las pacientes fue de 36.3 años (DE: 40.3; mediana: 35). Se estudió la distribución de peticiones para detección de VPH en función de la edad y el sexo del paciente. La procedencia de las muestras fue muy variada; la mayor parte de las mismas procedían de Atención Ginecológica del Servicio Territorial de Sanidad de Valladolid y del HCUV, aunque también se recibieron muestras del Hospital Universitario “del Río Hortega” de Valladolid, de Centros de Salud de Área Sanitaria que abarca el HCUV, de la Asociación Castellano-Leonesa de Ayuda al Drogodependiente (ACLAD), del Hospital de Medina del Campo y del Servicio Territorial de Sanidad de Ávila. Técnicas utilizadas Se utilizaron hasta cinco técnicas distintas, en función del momento en el que se realizó el estudio. En la Figura 9 se representa el cronograma de la utilización de las distintas técnicas empleadas, así en el año 1996 se inició el diagnóstico de VPH utilizando la tecnología basada en la Captura de Híbrido o Hybrid Capture 1 (HC 1) (Digene Corporation, EEUU), la cual fue sustituida, aproximadamente en junio de 1998, por HC 2. La técnica HC 2 sigue utilizándose en la actualidad y no ha sido reemplazada por ninguna otra a lo largo de estos años. En el año 2000, se introdujo la PCR mediante digestión con enzimas de restricción (ERpcr) (VPH fast, Genomica), como técnica de 58 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos confirmación y genotipado de los VPH positivos por HC 2. Esta ERpcr dejó de utilizarse a principios del año 2005. Simultáneamente, en los años 2002 y 2003, empezaron a utilizarse las técnicas de LiPA y Microarrays, respectivamente, como técnicas de confirmación y genotipado, ambas se siguen utilizando en la actualidad. Figura 9. Cronograma de la utilización de las distintas técnicas para el cribado, confirmación y genotipado del VPH, empleadas en el HCUV durante el periodo 19962006. HC: Captura de Híbridos; ERpcr: PCR con digestión mediante enzimas de restricción. Hibridación con sondas diferenciadas y con sonda única mediante Hybrid Capture 2 (HC 2) En 4375 muestras se realizó un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos para la detección del ADN del VPH, con la técnica Hybrid Capture (HC), como cribado primario. Esta técnica permite detectar ADN de VPH asociados a moderado-alto riesgo de transformación celular, VPH de bajo riesgo y VPH de ambos grupos. Durante el año 1996 y hasta junio de 1998 se utilizó la tecnología HC 1, y a partir de junio de ese mismo año se comenzó con HC 2, la cual sigue utilizándose actualmente. En la siguiente tabla se exponen las diferencias entre la primera y la segunda versión de esta técnica (Tabla 2). 59 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos TABLA 2. Características diferenciales de las técnicas Hybrid Capture® (HC 1 y HC 2): Hybrid Capture (HC) VPH DNA Assay (Digene Corporation, EEUU) HC 1(distribuido en EU hasta HC 2 2004) Tipos virales: Bajo riesgo Alto riesgo 6, 11, 42, 43, 44 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56 6, 11, 42, 43, 44 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 Hibridación Microtubos en Baño María Captura Sustrato de detección: Microtubos de Captura Lumiphos 530 Microplacas de 96 pocillos en Microplate Heater Microplaca de Captura CDP-Star with Emerald II Volumen muestra en el ensayo: 150µl de muestra desnaturalizada de Cervical Sampler Biopsias Lectura: Luminómetro DCR-1, tubo a tubo Software Variabilidad calibradores (%CV) PC/NC Límite de detección (punto de corte = cut off) Agitación Marcado CE Controles de Calidad (QC) NO <30% Capacidad 60 test BR y AR: 24 muestras X 2 AR: 51 muestras 75µl de muestra desnaturalizada de Cervical Sampler Biopsias 4ml de ThinPrep 2.8 ml de SurePath Luminómetro DML2000, placa completa Versión 2 (DMS2) NC: 25% Cal HR/Cal LR: 15% >1.5 10pg/ml >2 1pg/ml (aprox. 5000 genomas/ensayo) Thermolyne NO No incluidos Rotary Shaker I SI Incluidos en el kit de reactivos: 1 QC LR (5pg/ml DNA) y 1 QC HR (5pg/ml DNA) 96 test BR y AR: 40 muestras X 2 AR: 88 muestras HC: Captura de Híbridos. En 362 muestras elegidas aleatoriamente, que habían sido procesadas previamente por HC 2 con sondas diferenciadas, se realizó la técnica de captura de híbridos pero utilizando una sonda única compuesta por una mezcla de las dos sondas de detección. Mediante esta técnica no se diferencia entre VPH de moderado-alto o bajo riesgo de 60 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos transformación celular, la técnica clasifica los resultados de VPH como detección de ADN positiva o negativa. Este ensayo se basa en la hibridación con sondas de ARN complementarias de la secuencia genómica de 13 tipos de VPH de alto riesgo oncogénico (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) y otra para la detección de cinco tipos de bajo riesgo (6, 11, 42, 43, 44). Las células cervicales se lisan en solución para liberar el ADN, el cual se desnaturalizó, y luego se incubaron con sondas de ARN en unas condiciones estrictas que permiten la formación del híbrido ARN-ADN. La estructura tridimensional específica de este híbrido la reconoce y captura un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina que está ligado a las paredes de un pozo de microplaca. Los híbridos inmovilizados se detectaron mediante adición de un sustrato que reacciona con la fosfatasa alcalina y produce fotones. La luz emitida se mide en un luminómetro y se expresa como unidad relativa de luz (RLU). La prueba de determinación del VPH mediante HC 2 VPH DNA Test, se realizó a partir de muestras cervicouterinas recogidas en HC Cervical Sampler (Digene Corporation, EEUU), compuesto por un escobillón cervical Digene y medio de transporte de muestra (Specimen Transport Médium, STM, Digene Corporation, EEUU). Se añadió a las muestras, calibradores y a los controles el reactivo de desnaturalización; una solución diluida de hidróxido de sodio (NaOH). El volumen necesario del reactivo de desnaturalización es equivalente a la mitad del volumen de la muestra (500 µl a las muestras cervicouterinas, 500 µl a los calibradores y control positivo y 1000 µl al control negativo). Se incubaron los tubos en un baño a 65 ± 2ºC durante 45 minutos. Método de cóctel de sondas combinadas Las muestras una vez desnaturalizadas se mezclaron en vortex® durante 5 segundos y se añadieron 75 µl de cada control, calibrador o muestras a los pocillos de la microplaca de hibridación. Se incubó durante 10 minutos a 25ºC. Se añadió 25 µl de cóctel de sondas combinadas a los pocillos de la microplaca de hibridación. Para la preparación del cóctel de sondas combinadas se prepararon las mezclas de sondas de VPH de bajo y alto riesgo y se añadió el contenido de la mezcla de la sonda de VPH de bajo riesgo diluida al tubo de la mezcla de la sonda de VPH de alto riesgo diluida. Se mezclaron agitando en vortex® durante 5 segundos. 61 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Para la preparación de la mezcla de sonda de VPH de bajo riesgo (preparada a partir de la sonda de VPH de bajo riesgo (sonda de ARN de VPH 6/11/42/42/44 en solución tampón) y los diluyentes de la sonda (solución tampón con 0.5 % p/v de azida sódica), se centrifugó el vial de la sonda de VPH de bajo riesgo. La cantidad de mezcla de la sonda que se necesita y la cantidad de diluyente de sonda necesario se calcula en función del número de test: Nº test volumen diluyente de sonda volumen de la sonda 48 2.0 ml 80.0 µl 24 1.0 ml 40.0 µl Se añadió la sonda de VPH de bajo riesgo al diluyente de sonda. Se agitó en vortex® durante 5 segundos para mezclar bien. La mezcla de la sonda de VPH de alto riesgo se prepara igual que la de bajo riesgo pero utilizando la sonda de VPH de alto riesgo (sonda de ARN de VPH 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 en solución tampón). Método de dos sondas La muestras una vez desnaturalizadas se mezclaron en vortex durante 5 segundos y se añadieron 75 µl a los pocillos LR (bajo riesgo) y 75 µl a los pocillos HR (alto riesgo) de la microplaca. Se incubó durante 10 minutos a 25ºC y se añadió 25 µl de mezcla de las sonda de VPH de bajo riesgo a los pocillos LR de la microplaca y 25 µl de mezcla de la sonda de VPH de alto riesgo a los pocillos HR de la microplaca. Se cubrió la microplaca con una tapa y se agitó en el agitador rotatorio I del sistema Hybrid capture a 1100 rpm durante 3 minutos. Cuando todos los pocillos presentaban una coloración amarilla significaba que se había producido la hibridación, en aquellos que no se había producido cambio de color se añadió 25 µl más de la sonda que correspondiese y se incubó a 65ºC durante una hora en el incubador de placas I. Para realizar la captura de híbridos, se traspasó el contenido de cada pocillo de la placa de hibridación al pocillo correspondiente en la microplaca de captura, recubierta con anticuerpos de híbridos anti-ARN: ADN. Se cubrió la placa con un sellador de placas. Se agitó en al agitador rotatorio I a 1100 rpm a 25 ºC durante una hora y transcurrido este tiempo, se decantó y secó la microplaca de captura. 62 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Posteriormente, para realizar la detección de los híbridos se añadió 75 µl del reactivo de detección 1 (anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina contra los híbridos de ARN: ADN en solución con azida sódica) a cada pocillo de la microplaca de captura. Se cubrió esta con sellador de placas y se incubó a 25ºC durante 30-45 minutos. Se procedió al lavado de la placa con un lavador automático de placas I (con tampón de lavado). A continuación se añadió 75 µl del reactivo de detección 2; CDP-Star con Emerald II (sustrato quimioluminiscente) a cada pocillo de la microplaca de captura y se incubó a 25 ºC durante 15-30 minutos. Finalmente se procedió a la lectura de la microplaca de captura en el luminómetro de microplacas Digene 2000 (DML 2000) después de los 15 minutos de incubación. El software DHCS V.2 calcula automáticamente los criterios de verificación y los verifica como válidos o no válidos. Una determinación de RLU igual o superior al valor de corte indica la presencia de secuencias de ADN de VPH en la muestra. Una determinación de RLU inferior al valor de corte indica la ausencia de secuencias de ADN de VPH ensayadas o bien, la presencia de niveles de ADN de VPH inferiores al límite de detección del ensayo. La sensibilidad de la técnica es de 1 picogramo (pg.) de ADN de VPH 16 clonado por ml de muestra, lo que equivale a 100.000 copias por ml de muestra ó 5000 copias por ensayo. El límite de detección para los distintos tipos de VPH incluidos en las sondas de alto y bajo riesgo según las instrucciones del fabricante varía entre 0.62-1.39 pg por ml de muestra, con un valor promedio de 1.09 equivalente a 109.000 copias. Amplificación del ADN de VPH y tipificación con enzimas de restricción (PVHfast®) En 477 muestras se utilizó amplificación mediante PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (ERpcr) (PVHfast® Pharmagen S.A), a partir de muestras previamente procesadas por HC 2, con dos sondas diferenciadas. El VPH se detecta amplificando una región del ADN del virus de unos 450pb dentro de la región L1 del marco de lectura (ORF) del mismo, siendo esta una región altamente conservada entre los VPH, aunque presenta un patrón de restricción característico para cada tipo de virus. 63 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Para tipar los diferentes VPH, se digiere el ADN amplificado anteriormente con enzimas de restricción. Las enzimas de restricción cortan en puntos específicos la secuencia de ADN. Si separamos estos fragmentos por su tamaño en gel de agarosa, cada tipo de virus presentará un patrón de bandas característico. La extracción del ADN de VPH se llevó a cabo a partir de las torundas utilizadas para la toma de la muestra de exudados de distintas zonas del tracto ano-genital. Cuando se iba a tardar más de 7-15 días en procesar las muestras, la alternativa para un buen funcionamiento de la técnica era el siguiente procedimiento: - Se añadió 1,5 ml de Suero Salino fisiológico (NaCl 0,95) al tubo que contenía la muestra. - Se agitó en vortex® durante 1 minuto. - Se decantó el sobrenadante en un tubo estéril de 1,5 ml. Se incluyó con cada serie de muestras un control negativo, constituido por un tubo con 1 ml de suero salino y se procesó igual que el resto de las muestras. - Se centrifugaron durante 10 minutos en una microcentrífuga a 12.000 rpm. - Mientras se centrifugaban las muestras, se descongelaban los tubos necesarios, según el número de muestras, de Solución de Digestión 2.0 y de Proteinasa K (nunca se usaron temperaturas superiores a 37ºC para la descongelación). - Se retiró el sobrenadante y se congeló el precipitado (“pellet”) hasta el procesamiento posterior de la muestra para la extracción del ADN. - Se añadió 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9%) al tubo que contenía la torunda y se agitó en el vortex durante 1 minuto. - La suspensión celular obtenida al vortear, se decantó en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugó durante 10 minutos en microcentrífuga a la máxima velocidad. - Se desechó el sobrenadante con ayuda de una micropipeta con cuidado de no arrastrar el precipitado de células o “pellet” y resuspender e precipitado en 50 µl de solución de digestión y 50 µl de proteinasa K. (Se incluyó un control negativo para cada serie de muestras, constituido por 1 ml de suero salino y fue procesado igual que el resto de las muestras) 64 Marta Domínguez-Gil González - Material y métodos Se incubaron los tubos que contenían el precipitado celular con la solución de digestión y la proteinasa K a 55-60ºC durante 2-3 horas. Los tubos se pusieron a hervir a 100ºC durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K. Se centrifugó en microcentrífuga durante 10 minutos a la máxima velocidad y se pasó el sobrenadante (ADN) a un tubo limpio para evitar contaminación del “pellet”. De este sobrenadante se cogió un alícuota de 5 µl para le reacción de amplificación, y es resto se guardó a -20ºC. Una vez que se extrajo el ADN se pasó a realizar la reacción de amplificación: Los tubos de reacción se han de mantener congelados a -20ºC y contienen la mezcla de reacción; constituida por la enzima Taq polimerasa, iniciadores para la síntesis del ADN, nucleótidos trifosfato, cloruro de magnesio y tampón; todos ellos elementos necesarios para que se produzca la amplificación. Se descongelaron tanto tubos de reacción como muestras procesadas durante unos segundos a 37ºC y se guardaron en hielo. Se añadieron 5 µl del ADN extraído de las muestras a cada tubo de amplificación. Los tubos que contienen la mezcla de reacción deben ser mantenidos en hielo hasta que son introducidos en el termociclador, con el fin de evitar amplificaciones inespecíficas. Estos tubos contienen un plásmido modificado que sirve como control interno de la reacción de amplificación, ya que se amplifica con los mismos cebadores que el VPH produciendo una banda a 1200pb. Además, el control interno presenta una diana para el enzima RsaI produciendo dos fragmentos de 550 y 650 pb, por lo que también es útil para monitorizar la digestión con los enzimas de restricción y la electroforesis. En cada reacción de amplificación se utilizaron dos tipos de controles: - Controles externos. Un control negativo procesado igual que el resto de las muestras (solución salina) y un control positivo (un ADN de VPH conocido) para comprobar que la banda obtenida en el gel de electroforesis corresponde con la banda del ADN del VPH. - Control Interno de la reacción de amplificación. 65 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos El termociclador utilizado fue Mastercycler Personal (Eppendorf®) que se programó del modo siguiente: Nº de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo (minutos) 1 94 4 35 94 48 72 72 0.5 1.5 2 10 1 Se programa 4ºC continuo hasta la recogida de los tubos para procesarlos. Después de la amplificación se visualiza el producto amplificado mediante una electroforesis en gel de agarosa de baja resolución al 2%: para ello se utilizó agarosa Sigma A-6013 de tipo I y como tampón de electroforesis TBE (Tris-Borato-EDTA). El gel resultó teñido con bromuro de etidio (BrEt) de una concentración de 10 mg/ml, para un gel de 100ml. Se añadió BrEt al buffer de electroforesis en una proporción de 10 µl por 500 ml de TBE. - Se cogieron 10 µl del producto amplificado y el resto del contenido del tubo se guardó a 4ºC para el genotipado del virus (en el caso de que las muestras sean positivas). - Se añadieron 2 µl de solución de carga (Azul de bromofenol), que actúa como colorante para marcar el frente de avance de la electroforesis, a los 10 µl de muestra. - Dicha mezcla se cargó en el gel (correr la electroforesis a 8 V para un gel de 10 cm. de largo) Una muestra será positiva para la presencia de VPH cuando aparezca una banda de 450pb correspondiente al genoma de VPH y además una banda de 1200pb correspondiente al control interno de amplificación. En muestras con un elevado número de copias de virus no se detectará esta banda correspondiente al control interno, ya que el amplificado de VPH compite con el del control interno. Una muestra será negativa para la presencia de VPH cuando aparezca solamente una banda de 1200pb correspondiente al 66 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos control interno. La reacción de amplificación de una muestra estará inhibida cuando no aparezca ninguna banda. La reacción de amplificación estará contaminada si en el control negativo aparece la banda de 450pb correspondiente al genoma del VPH. En los casos en los que la reacción de amplificación se inhibía, se realizó una nueva extracción a partir de la torunda inicial diluyéndola con solución salina. Si la reacción seguía inhibiéndose se pidió una nueva muestra. Las muestras que resultaron positivas fueron tipadas por digestión con enzimas de restricción. - Se utilizaron la enzima 1 (RsaI) y la enzima 2 que se mantuvieron almacenadas a -20ºC. Antes de añadirlas al tubo, se centrifugaron durante unos segundos. - Se añadió 1 µl de RsaI a los amplificados positivos resuspendiendo con la micropipeta. De aquí se pasaron 20 µl de la solución a otros tubos, a los que se les añadió 1 µl de la enzima 2 resuspendiendo de nuevo con la micropipeta (este segundo tubo contiene las dos enzimas). - Se incubaron todos los tubos en una estufa a 37ºC durante 2 horas. - Tras esta incubación, se procedió a la visualización de los resultados en un gel de agarosa de alta resolución. La detección del producto amplificado se realizó en agarosa de alta resolución, para ello, previamente se preparó el tampón para la electroforesis TBE 1x y a continuación se preparó el gel de agarosa de alta resolución al 2,5%. - Se pesaron 1,25 gr. de dicha agarosa y se añadió a 50 ml de tampón TBE 1x, a continuación se fundió la agarosa hasta su completa disolución. - Se dejó que se enfriara durante unos minutos y se le añadió 1µl de BrEt. - Los extremos de la bandeja de electroforesis se cerraron con cinta adhesiva. A continuación se colocó el peine para modelar los pocillos. Sobre esta base preparada se vertió la agarosa. Después se esperó de 15 a 30 minutos a que solidificara y se mantuvo a 4ºC durante 30 minutos para asegurar su consistencia. - Se rellenó la cubeta de electroforesis con TBE 1x añadiendo 10 µl de BrEt por cada 500 ml de tampón y se colocó el gel dentro de la misma. 67 Marta Domínguez-Gil González - Material y métodos Se cargó el marcador de peso molecular phiX174/Hae III (Promega) en el primer pocillo y en el resto de los pocillos se cargaron 15µl de cada muestra. Tanto a las muestras como a los marcadores se les añadieron 3µl de solución de carga (azul de bromofenol). Por último se añadió el marcador de peso molecular VIII en el último pocillo que presenta bandas de 114, 900, 692, 501, 489, 404, 320, 242, 190, 147, 124, 110, 67, 37, 34, 26 y 19pb. Después de llevar a cabo la electroforesis se visualizó el gel en un transiluminador de luz ultravioleta y se tomó la fotografía. Al haber incubado el amplificado de una muestra positiva para VPH con la enzima 1 y con la enzima 1+2, la banda de 450pb se digiere originando un patrón de bandas distinto según el tipo de VPH que se identifican observando los patrones de restricción establecidos que se muestran en la Tabla 3. Además del patrón de bandas del virus aparecen dos bandas de 550 y 650pb correspondientes a la digestión de la banda de 1200pb, del control interno (Figura 10). M M Figura 10. Ejemplo de un gel de agarosa en la que se muestran los genotipos de VPH encontrados en tres muestras de cérvix uterino, donde M representa el marcador de peso molecular; la muestra número 13 corresponde a un VPH genotipo 58, la muestra 14 es un VPH 18 y la muestra 18 es un VPH 31. 68 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos TABLA 3. Patrones de restricción para la enzima 1 y la enzima 1+ enzima 2 de los distintos genotipos de VPH que afectan mucosas. No se indican las bandas de 550 y 650 pb del control interno. GENOTIPOS DE VPH ENZIMA 1 ENZIMA 2 VPH 6 161,149,72,67 149,94,72,67,67 VPH 11 216,135,72,26 216,85,70,50,26,2 VPH 13 175,135,73,72 175,73,67,62,6 VPH 16 310,72,70 310,72,70 VPH 18 135,125,85,72,38 125,112,85,72,38 VPH 30 449 291,108,50 VPH 31 380,72 213,167,70,2 VPH 33 236,102,72,39 209,77,72,39,27 VPH 34 186,161,96,15 146,96,88,65,40 VPH 35 177,161,72,42 177,135,72,42 VPH 39 260,123,72 210,72,64,59 VPH 40 365,90 297,90,68 VPH 42 242,135,72 242,108,72,27 VPH 43 338,72,45 330,72,45,8 VPH 45 338,72,45 274,72,50,45 VPH 51 380,72 290,90,72 VPH 52 449 357,92 VPH 53 449 206,158,85 VPH 54 138,125,117,72 125,117,88,72 VPH 55 165,161,72,57 112,83,82,72,46 VPH 56 310,72,49,18 257,72,50,49,18 VPH 57 449 211,142,50,46 VPH 58 306,111,32 256,101,50,32 VPH 59 452 298,152,2 VPH 61 185,180,72,18 185,180,72,18 VPH 62 359,72,18 249,110,72,18 VPH 64 186,161,72,39 146,87,72,65,39 VPH 66 449 291,158 VPH 67 310,72,67 240,72,67,50,20 VPH 68 260,85,72,38 260,85,72,38 VPH 69 365,72,18 365,72,18 Inespecífica ADN genómico 450 aprox. (400) 235,147,85 Modificado de (32) 69 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Hibridación reversa en tira (INNO-LiPA VPH Genotyping CE®) En 404 muestras se comparó el resultado obtenido por HC 2 con dos sondas diferenciadas frente a los resultados obtenidos con una técnica de hibridación reversa en tira (Inno-Lipa VPH Genotyping CE®, Innogenetics). Es un ensayo de sondas en tira para uso diagnóstico in vitro, diseñado para la identificación de 16 genotipos distintos del VPH mediante la detección de secuencias específicas de la región L1 del genoma de VPH. Para realizar la extracción y amplificación a partir de raspados cervicales, en primer lugar se prepararon las alícuotas del Master Mix para la PCR Para preparar 30 tubos de PCR se añadieron los siguientes reactivos: Reactivos H2O (pura) Vol.(ul)-1 tubo Vol. (ul) – 30 tubos Concentración final 19.7 591 - PCR buffer (10x) 5 150 - dNTP (10 mM cada uno) 1 30 - MgCl2 (25mM)* 4 120 2mM Primers SPF10 10 300 - Taq Hot Stara (5U/ul) 0.3 9 1.5U Total 40 1200 Vol. Reacción 50 Se vorteó el mix y se prepararon alícuotas de en 30 tubos de PCR que posteriormente se congelaron a -20ºC en un ambiente libre de productos amplificados. Para la extracción del ADN vírico de VPH a partir de muestras cervicales (muestras procesadas previamente por Digene), se procedió en primer lugar a la purificación del ADN vírico mediante columnas (Wizard ® SV Genomic DNA Purification System, Promega). Se preparó previamente la solución de lavado (añadiendo al reactivo Wizard® SV Wash Solution, 312 ml de etanol 95%). 70 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Preparación de las muestras: - Transferimos un volumen de muestra que contenga aproximadamente 5x106 células a un tubo eppendorf® de 1,5 ml; que equivale a 250 µl de muestra. - Montamos las columnas; una por muestras y en cada una se añadió 150 µl de Solución tampón de lisis (Wizard SV Lysis buffer), mezclando con micropipeta. - Se centrifugó a 13000 rpm durante 3 minutos. El líquido que quedaba en el tubo de recogida se descartó. - Se añadió a cada columna 650 µl de Solución de lavado y se volvió a centrifugar a 13000 rpm durante 1 minuto, descartando nuevamente el líquido depositado en tubo de recogida. Este lavado se repitió cuatro veces. - Para secar la matriz de adhesión, en la que estaba retenido el ADN se volvió a centrifugar a 13000 rpm durante 2 minutos, pero esta vez sin la solución de lavado. - La parte superior de la columna en la que estaba contenida la matriz de adhesión se colocó en un tubo estéril de 1,5 ml. El tubo de recogida que completaba la columna se descartó. - Se añadió 200 µl de Nuclease-free-Water a cada uno de los tubos y se dejó incubar a temperatura ambiente dos minutos. - Posteriormente, se centrifugó la minicolumna insertada en el tubo de elusión a 13000 rpm durante 1 minuto. Tras esta operación la minicolumna se descartó, conservando el tubo de elución. - El ADN purificado se conservó a -20ºC hasta el momento de su procesamiento. Una vez purificado el ADN se procedió a su amplificación para ello se preparó la PCR Master Mix Master Mix; constituida por: PCR nucleotide Mix: N x 1 µl Primers: N x 10 µl Mgcl2: N x 4 µl PCR Buffer II 10X: N x 5 µl Ampli Taq Gold: N x 0,3 µl Agua estéril: N x 19,7 µl 71 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Siendo N= Número de muestras + Control Negativo + 1 Se dispensó 40 µl de la PCR a tubos estériles de 0,2 (un tubo por cada muestra a procesar y otro para el control negativo). - En cada tubo se añadió 10 µl del ADN purificado, añadiendo 10 µl de agua estéril al tubo correspondiente al control negativo. Se metieron las muestras en el Termociclador, programado según este protocolo: Nº de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo 1 94 9 min. 35 94 48 72 72 30 seg. 45 seg. 45 seg. 5 min. 1 Se mantuvo a 4ºC continuo hasta el momento de procesamiento de las muestras Se programaron 9 minutos a 94ºC para la activación de la Amplitaq Gold polimerasa, y 40 ciclos, incluyendo: 30 segundos a 94ºC de desnaturalización 45 segundos a 52ºC de annealing 45 segundos a 72ºC de extensión Por último se programó 5 minutos a 72ºC para la extensión final, y se mantuvo a finalmente a 4ºC hasta el momento de la retirada de los tubos Posteriormente, se llevó a cabo la desnaturalización del ADN; a partir de este paso, todas las reacciones se llevaron a cabo en el aparato INNO LIPA - Una vez terminada la amplificación se tomó la bandeja en la que se dispusieron las tiras de nitrocelulosa. - En el extremo de cada canal de la bandeja se añadió 10 µl de Solución de desnaturalización (SD). 72 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos - Se añadió sobre la gota de SD, 10µl del ADN amplificado (una muestra en cada uno de los canales) - Se colocó una tira de nitrocelulosa por muestra, cuidando de que la tira no tocase la muestra con la SD. - Se colocó la bandeja en el aparato INNO LIPA y a partir de aquí el proceso fue automático En la Figura 11 se muestra la posición de las distintas sondas de oligonucleótidos en las tiras de INNO-LiPA VPH Genotyping CE®. Una banda se consideró positiva si aparecía una banda de color morado o marrón al final del ensayo. Figura 11. Ubicación de las sondas específicas de una tira de INNO-LiPA VPH Genotyping CE®. En la parte superior de la tira hay una línea roja para su orientación - La primera banda después de la línea roja es la banda de control de conjugado que controla la adición de solución de conjugado y de solución de sustrato durante el procedimiento de detección. Debe ser siempre positiva y tener aproximadamente la misma intensidad en cada tira de un mismo ensayo. - Una muestra se considera VPH positiva si al menos una de las bandas específicas de tipo o una de las bandas de control de VPH es positiva. - Se incluyó siempre un control de ensayo positivo: el control de amplificación positivo incluido en el kit de amplificación INNO-LiPA VPH Genotyping CE®. - El control positivo contiene VPH6 y debe reaccionar en las siguientes bandas: control de conjugado, control 1 de VPH y banda 1 (VPH6). - Se incluyó siempre un control de ensayo negativo; debe ser preferiblemente una muestra negativa procesada simultáneamente con las muestras estudiadas en la extracción de ADN y en la etapa de PCR. 73 Marta Domínguez-Gil González - Material y métodos Si se obtenía una banda positiva para el control negativo en el ensayo LiPA, se descartó todo el ensayo y se repitió el procedimiento completo. Todas las bandas claramente visibles se clasificaron utilizando la tarjeta de lectura de INNO-LiPA VPH Genotyping CE® Los patrones de bandas deben compararse con el diagrama de interpretación de INNO-LiPA VPH Genotyping CE® suministrado con el kit. Este diagrama marca las bandas positivas (filas) para los distintos tipos de VPH (columnas) con una “X”. Diagrama de interpretación de INNO LiPA Genotyping CE® Aquellas muestras para las que el patrón de bandas obtenido no podía asignarse a ningún patrón de genotipo, o aquellas que no tenían bandas específicas de tipo (bandas 117), pero al menos tenían una banda de control positiva de VPH, se clasificaron como VPH positivas, pero de genotipo no identificable (VPH X). Cuando había reactividad en todas las bandas de sonda, se consideró como no interpretable (Figura 12). 74 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Figura 12. Genotipificación de VPH en muestras de cérvix uterino evaluadas mediante hibridación reversa en tira: tira 1: VPH 16/18/35/45; tira 2 VPH 16/18/45/58; tira 3 VPH 31/33/44; tira 4 VPH 16; tira 5 VPH 16/18/31/45; tira 6 VPH 16/18; tira 7 VPH X y tira 8 VPH 18 Genotipado de VPH mediante identificación genómica para diagnóstico in vitro, mediante Clinical Arrays papilomavirus humano En 355 muestras se utilizó microarrays (Clinical Arrays Papillomavirus®, Genomica) a partir de muestras previamente procesadas por HC 2, con dos sondas diferenciadas. La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento de unos 450 pb dentro de la región L1 del virus. La detección del producto amplificado se lleva a 75 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos cabo mediante una nueva plataforma tecnológica basada en microarrays de baja densidad. En primer lugar, se procedió a la extracción del ADN, para ello se comenzó con la preparación de la muestra, en función de si se trataba de un frotis realizado con un hisopo sin medio de transporte o bien de una suspensión. Frotis: - Se añadió 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9%) al tubo que contenía la torunda y se agitó en vortex® durante 1 minuto. - Se decantó el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml estéril. En cada serie se incluyó un control negativo, constituido por un tubo con 1 ml de suero salino y se procesó igual que el resto de las muestras. - Las muestras y el control negativo se centrifugaron durante 10 minutos en una microcentrífuga a 12.000 rpm y se retiró con una micropipeta los restos de líquido, cuidando de no llevarse el precipitado. - Se resuspendieron en 180 µl de Solución T1 y se transfirió a un tubo estéril de 1,5 ml. Suspensiones celulares: - Se agitó la muestra invirtiendo varias veces el vial en el que está contenida y se pasó 1 ml a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml. En cada serie se incluyó un control negativo, constituido por un tubo con 1 ml de suero salino y se procesó igual que el resto de las muestras. - Se centrifugaron las muestras durante 10 minutos en una microcentrífuga a 12.000 rpm y se retiró con una micropipeta los restos de líquido, cuidando de no llevarse el precipitado. - Se resuspendió el precipitado con 1 ml de agua destilada estéril. - Se centrifugaron las muestras durante 10 minutos en una microcentrífuga a 12.000 rpm y se retiró con una micropipeta los restos de líquido, cuidando de no llevarse el precipitado 76 Marta Domínguez-Gil González - Material y métodos Se resuspendieron en 180 µl de Solución T1 y se transfirió a un tubo estéril de 1,5 ml. A partir de este paso, todas las muestras fueron tratadas de la misma manera, de acuerdo con el siguiente protocolo: - Se añadió 25 µl de la solución de Proteinasa K y se mezcló en vortex. - Se incubó a 56 ºC (1-3 horas) en un termobloque (Thermomixer comfort®, Eppendorf) con agitación, para que la muestra se lisara completamente. - Se añadió 200 µl de Solución B3 a cada muestra y se mezcló en vortex e incubó a 70ºC durante 10 minutos. - Se añadió 210 µl de etanol 96% a cada muestra y se agitó en vortex®. - Se preparó una columna de purificación por muestra y se colocó en un tubo de recogida de 2 ml. Las muestras se añadieron y se centrifugaron durante 1 minuto a 12.000 rpm. Si el líquido no había atravesado completamente la membrana, se volvía a centrifugar. Y se descartó el fluido filtrado. - Se añadió 500 µl de la Solución BW a la columna y se centrifugó a 12.000 rpm durante 1 minuto, para posteriormente descartar el fluido filtrado. - Se añadió 600 µl de Solución B5 a la columna y se centrifugó a 12.000 rpm durante 1 minuto y se descartó el fluido filtrado. - La columna se reinsertó en el tubo de recogida y se centrifugó a 12000 rpm durante 1 minuto para eliminar los restos de la solución B5. - Finalmente, se colocó en un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml y se procedió a eluir el ADN con 100 µl de la Solución BE (previamente calentada a 70ºC), y se incubó esta solución en la columna a temperatura ambiente durante 1 minuto. Posteriormente, se centrifugó a 12000 rpm durante 1 minuto. - Se recuperó el filtrado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se utilizaron 5 µl para la reacción de amplificación y el resto se congeló a -20ºC. 77 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos A continuación se realizó la reacción de amplificación: - Se descongeló un tubo de reacción por cada muestra y se mantuvieron en hielo. - Se añadió 5 µl del ADN extraído de las muestras a los tubos de reacción y se resuspendió varias veces con la micropipeta. Se dejaron los tubos en hielo. - Se programó el termociclador de la siguiente manera: Nº de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo (minutos) 1 95 9 45 94 55 72 0.5 1 1.5 1 72 8 Se mantuvo al terminar 20 ºC continuo hasta la recogida de los tubos - Cuando el bloque había sobrepasado los 90 ºC (para minimizar las posibles amplificaciones inespecíficas) se colocaron los tubos de reacción en el termociclador y se arrancó el programa. Finalmente, para la visualización del producto amplificado: - Se colocan los tubos amplificados en el termociclador a 95ºC durante 10 minutos para la desnaturalización. - Se añadieron 300 µl de tampón de lavado diluido, preparada con 3 ml del tampón y 27 ml de agua destilada, a cada tubo AT (un tubo de ensayo tipo eppendorf que contiene en la parte inferior un microarray de baja densidad). Con este paso se lograba tener los tubos AT limpios antes de añadir la muestra. - Una vez desnaturalizados los productos de PCR, se añadió 100 µl de la solución de hibridación a cada tubo AT. - Añadir 5 µl de producto de PCR desnaturalizado al tubo AT, resuspendiendo varias veces. 78 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos - Se incubó en termobloque 1 hora a 55 ºC, agitando a 550 rpm. - Se desechó la solución de hibridación mediante una bomba de vacío. - Se añadió 300 µl de tampón de lavado diluido a cada tubo AT invirtiendo cada uno 5-10 veces y se desechó la solución de lavado mediante vacío. - Se preparó la solución de conjugado diluida: 100 µl de diluyente de conjugado con 0.75 µl de conjugado por cada tubo AT. Se añadió a cada tubo 100 µl de esta solución y se incubó durante 15 minutos a 30 ºC, agitando a 550 rpm. - Se desechó la solución del tubo AT a vacío. - Añadimos 300 µl de la solución de lavado a cada tubo AT invirtiendo 5-10 veces y se volvió a desechar esta solución mediante vació. - Finalmente, se realiza un último lavado añadiendo 300 µl de solución de lavado a cada tubo invirtiendo de 5-10 veces y desechar mediante vació. - Para proceder al revelado se añadió 100 µl de solución de revelado a cada tubo AT e incubar 10 minutos a 25 ºC en el termobloque sin agitación. Una vez añadida la solución de revelado, se esperó 10 minutos y comenzó la lectura, directamente con la solución de revelado, en el equipo de lectura (lector de tubos AT; fabricado por CLONDIAG Chip Tecnologies GmbH para uso con los kits de diagnóstico in vitro de GENOMICA). El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de forma automática. El equipo de lectura y análisis presenta un informe en el que se indican los resultados. El Software que utiliza es específico para CLINICAL ARRAYS® Papillomavirus Humano, fabricado por CLONDIAG Chip Tecnologies GMBH, instalado y listo para su uso. En la pantalla del equipo aparece una tabla de tres columnas, en la columna de la izquierda aparecen los genotipos de VPH, en la de centro, positivo o negativo para cada genotipo de virus y en la de la derecha aparecerá la conformidad de los controles de ADN y de amplificación. En la Figura 13 se muestra una imagen del resultado del informe obtenido mediante microarrays y un Array tube utilizado para llevar a cabo esta reacción. 79 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Figura 13. Imagen del Genotipo VPH 16 detectado mediante microarrays e imagen de un Array Tube (AT) en el que se puede apreciar en la parte inferior un microarray de baja densidad . Procedimientos Cribado de VPH por Hibridación con sondas diferenciadas Mediante hibridación de ácidos nucleicos para la detección del ADN de VPH, por la técnica Hybrid Capture® (HC) con dos sondas diferenciadas; se analizaron 4375 muestras, entre los años 1996 a 2006. Durante el año 1996 y hasta junio de 1998 se utilizó la tecnológica HC 1, y a partir de junio de ese mismo año se comenzó con HC 2. Se estudió el porcentaje de positividad de VPH entre 1996-2006 y se determinó la relación existente entre el número de determinaciones de VPH y el número de resultados positivos. Se analizó la Razón de prevalencias (RP) de las muestras positivas para determinar si existían diferencias significativas respecto al número de muestras positivas y ver si existía tendencia lineal del número de resultados positivos para VPH durante los once años que abarcaba el estudio. También se estudio la RP de los diferentes grupos etarios y en función de la edad del paciente en los que se detectó VPH, para ver si existían diferencias significativas y si 80 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos existía o no tendencia lineal entre el número de VPH positivos y la edad y el sexo del paciente. La distribución de resultados de acuerdo con los hallazgos obtenidos del VPH asociados a riesgo de transformación celular, permitió obtener tres tipos de resultados para VPH. Unos que presentaban positividad en la prueba de hibridación con sonda correspondiente a los VPH asociados a moderado-alto riesgo de transformación celular, otros en los que se detectó únicamente VPH de bajo riesgo y finalmente, un tercer grupo en el que se detectó simultáneamente VPH de moderado-alto riesgo y VPH de bajo riesgo. Se estudió la evolución anual de resultados positivos en función del tipo de VPH detectado: VPH de alto riesgo oncogénico (VPH AR), VPH de bajo riesgo (BR) o ambos grupos (VPH AR y BR), para determinar si existía incremento anual y observar la evolución temporal de los mismos. Se consideraron por una parte las muestras en las que se detectó ADN de VPH AR, ya fuese solo o acompañado de VPH de BR y por otra parte las muestras en las que se detectó ADN de VPH BR Se relacionó el resultado obtenido en el diagnóstico de VPH en función del riesgo de transformación celular, según la edad del paciente. Cribado de VPH por Hibridación con sonda única En 362 muestras elegidas aleatoriamente, que fueron procesadas previamente por la técnica de captura de híbridos (HC) con sondas diferenciadas, se realizó HC pero utilizando una sonda única compuesta por una mezcla de las dos sondas de detección. Mediante esta técnica no se diferencia entre VPH AR o BR de transformación celular, la técnica clasifica los resultados de VPH como detección de ADN positiva o negativa. Se compararon los resultados de detección de VPH al utilizar sondas diferenciadas y sonda única, para ver si existían discordancias de resultados entre las muestras analizadas. Las discordancias observadas al utilizar ambas técnicas se estudiaron posteriormente, se analizaron las reactividades obtenidas en la detección de VPH y se analizaron por otras técnicas de detección y genotipado (Microarrays y LiPA). 81 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Confirmación e identificación de VPH positivos en la prueba de cribado Confirmación de VPH mediante amplificación por PCR y posterior digestión con enzimas de restricción En 504 muestras se utilizó amplificación mediante PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (ERpcr) (PVHfast® Pharmagen S.A), a partir de muestras previamente procesadas por HC 2, con dos sondas diferenciadas. Se comparó los resultados al analizar las muestras por ambos tipos de técnicas y se calculó la sensibilidad y especificidad de PCR, así como los VPP y VPN. También se analizaron los resultados obtenidos por HC 2 y los obtenidos por ERpcr, comparando aquellos en los que por HC 2 el resultado había sido VPH de AR, o BR o ambos grupos. Se calculó la sensibilidad, especificidad, el VPP, el VPN, así como la prevalencia y las razones de verosimilitud positiva y negativa de la ERpcr para detectar VPH de AR, de BR y mixtas. Confirmación de VPH mediante Hibridación reversa en tira (Inno-LiPA VPH Genotyping CE®) En 413 muestras se comparó el resultado obtenido por HC 2 con dos sondas diferenciadas frente a los resultados obtenidos con una técnica de hibridación reversa en tira (Inno-Lipa VPH Genotyping CE®, Innogenetics). Se analizaron los valores de sensibilidad y especificidad, valores predictivos positivo y negativo (VPP y VPN) de la técnica LiPA como técnica de cribado. También se analizaron los resultados obtenidos por HC 2 y los obtenidos por LiPA, comparando aquellos en los que por HC 2 el resultado había sido VPH AR, o BR o ambos grupos. Se calculó la sensibilidad, especificidad, el VPP, el VPN, así como la prevalencia y las razones de verosimilitud positiva y negativa del LiPA para detectar VPH AR, BR y mixtas. 82 Marta Domínguez-Gil González Confirmación de Papillomavirus®) Material y métodos VPH mediante Microarrays (Clinical Arrays En 377 muestras se utilizó Microarrays (Clinical Arrays Papillomavirus®, Genomica) a partir de muestras previamente procesadas por HC 2, con dos sondas diferenciadas. Se comparó los resultados al analizar las muestras por ambos tipos de técnicas y se calculó la sensibilidad y especificidad de los Microarrays, así como los VPP y VPN. También se analizaron los resultados obtenidos por HC 2 y los obtenidos por Microarrays, comparando aquellos en los que por HC 2 el resultado había sido VPH AR, o BR o ambos grupos. Se calculó la sensibilidad, especificidad, el VPP, el VPN, así como la prevalencia y las razones de verosimilitud positiva y negativa de los Microarrays, para detectar VPH AR, BR y mixtas. Genotipado de VPH por amplificación con PCR y posterior digestión con enzimas de restricción En las 236 muestras en las que se detectó ADN de VPH mediante ERpcr se procedió a determinar el genotipo de VPH mediante el empleo de enzimas de restricción. Se estudiaron los genotipos de VPH que se detectaban con mayor frecuencia al emplear esta técnica de detección y genotipado, y la evolución anual de los genotipos de VPH detectados. También se analizaron la coinfecciones por más de un genotipo de VPH que se detectaron por esta ERpcr. Genotipado de VPH por LiPA En las 207 muestras en las que se detectó ADN de VPH mediante LiPA se procedió a determinar el genotipo de VPH. Se estudiaron los genotipos de VPH que se detectaban con mayor frecuencia al emplear esta técnica de detección y genotipado, y la evolución anual de los genotipos de VPH detectados. También se analizaron la coinfecciones por más de un genotipo de VPH que se detectaron por LiPA. 83 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos Genotipado de VPH por Microarrays En las 188 muestras en las que se detectó ADN de VPH mediante Microarrays se procedió a determinar el genotipo de VPH. Se estudiaron los genotipos de VPH que se detectaban con mayor frecuencia al emplear esta técnica de detección y genotipado, y la evolución anual de los genotipos de VPH detectados. También se analizaron la coinfecciones por más de un genotipo de VPH que se detectaron por Microarrays. Genotipado GLOBAL de VPH En total se genotiparon 436 muestras, en las que se detectó ADN de VPH mediante cualquiera de las tres técnicas empleadas (ERpcr, LiPA y/o Microarrays). Se estudiaron los genotipos de VPH que se detectaban con mayor frecuencia al emplear las distintas técnicas de detección y genotipado, y la evolución anual de los genotipos de VPH detectados. También se analizaron la coinfecciones por más de un genotipo de VPH que se detectaron por alguna de las técnicas empleadas. Concordancia para la detección de los distintos genotipos de VPH mediante LiPA, Microarrays y Erpcr Se realizó el calculo de concordancia, para las distintas técnicas, para poder expresar el porcentaje de acuerdo que existía entre ellas y determinar en que medida hubo coincidencia en la clasificación entre las técnicas de detección en relación al total de VPH genotipados. Para poder cuantificar el grado de acuerdo, una vez eliminada la parte que puede atribuirse al azar, se procedió a determinar el Índice Kappa (Concordancia no debida al azar). Se consideró que un valor de Kappa podía considerarse como indicador de una concordancia aceptable, si era mayor o igual a 0.4 y excelente si era superior a 0.75. Cuando el valor de Kappa alcanzaba su máximo valor, suponía una total coincidencia entre las técnicas y por tanto el acuerdo observado era del 100%. Se estudió la concordancia observada y los índices Kappa (con sus valores máximo y mínimo; Ikm e IkM: valores teóricos extremos que podría tomar el índice Kappa teniendo en cuenta el número de test realizados y la prevalencia observada) para la detección de los genotipos de VPH detectados con mayor frecuencia (VPH 16, VPH 6, 84 Marta Domínguez-Gil González Material y métodos VPH 11, VPH 18, VPH 31, VPH 42, VPH 51, VPH 53 y VPH 58). Se consideró la concordancia observada como el porcentaje de resultados en los que las dos pruebas coinciden. Se analizó la concordancia observada entre LiPA y Microarrays para los distintos genotipos de VPH detectados con mayor frecuencia, la concordancia entre LiPA y ERpcr, y entre ERpcr y Microarrays, y finalmente la concordancia entre las tres técnicas de detección y genotipado empleadas en este estudio. Calculo de resultados y análisis estadístico Para el almacenamiento de los datos y el cálculo de frecuencias de las distintas variables se utilizó la hoja de cálculo Microsoft Excel 97. El cálculo de los intervalos de confianza y de la significación estadística al comparar proporciones mediante cuadrado y el cálculo de los valores de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y razones de verosimilitud, así como sus intervalos de confianza se realizó mediante el programa estadístico SPSS para Windows versión 12. 85 Resultados Marta Domínguez-Gil González Resultados Demanda analítica de detección de VPH Evolución de la demanda y tipos de muestras En este trabajo, entre los años 1996 a 2006, se han procesado para detección de VPH; 4375 muestras genitales o de otra localización, correspondientes a 3978 pacientes, recibidas en el Laboratorio de Virología del HCUV. La evolución anual del número de peticiones para detección de VPH al HCUV, durante los once años que abarca el estudio, se muestra en la Figura 14. El total de 4375 determinaciones realizadas desde 1996 a 2006, supone una media de 397.7 determinaciones por año, 33.1 determinaciones mensuales y 1.1 por día, durante el periodo global de 11 años. La gráfica muestra un incremento constante distribuido en tres periodos distintos. Un primer periodo que abarca los años 1996 a 2001, un segundo periodo de 2001 a 2004 y por último un tercer periodo de 2004 a 2006. Desde 1996 a 2001 la demanda sube desde 3 a 528 peticiones anuales, lo que supone un incremento anual de 109.3 muestras (p<0.001), con una bondad de ajuste del 98,4%, posteriormente oscila entre 528 y 425 durante los años 2001 a 2004, lo que supone un incremento anual (decremento) de -34.4 muestras (p=0.06) y una bondad de ajuste de 83.4%. Finalmente, en los últimos años del estudio pasa de 425 a 799 muestras al año, suponiendo un incremento anual de 187 muestras (p=0.08) y una bondad de ajuste de 96.7%. 87 Figura 14. Evolución anual de peticiones para detección de VPH. Marta Domínguez-Gil González Resultados Al analizar el tipo de muestra que fue remitida para su posterior análisis se observó la presencia de diferentes modalidades de muestras. La mayor parte correspondieron a muestras genitales, siendo la mayoría de frotis de cérvix uterino: 4307 (98.4%, IC95%:98.0%-97.9%). También se analizaron otros tipos de muestras, aunque en mucha menor proporción, como frotis uretrales (1.1%), exudados uretrales (0.3%), biopsias (0.1%), frotis de mucosa oral (0.02%) y líquido prostático (0.02%). En la Tabla 4 se reflejan los porcentajes de los distintos tipos de muestras analizadas para el diagnóstico de VPH, durante los años de estudio. Al analizar las muestras de frotis de cérvix uterino (FCU) remitidas para la detección de VPH se observó que entre los años 1996 a 2001 la demanda sube de 3 a 522, lo que supone un incremento de 107.7 muestras de FCU al año (p<0.001) con una bondad de ajuste del 98.5%. Entre 2001 a 2004, pasa de 522 a 416, siendo el incremento anual (decremento) de -33.0 muestras (p=0.05) con una bondad de ajuste de 85.2%. Finalmente, entre 2004 a 2006, las muestras de FCU recibidas pasaron de 416 a 787, suponiendo un incremento anual de 185.5 muestras de FCU (p=0.09). Respecto a las muestras uretrales (frotis y exudados) remitidas para la detección de VPH, incluyendo todo el periodo de estudio se observó un incremento anual de 1.17 muestras (p<0.001) con una bondad de ajuste de 82.9% y al analizar los otros tipos de muestras (biopsias, frotis oral y líquido prostático) solamente supuso un incremento anual de 0.13 muestras (p=0.117) con una bondad de ajuste de 16.7 89 TABLA 4. Distribución anual de tipos de muestras analizadas para detección de VPH. AÑO N F Cx % F Ur % Ex Ur % OTRAS % 1996 3 3 100 0 0 0 0 0 0 1997 90 90 100 0 0 0 0 0 0 1998 211 210 99.5 1 0.5 0 0 0 0 1999 287 283 98.6 3 1.0 1 0.3 0 0 2000 465 457 98.3 6 1.3 2 0.4 0 0 2001 528 522 98.9 2 0.4 2 0.4 2 0.4 2002 506 500 98.8 3 0.6 1 0.2 2 0.4 2003 491 482 98.2 3 0.6 5 1.0 1 0.2 2004 425 416 97.8 7 1.6 1 0.2 1 0.2 2005 570 557 97.7 11 1.9 0 0 2 0.4 2006 799 787 98.5 11 1.4 1 0.1 0 0 TOTAL 4375 4307 98.4 47 1.1 13 0.3 8 0.2 *FCx: Frotis Cérvix Uterino; FUr: Frotis Uretral; ExUr: Exudado Uretral; Otras: Biopsia, Frotis Oral y Líquido Prostático Marta Domínguez-Gil González Resultados Variables de persona y procedencia clínica La distribución de los pacientes por grupos de edad aparece representada en la Figura 15. La clasificación etaria de estos pacientes se realizó en cinco grupos: menores de 25 años, de 25-34 años, 35-44 años, 45-54 años y mayores de 54 años. Al analizar los volantes de petición se observó que en 3266 (74.7%) de las mismas figuraba la edad del paciente, mientras que en 1109 peticiones (25.3%) no se dispuso de esta información. Se obtuvo una media de edad de 36.3 años (DE: 40.3; mediana: 35), para las muestras analizadas con edad reseñada en el volante. La distribución de las peticiones realizadas en función del sexo del paciente mostró un porcentaje mucho mayor de muestras pertenecientes a mujeres que a varones. La distribución anual de peticiones de detección de VPH en función del sexo se representa en la Figura 16. Un total de 4313 de las peticiones correspondían a mujeres, y 62 peticiones a varones, 98.6% (IC95%:98.2-99.1) y 1.4% (IC95%:1.0-1.9), respectivamente. Al analizar la distribución de muestras procedentes de mujeres se observó que en el primer periodo (1996-2001) suponía un incremento anual de 108.0 muestras (p<0.001) con una bondad de ajuste del 98.5%, en el segundo periodo (2001-2004) supuso un incremento anual de -34.0 muestras (p=0.05) y una bondad de ajuste del 85.7%), y por último en el tercer periodo que abarcaba de 2004 a 2006, se observó un incremento anual de 185.0 muestras de mujeres (p=0.09) y una bondad de ajuste de 96.1%. Respecto a las muestras procedente de varones, y analizando todo el periodo que abarca el estudio (1996-2006), el incremento anual de muestras para detección de VPH, únicamente fue de 1.25 muestras (p<0.001), y una bondad de ajuste de 81.6%. 91 Figura 15. Distribución etaria de peticiones para detección de VPH 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 MUJERES 3 90 210 283 457 524 502 483 417 557 787 HOMBRES 0 0 1 4 8 4 4 8 8 13 12 Figura 16. Evolución anual de peticiones para detección de VPH en función del sexo. Marta Domínguez-Gil González Resultados La distribución anual de muestras analizadas en función de su procedencia queda reflejada en la Tabla 5. Las mismas se agruparon en siete categorías, de mayor a menor cantidad de muestras. En primer lugar las muestras procedentes de Atención Ginecológica del Servicio Territorial de Sanidad de Valladolid (AGSTS), a continuación las del Hospital Clínico Universitario de Valladolid (HCUV), después aquellas procedentes del Hospital Universitario del Río Hortega (HURH), de Centros de Salud del Área Sanitaria que abarca el HCUV (CS), de la Asociación Castellano Leonesa de Ayuda al Drogodependiente (ACLAD), del Hospital de Medina del Campo (HMC) y del Servicio Territorial de Sanidad de Ávila (SA). En función de la procedencia de las muestras el porcentaje de peticiones de diagnóstico de VPH se distribuyó de la siguiente manera: 28.8% AGSTS, 28.7% HUCV, 22.2% HURH, 10.3% CS, 7.0% ACLAD, 1.7% HMC y 1.3% SA. La evolución de peticiones para detección de VPH según la procedencia es distinta en las muestras procedentes de los tres hospitales de Valladolid (Figura 17) y las de procedencia extrahospitalaria (Figura 18). Las muestras procedentes del HCUV muestran un paralelismo con la evolución general anual de la Figura 11, observándose un incremento paulatino en las muestras procedentes del HRH que siguen en los últimos tres años a las del HCUV. En las muestras de procedencia extrahospitalaria se observa la desaparición de muestras procedentes de AGSTS en el 2004 y el paulatino incremento de demanda analítica de CS desde dicho año hasta el 2006. 94 TABLA 5. Distribución anual de muestras analizadas para detección de VPH en función de su procedencia 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 TOTAL % Procedencia AGSTS - 39 136 146 208 256 249 223 1 1 - 1259 28.8 HCUV 3 45 63 102 149 140 116 143 135 147 211 1254 28.7 HURH - - 4 24 29 42 63 55 152 249 355 973 22.2 CS - 6 8 15 34 31 17 29 65 109 137 451 10.3 ACLAD - - - - 42 41 37 31 61 36 60 308 7.0 HMC - - - - - - - - 10 28 36 74 1.7 SA - - - - 3 18 24 10 1 - - 56 1.3 TOTAL 3 90 211 287 465 528 506 491 425 570 799 4375 100.0% Año VPH: Virus del Papiloma Humano; AGSTS: Atención Ginecológica del Servicio Territorial de Sanidad de Valladolid; HCUV: Hospital Clínico Universitario de Valladolid; HURH: Hospital Universitario del Río Hortega; CS: Centros de Salud del Área Sanitaria que abarca el HCUV; ACLAD: Asociación Castellano Leonesa de Ayuda al Drogodependiente; HMC: Hospital de Medina del Campo; SA: Servicio Territorial de Sanidad de Ávila. Marta Domínguez-Gil González Resultados 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1996 1998 2000 HCUV 2002 HURH 2004 2006 HMC Figura 17. Evolución anual de peticiones para detección de VPH (Procedencia Hospitalaria). HUCV: Hospital Clínico Universitario de Valladolid; HURH: Hospital Universitario del “Río Hortega”; HMC: Hospital de Medina del Campo (Valladolid) 300 250 200 150 100 50 0 1996 1998 2000 CS AGSTS 2002 SA 2004 2006 ACLAD Figura 18. Evolución anual de peticiones para detección de VPH (Procedencia Extrahospitalaria). CS: Centros de Salud del Área Sanitaria que abarca el HCUV; AGSTS: Atención Ginecológica del Servicio Territorial de Sanidad de Valladolid; SA: Servicio Territorial de Sanidad de Ávila; ACLAD: Asociación Castellano Leonesa de Ayuda al Drogodependiente. 96 Marta Domínguez-Gil González Resultados Cribado de VPH por Hibridación con sondas diferenciadas De las 4375 muestras analizadas, mediante hibridación de ácidos nucleicos para la detección del ADN de VPH, por la técnica Hybrid Capture® (HC) con dos sondas diferenciadas; en total 1815 (41.5%; IC95%:38.3-44.7) muestras fueron positivas para algún VPH y 2560 (58.5%; IC95%:55.3-61.7) fueron negativas. Los resultados globales de la detección de VPH por el método de cribado (HC), se resumen en la Tabla 6 y Figura 19. En la Tabla 6 se recogen los porcentajes de positividad de detección de VPH de las muestras analizadas. La relación entre el número de determinaciones de VPH y el número de resultados positivos se refleja en la Figura 19. Se obtuvieron 1815 resultados positivos para VPH, lo que supone una media de 165 resultados de VPH positivos por año. 97 TABLA 6. Porcentajes de positividad en muestras clínicas analizadas frente a VPH entre 1996-2006. AÑO N NEGATIVAS % POSITIVAS % 1996 3 2 66.7 1 33.3 1997 90 48 53.3 42 46.7 1998 211 123 58.3 88 41.7 1999 287 155 54.0 132 46.0 2000 465 254 54.6 211 45.4 2001 528 309 58.5 219 41.5 2002 506 329 65.0 177 35.0 2003 491 322 65.6 169 34.4 2004 425 271 63.8 154 36.2 2005 570 336 59.0 234 41.1 2006 799 411 51.4 388 48.6 TOTAL 4375 2560 58.5 1815 41.5 N: Número de peticiones para detección de VPH 900 800 700 600 500 48.6% 400 300 45.4% 41.5% 35.0% 200 34.4% 46.0% 46.6% 100 36.2% 41.1% % 41.7% 33.3% 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Nº de peticiones 2002 2003 2004 Nº de muestras positivas Figura 19. Relación entre el número de determinaciones de VPH y el número de resultados positivos. 2005 2006 Marta Domínguez-Gil González Resultados Al analizar la razón de prevalencias (RP) de muestras positivas (excluido el año 1996) se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 7): TABLA 7. Razón de prevalencias e IC durante 1997-2006. 95% de las muestras positivas para VPH AÑO Prevalencia RP 1997 0.4667 (46.7%) 1.0000 1998 0.4171 (41.7%) 0.8937 0.6806-1.1736 1999 0.4599 (45.9%) 0.9856 0.7645-1.2705 2000 0.4538 (45.4%) 0.9724 0.7631-1.2390 2001 0.4148 (41.5%) 0.8888 0.6971-1.1333 2002 0.3498 (34.9%) 0.7496 0.5833-0.9632 2003 0.3442 (34.4%) 0.7376 0.5731-0.9493 2004 0.3624 (36.2%) 0.7765 0.6021-1.0013 2005 0.4105 (41.1%) 0.8797 0.6908-1.1203 2006 0.4856 (48.6%) 1.0406 0.8250-1.3124 IC 95% RP: Razón de prevalencias; IC: Intervalo de confianza Únicamente se observaron diferencias estadísticamente significativas en los años 2002 y 2003, mientras que en el resto de los años que abarca el estudio no existen diferencias significativas respecto al número de muestras positivas. Al analizar la tendencia lineal del número de muestras positivas durante los once años que abarca el estudio se obtuvo una p=0.6418, por lo que no hay tendencia lineal del número de resultados positivos para VPH, tal y como puede observarse en la gráfica (Figura 20). 100 100 90 Porcentaje positivos Porcentaje negativos Lineal (Porcentaje positivos) 80 y = -0,0327x + 59,305 2 R = 0,0004 70 Muestras 60 50 40 30 20 10 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Año Figura 20. Representación de la tendencia de las muestras positivas para VPH durante los años de estudio (1996-2006). 2006 Marta Domínguez-Gil González Resultados En la Tabla 8 se presentan la proporción de resultados positivos por grupos de edad. Al analizar los resultados positivos para detección de VPH en función de la edad del paciente se detectó ADN de VPH en 229 muestras del grupo etario menores de 25 años, lo que supone un 50.6% de diagnósticos positivos. En el grupo de 25 a 34 años, se detectó ADN de VPH en 522 muestras, lo que supone un 47.7 % de diagnósticos positivos. En los grupos etarios 35-44 años y 45-54 años, se detectó ADN de VPH en 413 y 195 muestras, lo que supone un 40.9 y un 37.2% de diagnóstico de VPH, respectivamente. Por último, en las pacientes mayores de 54 años se detectó ADN de VPH en 81 muestras, suponiendo un 43.8% de diagnóstico de VPH dentro del grupo etario (Figura 21). 102 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 8. Resultados positivos para VPH en función de la edad del paciente. GRUPO Nº PETICIONES Nº POSITIVAS % de diagnóstico de ETARIO (%) VPH VPH del grupo etario <25 años 453 (13.9%) 229 50.6 25-34 años 1095 (33.5%) 522 47.7 35-44 años 1009 (30.9%) 413 40.9 45-54 años 524 (16.0%) 195 37.2 >54 años 185 (5.7%) 81 43.8 TOTAL 3266 (100.0%) 1440 60 50,6 50 47,7 40,9 40 37,2 43,8 30 20 10 0 <25 años 25-34 35-44 45-54 >54 años Figura 21. Porcentaje de diagnóstico de VPH para los distintos grupos etarios 103 Marta Domínguez-Gil González Resultados Al estudiar la razón de prevalencias (RP) de los diferentes grupos etarios se obtuvieron los siguientes datos (Tabla 9): TABLA 9. Razón de prevalencias en los grupos etarios de detección de VPH. Grupo etario Prevalencia % de positivos RP IC 95% - <25 años 0.5055 50.6 1.0000 25-34 años 0.4767 47.7 0.9430 0.8446-1.0529 35-44 años 0.4093 40.9 0.8097 0.7200-0.9106 45-54 años 0.3721 37.2 0.7361 0.6376-0.8500 >54 años 0.4378 43.8 0.8661 0.7184-1.0442 RP: Razón de prevalencia; IC: Intervalo de confianza Únicamente existen diferencias estadísticamente significativas en los grupos etarios de 35-44 años y 45-54 años. La prueba de homogeneidad entre niveles tuvo p<0,001 y en la prueba de tendencia lineal p<0,001, mostrando que existe tendencia lineal, ya que a medida que aumenta la edad de la paciente el porcentaje de positivos es menor. Al analizar la evolución anual de resultados positivos para detección de VPH en función del sexo del paciente se observó que en 1788 muestras (40.9%, IC95%:37.6-44.2) pertenecientes a mujeres se detectaba ADN de VPH, frente las 27 muestras (0.6%, IC95%:0.4-0.8) pertenecientes a varones (Figura 22). 104 Marta Domínguez-Gil González Resultados 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 MUJERES 1 42 88 132 206 217 174 166 150 230 382 HOMBRES 0 0 0 0 5 2 3 3 4 4 6 Figura 22. Evolución anual de la positividad de VPH en función del sexo del paciente La distribución de resultados de acuerdo con los hallazgos obtenidos del VPH asociados a riesgo de transformación celular, permitió obtener tres tipos de resultados para VPH. Unos que presentaban positividad en la prueba de hibridación con sonda correspondiente a los VPH asociados a alto riesgo de transformación celular, otros en los que se detectó únicamente VPH de bajo riesgo y finalmente, un tercer grupo en el que se detectó simultáneamente VPH de alto riesgo y VPH de bajo riesgo. En la Tabla 10 se presenta la evolución anual de resultados positivos en función del tipo de VPH detectado: alto riesgo (AR), bajo riesgo (BR) o ambos grupos (AR y BR). Para los VPH de AR se observó un incremento anual de -0.89 % (p=0.106 y una bondad de ajuste de 20,5%), para los VPH de BR el incremento anual fue de 0,92% (p=0.01 y una bondad de ajuste de 52.0%) y finalmente para los que se detectaron ambos tipos de VPH, el incremento anual fue de -0.02% (p: 0.97 y una bondad de ajuste de 0%, lo que supone que no existen variaciones significativas). La evolución temporal de los porcentajes de VPH de alto riesgo se muestra en la Figura 23 Se obtuvieron 1313 muestras en las que se detectó ADN de VPH de alto riesgo de transformación celular, lo que equivale a un 72.3 % (IC95%:58.9-85.7) del total de 105 Marta Domínguez-Gil González Resultados muestras positivas para VPH. En 205 muestras se detectó ADN de VPH de bajo riesgo, lo que supone un 11.3% (IC95%:6.7-15.9) de las positivas y en 297 muestras se detectó la presencia de ADN de VPH de ambos grupos (AR y BR), lo que supone un 16.4% (IC95%:12.4-20.4) de las muestras positivas para VPH (Figura 24. Por lo que se podía confirmar que en 1610 (88.7%) muestras se detectó ADN de VPH de AR, si se tienen en cuenta, tanto aquellas en las que únicamente se detecta ADN de VPH de AR como aquellas en las que VPH de AR aparece acompañado de VPH de BR. En la Figura 25 se muestran los resultados obtenidos en el diagnóstico de VPH en función del riesgo de transformación celular, según la edad del paciente. En el análisis de la tendencia de la distribución de resultados de cribado de VPH en función de la edad del paciente, se pudo observar que la detección de VPH de AR supone un incremento anual de 7.2% (p<0,001 y bondad de ajuste de 100%) al aumentar la edad del paciente. Respecto a los VPH de BR se observa un incremento de -2,04% (p<0,001 y bondad de ajuste de 100%) al aumentar la edad del paciente. Para las infecciones mixtas se observó un incremento anual de -5,17% (p<0,001 y bondad de ajuste de 98,4%) al aumentar la edad del paciente. En la Figura 26 se representa la relación entre el porcentaje de VPH de AR al aumentar la edad del paciente y el porcentaje de VPH positivos en función de la edad. 106 TABLA 10. Distribución de VPH positivos en función del riesgo de transformación celular (Hibridación, con sondas diferenciadas) AÑO POSITIVAS % AR % BR % AR % AR Totales % 1996 1 33.3 0 0 1 33.3 0 0 0 0 1997 42 46.7 32 76.2 4 9.5 6 14.3 38 90.5 1998 88 41.7 74 84.1 6 6.8 8 9.1 82 93.2 1999 132 46.0 95 72.0 11 8.3 26 19.7 121 91.7 2000 211 45.4 143 67.7 10 4.7 58 27.5 201 95.3 2001 219 41.4 171 78.1 19 8.7 29 13.2 200 91.3 2002 177 35.0 130 73.4 25 14.1 22 12.4 152 85.9 2003 169 34.6 126 74.6 18 10.7 25 14.8 151 89.3 2004 154 36.3 107 69.5 24 15.6 23 14.9 130 84.4 2005 234 41.1 171 73.1 34 14.5 29 12.4 200 85.5 2006 388 48.3 264 68.0 53 13.7 71 18.3 335 86.3 TOTAL 1815 41.5 1313 72.3 205 11.3 297 16.4 1610 88.7 AR: VPH de Alto riesgo oncogénico; BR: VPH de Bajo Riesgo oncogénico 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1996 1997 1998 1999 VPH AR 2000 2001 VPH BR 2002 2003 VPH BR y AR Figura 23. Evolución temporal de los porcentajes de VPH de alto riesgo y bajo riesgo. VPH AR: VPH de Alto riesgo oncogénico; VPH BR: VPH de Bajo riesgo oncogénico. 2004 2005 2006 Figura 24. Distribución porcentual de tipos de VPH en función del riesgo de transformación celular. VPH AR: VPH de Alto riesgo oncogénico; VPH BR: VPH de Bajo riesgo oncogénico Porcentaje de muestras 100% 1 90% 0,9 80% 0,8 70% 0,7 60% 0,6 50% 0,5 40% 0,4 30% 0,3 20% 0,2 10% 0,1 0% 0 <25 años 25-34 35-44 45-54 >55 años Grupo de Edad <25 años 25-34 años 35-44 años 45-54 años >54 años Mixtas 53 82 49 20 0 Bajo Riesgo 27 70 37 13 4 Alto Riesgo 149 370 327 162 77 Figura 25. Distribución de resultados de cribado de VPH y la edad del paciente Marta Domínguez-Gil González Resultados 100 90 80 70 % de VPH AR con la edad 60 50 40 30 % de VPH con la edad 20 10 0 <25 años 25-34 35-44 45-54 >54 % de VPH AR con la edad 65,1 70,9 79,2 83,1 95,1 % de VPH con la edad 50,6 47,7 40,9 37,2 43,8 Figura 26. Relación entre el porcentaje de VPH AR y el porcentaje de VPH en función de la edad del paciente. VPH AR: VPH de Alto riesgo oncogénico. Otros abordajes del cribado Cribado de VPH por Hibridación con sonda única En 362 muestras elegidas aleatoriamente, procesadas previamente por la técnica de captura de híbridos (HC) con sondas diferenciadas, se realizó HC utilizando una sonda única compuesta por una mezcla de las dos sondas de detección. La técnica clasifica los resultados de VPH como detección de ADN positiva o negativa, sin diferenciar entre VPH de alto o bajo riesgo de transformación celular. Al utilizar sondas diferenciadas 180 (49.7%) muestras fueron positivas y 182 negativas (50.3%), mientras que al utilizar una sonda única se obtuvieron 167 muestras positivas (46.1%) para VPH y 195 negativas (53.9%). En la Figura 27 se muestran los resultados conjuntos de detección de VPH al utilizar sondas diferenciadas y sonda única en las mismas muestras. De las 362 muestras, la concordancia en ambos ensayos se reconoció en 345/362 muestras (95.3%). Al analizar los resultados obtenidos por ambos tipos de técnicas se observó que existía discordancia de resultados en 17 (4.7 %) de las muestras analizadas. Así en dos 111 Marta Domínguez-Gil González Resultados muestras en las que la hibridación con sondas diferenciadas el resultado fue negativo, resultó positiva al utilizar sonda única. En 15 muestras cuyo resultado había sido positivo mediante el empleo de sondas diferenciadas, resultaron negativas al utilizar sonda única (Tabla 11). Al analizar los resultados de la Tabla 11, se obtiene una sensibilidad de 91,7% (IC95%: 87.4-96.0) al utilizar sonda única, y 98,9% (IC95%: 97.1-100.0) de especificidad. El VPP fue de 98.8% y el VPN del 92.3%. La prevalencia fue de 49.7% (IC95%: 44.4-55.0) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 83.4 y 0.1, respectivamente. Las discordancias entre ambas técnicas se estudiaron posteriormente y al analizarse por otro tipo de técnicas, de detección y genotipado, para confirmar se obtuvieron distintos resultados, que se analizan a continuación (Tabla 12). 112 Marta Domínguez-Gil González Resultados 195 SONDA ÚNICA 167 NEGATIVA POSITIVA SONDAS DIFERENCIADAS 182 0 100 180 200 300 400 N: 362 muestras Figura 27. Resultados de VPH en muestras analizadas mediante sondas diferenciadas o sonda única. TABLA 11. Diagnóstico de VPH por hibridación utilizando diferente patrón de sondas. Sondas Sondas Diferenciadas diferenciadas POSITIVO NEGATIVO Sonda única POS 165 2 167 Sonda única NEG 15 180 195 180 182 362 113 TABLA 12. Reactividades obtenidas en la detección de VPH con dos sondas diferenciadas y con sonda única (Resultados discordantes) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Muestras Sonda Única Ratio SONDA AR Ratio SONDA BR Ratio 03/54621 03/55374 03/57595 03/58234 03/58635 04/00030 04/01985 04/07391 04/14426 04/32262 04/32848 04/33816 06/39395 06/42962 06/43259 06/46095 06/48667 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG POS NEG NEG NEG POS NEG 0.40 0.33 0.52 0.24 0.79 0.60 0.49 0.57 0.51 0.46 0.22 1.03 0.35 0.54 0.57 64.23 0.56 POS POS NEG POS NEG NEG NEG NEG POS POS NEG NEG NEG POS NEG NEG NEG 4.6 1.65 0.96 514.37 0.96 0.81 0.67 0.44 1.57 1.17 0.52 0.53 0.53 1.17 0.54 0.84 0.52 POS NEG POS NEG POS POS POS POS NEG NEG POS NEG POS NEG POS NEG POS 1.85 0.29 1.34 0.29 139.56 1.14 2.03 1.85 0.36 0.54 1.33 0.51 1.51 0.51 1.33 0.51 1.51 CONFIRMACION Y GENOTIPADO MA LiPA POS (VPH 16) POS (VPH 16) NEG NEG NEG NEG POS(VPH 16) NEG POS (VPH 6) NEG NEG NEG POS (VPH 6) POS (VPH 6, 11) NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG Inh NEG NEG NEG Marta Domínguez-Gil González Resultados En 15 de las muestras discrepantes, se observó que el resultado era negativo al utilizar sonda única, mientras que al utilizar sondas diferenciadas el resultado fue positivo. Estas muestras fueron evaluadas por otras técnicas, consideradas de confirmación y genotipado y el resultado fue; dos muestras positivas (por Microarrays y LiPA), 11 muestras negativas por ambas técnicas y dos cuyo resultado fue positivo por Microarrays y negativo por LiPA. En dos muestras en las que el resultado había sido positivo al utilizar sonda única y negativo al utilizar sondas diferenciadas se confirmó que el resultado fue negativo por las dos técnicas de confirmación en una de ellas y en la otra, al utilizar Microarrays el resultado fue de PCR inhibida y al utilizar LiPA negativa Confirmación e identificación de VPH positivos por la prueba de cribado De las 1815 muestras positivas por HC 2 se realizó confirmación por alguna de las técnicas en 630 (34.7%) muestras. De esas 630 muestras positivas en la técnica de cribado se lograron confirmar por una, dos o las tres técnicas (ERpcr, LiPA y Microarrays) 410 muestras (65.1%). Confirmación de VPH con Amplificación mediante PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (ERpcr) En 504 muestras se utilizó amplificación mediante PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (ERpcr) (PVHfastPharmagen S.A), a partir de muestras previamente procesadas por HC 2, con dos sondas diferenciadas. De las 504 muestras procesadas por ambas técnicas, 450 (89.3%) fueron positivas por HC 2, de las cuales pudieron confirmarse como positivas, mediante esta PCR, 225 muestras (50.0%) (Tabla 13). De las 504 muestras, la concordancia en ambos ensayos se reconoció en 268/504 muestras (53.2%). 115 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 13. Distribución de resultados al comparar HC 2 con PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (ERpcr) HC 2 POSITIVO HC 2 NEGATIVO ERpcr POSITIVA 225 11 236 ERpcr NEGATIVA 225 43 268 (No amplifican: 23) (No amplifican: 3) 450 54 504 Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 13, se obtiene una sensibilidad de 50% (IC95%: 45.3-54.7) de la ERpcr, y 79.6% (IC95%: 68.0-91.3) de especificidad. El VPP fue de 95.3% y el VPN del 16.0%. La prevalencia fue de 89.3% (IC95%: 86.5-92.1) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 2.45 y 0.63, respectivamente. En 351 (78.0%) muestras en las que la Sonda B (VPH AR) había resultado positiva, únicamente se detectó ADN de VPH en 185 (52.7%) y no de detectó en 166 (47.3%) mediante ERpcr (Tabla 14). En 36 (8%) muestras en las que la Sonda A (VPH BR) fue positiva, únicamente se detectó ADN de VPH en 8 (22.2%) y en 28 (77.8%) fue negativa (Tabla 15). En 63 (14%) muestras, ambas sondas fueron positivas (VPH AR y BR), únicamente se detectó ADN de VPH en 32 (50.8%) y en 31 (49.2%) no se detectó ADN de VPH mediante ERpcr (Tabla 16). En 414 muestras (92%) se detectó ADN de VPH de AR (sólo y acompañado de BR), es decir se consideraban los VPH de AR y los VPH mixtas, en las que también aparecía VPH de AR pero acompañado de VPH de BR. Se detectó ADN de VPH mediante ERpcr en 217 (52.4%) muestras y no se detectó en 197 (47.6%) (Tabla 17). 116 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 14. Distribución de resultados al comparar HC 2 con PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (VPH AR) HC 2 HC 2 VPH AR VPH AR POSITIVO NEGATIVO ERpcr POSITIVA 178 7 185 ERpcr NEGATIVA 173 47 220 (No amplifican: 20) (No amplifican: 3) 351 54 405 Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 14, se obtiene una sensibilidad de 50.7% (IC95%:45.3-56.1) de la ERpcr para detectar VPH AR, y 87.0% (IC95%:77.2-96.9) de especificidad. El VPP fue de 96.2% y el VPN del 21.4%. La prevalencia fue de 86.7% (IC95%: 83.2-90.1) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 3.9 y 0.6, respectivamente. TABLA 15. Distribución de resultados al comparar HC 2 con PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (VPH BR) HC 2 HC 2 VPH BR VPH BR POSITIVO NEGATIVO ERpcr POSITIVA 7 4 11 ERpcr NEGATIVA 29 50 79 (No amplifican:2) (No amplifican: 3) 36 54 90 Nivel de confianza: 95% 117 Marta Domínguez-Gil González Resultados Al analizar los resultados de la Tabla 15, se obtiene una sensibilidad de 19.4% (IC95%: 5.1-33.8) de la ERpcr para detectar VPH de BR, y 92.6% (IC95%:84.7-100) de especificidad. El VPP fue de 63.4% y el VPN del 63.3%. La prevalencia fue de 40% (IC95%: 29.3-50.7) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 2.63 y 0.9, respectivamente. TABLA 16. Distribución de resultados al comparar HC 2 con PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (VPH AR y BR) HC 2 HC 2 VPH AR y BR VPH AR y BR POSITIVO NEGATIVO ERpcr POSITIVA 0 0 0 ERpcr NEGATIVA 63 54 117 (No amplifican: 1) (No amplifican: 3) 63 54 117 Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 16, se obtiene una sensibilidad de 0% de la ERpcr para detectar infecciones mixtas (VPH AR y BR), y 100% de especificidad. El VPP fue 0% y el VPN del 30.5%. TABLA 17. Distribución de resultados al comparar HC 2 con PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (VPH AR totales) HC 2 HC 2 VPH AR totales VPH AR totales POSITIVO NEGATIVO ERpcr POSITIVA 203 7 210 ERpcr NEGATIVA 211 47 258 414 54 468 Nivel de confianza: 95% 118 Marta Domínguez-Gil González Resultados Al analizar los resultados de la Tabla 17, se obtiene una sensibilidad de 49% (IC95%: 44.1-54.0) de la ERpcr para detectar infecciones por VPH de ALTO RIESGO (VPH AR y AR+BR), y 87.0% (IC95%:77.2-96.9) de especificidad. El VPP fue de 96.7% y el VPN del 18.2%. La prevalencia fue de 88.5% (IC95%: 85.5-91.5) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 3.8 y 0.6, respectivamente. Confirmación de VPH mediante Hibridación reversa en tira. Muestras procesadas por HC 2 y LiPA En 413 muestras se utilizó una hibridación reversa en tira (Inno-Lipa VPH Genotyping CE®, Innogenetics), a partir de muestras previamente procesadas por HC 2, con dos sondas diferenciadas. De las 413 muestras procesadas por ambas técnicas, 243 (58.8%) fueron positivas por HC 2, de las cuales se pudieron confirmar mediante LiPA como positivas, 195 muestras (80.2%) (Tabla 18). De las 413 muestras, la concordancia en ambos ensayos se reconoció en 353/413 muestras (85.5%). TABLA 18. Distribución de resultados al comparar HC 2 y LiPA HC 2 HC 2 POSITIVO NEGATIVO LiPA POSITIVO 195 12 207 LiPA NEGATIVO 48 158 206 243 170 413 Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 18, se obtiene una sensibilidad de 80.2% (IC95%:75.0-85.5) del LiPA, y 92.9% (IC95%:88.0-97.1) de especificidad. El VPP fue de 94.2% y el VPN del 76.7%. La prevalencia fue de 58.8% (IC95%: 54.0-63.7) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 11.4 y 0.2, respectivamente. En 173 muestras en las que la Sonda B (VPH AR) había resultado positiva, se detectó ADN de VPH en 112 (64.7%) y no de detectó en 61(35.3%) mediante LiPA (Tabla 19). 119 Marta Domínguez-Gil González Resultados En 31 muestras en las que la Sonda A (VPH BR) fue positiva, únicamente se detectó ADN de VPH en 10 (32.3%) y en 21 (67.7%) fue negativa (Tabla 20). En 39 muestras, ambas sondas fueron positivas (VPH AR y BR), únicamente se detectó ADN de VPH en 15 (38.5%) y en 24 (61.5%) no se detectó ADN de VPH mediante LiPA (Tabla 21). En 212 muestras se detectó ADN de VPH de AR (solo y acompañado de BR), es decir se consideraban los VPH de MAR y los VPH mixtas, en las que también aparecía VPH de AR pero acompañado de VPH de BR. Se detectó ADN de VPH mediante LiPA en 163 (76.9%) muestras y no se detectó en 49(23.1%) (Tabla 22). TABLA 19. Distribución de resultados al comparar HC 2 y LiPA (VPH AR). HC 2 HC 2 AR POSITIVO AR NEGATIVO LiPA POSITIVO 112 5 117 LiPA NEGATIVO 61 165 226 173 170 343 Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 19, se obtiene una sensibilidad de 64.7% (IC95%: 57.3-72.2) del LiPA para detectar VPH AR, y 97.1% (IC95%:94.2-99.9) de especificidad. El VPP fue de 95.7% y el VPN del 73.0%. La prevalencia fue de 50.4% (IC95%: 45.0-55.9) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 22 y 0.4, respectivamente. Al comparar los resultados en los que por HC 2 había sido VPH de BR y el resultado obtenido por hibridación reversa en tira o LiPA se obtuvieron los siguientes datos (Tabla 20). 120 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 20. Distribución de resultados al comparar HC 2 y LiPA (VPH BR) HC 2 BR POSITIVO HC 2 BR NEGATIVO LiPA POSITIVO 10 4 14 LiPA NEGATIVO 21 166 187 31 170 201 Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 20, se obtiene una sensibilidad de 32.3% (IC95%: 14.2-50.3) del LiPA para detectar VPH BR, y 97.7% (IC95%:95.1-100.0) de especificidad. El VPP fue de 71.4% y el VPN del 88.7%. La prevalencia fue de 15.4% (IC95%: 10.2-20.7) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 13.7 y 0.7, respectivamente. Al comparar los resultados en los que por HC 2 había sido positivo para ambos tipos de sonda (VPH AR y VPH-BR) y el resultado obtenido por hibridación reversa en tira o LiPA se obtuvieron los siguientes datos (Tabla 21). TABLA 21. Distribución de resultados al comparar HC 2 y LiPA (VPH AR y BR) HC 2 HC 2 AR y BR AR y BR POSITIVO NEGATIVO (AR y BR) LiPA POSITIVO 15 1 16 LiPA NEGATIVO 24 169 193 39 170 209 Nivel de confianza: 95% 121 Marta Domínguez-Gil González Resultados Al analizar los resultados de la Tabla 21, se obtiene una sensibilidad de 38.5% (IC95%: 21.9-55.0) del LiPA para detectar infecciones mixtas (AR y BR), y 99.4% (IC95%: 98.0-100.0) de especificidad. El VPP fue de 93.8% y el VPN del 87.6%. La prevalencia fue de 18.7% (IC95%: 13.1-24.2) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 65.4 y 0.6, respectivamente. TABLA 22. Distribución de resultados al comparar HC 2 y LiPA (VPH AR totales) HC 2 HC 2 AR totales AR totales POSITIVO NEGATIVO LiPA POSITIVO 163 8 171 LiPA NEGATIVO 49 162 211 212 170 382 Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 22, se obtiene una sensibilidad de 76.9% (IC95%: 71.0-82.8) del LiPA para detectar infecciones por VPH de ALTO RIESGO, y 95.3% (IC95%: 91.8-98.8) de especificidad. El VPP fue de 95.3% y el VPN del 76.8%. La prevalencia fue de 55.5% (IC95%: 50.4-60.6) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 16.3 y 0.24, respectivamente. Confirmación de VPH mediante Microarrays En 377 muestras se utilizó Microarrays (Clinical Arrays® Papillomavirus, Genomica), a partir de muestras previamente procesadas por HC 2, con dos sondas diferenciadas. De las 377 muestras procesadas por ambas técnicas, 203 (53.5%) fueron positivas por HC 2 y se confirmaron como positivas utilizando Microarrays, 176 muestras (86.7%) (Tabla 23). De las 377 muestras, la concordancia en ambos ensayos se reconoció en 338/377 muestras (89.7%). 122 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 23. Distribución de resultados al comparar HC 2 y Microarrays Microarrays HC 2 HC 2 POSITIVO NEGATIVO 176 12 188 27 162 189 203 174 377 POSITIVO Microarrays NEGATIVO Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 23, se obtiene una sensibilidad de 86.7% (IC95%: 81.8-91.6) de los Microarrays, y 93.1% (IC95%: 89.1-97.2) de especificidad. El VPP fue de 93.6% y el VPN del 85.7%. La prevalencia fue de 53.9% (IC95%: 48.7-59.0) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 12.6 y 0.1, respectivamente. En 138 muestras en las que la Sonda B (VPH AR) había resultado positiva, se detectó ADN de VPH en 103 (76.6%) y no de detectó en 35 (25.4%) (Tabla 24). En 32 muestras en las que la Sonda A (VPH BR) fue positiva, se detectó ADN de VPH en 14(43.8%) y en 18 (56.3%) fue negativa (Tabla 25). En 33 muestras en ambas sondas fueron positivas (VPH AR y BR), se detectó ADN de VPH en 21 (63.6%) y en 12 (36.4%) fue negativa (Tabla 26). En 171 muestras se detectó ADN de VPH AR, tanto solo como acompañado de VPH BR (AR totales), se detectó ADN de VPH mediante Microarrays en 149 muestras (87.1%) y no se detectó en 22 (12.9 %) (Tabla 27). 123 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 24. Distribución de resultados al comparar HC 2 y Microarrays (VPH AR) Microarrays HC 2 HC 2 VPH AR VPH AR POSITIVO NEGATIVO 103 3 106 35 171 206 138 174 312 POSITIVO Microarrays NEGATIVO Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 24, se obtiene una sensibilidad de 74.6% (IC95%: 67.0-82.3) de los Microarrays para detectar VPH de AR, y 98.3% (IC95%: 96.1100.0) de especificidad. El VPP fue de 97.2% y el VPN del 83.0%. La prevalencia fue de 44.2% (IC95%: 38.6-49.9) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 43.3 y 0.3, respectivamente. TABLA 25. Distribución de resultados al comparar HC 2 y Microarrays (VPH BR) Microarrays HC 2 HC 2 VPH BR VPH BR POSITIVO NEGATIVO 14 9 23 18 165 183 32 174 206 POSITIVO Microarrays NEGATIVO Nivel de confianza: 95% 124 Marta Domínguez-Gil González Resultados Al analizar los resultados de la Tabla 25, se obtiene una sensibilidad de 43.8% (IC95%: 25.0-62.5) de los Microarrays para detectar VPH de BR, y 94.8% (IC95%: 91.398.4) de especificidad. El VPP fue de 60.9% y el VPN del 90.2%. La prevalencia fue de 15.5% (IC95%: 10.3-20.7) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 8.5 y 0.6, respectivamente. TABLA 26. Distribución de resultados al comparar HC 2 y Microarrays (VPH AR y BR) Microarrays HC 2 HC 2 VPH AR y BR VPH AR y BR POSITIVO NEGATIVO 21 0 21 12 174 186 33 174 207 POSITIVO Microarrays NEGATIVO Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 26, se obtiene una sensibilidad de 63.6% (IC95%: 45.7-81.6) de los Microarrays para detectar infecciones mixtas (VPH AR y BR), y 100.0% (IC95%:99.7-100.0) de especificidad. El VPP fue de 100.0% y el VPN del 93.6%. La prevalencia fue de 15.9% (IC95%: 10.7-21.2) y la razón de verosimilitud negativa fue 0.4. 125 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 27. Distribución de resultados al comparar HC 2 y Microarrays (VPH AR totales) Microarrays HC 2 HC 2 VPH AR totales VPH AR totales POSITIVO NEGATIVO 149 3 152 22 171 193 171 174 345 POSITIVO Microarrays NEGATIVO Nivel de confianza: 95% Al analizar los resultados de la Tabla 27, se obtiene una sensibilidad de 87.1% (IC95%: 81.8-92.5 de los Microarrays para detectar VPH AR totales, y 98.3% (IC95%:96.1100.0) de especificidad. El VPP fue de 98.0% y el VPN del 88.6%. La prevalencia fue de 49.6% (IC95%: 44.1-55.0) y las razones de verosimilitud positiva y negativa fueron de 50.5 y 0.1, respectivamente. Genotipado de VPH por amplificación con PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (ERpcr) En total se genotiparon por ERpcr las 236 muestras en las que se había detectado ADN de VPH. Un 95.3% fueron infecciones por un único genotipo de VPH, mientras que un 4.7% fueron coinfecciones. Al analizar los VPH detectados por ERpcr, se observó que los genotipos más frecuentes fueron: VPH 16 (39.8%); VPH X (no tipable) (11.9%); VPH 53 (10.2%); VPH 31 (8.9%); VPH 58 (8.5%); VPH 6 (5.1%); VPH 33 (4.7%); VPH 18 (3.0%) y el VPH 70 (3.0%) (Tabla 28). En la Figura 28 se observan los genotipos de VPH más frecuentemente detectados por ERpcr. 126 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 28. Genotipos de VPH detectados mediante PCR y posterior digestión con enzimas de restricción. Genotipo de VPH 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º 13º 14º 15º 16º 17º 18º 19º 20º 21º VPH 16 VPH X VPH 53** VPH 31 VPH 58 VPH 6 VPH 33 VPH 18 VPH 70 VPH 66**/59 VPH 52 VPH 57 VPH 11 VPH 51 VPH 40 VPH 42 VPH 43 VPH 62 VPH MM7 VPH MM8 VPH 82 N N En infecciones por un solo tipo de VPH En coinfecciones TOTAL % 85 26 21 20 20 12 9 7 7 2 3 3 2 2 1 1 1 1 1 1 - 9 2 3 1 2 3 1 1 94 28 24 21 20 12 11 7 7 5 4 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 39.8 11.9 10.2 8.9 8.5 5.1 4.7 3.0 3.0 2.1 1.7 1.3 0.8 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 * En negrita los genotipos de VPH de riesgo oncogénico elevado. ** Probable alto riesgo oncogénico 127 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 VPH 16 VPH X VPH 53 VPH 31 VPH 58 VPH 6 VPH 33 VPH 18 VPH 70 VPH 66/59 Figura 28. Genotipos de VPH más frecuentes detectados por amplificación con PCR y digestión por enzimas de restricción* *Otros VPH que se detectaron con menor frecuencia: VPH 52, VPH 57, VPH 11, VPH 51, VPH 40, VPH 42, VPH 43, VPH 62, MM7, MM8 y VPH 82 Marta Domínguez-Gil González Resultados En la Figura 29 se muestra la evolución anual de los genotipos de VPH más frecuentemente detectados por ERpcr. Las coinfecciones detectadas en el mismo periodo de tiempo estudiado mediante esta técnica de PCR fueron 11, lo que supone un 4.7% de las muestras. En la Figura 30 se representan las coinfecciones por genotipos de VPH detectadas mediante ERpcr El VPH 16 fue el más frecuentemente detectado en las coinfecciones, detectándose en nueve muestras, seguido del VPH 53, VPH66/59 que se detectaron en tres muestras cada uno de ellos. 129 100% 80% 60% 40% 20% 0% 2000 2001 2002 2003 2004 TOTAL 6 5 4 3 0 0 12 58 5 8 1 6 0 20 31 5 10 4 1 1 21 53 4 4 5 11 0 24 X 6 4 8 10 0 28 16 20 24 23 15 12 94 Figura 29. Distribución anual de los genotipos de VPH más frecuentes detectados mediante PCR y digestión con enzimas de restricción. 2,5 2 1,5 1 0,5 0 VPH 16+53 VPH 16+66/59 VPH 16+82 VPH 16+62 VPH 16+X VPH 16+33 VPH 16+31+53 VPH 33+66/59 Figura 30. Genotipos de VPH detectados en coinfecciones por PCR y digestión por enzimas de restricción VPH 52+X Marta Domínguez-Gil González Resultados Genotipado de VPH por LiPA En las 207 muestras en las que se detectó ADN de VPH mediante LiPA se procedió a determinar el genotipo de VPH mediante esta técnica. Un 43.5% fueron infecciones por un único genotipo de VPH, mientras que el 56.5% fueron coinfecciones. Al analizar los VPH detectados por LiPA, se observó que los genotipos más frecuentes fueron: VPH 16 (39.6 %); VPH 51 (20.8%); VPH 53 (16.9%); VPH 6 (13.0%); VPH 11 (13.0%) y VPH 58 (12.1%) (Tabla 29). En la Figura 31 se observa la distribución de los genotipos de VPH más frecuentemente detectados por LiPA TABLA 29. Genotipos de VPH detectados mediante LiPA Genotipo de VPH 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º 13º 14º 15º 16º 17º 18º 19º 20º 21º 22º 23º VPH 16 VPH 51 VPH 53** VPH 11 VPH 6 VPH 58 VPH 52 VPH 66** VPH 18 VPH 31 VPH 56 VPH 39 VPH 40 VPH 33 VPH 68 VPH X VPH 70 VPH 74 VPH 42 VPH 35 VPH 45 VPH 44 VPH 69 N N En infecciones por TOTAL % En coinfecciones un solo genotipo de VPH 26 56 82 39.6 3 41 44 21.3 8 27 35 16.9 8 19 27 13.0 6 21 27 13.0 4 22 26 12.6 2 23 25 12.1 2 23 25 12.1 5 17 22 10.6 2 17 19 9.2 2 8 10 4.8 4 5 9 4.3 2 7 9 4.3 8 8 3.9 1 6 7 3.4 6 6 2.9 4 2 6 2.9 5 5 2.4 2 3 5 2.4 2 2 4 1.9 1 3 4 1.9 2 2 1.0 1 1 0.5 * En negrita los genotipos de VPH de riesgo oncogénico elevado. ** Probable alto riesgo oncogénico 132 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 VPH 16 VPH 51 VPH 53 VPH 11 VPH 6 VPH 58 VPH 52 Figura 31. Genotipos de VPH más frecuentes detectados por LiPA* *Otros VPH detectados con menor frecuencia: VPH56, 39, 40, 33, 68, X, 70, 74, 42, 35, 45, 44 y 69 VPH 66 VPH 18 VPH 31 Marta Domínguez-Gil González Resultados En la Figura 32 se muestra la evolución anual de los genotipos de VPH más frecuentemente detectados por LiPA. Las coinfecciones detectadas en el mismo periodo de tiempo estudiado mediante LiPA fueron 117 (56,5%). En la Figura 33 se representan las coinfecciones por genotipos de VPH más frecuentemente detectadas por LiPA. Al analizar las coinfecciones detectadas por LiPA, se observó que la mayor parte de las mismas eran por dos genotipos de VPH: 74 (63.2%), por tres genotipos de VPH: 24 (20.5%), por cuatro: 7 (6.0%) y más de cuatro genotipos de VPH en 12 (10.3%) El VPH 16 fue el más frecuentemente detectado en coinfecciones, detectándose en 56 ocasiones, seguido del VPH 51, que se detectó en 41 ocasiones, el VPH 53 en 27 ocasiones y el VPH 52 y 66 que se detectaron en 23 ocasiones cada uno de ellos. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 2002 58 6 2 11 2003 2004 2006 TOTAL 19 2 5 26 12 3 10 27 19 4 4 27 53 1 28 1 5 35 51 2 27 7 8 44 16 5 55 16 6 82 Figura 32. Distribución anual de los genotipos de VPH más frecuentemente detectados mediante LiPA 134 8 7 6 5 4 3 2 1 0 VPH 16+18 VPH 16+58 VPH 16+52 VPH 16+66 VPH 16+51 VPH 16+53 Figura 33. Coinfecciones por genotipos de VPH más frecuentes detectadas por LiPA VPH 11+53 VPH 51+53 VPH 16+58+66 Marta Domínguez-Gil González Resultados Genotipado de VPH por Microarrays En 188 muestras en las que se detectó ADN de VPH mediante Microarrays se procedió a determinar el genotipo de VPH mediante esta técnica. Un 46.8% fueron infecciones por un único genotipo de VPH, mientras que el 53.2% fueron coinfecciones. Al analizar los VPH detectados por Microarrays, se observó que los genotipos más frecuentes fueron: VPH 16 (44.7%); VPH 6 (21.3%); VPH 53 (14.9%); VPH 51 (11.7%); VPH 58 (10.6%); VPH 11 (8.5%); VPH 66 (8.5%) y VPH 18 (6.4%) (Tabla 30). En la Figura 34 se observa la distribución de los genotipos de VPH más frecuentemente detectados por Microarrays. TABLA 30. Genotipos de VPH detectados mediante Microarrays Genotipo de VPH 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º 13º 14º 15º 16º 17º 18º 19º 20º 21º 22º 23º 24º 25º 26º VPH 16 VPH 6 VPH 53** VPH 51 VPH 58 VPH 11 VPH 66** VPH 18 VPH 52 VPH 33 VPH 39 VPH 70 VPH 31 VPH 42 VPH 68 VPH 45 VPH 81 VPH 71 VPH 26** VPH 35 VPH 85 VPH 56 VPH 40 VPH 73 VPH 82 VPH 69 N En infecciones por un solo genotipo de VPH 28 13 12 2 7 2 1 3 1 2 3 4 2 3 2 1 1 - N En coinfecciones TOTAL % 56 27 16 20 13 14 15 9 10 6 4 2 3 2 4 1 2 3 3 1 2 2 1 1 1 1 84 40 28 22 20 16 16 12 11 8 7 6 5 5 4 3 3 3 3 2 2 2 1 1 1 1 44.7 21.3 14.9 11.7 10.6 8.5 8.5 6.4 5.9 4.3 3.7 3.2 2.7 2.7 2.1 1.6 1.6 1.6 1.6 1.1 1.1 1.1 0.5 0.5 0.5 0.5 * En negrita los genotipos de VPH de riesgo oncogénico elevado. ** Probable alto riesgo oncogénico 136 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 VPH 16 VPH 6 VPH 53 VPH 51 VPH 58 VPH 11 VPH 66 Figura 34. Distribución de los genotipos de VPH más frecuentes detectados por Microarrays* *Otros genotipos de VPH detectados con menor frecuencia: VPH 52, 33, 39, 70, 31, 42, 68, 45, 81, 71, 26, 35, 85, 56, 40, 73, 82 y 69 VPH 18 Marta Domínguez-Gil González Resultados En la Figura 35 se muestra la evolución anual de los genotipos de VPH más frecuentemente detectados por Microarrays. Las coinfecciones detectadas en el mismo periodo de tiempo estudiado mediante Microarrays fueron 100 (53.2%). En la Figura 36 se representan las coinfecciones detectadas. Al analizar las coinfecciones detectadas por Microarrays, se observó que la mayor parte de las mismas eran por dos genotipos de VPH: 84 (84.0%), por tres genotipos de VPH: 12 (12.0%), por cuatro: 2 (2.0%) y más de cuatro genotipos de VPH en 2 (2.0%). El VPH 16 fue el más frecuentemente detectado en coinfecciones, detectándose en 56 ocasiones, seguido del VPH 6, que se detectó en 27 ocasiones, el VPH 51 en 20 ocasiones y los genotipos VPH 53 y 66, que se detectaron en 16 y 15 ocasiones, respectivamente. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 2003 2004 10 2 66 9 2 1 4 16 11 10 1 5 16 58 13 1 6 20 51 18 2 1 22 53 22 3 3 28 6 5 2 26 7 40 16 49 10 19 6 84 18 1 2005 2006 TOTAL 12 Figura 35. Distribución anual de los genotipos más frecuentes de VPH detectados mediante Microarrays 138 16 14 12 10 8 6 4 2 0 VPH 6,16 VPH 16,51 VPH 16,58 VPH 16,66 VPH 11,16 VPH 16,18 VPH 16,52 Figura 36. Genotipos de VPH más frecuentes detectados por Microarrays en coinfecciones VPH 16,53 VPH 18,51 VPH 51,53 Marta Domínguez-Gil González Resultados En la Tabla 31 se presentan las coinfecciones detectadas (por dos, tres, cuatro o más de cuatro genotipos de VPH) por las distintas técnicas basadas en PCR empleadas en el genotipado de VPH (Figura 37). La técnica LiPA fue la que detectó mayor número de coinfecciones, en total 117. El LiPA igualmente fue la que detectó el mayor número de genotipos distintos en una misma reacción, detectándose en un 10.3% de las ocasiones más de cuatro genotipos de VPH distintos. La ERpcr no detectó en ninguna ocasión más de tres genotipos de VPH distintos, solo detectó coinfecciones por 2 y 3 genotipos distintos de VPH. Tanto LiPA como Microarrays detectaron coinfecciones por múltiples genotipos de VPH (incluso más de 4 genotipos). Los Microarrays detectaron con mayor frecuencia coinfecciones por dos genotipos de VPH (84%) que la ERpcr (63.6%) y el LiPA (63.2%). TABLA 31. Coinfecciones detectadas por dos, tres, cuatro o más de cuatro genotipos distintos de VPH, para las distintas técnicas empleadas en el genotipado Técnica 2 genotipos VPH 3 genotipos VPH 4 genotipos VPH Más de 4 genotipos de VPH Erpcr 7 (63,6%) 4 (36,4%) __ __ LiPA 74 (63,2%) 24 (20,5%) 7 (6%) 12 (10,3%) Microarrays 84 (84%) 12 (12%) 2 (2%) 2 (2%) 140 Marta Domínguez-Gil González Resultados Microarrays LiPA ERpcr 0 20 40 2 genotipos VPH 4 genotipos VPH 60 80 100 3 genotipos VPH >4 genotipos VPH Figura 37. Coinfecciones detectadas por dos, tres, cuatro o más de cuatro genotipos distintos de VPH, para las distintas técnicas empleadas en el genotipado Resultados globales del genotipado de VPH En total se genotiparon 436 muestras, previamente procesadas por HC 2 con sondas diferenciadas, por alguna de las tres técnicas del estudio (PCR con digestión por enzimas de restricción, LiPA y/o Microarrays). En 270 muestras (61.9%) solo se detectó un genotipo de VPH, mientras que 166 muestras (38.1%) fueron coinfecciones por más de un genotipo de VPH. Al identificar los VPH detectados, se observó que los genotipos más frecuentes fueron: VPH 16 (26.7%); VPH 6(10.0%); VPH 53 (7.6%); VPH 58 (7.1%); VPH 51 (6.3%); VPH 31 (5.3%); VPH 66 (4.8%) y VPH X (no tipable) (4.8%) (Tabla 32). En la Figura 38 se observa la distribución de los genotipos de VPH más frecuentemente detectados por alguna de las técnicas empleadas. 141 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 32. Genotipos de VPH detectados mediante distintas técnicas Genotipo de VPH 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º 13º 14º 15º 16º 17º 18º 19º 20º 21º 22º 23º 24º 25º 26º 27º 28º 29º 30º VPH 16 VPH 6 VPH 53** VPH 58 VPH 51 VPH 31 VPH 66** VPH X VPH 11 VPH 52 VPH 18 VPH 33 VPH 70 VPH 39 VPH 56 VPH 68 VPH 42 VPH 35 VPH 82 VPH 59 VPH 40 VPH 45 VPH 57 VPH 81 VPH 62 VPH 71 VPH 85 VPH 43 VPH MM7 VPH MM8 N En infecciones por un solo genotipo de VPH 92 26 20 20 5 22 2 18 7 5 9 8 11 4 2 1 4 2 2 2 3 1 1 1 1 1 N En coinfecciones TOTAL % 85 40 31 27 38 13 30 14 22 21 16 9 3 8 6 6 2 3 5 5 2 1 2 1 2 2 - 177 66 51 47 43 35 32 32 29 26 25 17 14 12 8 7 6 5 5 5 4 3 3 3 2 2 2 1 1 1 26.7 10.0 7.7 7.1 6.5 5.3 4.8 4.8 4.4 3.9 3.8 2.6 2.1 1.8 1.2 1.1 0.9 0.8 0.8 0.8 0.6 0.5 0.5 0.5 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 *En negrita los genotipos de VPH de riesgo oncogénico elevado. ** Probable alto riesgo oncogénico 142 30 25 20 15 10 5 0 VPH 16 VPH 6 VPH 53 VPH 58 VPH 51 VPH 31 VPH 66 VPH X Figura 38. Tipos de VPH más frecuentes detectados por distintas técnicas* *Otros genotipos de VPH detectados con menor frecuencia: VPH 11, 52, 18,3 3, 70, 39, 56, 68, 42, 35, 82 Marta Domínguez-Gil González Resultados En la Figura 39 se muestra la evolución anual de los genotipos de VPH más frecuentemente detectados por las distintas técnicas. Las coinfecciones detectadas en el mismo periodo de tiempo fueron 166 (38.1%). En la Figura 40 se representan las coinfecciones detectadas. Al analizar las coinfecciones detectadas por las distintas técnicas empleadas, se observó que la mayor parte de las mismas eran por dos genotipos de VPH: 105 (63.3.0%), por tres genotipos de VPH: 46 (27.2%), por cuatro: 12 (7.2%) y más de cuatro genotipos de VPH en 3 (1.8%). El VPH 16 fue el más frecuentemente detectado en coinfecciones, detectándose en 85 ocasiones, seguido del VPH 6, que se detectó en 40 ocasiones, el VPH 51 en 37 ocasiones y los genotipos VPH 53 y 66, que se detectaron en 30 ocasiones, cada uno de ellos. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 51 - - 2 25 8 2 6 TOTAL 43 58 4 8 1 20 1 5 8 47 53 4 4 6 28 - 3 6 51 6 5 4 5 10 3 27 12 66 16 20 24 27 59 19 19 9 177 Figura 39. Distribución anual de los genotipos más frecuentes de VPH detectados mediante distintas técnicas. 144 16 14 12 10 8 6 4 2 0 VPH 6,16 VPH 16,52 VPH 16,18 VPH 16,58 VPH 16,66 VPH 16,53 VPH 11,16 Figura 40. Genotipos de VPH más frecuentes detectados por distintas técnicas en coinfecciones. VPH 16,51 VPH 18,51 Marta Domínguez-Gil González Resultados Concordancia para la detección de los distintos genotipos de VPH mediante LiPA, Microarrays y ERpcr Se realizó el cálculo de la concordancia, para las distintas técnicas, para poder expresar el porcentaje de acuerdo que existía entre ellas y determinar en qué medida hubo coincidencia en la clasificación entre las técnicas de detección en relación al total de VPH genotipados. Para poder cuantificar el grado de acuerdo, una vez eliminada la parte que puede atribuirse solamente al azar, se procedió a determinar el índice Kappa. Se consideró que un valor de Kappa podía considerarse como indicador de una concordancia aceptable, si era mayor o igual a 0,4 y excelente si era superior a 0,75. Cuando el valor de Kappa alcanzaba su máximo valor, suponía una total coincidencia entre las técnicas y por tanto el acuerdo observado era del 100%. En la Tabla 33 se representan la concordancia observada y los índices Kappa (con sus valores máximos y mínimos) para la detección de los genotipos de VPH detectados con mayor frecuencia (VPH 16, 6, 11, 18, 31, 42, 51, 53 y 58). 146 Marta Domínguez-Gil González Resultados TABLA 33. Índices Kappa para la detección de los genotipos más frecuentes de VPH mediante LiPA, Microarrays y ERpcr. a. b. CO = Concordancia observada; EE = Error estándar; IKm = Índice de Kappa mínimo; IKM = Índice de Kappa máximo. p-valor bajo la hipótesis nula de igualdad de índices Kappa entre pruebas 147 Marta Domínguez-Gil González Resultados Al analizar la concordancia entre LiPA y Microarrays (Figura 41) para los distintos genotipos de VPH detectados con mayor frecuencia, se pudo observar que para los genotipos 16, 11, 18 51 53 y 58 la concordancia entre ambas técnicas era excelente. Sin embargo la concordancia había sido sólo aceptable para los genotipos 6 y 31, entre LiPA y Microarrays. Únicamente, se dió un valor de Kappa máximo para el VPH genotipo 42, lo que suponía que existía una total coincidencia entre LiPA y Microarrays en la detección del VPH 42 y por tanto el acuerdo observado entre ambas técnicas era del 100% cuando el genotipo detectado era el 42. Al analizar la concordancia entre LiPA y ERpcr (Figura 42) para los distintos genotipos de VPH detectados con mayor frecuencia, se pudo observar que solamente para los VPH 16, 31, 53 y 58 la concordancia entre ambas técnicas era aceptable. La concordancia no era aceptable para los genotipos 11 y 18, entre LiPA y ERpcr. No existía total coincidencia entre LiPA y ERpcr para ninguno de los genotipos de VPH y por tanto el acuerdo observado entre ambas técnicas en ningún caso fue del 100%. En tres genotipos de VPH (VPH 6, 42 y 51) el grado de acuerdo observado entre LiPA y ERpcr se pudo atribuir enteramente al azar. Al analizar la concordancia entre Microarrays y ERpcr (Figura 43) para los distintos genotipos de VPH detectados con mayor frecuencia, se pudo observar que solamente para los VPH 16, 31, 53 y 58 la concordancia entre ambas técnicas era aceptable. La concordancia no era aceptable para los genotipos 11 y 18, entre Microarrays y ERpcr. No existía total coincidencia entre Microarrays y ERpcr para ninguno de los genotipos de VPH por tanto el acuerdo observado entre ambas técnicas en ningún caso fue del 100%. En tres genotipos de VPH (VPH 6, 42 y 51) el grado de acuerdo observado entre LiPA y ERpcr se pudo atribuir enteramente al azar. 148 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 VPH 42 VPH 16 VPH 18 VPH 53 VPH 58 VPH 51 VPH 11 Figura 41. Índices Kappa para los genotipos de VPH más frecuentes entre LiPA y Microarrays VPH 6 VPH 31 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 VPH 31 VPH 53 VPH 58 VPH 16 VPH 11 VPH 18 VPH 6 Figura 43. Índices Kappa para los genotipos de VPH más frecuentes entre Microarrays y Erpcr. VPH 42 VPH 51 Marta Domínguez-Gil González Resultados Al analizar la concordancia entre las tres técnicas (Figura 44) para los distintos genotipos de VPH detectados con mayor frecuencia, se pudo observar que solamente para los VPH 16, 18, y 53 la concordancia entre las técnicas era excelente. La concordancia era aceptable para los genotipos 11, 31 y 58, entre las tres técnicas. No existía total coincidencia entre las tres para ninguno de los genotipos de VPH, por tanto el acuerdo observado entre ellas en ningún caso fue del 100%. En tres genotipos de VPH (VPH 6, 42 y 51) el grado de acuerdo observado entre LiPA, Microarrays y ERpcr se pudo atribuir enteramente al azar. 151 0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 VPH 16 VPH 53 VPH 18 VPH 58 VPH 11 VPH 31 VPH 42 VPH 51 VPH 6 Figura 44. Índices Kappa para los genotipos de VPH más frecuentes entre las tres técnicas, LiPA, Microarrays y ERpcr (Global). Marta Domínguez-Gil González Resultados Comparativo entre técnicas: HC 2, ERpcr, LiPA y Microarrays En una muestra deliberadamente sesgada, en aras a la oportunidad de aplicación de las técnicas, los resultados obtenidos por las cuatro técnicas utilizadas en 113 se obtuvieron los resultados que se muestran en la Figura 45. En estas 113 muestras genitales se analizó la concordancia entre los resultados obtenidos por HC 2, ERpcr, LiPA y Microarrays. Los resultados obtenidos por HC 2 se distribuyeron como sigue: 15% de las muestras fueron negativas y 96 (85%) fueron positivas para detección de VPH: 81 VPH AR (84.4%); 8 VPH BR (8.3%) y 7 en las que se detectó VPH AR y BR (mixtas) (7.3%). Estas 96 muestras positivas por HC 2 se procesaron por las otras tres técnicas para ver la concordancia que existía entre ellas. Mediante ERpcr se detectó la presencia de ADN de VPH en 48 de las muestras analizadas (N=96), es decir, se confirmaron un 50% de las muestras. Mediante Microarrays se detectó la presencia de ADN de VPH en 94 de las muestras analizadas, es decir, se confirmaron un 97.9% de las muestras. Mediante LiPA se detectó la presencia de ADN de VPH en 93 de las muestras analizadas, es decir, se confirmaron un 96.9% de las muestras positivas por HC 2. El 43.2% de los VPH de AR no se detectaron por ERpcr, el 1.2% no se detectaron por Microarrays y un 2.5% no se detectaron por LiPA (N=81). El 87.5% de los VPH de BR no se detectaron por ERpcr, el 12.5% no se detectaron por LiPA y un 12.5% tampoco se detectaron por Microarrays (N=8). El 85.7% de los VPH positivos para ambos grupos de VPH (AR y BR) no fueron detectados por ERpcr, sin embargo, tanto LiPA como por Microarrays detectaron el 100% de las infecciones mixtas (VPH AR y BR) (N=7). Mediante ERpcr se detectaron tres coinfecciones, mientras que con LiPA se detectaron 59 coinfecciones y con Microarrays 43. El VPH 16 fue el VPH más frecuentemente identificado, apareciendo en 18 ocasiones mediante ERpcr, y en 52 (16 en infecciones únicas y 36 en coinfecciones) y 51 (22 en infecciones únicas y 29 en coinfecciones) ocasiones mediante LiPA y Microarrays, respectivamente. 153 Marta Domínguez-Gil González Resultados 90 80 70 60 50 L iP A 40 M ic ro a rr a y s 30 20 ER pcr 10 HC 2 VPH AR V PH BR VPH AR +BR HC 2 81 8 7 E R pcr 46 1 1 M ic ro a r ra y s 80 7 7 L iP A 79 7 7 HC 2 ERpcr M ic r o a r r a y s 0 L iP A Figura 45. Distribución de resultados al comparar HC 2, ERpcr, LiPA y Microarrays. 154 Discusión Marta Domínguez-Gil González Discusión Se acepta como evidencia científica que prácticamente todos los casos de cáncer de cuello de útero están relacionados con una infección persistente por determinados genotipos de VPH10,13,20. El cribado sistemático de muestras endocervicales mediante estudio citológico (Tinción de Papanicolaou) ha disminuido la incidencia de cáncer en aquellos países en los que estos métodos se realizan de forma sistemática21,22. Aunque la prueba de Papanicolaou ha tenido una contribución trascendente en la reducción de los casos de cáncer, su sensibilidad clínica se aproxima al 60% en los mejores casos, en función de las muestras poblacionales estudiadas. Por ello no puede ser considerada como el método más adecuado para el cribado primario del cáncer de cuello uterino21,22,23. El desarrollo y empleo de las modernas técnicas moleculares ha contribuido a conseguir niveles de sensibilidad excelentes en la detección de ADN de VPH superando al Papanicolaou. De este modo, la infección puede ser diagnosticada en mejores condiciones que antes, anticipando las posibles consecuencias que podrían ser detectadas mediante posteriores análisis citológicos o histológicos24,25,26. La consolidación de las técnicas moleculares en microbiología, y su estandarización, ha conducido a su empleo como herramienta diagnóstica habitual. Ante la demanda de este tipo de pruebas, las compañías de diagnóstico han generado numerosos equipos, muchos de ellos poco contrastados o sin estar validados por las principales instituciones sanitarias.143 Existen numerosas técnicas de cribado que van a seguir proliferando en los próximos años, pero sólo algunas han sido validadas por instituciones oficiales. Por ello es extraordinariamente importante la valoración de técnicas que se precisan aplicar para el diagnóstico rutinario de VPH y el rendimiento que podemos esperar los microbiólogos y clínicos de ellas, así como las dificultades microbiológicas derivadas de la interpretación clínica de los hallazgos que necesariamente producirán cambios en los patrones de diagnóstico y el cribado de las mujeres en relación con la prevención del cáncer de cérvix. Por todo lo expuesto, podría decirse que el diagnóstico de VPH va a constituir la herramienta para la prevención y el control del cáncer de cérvix más importante en los próximos años27. Se puede apuntar, por tanto, que resulta más racional realizar un cribado para detectar el virus y confirmar el daño citológico con Papanicolaou en mujeres infectadas. El valor predictivo negativo de ambas técnicas conjuntas es del 100% y, teniendo en 156 Marta Domínguez-Gil González Discusión cuenta el tiempo medio necesario para que una infección evolucione y provoque lesiones tumorales, permite diferir el siguiente control, en al menos tres a cinco años23,28. Evolución de la demanda analítica de detección de VPH y tipo de muestras /Variables de persona y de procedencia clínica El presente trabajo constituye, hasta donde conocemos, una de las primeras aproximaciones diagnósticas realizadas en España y una de las que abarca más número de años y muestras analizadas, ya que entre los años 1996 a 2006, se han procesado para detección de VPH; 4375 muestras, correspondientes a 3978 pacientes. Podemos afirmar que este estudio, en cierto modo, es representativo de la población de la provincia de Valladolid, y los datos obtenidos del mismo, son un reflejo de las características de la población de Valladolid, ya que es el único centro de la provincia en donde se realiza la detección de VPH. En la curva de evolución que se observa en este trabajo se distinguen tres fases claramente diferenciadas; una primera de implementación de la técnica con un aumento progresivo y gradual hasta el año 2001, una fase más o menos estacionaria hasta el año 2004, probablemente fruto de la falta de información nueva sobre el VPH, y a partir de 2004 un incremento muy notable debido a las expectativas curativas y preventivas que han despertado la elaboración de las nuevas vacunas. El total de 4375 determinaciones realizadas desde 1996 a 2006, supone una media global de solicitudes de 398 muestras al año, sobrepasando en la actualidad las 1000 muestras anuales (1163 en 2007). La detección de VPH, se ha realizado fundamentalmente en muestras genitales, siendo la mayoría de ellas, frotis de cérvix uterino. Esto es debido, a que la mayoría de las técnicas empleadas para la detección y genotipado de VPH, están validadas para su empleo con muestras de frotis de cérvix uterino, y en el presente estudio se da un claro predominio de esta modalidad de muestra frente a otras (exudados uretrales, biopsia…) que supone en conjunto un 98.4%, y que experimenta mínimas variaciones en el conjunto de años de este trabajo. Resulta lógico por tanto que la mayor proporción de pacientes en los que se realizó detección de VPH fueran mujeres, con una edad media de 36.3 años (mediana: 35; DE: 157 Marta Domínguez-Gil González Discusión 40.3). El grupo etario con mayor demanda analítica de VPH fue el de mujeres de 25-34 años (33.5%), seguido del grupo de 35-44 años (30.9%). Aunque en los últimos años ha habido un ligerísimo incremento de solicitud de detección de VPH en varones (con un incremento anual de 1.3 muestras), sigue siendo muy inferior la demanda de detección de VPH en el varón, ello es consecuencia de la menor sensibilidad de las técnicas en varones y la falta de validación de los tests en el mercado para su empleo en aquellos144. El mayor porcentaje de solicitud de detección de VPH, corresponde a mujeres con un 98.6% del total de las peticiones, frente al 1.4% de muestras que correspondían a varones. Como veremos más adelante el porcentaje global de detección de VPH en mujeres fue del 41%, y por el contrario en hombre fue muy inferior respecto a las mujeres, detectándose VPH en únicamente un 0.6%, coincidiendo con lo publicado en algunos estudios145,146. Entre los años 1996 a 2004, la mayoría de las muestras procesadas procedían de Atención Ginecológica del Servicio Territorial de Sanidad de Valladolid (AGSTS). Desde 2004 no se recibieron muestras de esta localización, por motivos de deslocalización sanitaria y actualmente, la mayoría de las peticiones de detección de VPH proceden de los dos grandes centros hospitalarios de Valladolid; el Hospital Clínico Universitario y el Hospital Universitario Río Hortega; aunque en los últimos años han ido incrementándose las solicitudes por parte de los distintos Centros de Salud de Valladolid y de la Asociación Castellano Leonesa de Ayuda al Drogodependiente (ACLAD), de tal manera que algo más de las tres cuartas partes de las peticiones proceden de los dos grandes hospitales y el resto de demanda, de otros centros. Se puede concluir que la demanda de detección de papilomavirus por parte del área Oeste y área Este de Valladolid, se cifra en torno a las 900 muestras anuales, siendo el perfil tipo de la misma, mujer de 36 años de edad que acude por primera vez al Servicio de Microbiología, derivada de la atención ambulatoria u hospitalaria ginecológica. Cribado de VPH El cribado de VPH constituye hoy día la técnica más eficaz para los programas de prevención de cáncer de cérvix. Cuando los resultados obtenidos en dicho cribado son negativos y la citología lo es también, se pueden retrasar las visitas siguientes de las mujeres hasta cinco años28. La mayoría de los cribados de VPH tienen como objetivo 158 Marta Domínguez-Gil González Discusión principal la detección de los genotipos más frecuentemente involucrados en la carcinogénesis o en los procesos de transformación celular147. Un método de cribado ideal de VPH debería por tanto ser capaz de detectar cualquier tipo de VPH que estuviera asociado a riesgo de desarrollo de lesiones carcinomatosas y al mismo tiempo debería ser una técnica de ejecución lo más sencilla posible, reproductible y con un alto valor predictivo negativo. Estas características conforman las propiedades de una técnica robusta148. La detección del VPH se reconoce en la actualidad como instrumento importante para la disminución de la incidencia y mortalidad del cáncer de cuello uterino. Muchos grupos evalúan la posibilidad de emplear técnicas moleculares para la detección del VPH como herramienta en el cribado primario del cáncer cervical y la atención de las pacientes con diagnóstico de ASCUS y lesiones de bajo grado. Las técnicas empleadas en estos trabajos, son muy distintas149,150,151. A pesar de ello, lo que resulta importante es que las mismas tengan una gran sensibilidad y especificidad para la detección del VPH. Las técnicas deben tener la sensibilidad y especificidad necesarias, además de una buena reproducibilidad, para considerarlas óptimas y aplicarlas en la detección del VPH en la práctica clínica. La posibilidad de reducir el porcentaje de falsos negativos de citología en el primer cribado de la población y la incorporación de una prueba molecular de VPH son algunas de las razones para evaluar estas pruebas. En el presente trabajo la mayoría del cribado, se ha realizado con la técnica HC 2, que a lo largo del tiempo, desde su aparición en 1998, ha sufrido ligeras modificaciones. Esta técnica de detección de VPH a partir de muestras genitales, preferentemente de mujeres, remitidas por los servicios de ginecología, ha ofrecido un altísimo rendimiento diagnóstico, ya que empleada en la modalidad de dos sondas ha ofrecido un rendimiento diagnóstico superior al 40% de resultados positivos sobre el total de muestras analizadas. La técnica de captura de híbridos utilizada desde que se implementó en nuestro hospital la detección de VPH, ha generado un porcentaje global de detecciones positivas de un 41.5%. Estos porcentajes han sido muy similares a los obtenidos en otros estudios de nuestro país152,153, dado que la captura de híbridos ha mostrado tener una buena fiabilidad tanto en lo referente a la reproducibilidad de la técnica como en lo referente a su rendimiento clínico154 . Se puede concluir que el cribado de VPH a lo largo de once años de estudio en la población atendida por los Hospitales de Valladolid, proporciona uno de los rendimientos más altos de las técnicas microbiológicas de diagnóstico, con una rentabilidad próxima al 40%. Podríamos decir, por tanto, que entre la analítica del 159 Marta Domínguez-Gil González Discusión laboratorio de Microbiología, la detección de VPH, es la técnica que ofrece un rendimiento mayor de diagnóstico (40%), ya que no hay ninguna otra en la que el porcentaje de positividad sea tan elevado. A pesar de la variación de la carga de trabajo específica de este análisis no se observa una tendencia lineal en un sentido decreciente o ascendiente del número de resultados positivos para VPH a lo largo del estudio de evolución. La demanda analítica aumenta, pero el porcentaje de positividad sufre mínimas variaciones a lo largo de estos once años de estudio apreciándose una tendencia estable en el porcentaje de hallazgos. Únicamente, se observaron diferencias significativas entre los años 2002 y 2003, en los que se sitúa de forma más marcada el estancamiento de peticiones, mientras que en el resto de los años que abarca el estudio no existen diferencias significativas respecto a número de muestras positivas, existiendo un paralelismo marcado entre peticiones y hallazgo de VPH. Estos hechos parecen demostrar que la demanda de VPH por parte de los clínicos sigue unos patrones constantes. A este respecto, cabe mencionar, la enorme discrepancia entre los datos publicados por las diferentes series en los últimos años. Ello obedece a la distinta modelización, diseño, grupo poblacional, metodología, entre otros, de los trabajos realizados. El rango de la prevalencia en población general a nivel mundial, de la infección por VPH varía entre el 2 y 44%51, rango en el que influye la edad de la población estudiada, la sensibilidad de los ensayos moleculares utilizados para la detección del ADN viral, la procedencia de la población estudiada, los objetivos del estudio, el ámbito de realización, entre otros. En el presente estudio los resultados demuestran la consistencia y verosimilitud de la muestra hospitalaria estudiada, lo cual permite afirmar que los resultados obtenidos aquí pueden ser extrapolables a otras muestras procedentes de pacientes ginecológicos. Se puede concluir que el diagnóstico de VPH por cribado mediante Captura de Híbridos (HC 2) ofrece una de las mayores rentabilidades diagnósticas del laboratorio de microbiología. La rentabilidad media ha sido cercana al 40%, sin oscilaciones a lo largo de once años de uso de dicha técnica sobre muestras de procedencia mayoritariamente ginecológicas. La prevalencia de detección de VPH está asociada a la edad, generalmente, la prevalencia es más alta en las edades inmediatas al inicio de las relaciones sexuales y responde al patrón de comportamiento sexual de la comunidad. En las poblaciones en las que el número de compañeros sexuales distintos y ocasionales es elevado, la prevalencia 160 Marta Domínguez-Gil González Discusión puede ser elevada, del 30-40% en los grupos de menores de 25 años44. Este primer pico de prevalencia va seguido de una disminución muy notable, de modo que en las edades intermedias (25-40 años) la detección viral se estabiliza en niveles del 3-10%. Esta fracción prevalente se interpreta como medida indirecta del grupo de mujeres portadoras crónicas de la infección viral y del grupo de alto riesgo para la progresión neoplásica. En algunas poblaciones se ha observado un segundo pico de prevalencia en las mujeres posmenopáusicas, cuya interpretación es todavía objeto de investigación. En este trabajo, la prevalencia de la infección por VPH es alta y creciente en mujeres jóvenes sexualmente activas hasta los 25 años, luego disminuye con la edad, para finalmente alcanzar un segundo pico de prevalencia después de los 55 años155. A pesar de que los grupos etarios con mayor demanda de detección de VPH son 2534 años y 35-44 años; el mayor porcentaje de diagnóstico de VPH se concentró en el grupo de menos de 25 años, en el que un 50.6% de las muestras resultaron positivas en el cribado de VPH. Se observa que a medida que aumenta la edad del paciente el porcentaje de diagnóstico de VPH va disminuyendo; es decir que existe una tendencia lineal decreciente con la edad, exactamente igual a lo que sucede en los cribados de población general pero con porcentajes logarítmicamente superiores en las muestras de procedencia clínica. En nuestro país, el porcentaje de la población objeto de estudio se sitúa en rangos similares a lo descrito en otros estudios con poblaciones semejantes20,156. Como en estos estudios, los grupos de edad más joven son donde hay más casos de positividad y se correlacionan con factores de riesgo ya conocidos como la paridad, el número de embarazos y el número de compañeros sexuales. El porcentaje de positividad para VPH fue significativamente mayor en mujeres que en varones, con un 40.9% y un 0.6%, respectivamente; aspecto a tener en cuenta ya que la técnica de HC 2 no ha sido validada para muestras uretrales. La sensibilidad en varones es inferior y prueba de ello es que todas las muestras proceden de servicios clínicos, bien de individuos con factores de riesgo de ETS o parejas de mujeres con VPH. En este estudio, la técnica de cribado se ha realizado mayoritariamente empleando dos sondas distintas de hibridación. La distribución de VPH positivos en función del riesgo de transformación celular fue mayoritariamente a favor de los VPH de alto riesgo de transformación celular (VPH AR), ya que se detectó en una proporción mucho mayor (88.7%) el VPH AR que el VPH de bajo riesgo de transformación celular (VPH BR); con un 11.3%. 161 Marta Domínguez-Gil González Discusión Al analizar la tendencia de la distribución de resultados de cribado de VPH AR en función de la edad del paciente, se pudo observar que la detección de VPH AR aumenta con la edad del paciente, aunque el porcentaje de VPH disminuye con la edad, por lo que se demuestra que aunque la frecuencia de hallazgo de VPH disminuye con el incremento etario, la probabilidad de diagnosticar un VPH de AR aumenta. Podemos señalar por tanto que el porcentaje de detección de VPH a partir de muestras ginecológicas, ofrece un perfil similar al descrito en trabajos de cribado de población general, aunque con frecuencias logarítmicamente mayores. Cabe apuntar que se observa una mayor frecuencia de detección de VPH en mujeres menores de 25 años y decreciendo dicha cifra con el aumento de la edad; si bien la probabilidad de encontrar VPH relacionadas con carcinogénesis aumenta con la edad de los pacientes. Como veremos más adelante, en el apartado correspondiente a la confirmación, la técnica de HC 2 ha sido capaz de detectar papilomavirus para los que no está validada, probablemente debido a que utiliza sondas degeneradas que son capaces de hibridar con VPH que no están incluidas específicamente. El cribado debe reunir características máximas de sencillez y aplicabilidad, junto con una sensibilidad máxima. No conocemos trabajos disponibles en los índices habituales bibliométricos, que hayan comparado la detección de VPH mediante HC 2 con el uso de dos sondas (de AR y BR) por separado frente a la detección utilizando una mezcla de ambas sondas. Por ello en este estudio se ensayó en una muestra reducida (362 muestras) el cribado utilizando una única sonda que clasificaba a las muestras como positivas o negativas, sin diferenciar entre VPH AR o VPH BR. Al comparar los resultados obtenidos con esta modalidad y la HC 2 con sondas diferenciadas como estándar de oro, se pudo observar que la sensibilidad al utilizar sonda única era de 91.7% y la especificidad de 98.9%. Cabría esperar que al usar una mezcla de ambas sondas, tuviéramos los mismos resultados que con el empleo de las sondas AR y BR utilizadas de forma separada. Sin embargo los resultados obtenidos permiten apreciar como en 17 muestras existen discrepancias. Al analizarse las discordancias entre ambas técnicas, se observó que 15 muestras fueron negativas al utilizar sonda única y sin embargo con sondas diferenciadas fueron positivas, y otras dos muestras fueron positivas al utilizar sonda única y fueron negativas al emplear sondas diferenciadas. Al estudiar estas discordancias por otras técnicas como LiPA y Microarrays se confirmaron como positivas únicamente cuatro muestras, precisamente aquellas en las 162 Marta Domínguez-Gil González Discusión que el ratio de HC 2 con sonda doble fue elevado, y de las dos que habían sido positivas por la mezcla de las dos sondas, no se pudo confirmar ninguna de ellas. Los resultados obtenidos en este ensayo de 362 muestras en las que se pudo aplicar estas dos formas de cribado, una con dos sondas (1 por AR y otra por BR) y otra mezclando ambas, después de las correcciones y ajustes mencionados más arriba, parecen apuntar a una ligera pérdida de sensibilidad. Como se ha señalado anteriormente, parece no existir bibliografía sobre el cribado de VPH comparando el empleo de HC 2 con sonda única, y con sondas diferenciadas, ni de las posibles discrepancias entre utilizar una u otra modalidad de la técnica, pero en función de nuestros resultados, cabría la posibilidad de plantearnos si el umbral de positividad de la técnica es demasiado bajo para considerar una muestra positiva para VPH, ya que en este estudio, se observa que solo unas pocas muestras, en las que la reactividad era próxima al umbral, no se confirmaron al emplearse otras técnicas. Según algunos estudios, la exactitud de la captura de híbridos depende del valor de corte usado como umbral de detección positiva. Al aumentar el umbral positivo del test, disminuyen la sensibilidad y el valor predictivo negativo (VPN), y aumentan la especificidad y el valor predictivo positivo (VPP)125. Con un nivel de corte de 1 URL, equivalente a 1 pg/ml de ADN del VPH (umbral de positividad aconsejado por el laboratorio que lo comercializa), el HC 2 tiene una sensibilidad del 85-100% y un VPN del 100% en la mayoría de los trabajos publicados157,158. Parece recomendable, que en aquellas muestras con resultado próximo a 1 unidad del ratio de positividad se empleen otras técnicas de confirmación, o se reclame nueva muestra, para evitar los falsos positivos. Con la sonda única (mezcla de sondas en una única sonda) hubo cuatro muestras que no se detectaron y sin embargo fueron positivas por HC 2 con las sondas AR y BR diferenciadas, confirmadas posteriormente por LiPA o Microarrays. La aplicación del cribado con una sonda única reduce la sensibilidad de la técnica aunque mejora la relación coste-eficacia, debido a la reducción de costes y tiempo de análisis. A tenor de lo expuesto parece que la técnica de HC 2 utilizada en sonda doble, puede dar algunos resultados falsos positivos, sobre todo en muestras próximas al umbral de la prueba. Por otra parte, parece claro que el uso de la técnica en la modalidad de una única sonda (mezcla de las dos; AR y BR) deja escapar cuatro casos positivos de VPH, dos de ellos de BR (VPH 6 y VPH 11) y dos de AR (VPH 16). 163 Marta Domínguez-Gil González Discusión El uso del cribado mediante hibridación con sonda única (mezcla de sonda de alto riesgo y bajo riesgo en una única sonda) permitiría una mejora del coste/efectividad de la técnica, con una ligera disminución de la sensibilidad. Lo que restringiría su uso en el cribado de determinadas poblaciones. La concordancia obtenida es la máxima con respecto a otras técnicas (95.3%). Cribado de VPH con técnicas basadas en PCR En los últimos seis años, han aparecido diversas técnicas de detección de VPH, basadas en la PCR, que ofrecen la posibilidad de detectar y tipar un número limitado de VPH en la misma reacción. Esta detección está dirigida de manera preferente hacia los que entrañan riesgo de transformación celular. Los métodos de PCR basados en la amplificación de ADN de VPH poseen una alta sensibilidad para la detección del virus en muestras cervicogenitales159. Estos ensayos presentan el problema de la posible contaminación con producto amplificado, por lo que deben realizarse en laboratorios especializados, y se deben utilizar los que estén validados. La técnica de detección LiPA, es una de estas técnicas que ofrecen la posibilidad de detectar y tipar VPH en la misma reacción, es decir realiza cribado y genotipado en una misma reacción. Los resultados obtenidos en el estudio de las 413 muestras en las que se aplicó las dos formas de cribado (una HC 2 con dos sondas diferenciadas y LiPA) parecen apuntar a una pérdida de sensibilidad del LiPA (80.2%) y una especificidad del 92.9% respecto a HC 2. Los resultados obtenidos permiten apreciar como en 60 muestras existen discrepancias. Al analizarse las discordancias entre ambas técnicas, en 48 muestras se observó que fueron negativas al utilizar LiPA y sin embargo con HC 2 con sondas diferenciadas fueron positivas, y otras 12 (2.9%) fueron positivas al utilizar LiPA y negativas al realizarse HC 2 con sondas diferenciadas. Estos datos de discordancia han sido referidos en distintos estudios al emplear técnicas moleculares de detección frente a VPH160. De las 48 muestras en las que HC 2 había resultado positivo y el LiPA negativo, únicamente se pudo realizar Microarrays en 20, de las cuales; solo seis muestras se confirmaron como positivas al utilizarse Microarrays (dos coinfecciones por VPH 39 y VPH 68, una por VPH 6 y VPH 53, un VPH 16, un VPH 6 y un VPH 31). 164 Marta Domínguez-Gil González Discusión Es necesario señalar como el genotipo 53 no está incluido en el cóctel de sondas de HC 2 y sin embargo es detectado por dicha técnica debido al uso de sondas degeneradas. Este aspecto ha sido señalado para los de bajo riesgo, ya que el HC 2 tiene un cierto grado de reactividad cruzada con tipos de VPH BR no representados en la sonda161, y otros autores han apuntado la posibilidad de que las mujeres con cifras cercanas al nivel de corte (1-2 URL) tienen un bajo riesgo de desarrollar HSIL162. Por el contrario, al estudiar las discordancias, positivas por LiPA y negativas por HC 2, por la técnica de Microarrays, se confirmaron como positivas seis muestras, de las 12 en las que LiPA era positivo y el HC 2 negativo, cuatro de ellas de Bajo riesgo (tres VPH 70 y un tipo 40) y dos de probable Alto riesgo (VPH 53). Se observa como los falsos negativos de HC 2 son frente a genotipos que no están incluidos en la mezcla de sondas para hibridación. Estos resultados apuntan a que el test de HC 2 detecta con muy buena sensibilidad los VPH para los que esta validado y en ocasiones, pero no siempre otros tipos no incluidos fundamentalmente el 53. Estos resultados obtenidos hacen decrecer el VPN del LiPA y no demuestran una mayor superioridad para el cribado, sin embargo si facilitan en una única reacción el genotipado. La concordancia entre la prueba validada por la FDA y el LiPA fue del 85.5%. Las técnicas de cribado deben tener un alto VPN aun a expensas de dar falsos positivos. Parece claro que el uso de la técnica LiPA deja escapar varios casos positivos de VPH, pero al introducir otra técnica de PCR (Microarrays) se comprueba que HC 2 también parece no diagnosticar seis casos de VPH, aunque de genotipos no incluidos en dicho test. Los resultados obtenidos en el estudio de las 377 muestras en las que aplicó las dos formas de cribado, una HC 2 con dos sondas diferenciadas y la otra Microarrays, parecen apuntar a una pérdida de sensibilidad de los Microarrays (86.7%) y una especificidad del 93,1%, valores ligeramente superiores a la técnica LiPA. Los resultados obtenidos permiten apreciar como en 39 muestras existen discrepancias. Al analizarse las discordancias entre ambas técnicas, en 27 muestras se observó que fueron negativas al utilizar Microarrays y sin embargo con HC 2 con sondas diferenciadas fueron positivas, y otras 12 fueron positivas al utilizar microarrays y negativas al realizarse HC 2 con sondas diferenciadas, siendo la correlación entre ambas técnicas del 89.7% 165 Marta Domínguez-Gil González Discusión Al estudiar estas discordancias por otra técnica de PCR (LiPA), en 8 muestras en las que HC 2 había resultado negativo y Microarrays positivo, se confirmaron como positivas seis muestras, (tres VPH tipo 70, dos VPH tipo 53 y un VPH tipo 40). Las otras dos muestras, fueron negativas cuando se realizó LiPA. De la misma forma 23 muestras en las que HC 2 había resultado positivo y Microarrays negativo, 14 muestras resultaron también negativas por LiPA, y nueve muestras se confirmaron como positivas al utilizarse LiPA (cuatro coinfecciones por los VPH tipos 6+40+51+53, VPH 6+16+58, VPH 16+58, y VPH 16+45 y dos VPH tipo X, un VPH 51, un VPH 31 y un VPH 6). Llama la atención en este comparativo la presencia de coinfecciones detectadas por la técnica de LiPA Las técnicas de cribado deben tener un alto valor predictivo negativo aunque sea a expensas de falsos positivos. No existe ninguna técnica que permita detectar el 100% de los VPH en una determinada muestra poblacional, por ello el uso de una técnica de cribado muy sensible y otra a continuación de identificación y confirmación de los positivos permite diseñar un algoritmo de diagnóstico de VPH suficientemente robusto. Del análisis de los resultados obtenidos por las técnicas basadas en PCR (Microarrays y LiPA) se deduce que la correlación con HC 2 es superior para microarrays, a continuación LiPA y después la ERpcr, aunque ninguna de las tres técnicas fue capaz de detectar todos los papilomavirus que pueden estar presentes. En el cribado, HC 2 detectó a más mujeres positivas que las técnicas de PCR. Estas diferencias fueron menores respecto a los Microarrays (203 contra 188), que con LiPA (243 contra 207). Las correlaciones fueron similares aunque ligeramente superiores para Microarrays. Las sondas de HC 2 pueden suscitar reacciones cruzadas con otros tipos que no están presentes en las técnicas de PCR y que corresponden a tipos de bajo riesgo. Sin embargo, como ha quedado demostrado, la detección de dichos VPH no siempre se produce. Estas muestras pueden considerarse como "falsos positivos" para HC 2. Por otro lado, las discordancias que se obtienen entre técnicas de PCR pueden obedecer a fallos en la amplificación de la PCR por delecciones o cambios en la secuencia viral que afectan el resultado final de la PCR. Aspectos que se discutirán en el apartado siguiente de la discusión. En conclusión, la técnica de cribado que parece cumplir mejor las expectativas de detección de VPH asociados a cáncer es la Captura de Híbridos (HC2), que en algunos casos permite además, la detección de genotipos no incluidos en el test. 166 Marta Domínguez-Gil González Discusión Las técnicas de cribado basadas en la PCR ofrecen correlaciones similares con HC 2, única técnica validada por la FDA, con ligera superioridad de Microarrays respecto a LiPA y mucho menor para la ERpcr. Aunque ninguna de las tres técnicas es capaz de diagnosticar todas las muestras VPH positivas en una población determinada. Todas las técnicas de detección ensayadas, tanto genéricas como específicas para determinados genotipos de VPH, tienen falsos negativos incluso con genotipos asociados a alto riesgo de transformación. El uso combinado de técnicas podría solventar ese problema. Confirmación e identificación de VPH positivos por la prueba de cribado Un porcentaje significativo de muestras positivas en la prueba de cribado (HC 2 con sondas diferenciadas) se sometieron posteriormente a procedimientos de confirmación por distintas técnicas. De un total de 630 muestras positivas por HC 2, se han confirmado en 410 (65.1%) de las mismas, por alguna o varias de las otras técnicas (ERpcr, LiPA y Microarrays). La confirmación se ha realizado siempre con técnicas basadas en la PCR que han evolucionado en el tiempo. En un principio se utilizó, como ha sido expuesto en material y métodos, una PCR con posterior digestión mediante enzimas de restricción (ERpcr), que fue retirada años después del mercado. Con aquella técnica se obtuvieron porcentajes de confirmación muy bajos (50%). La baja sensibilidad se confirma claramente, ya que al comparar el resultado obtenido por HC 2 con sondas diferenciadas y el obtenido al utilizar ERpcr, solo un 50% de las muestras positivas por HC 2 fueron confirmadas. Hubo un número significativo de muestras (26 muestras), que no amplificaban con esta PCR, debido a factores que desconocemos pero en los que se ha apuntado una baja sensibilidad amplificación para determinados genotipos e inhibiciones de la amplificación. Al analizar los resultados obtenidos por esta técnica de identificación en función del riesgo de transformación celular se vió que la sensibilidad para detectar VPH era en general baja, pero especialmente baja para confirmar las infecciones por VPH de BR, con una sensibilidad del 19.4%. Además, no demostró ser una buena técnica para detectar infecciones mixtas, detectando en contadas ocasiones coinfecciones por VPH de AR y de BR, aunque si detectó coinfecciones de distintos tipos de AR o de distintos tipos de BR pero nunca simultáneamente. 167 Marta Domínguez-Gil González Discusión En 2003, la confirmación por ERpcr, fue retirada del mercado por parte del propio fabricante, que la sustituyó por otra técnica. La confirmación e identificación por una metodología basada en LiPA, permite un mayor porcentaje de muestras confirmadas, cercano al 80%. Esta técnica ofrece una sensibilidad mayor que la PCR y digestión mediante enzimas de restricción, para confirmar e identificar VPH, con una sensibilidad del 80.2% y especificidad del 92.9%. Algunos estudios refieren concordancias entre HC 2 y LiPA del 88%160. Este método, aparecido en 2002, se continua validando en estudios que además utilizan primers tradicionales como MY09/11163 e incluso en comparación con la captura de híbridos164, usando distintos tipos de muestras, y tanto en raspados cervicales165,166 como en biopsias de cuello uterino167,168,169, ha demostrado tener una elevada sensibilidad para detectar la presencia de ADN de VPH, aunque inferior a HC 2. Las características operacionales de la técnica al analizar los resultados en función del riesgo de transformación celular demuestran que la sensibilidad para detectar VPH era mejor y diferente a la observada con la ERpcr, detectando también de manera más eficiente los VPH de AR. La técnica LiPA ofreció una sensibilidad del 64.7% para detectar VPH de AR debido a que algunas infecciones detectadas como AR por HC 2, al utilizar LiPA, eran identificadas como VPH de BR. Las coinfecciones por distintos tipos de VPH son un tema de actualidad. En algunas ocasiones alguno de los genotipos implicados puede tener una mayor representación final tras la amplificación. Por ello solo la aplicación de técnicas como secuenciación permitirá resolver esas discrepancias. La confirmación e identificación por una metodología basada en Microarrays, demostró el mayor porcentaje de muestras confirmadas (86.7%). Esta técnica ofrece así mismo una especificidad mayor que la PCR con digestión por enzimas de restricción y que el LiPA, para detectar VPH, (93.1% frente a 79.6% y 92.9%). Al analizar los resultados en función del riesgo de transformación celular se vió que la sensibilidad para confirmar la presencia de VPH era buena, pero detectaba mejor los VPH de AR. La técnica de Microarrays, ofreció una sensibilidad del 74.6% para detectar VPH de AR debido al igual que LiPA a la detección exclusiva de genotipos de VPH de BR que habían sido detectados como AR en HC 2. Este hecho similar a lo que ocurre con la técnica de LiPA sucedió en menos ocasiones que con la ERpcr y con el LiPA. A tenor de los resultados obtenidos la ERpcr demostró un perfil de sensibilidad y especificidad mucho menor que las otras dos técnicas de PCR. 168 Marta Domínguez-Gil González Discusión De las técnicas de confirmación/identificación ensayadas, la que está basada en microarrays presenta los mejores resultados, seguida por la técnica de LiPA y con un porcentaje de confirmación excesivamente bajo la de ERpcr. Dichos porcentajes oscilan entre cerca de un 90% a un 50%. En general las tres técnicas de confirmación/identificación detectan mejor las infecciones por genotipos de VPH asociados a alto riesgo que los de bajo riesgo, probablemente el diseño específico para los de alto riesgo es la causa principal. Genotipado de VPH El genotipado de VPH permite identificar de forma más precisa aquellos genotipos que la literatura científica ha asociado con más frecuencia a riesgo de cáncer. Este aspecto es importante en el seguimiento clínico de pacientes ginecológicas con distintos grados de anomalía citológica y especialmente importante, a raíz del desarrollo de programas de vacunación170. Los resultados del genotipado deben tener en cuenta la distinta sensibilidad de las técnicas para la detección de los distintos genotipos de VPH. Como se ha comentado anteriormente, las técnicas que identifican VPH están basadas en distintas modalidades de PCR y ofrecen resultados similares. Las pruebas de genotipado candidatas deberían ser compatibles con las pruebas actuales clínicamente validadas que detectan VPHs oncogénicos de forma genérica, en términos de sensibilidad y especificidad170. En este estudio se han podido realizar técnicas de identificación a una tercera parte de las muestras positivas por cribado, lográndose una identificación en el 65% de todos los casos. Este porcentaje inferior al 100% se debe a que la técnica de ERpcr no amplificaba correctamente una importante proporción las muestras y su rendimiento de identificación fue el más bajo de todas las empleadas. Estos resultados han evolucionado a lo largo del estudio en función de la técnica empleada. Las primeras técnicas de identificación mostraron una sensibilidad muy baja e inaceptable para algunos genotipos lo que pone de manifiesto la trascendencia en la elección de uno u otro tipo de test. De los resultados de la identificación se pueden obtener dos tipos de información distintas, la existencia y prevalencia de los genotipos más frecuentes y la presencia de 169 Marta Domínguez-Gil González Discusión coinfecciones. La identificación es importante por que permitirá en el seguimiento, verificar cual de los genotipos es el que persiste. Según uno de los estudios más citados y amplios39, el VPH 16 es el más común en todos los países, aproximadamente 58.9%; (43.9-72.4). El VPH 18 es el segundo más frecuente (15%) aunque en España y Colombia es menor (3.7 y 4.4%, respectivamente), y mayor en Filipinas (27.9%). El tercero más común, según estos autores, es el VPH 45 (5.9%), tiene muy baja prevalencia en España y Colombia (0.8 y 0.6%, respectivamente), y la mayor prevalencia en Filipinas (15.7%). Los VPH 31 y 35 son más comunes en Latino América que en otros países. El VPH 52 tiene su mayor prevalencia en Perú (8.6%). La proporción y el orden de prevalencia varían ligeramente dependiendo de la prueba de identificación que se utilice. Mediante la prueba de identificación más antigua (ERpcr) el genotipo de VPH que se detectó con mayor frecuencia de forma global fue el VPH 16 (39.8%), coincidiendo con lo descrito en la bibliografía39, aunque con un porcentaje inferior. Sin embargo, la mayoría de los estudios coinciden en señalar que el VPH 18 es también de los más frecuentes, y en el presente estudio al utilizar esta ERpcr, el segundo genotipo más frecuentemente detectado fue el VPH X (no tipable) (11.9%), el tercero el VPH 53 (10.2%), el cuarto el VPH 31(8.9%), el quinto el VPH 58 (8.5%), el sexto el VPH 6 (5.1%), el séptimo el VPH 33 (4.7%) y ya en octavo lugar el VPH tipo 18 (3.0%). Estos porcentajes no suman 100% debido a que algunos de los VPH se encuentran en forma de coinfección. En otro estudio español, utilizando esta ERpcr, los resultados fueron similares a los obtenidos en el presente estudio, detectando genotipos de VPH no identificados en un porcentaje ligeramente superior al 6% y obtuvieron la mayor prevalencia por genotipos VPH 16(30%), en segundo lugar el VPH 53 (9.3%) y en tercer lugar el VPH 58 (8.5%)171. El genotipo de VPH que se detectó con mayor frecuencia mediante la técnica LiPA, fue el VPH 16 (39.6%), un porcentaje similar al obtenido por ERpcr. Sin embargo; al utilizar LiPA, el segundo genotipo más frecuentemente detectado fue el VPH 51 (21.3%), que por la más antigua de las técnicas aparecía en decimocuarto lugar, el tercero el VPH 53 (16.9%), el cuarto el VPH 11 (13.0%), y el quinto el VPH 6 (13%). El VPH 18 se detectó en el noveno lugar con un 10.6% respecto al total de muestras identificadas por esta técnica. Como se puede comprobar este orden es diferente al obtenido mediante el uso de la técnica de ERpcr, aunque si bien, el conjunto de muestras no fuera el mismo, si 170 Marta Domínguez-Gil González Discusión procedían del mismo área sanitaria por lo que las variables de sesgos quedan minimizadas. Al igual que con las otras dos técnicas anteriores, el genotipo de VPH que se detectó con mayor frecuencia mediante Microarrays, fue el VPH 16 (44.7%), pero con esta técnica el siguiente en frecuencia fue el VPH 6 (21.3%), el tercero el VPH 53 (14.9%), el cuarto el VPH 51 (11.7%) y el quinto el VPH 58 (10.6%). El VPH 18 se detectó en octava posición con un 6.4%. Debido a la variación de las técnicas para identificar, los que podríamos denominar genotipos más minoritarios; el porcentaje global de prevalencia individual de los VPH detectados, se ve influenciado por las técnicas usadas. Sin embargo, al corresponder a números de muestras semejantes procedentes del mismo tipo de población, es probable que el uso de distintas técnicas se traduzca en un efecto corrector. Del apartado de identificación global de este estudio se pueden extraer distintas conclusiones. En primer lugar que el VPH 16 es el más frecuente con porcentajes que oscilan entre el 26.7% y el 44.7%. El segundo hecho demostrable es que el orden de frecuencia depende de forma importante de la técnica empleada. Todas reconocen e identifican el VPH 16, sin embargo a tenor de los resultados obtenidos algunas de ellas parecen identificar mejor a los genotipos minoritarios o mucosos. En la actualidad se ha concedido bastante importancia a algunos de los genotipos minoritarios en relación con VPH 16. Así los genotipos 18, 31 y 45 relacionados también con el cáncer escamoso de cérvix y el adenocarcinoma aparecen en primeros lugares en estudios de muchos de los países en los que se han analizado la prevalencia en población general. En este estudio el porcentaje de VPH 16 alcanza el 26%, cifra similar a la de otros artículos publicados en España65,153,172, siendo el más frecuente con cualquiera de las técnicas empleadas y parecen relativamente frecuentes otros que originan infecciones cutaneomucosas no transformantes (VPH 11 y 6). Como se ha demostrado en este estudio, el VPH 18 no es el segundo genotipo más frecuente tras el VPH 16. Ninguna de las técnicas empleadas lo ha situado en segunda posición y en el cómputo global aparece en undécima posición aunque con alguna de las técnicas está en 8º-9º lugar. Aunque el presente estudio no constituye en sí mismo un trabajo diseñado para conocer la prevalencia de genotipos de VPH, los datos de positividad constantemente 171 Marta Domínguez-Gil González Discusión obtenidos en el cribado, así como la procedencia de las muestras hacen muy probable que los genotipos hallados constituyen una imagen en espejo algo desdibujada de lo que ocurre en la población general. Es de destacar como los genotipos 53, 58 y 51 son los que en el global comparten los primeros órdenes de frecuencia tras el VPH 16 y el 6. En otros estudios realizados en España han obtenido en primer lugar el VPH 6, seguido del VPH 16, VPH 58, VPH 11 y en quinto lugar tanto el VPH 18 como el 53 152. Sin embargo, otros autores españoles próximos a nuestro medio sanitario173, obtuvieron en primer lugar el VPH 16, seguido del VPH 53 y el VPH 58. La asociación entre algunos genotipos de VPH de alto riesgo y el cáncer de cérvix está bien establecida. En el 99.7% de los cánceres de cérvix, existe ADN de VPH, siendo el más frecuente el VPH 16174. En este estudio hemos obtenido datos similares con respecto a los VPH de alto riesgo oncogénico, concretamente para el VPH 16, no así para el VPH 18, habiendo detectado 177 VPH del genotipo 16, pero pueden tener relación directa con el cáncer de cérvix, pues la presencia de ADN de VPH de alto riesgo oncogénico identifica tanto a las mujeres con cáncer cervicouterino como a las que corren especial riesgo de padecerlo y serán objeto de especial vigilancia152. Podemos concluir que el VPH 16 es el más frecuentemente detectado en muestras de procedencia mayoritariamente ginecológica, independientemente de la técnica de identificación empleada. Los porcentajes obtenidos con los distintos ensayos realizados oscilan entre el 27 y el 45%. El orden de frecuencia de los VPH minoritarios depende de forma importante de las técnicas empleadas. Aunque todas reconocen de manera muy fiable el genotipo 16, parecen existir discrepancias importantes en la fiabilidad de identificación de los restantes genotipos. Por otra parte, el genotipo 53 no se incluye en ninguna de las vacunas y en el presente estudio se puede observar que en los resultados globales del genotipado es el tercero en frecuencia, tras el VPH 16 y el VPH 6. Es interesante señalar que este genotipo, es muy prevalente también en otros estudios de nuestro país175, y no se encuentra entre los prevalentes en los estudios realizados en mujeres con cáncer de cérvix, siendo clasificado como probablemente de alto riesgo. Es necesario estudiar la importancia epidemiológica de este genotipo por su posible repercusión en los programas y diseño de futuras vacunas. 172 Marta Domínguez-Gil González Discusión Otro aspecto a tener en cuenta es la prevalencia del genotipo 45, ya que de los quince genotipos de VPH causantes de carcinoma cervicouterino, este es el comunicado como tercero en frecuencia. El VPH 16 es el más frecuente, seguido del 18 y del 45. Al primero se le atribuyen un 50 por ciento de los casos, mientras que el segundo y el tercero son causantes de un 20 y un 10 por ciento de los carcinomas respectivamente176. Las vacunas desarrolladas contra el VPH, y ya comercializadas en España, protegen frente a los genotipos 16 y 18 y por otro lado, al 16, 18, 6 y 11. Algunos estudios clínicos han observado que, aunque no se incluían estos genotipos específicamente, si existía protección frente a los tipos 45 y 31. Se ha demostrado en un estudio que la vacunación con una proteína modificada del VPH 16 puede proteger no sólo frente a este genotipo, sino también frente a otros176. En el presente estudio, el genotipo 45 se halló en muy pocos casos, únicamente en un 0.5% de las muestras genotipadas, ocupando la posición vigesimosegunda respecto al orden de frecuencia global de genotipos. El genotipo 31 sin embargo, ocupó el sexto lugar en orden de frecuencia. Por ello es importante seguir investigando la importancia epidemiológica de otros genotipos de VPH no incluidos en las vacunas, para poder determinar su implicación y repercusión futuras sobre lesiones precancerosas y cancerosas. La técnica de HC 2 no incluye los genotipos, VPH 40, VPH 53, VPH 62, VPH 66, VPH 70 y VPH 81, sin embargo en este trabajo se demuestra que aunque no están específicamente reseñados en el coctel de genotipos, por el fabricante, se han identificado 30 VPH de dichos genotipos (18 VPH 53, 7 VPH 70, dos VPH 66, un VPH 40, un VPH 62 y un VPH 81) sobre el total de muestras cribadas por la técnica HC 2 y ensayadas por técnicas de identificación/confirmación, hecho que ya ha sido indicado en algún estudio177. Una de las ventajas del genotipado es su capacidad para ofrecer un plus de rendimiento del cribado de VPH, mediante la identificación de aquellas mujeres con detección de VPH que están afectadas por un VPH oncogénico o de naturaleza persistente170. Si no se introduce el genotipado completo en el cribado, surge la pregunta importante sobre la frecuencia en que una mujer positiva repetidamente por VPHs oncogénicos (con o sin detección independiente de los VPH 16 y 18) tiene una infección oncogénica por el mismo genotipo que persiste. A medida que sucesivas cohortes de mujeres vayan recibiendo la vacuna contra el VPH, el cribado periódico mediante el uso de pruebas de detección del VPH será útil para monitorizar la duración de la protección otorgada por la vacuna a la población o la existencia de casos refractarios a la vacunación. 173 Marta Domínguez-Gil González Discusión Según vamos asistiendo al reemplazo del uso de la citología convencional por el uso de la prueba de detección de VPH como prueba de cribado primario, el genotipado podrá mostrar su utilidad para la clasificación de las mujeres positivas en función de su riesgo de desarrollar una lesión precancerosa o cáncer, y dependerá el manejo clínico más apropiado. Coinfecciones de VPH En pacientes diagnosticadas de cáncer cervical de útero, según uno de los estudios más referenciados en los últimos años39, un 91.9% tuvieron infección por un solo genotipo de VPH, y el 8.1% tuvieron coinfecciones por múltiples tipos. Cuando se realizó el genotipado a partir de controles sanos, el porcentaje de infecciones por un solo genotipo de VPH fue del 86.1%, y por múltiples genotipos en un 13.9 %. El rango de prevalencia de la infección múltiple por VPH en cuello uterino es bastante amplio, pudiendo encontrarse entre el 0%178, hasta más del 50%179. Esta variación podría estar influenciada por diversos factores, entre los que no podemos dejar de mencionar a las características epidemiológicas de los grupos clínicos así como la metodología utilizada para la detección del ADN viral. Es posible, que la verdadera prevalencia de las infecciones múltiples haya sido subestimada, principalmente en estudios epidemiológicos, debido al uso de metodologías moleculares con baja sensibilidad para detectar ciertos tipos de VPH. Esta hipótesis, que compartimos, fue investigada hace pocos años39,180.. En el presente estudio la mayoría de las muestras genotipadas por ERpcr fueron por un solo genotipo (95.3%) y únicamente en un 4.7% de las muestras, se detectó más de un genotipo de VPH. Al igual que otros estudios en España171, donde obtuvieron porcentajes de coinfección por ERpcr próximos al 6%. En teoría esta PCR podría haber sido la ideal ya que su diseño posibilitaba la identificación de cualquier genotipo, mientras que las otras técnicas están condicionadas por las sondas que se incluyen bien en las tiras del LiPA o en los Microarrays. Al emplear ERpcr las coinfecciones lo fueron por dos genotipos de VPH (63.6%) o por tres genotipos de VPH (36.4%) exclusivamente. Sin embargo, el LiPA identificó más coinfecciones que la ERpcr. De las 207 muestras genotipadas por esta técnica, un 56.5% fueron coinfecciones y un 43.5% fueron infecciones por un solo genotipo. Por lo que esta técnica parece que detecta mejor que la ERpcr las coinfecciones, debido probablemente a la mayor sensibilidad exhibida y 174 Marta Domínguez-Gil González Discusión demostrada a lo largo del estudio. Al emplear la técnica LiPA, las coinfecciones fueron por dos genotipos de VPH en un 63.2% de los casos, por tres genotipos un 20.5%, por cuatro genotipos un 6% y por más de cuatro genotipos distintos en un 10.3% de los casos. Los resultados de identificación obtenidos por Microarrays son semejantes a los de LiPA y muestran que un 46.8% fueron infecciones por un único genotipo de VPH, mientras que el 53.2% fueron coinfecciones, resultados bastante similares en proporción a los ofrecidos por LiPA. Al igual que el LiPA, esta técnica detecta bastante bien las coinfecciones por diferentes genotipos de VPH. Sin embargo, al emplear Microarrays, las coinfecciones fueron mayoritariamente por dos genotipos de VPH (84.0%), siendo las que se identificaron por tres y cuatro genotipos; un 12 y un 2%, respectivamente, y más de cuatro un 2%. Estos resultados ofrecen diferencias respecto a los obtenidos por la técnica LiPA, siendo menores las coinfecciones múltiples (tres o más genotipos) a pesar de que incluye más genotipos que el LiPA (25 detectados por LiPA frente a los 35 genotipos que detecta microarrays). Las distintas modalidades de identificación de VPH muestran diferentes capacidades para detectar coinfecciones. La técnica más antigua (ERpcr) es la que diagnostica menos coinfecciones y la de LiPA la que detecta más. Los resultados globales del genotipado e identificación de VPH en muestras de procedencia mayoritariamente ginecológicas, muestran que las coinfecciones son más frecuentes que las infecciones por un solo genotipo, siendo la más frecuente las del VPH 16 con otros de alto riesgo. En este estudio al analizar los resultados globales del genotipado de VPH, se obtuvieron un 38.1% de coinfecciones por más de un genotipo de VPH, la mayor parte de las mismas eran por dos genotipos de VPH (63.3%), por tres genotipos (27.2%), por cuatro genotipos (7.2%) y por más de cuatro genotipos (1.8%). En algunos estudios realizados en nuestro país152 tenían porcentajes de infecciones mixtas próximas al 3%, siendo la mayor parte de las mismas por dos genotipos (aproximadamente 67%). De las infecciones mixtas el más frecuente de los VPH de AR fue el VPH 16 y el VPH 6 de los de BR, tras estos fueron el VPH 51, 53 y 66. Las coinfecciones mas frecuentes obtenidas en el presente trabajo fueron las producidas por lo genotipos VPH 6 y 16, detectándose en quince ocasiones, seguida de VPH 16 y 52 (siete ocasiones), VPH 16 y 18 (seis ocasiones), VPH 16 y 58 (seis ocasiones), VPH 16 y 66 (seis ocasiones), VPH 16 y 53 (cinco ocasiones), VPH 16 y 11(cuatro ocasiones), VPH 16 y 51(cuatro ocasiones) y VPH 18 y 51 (tres ocasiones). En otros estudios39, la coinfección 175 Marta Domínguez-Gil González Discusión más frecuente fue la producida por los genotipos VPH 16 y 18, seguida de VPH 16 y33, VPH 18 y 45, VPH 16 y 31, VPH 18 y 33, etc. En el presente estudio, ha sido más frecuente la presencia de coinfecciones que la detección de un solo genotipo de VPH. La importancia clínica de las infecciones múltiples todavía no está bien definida, aunque estudios preliminares indican que un alto porcentaje de las lesiones de alto grado posee infecciones múltiples en comparación con las lesiones de bajo grado167. En muestras de carcinoma, la prevalencia de la infección múltiple es menor, lo que podría explicarse si se considera la hipótesis clonal de la carcinogénesis cervical. En este sentido, las infecciones múltiples podrían reflejar una mayor tolerancia inmunológica a la infección por VPH, con la acumulación consecuente de infecciones. Desde este punto de vista, las infecciones múltiples pueden representar un marcador de persistencia de la infección, lo cual han demostrado algunos estudios como un posible factor de progresión de la lesión181. La coinfección de varios genotipos virales formando entre si variadas combinaciones fue un hallazgo sorprendente en este estudio. Llama la atención la marcada presencia del VPH 53, VPH 58 y VPH 51, solos o en coinfecciones con el VPH 16, hallazgo relevante por ser genotipos de alto riesgo oncogénico. Finalmente, no podemos descartar la posibilidad de sobreestimar la prevalencia de la infección múltiple sobre todo cuando usamos métodos de amplificación tan sensibles, por lo que es conveniente realizar mas estudios de índole comparativa en nuestro medio para estandarizar estas técnicas moleculares en la detección y tipificación de ADN de VPH. En el conjunto de coinfecciones detectadas, la mayoría lo son por dos genotipos, con un 63% de los casos, por tres genotipos un 27% y por más de tres un 10%. Concordancia entre pruebas de diagnóstico utilizadas Al analizarse la concordancia observada para detectar los distintos genotipos de VPH, entre las distintas técnicas se comprobó que entre LiPA y Microarrays la concordancia era excelente para detectar el VPH 42, muy buena para detectar VPH 16, 18 y 53 y aceptable para detectar VPH 6 y 31. Entre LiPA y ERpcr, la concordancia fue bastante peor. Únicamente fue aceptable, para los VPH 16, 31, 53 y 58. Finalmente, la 176 Marta Domínguez-Gil González Discusión concordancia entre Microarrays y LiPA, únicamente fue aceptable, para los VPH 16, 31, 53 y 58. Al compararse las tres técnicas, la concordancia entre ellas fue excelente para detectar los genotipos 16, 18 y 53, y aceptable para detectar el VPH 11, 31 y 58. Estos resultados parecen demostrar de forma indirecta, como el interés en el diseño de métodos moleculares de detección esta influenciado por la literatura previa existente, focalizando las capacidades de identificación y detección de determinados genotipos frente a otros. Se debe destacar que la detección del VPH está reconocida como un instrumento útil para la disminución de la incidencia y mortalidad del cáncer de cuello uterino. Numerosos estudios149,150,151,182,183 evalúan la posibilidad de emplear distintas técnicas moleculares para la detección del VPH como herramienta en el cribado primario del cáncer cervical y la atención a los pacientes con diagnóstico de ASCUS y lesiones de bajo grado. Pese a ello, es importante que las técnicas aplicadas tengan una gran sensibilidad y especificidad para la detección de VPH. La captura de híbridos (HC 2) es una técnica que puede aplicarse con facilidad en los laboratorios, ya que no requiere instalaciones especiales como personal con amplia experiencia en técnicas moleculares, aunque puede tener un cierto grado de reacciones cruzadas con otros genotipos de bajo riesgo oncogénico, los denominados falsos positivos184. Por el momento, la técnica no permite conocer el genotipo específico de VPH, lo que en un futuro puede ser un factor limitante con la paulatina implantación de la vacuna contra VPH 6, 11, 16 y 18 181. Las técnicas basadas en PCR permiten conocer el genotipo específico y las infecciones múltiples, lo que posibilita el seguimiento particular de la persistencia de la infección y el riesgo probable. Sin embargo, tiene desventajas, como la necesidad de contar con espacios adecuados y personal con experiencia para minimizar los riesgos inherentes a las técnicas de amplificación. Estos factores limitan su incorporación en muchos laboratorios. Por lo tanto, es necesario focalizar los esfuerzos en el desarrollo de un método rápido, fácil, sensible y específico para identificar genotipos de alto riesgo oncogénico de VPH; más aún, debe tener una aplicación a gran escala y costo moderado para que todas las mujeres tengan acceso a él172. Las técnicas de identificación que ofrecen más coinfecciones, por 2 ó más genotipos de VPH, son las de más reciente aparición. El aumento de la sensibilidad de estas técnicas respecto a las PCR antiguas, ha sido seguramente una de las causas de estos hallazgos, como ha sucedido en el presente estudio. 177 Marta Domínguez-Gil González Discusión Los porcentajes de coinfecciones obtenidos con las dos técnicas aparecidas más recientemente son similares. El VPH más frecuentemente identificado siempre es el VPH 16, por cualquiera de las técnicas, sin embargo el orden siguiente es diferente según la técnica empleada; aunque se debe tener en cuenta que solo en 113 muestras se pudieron realizar las tres técnicas de identificación. A pesar de las limitaciones inherentes a este tipo de estudios, podemos concluir que los datos obtenidos indican que si bien existe una razonable concordancia entre la captura de híbridos (HC 2), Microarrays y LiPA, el uso de un solo ensayo en estudios de prevalencia tal vez no refleje la tasa real de infección por determinados genotipos de VPH, por ello la combinación de dos técnicas, una de cribado y otra de identificación aumentaría la sensibilidad sin merma de la especificidad. 178 Conclusiones Marta Domínguez-Gil González Conclusiones Conclusiones 1ª. La demanda de detección de papilomavirus por parte del área Oeste y área Este de Valladolid, se cifra en torno a las 900 muestras anuales, siendo el perfil tipo de la misma, mujer de 36 años de edad que acude por primera vez al Servicio de Microbiología, derivada de la atención ambulatoria u hospitalaria ginecológica. 2ª. El diagnóstico de VPH por cribado mediante Captura de Híbridos (HC 2) ofrece una de las mayores rentabilidades diagnósticas del laboratorio de microbiología. La rentabilidad media ha sido cercana al 40%, sin oscilaciones a lo largo de once años de uso de dicha técnica sobre muestras de procedencia mayoritariamente ginecológicas. 3ª. El porcentaje de detección de VPH a partir de muestras ginecológicas, ofrece un perfil similar al descrito en trabajos de cribado de población general, aunque con frecuencias logarítmicamente mayores. Observándose una mayor frecuencia de detección de VPH en mujeres menores de 25 años y decreciendo dicha cifra con el aumento de la edad; si bien la probabilidad de encontrar VPH relacionados con carcinogénesis aumenta con la edad de los pacientes. 4ª. El uso del cribado mediante hibridación con sonda única (mezcla de sonda de alto riesgo y bajo riesgo en una única sonda) permitiría una mejora del coste/efectividad de la técnica, con una ligera disminución de la sensibilidad, lo que restringiría su uso en el cribado de determinadas poblaciones. 5ª. La técnica de cribado que parece cumplir mejor las expectativas de detección de VPH asociados a cáncer es la Captura de Híbridos (HC 2), que en algunos casos permite además la detección de genotipos no incluidos en el test. 180 Marta Domínguez-Gil González Conclusiones 6ª. Las técnicas de cribado basadas en la PCR ofrecen correlaciones similares con HC 2, única técnica validada por la FDA, con ligera superioridad de Microarrays respecto a LiPA y mucho menor para la ERpcr. Aunque ninguna de las tres técnicas es capaz de diagnosticar todas las muestras VPH positivas en una población determinada. 7ª. De las técnicas de confirmación/identificación ensayadas, la que está basada en microarrays presenta mejores resultados, seguida por la técnica de LiPA y con un porcentaje de confirmación excesivamente bajo la de ERpcr. Dichos porcentajes oscilan entre cerca de un 90% a un 50%. 8ª. En general las tres técnicas de confirmación/identificación detectan mejor las infecciones por genotipos de VPH asociados a alto riesgo que los de bajo riesgo, probablemente el diseño específico para los de alto riesgo es la causa principal. 9ª. El VPH 16 es el más frecuentemente detectado en muestras de procedencia mayoritariamente ginecológica, independientemente de la técnica de identificación empleada. Los porcentajes obtenidos con los distintos ensayos realizados oscilan entre el 27 y el 45%. 10ª. El orden de frecuencia de los VPH minoritarios depende de forma importante de las técnicas empleadas. Aunque todas reconocen de manera muy fiable el genotipo 16, parece existir discrepancias importantes en la fiabilidad de identificación de los restantes genotipos. 11ª. Las distintas modalidades de identificación de VPH muestran diferentes capacidades para detectar coinfecciones. La técnica más antigua (ERpcr) es la que diagnostica menos coinfecciones y la de LiPA la que detecta más. 181 Marta Domínguez-Gil González Conclusiones 12ª. Los resultados globales del genotipado e identificación de VPH en muestras de procedencia mayoritariamente ginecológicas, muestran que las coinfecciones son más frecuentes que las infecciones por un solo genotipo, siendo la más frecuente las del VPH 16 con otros de alto riesgo. 13ª. En el conjunto de coinfecciones detectadas, la mayoría lo son por dos genotipos con un 63%, por tres genotipos un 27% y por más de tres genotipos un 10 %. 14ª. A pesar de las limitaciones inherentes a este tipo de estudios, podemos concluir que los datos obtenidos indican que si bien existe una razonable concordancia entre la Captura de Híbridos (HC 2), Microarrays y LiPA, el uso de un solo ensayo en estudios de prevalencia tal vez no refleje la tasa real de infección por determinados genotipos de VPH, por ello la combinación de dos técnicas, una de cribado y otra de identificación aumentaría la sensibilidad sin merma de la especificidad. 182 Anexos Marta Domínguez-Gil González Anexos Anexo 1. Clasificación citológica, Bethesda 2001. Idoneidad de la muestra Satisfactoria para evaluación (señalar la presencia o ausencia de células endocervicales o metaplásicas) Insatisfactoria para valoración (especificar el motivo) Muestra rechazada o no procesada (especificar el motivo) Muestra procesada y examinada, pero insatisfactoria para valoración de anormalidades epiteliales debido a… (especificar el motivo) Categorización general (opcional) Negativa para lesión intraepitelial o malignidad Células epiteliales anormales Otras Interpretación/resultado Negativa para lesión intraepitelial o malignidad Organismos Trichomonas vaginalis Hongos morfológicamente compatibles con Candida Flora sugestiva de vaginosis bacteriana Bacterias morfológicamente compatibles con Actinomyces Cambios celulares compatibles con virus del herpes simple Otros hallazgos no neoplásicos (opcional) Cambios celulares reactivos asociados a inflamación (incluye reparación típica), Radiación, Dispositivo intrauterino Células glandulares posthisterectomía Atrofia Células epiteliales anormales Células escamosas Células escamosas atípicas (ASC) de significado indeterminado (ASC-US); no puede excluir lesion escamosa intraepitelial de alto grado (ASC-H) Lesión escamosa intraepiteliales de bajo grado (LSIL) incluye: cambios por virus del papiloma humano/displasia leve/neoplasia cervical intraepitelial (CIN 1) Lesión escamosa intraepitelial de alto grado (HSIL) Incluye: cambios por displasia moderada y grave, carcinoma in situ; CIN 2 y CIN 3 Carcinoma escamoso Células glandulares Células glandulares atípicas (AGC) (especificar Endocervical, endometrial o sin especificar) Células glandulares atípicas, posible neoplasia (AGC-N) (especificar Endocervical o sin especificar) Adenocarcinoma “in situ” Endocervical (AIS) Adenocarcinoma Otros Células endometriales normales en mujer =40 años LECTURA AUTOMATIZADA Y TÉCNICAS AUXILIARES (Incluir si precisa) NOTAS DIDACTICAS Y SUGERENCIAS (Opcional) 184 Marta Domínguez-Gil González Anexos Anexo 2. Genotipos de VPH detectados por diferentes sistemas moleculares. GENOTIPOS DE VPH ALTO RIESGO 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 68 73 82 PROBLABLE ALTO RIESGO 26 53 66 BAJO RIESGO 6 11 40 42 43 44 54 61 70 72 74 81[CP8304] 89 HC2 ERpcr LIPA Microarrays X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X HC: Captura de Híbridos; ERpcr: Amplificación mediante PCR y posterior digestión con enzimas de restricción. 185 Bibliografía Marta Domínguez-Gil González Bibliografía Bibliografía 1. Ciuffo G. Innesto positivo con filtrado di verrucae volgare. Giorn Ital Mal Venereol 1907;48:12-17. 2. M’ Fadyean J, Hobday F. Note of the experimental “transmission of warts in the dog”. J Comp Pathol Ther 1898;11:341-344. 3. zur Hausen H, Meinhof W, Scheiber W, Bornkamm GW. Attempts to detect virusspecific DNA in human tumours. I. 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