05. d. ramon

05. D. RAMON
3/7/06
13:27
Página 48
1136-4815/06/48-52
ALIMENTACION, NUTRICION Y SALUD
Copyright © 2006 INSTITUTO DANONE
ALIM. NUTRI. SALUD
Vol. 13, N.º 2, pp. 48-52, 2006
Probióticos: aspectos microbiológicos y tecnológicos
D. Ramón Vidal
DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PÚBLICA, CIENCIA DE LOS ALIMENTOS,
TOXICOLOGÍA Y MEDICINA LEGAL. FACULTAD DE FARMACIA. UNIVERSITAT DE VALENCIA
BURJASSOT, VALENCIA. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA. INSTITUTO DE AGROQUÍMICA Y
TECNOLOGÍA DE ALIMENTO-CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS.
DEPARTAMENTO DE I+D, BIÓPOLIS S.L. VALENCIA
RESUMEN
D
ABSTRACT
D
urante los últimos años las ventas de probióticos
han aumentado notoriamente en muchos países. Su producción industrial exige la búsqueda del microorganismo y
su validación científica, la optimización de su producción
industrial, la formulación del alimento adicionado del probiótico y su validación clínica. El futuro de la investigación
con probióticos vendrá marcado por el empleo de las nuevas tecnologías “ómicas”.
uring the last few years, sales of probiotics have
been increased in many countries. The industrial production of these microorganisms includes the search for the
probiotic and its scientific validation, the optimization of
its industrial production, the formulation of the probiotic
food or beverage and finally its clinical validation. Future
trends in probiotic research will be based on the use of the
new “omic” technologies.
Palabras clave: Probiótico. Validación. Producción.
Key words: Probiotic. Validation. Production.
¿QUÉ ES UN PROBIÓTICO?
Durante siglos las bacterias ácido lácticas se han
usado empíricamente como forma de preservar y
mejorar la calidad de los alimentos fermentados.
Desde hace unos pocos años se acumulan muchas
evidencias científicas que indican que el consumo
sistemático de algunas de ellas afecta a la composición de la microflora del tracto gastrointestinal del
individuo que las ingiere. Como consecuencia se
produce un efecto beneficioso en su salud. Durante
más tiempo del deseable muchas de estas afirmaciones se basaban en evidencias in vitro o estudios preclínicos con animales de experimentación, pero en
los últimos años se han acumulado evidencias científicas en experimentación clínica con voluntarios humanos (Tabla I) que nos permiten afirmar que algunas de estas bacterias tienen un efecto positivo
sobre algunas patologías clínicas en humanos (1). En
48
muchos países desarrollados se ha disparado el consumo de alimentos adicionados con estos microorganismos como una forma de prevenir la aparición
de determinadas enfermedades o mejorar el estado
general de salud del consumidor. A este tipo de microorganismos los denominamos probióticos.
Existen muchas definiciones de probiótico. En general, considerando lo propuesto en su día por ILSI,
FAO y OMS podemos entender por probiótico “un
suplemento alimentario compuesto por microorganismos viables que tienen una influencia beneficiosa
sobre la salud del consumidor”. En esta definición se
hace preciso considerar que dicha influencia es específica de cepa, debe producirse con la ingesta en
cantidad usual del alimento y debe ser demostrada
por medio de una experimentación científica rigurosa. Aunque ateniéndose a este concepto de probiótico hay muchos microorganismos que pueden serlo,
los que se comercializan son fundamentalmente bacterias ácido lácticas (Tabla II). De hecho, casi todos
05. D. RAMON
3/7/06
13:27
Página 49
Vol. 13, N.º 2, 2006
PROBIÓTICOS: ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS Y TECNOLÓGICOS
TABLA I
ALGUNAS PATOLOGÍAS EN LAS QUE SE DISPONE DE
ALGÚN ENSAYO CLÍNICO CON PROBIÓTICOS CON
EFECTO POSITIVO
Patología
Colitis ulcerosa
Dermatitis atópica
Diarrea asociada a Clostridium difficile
Diarrea asociada al consumo de antibióticos
Diarrea infantil
Diarrea de los viajeros
Enfermedad de Crohn
Pouchitis
Síndrome de colon irritable
Vaginitis
Confeccionada con los datos descritos en 1.
TABLA II
ALGUNOS MICROORGANISMOS IDENTIFICADOS
COMO PROBIÓTICOS
Grupo microbiano
Bifidobacterias
Enterococos
Lactobacilos
Lactococos
Levaduras
Especie
Bifidobacterium adolescentis
Bifidobacterium animalis subsp. lactis
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium brevis
Bifidobacterium infantis
Bifidobacterium longum
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus amylovorus
Lactobacillus casei
Lactobacillus crispatus
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gallinarum
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus johnsonii
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus salivarius
Lactococcus lactis subsp. lactis
Saccharomyces boulardii
los probióticos comerciales están compuestos por
células viables de bacterias ácido lácticas pertenecientes a los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus. Las bacterias utilizadas con mayor frecuencia
como probióticos son distintas cepas de las especies
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus
rhamnosus. Aunque existe mucha confusión sobre
la taxonomía de algunas de estas cepas, como sucede en otros procesos industriales, dicha confusión
obedece en más ocasiones a intereses comerciales
que a cuestiones científicas.
Hay muchos productos alimentarios que contienen probióticos y están autorizados para la comercialización. Para tener una idea del potencial de
mercado de estos productos, baste recordar que en
el año 1998 se manejaban datos de ventas elevados
en Alemania (60 millones de dólares), Holanda (30
millones de dólares), Francia (28 millones de dólares), España (24 millones de dólares) y Reino Unido
(14 millones de dólares) y que sólo en el último de
estos países, en el año 2002 esta cifra había aumentado hasta 676 millones de dólares (2,3). En alimentación convencional los derivados lácteos como el
yogur, el queso, los helados o la mantequilla son el
vehículo más utilizado para comercializar probióticos
aunque existen otros como las leches de soja, mayonesa, zumos e incluso carnes, cacahuetes o sopas.
Aun así se hace necesario recordar que buena parte
de la producción mundial de probióticos se vende en
forma de suplementos nutricionales, particularmente
en Estados Unidos.
¿CÓMO PRODUCIR UN ALIMENTO CON
UN PROBIÓTICO?
Aunque a todos nos parece familiar el consumo
de este tipo de productos, con frecuencia desconocemos todos los pasos de investigación y desarrollo
que hay que llevar a cabo para poder formular el alimento adicionado del probiótico. Estos pasos incluyen la búsqueda del microorganismo y su validación
científica, la optimización de su producción industrial, la formulación del alimento adicionado del probiótico y su validación clínica. Dado el elevado coste
de los ensayos clínicos en humanos, ninguna empresa del sector asume este tipo de investigación hasta
estar seguros de ser capaces de disponer de un microorganismo que tenga unas determinadas propiedades funcionales in vitro se pueda producir de forma estable y sea viable en la matriz alimentaria a la
que se va a añadir.
En cuanto a la búsqueda del probiótico, se recomienda partir de muestras biológicas humanas (fundamentalmente heces) provenientes de individuos sa49
05. D. RAMON
3/7/06
13:27
Página 50
D. RAMÓN VIDAL
nos. Se suelen seguir estrategias de enriquecimiento
haciendo cultivos en medios a pH ácido adicionados
de sales biliares. De esta forma se seleccionan cepas
que posteriormente sean capaces de resistir las condiciones extremas del tracto digestivo y puedan por lo
tanto ejercer una acción positiva sobre la salud del
consumidor. Las cepas seleccionadas se someten a
una caracterización taxonómica exhaustiva, combinando propiedades fenotípicas con características genéticas. Es importante definir una huella genética de
la cepa que permita posteriormente identificarla a objeto de protección jurídica. Además se evalúa la resistencia al pH ácido y a las sales biliares y también se
estudia su capacidad de adherencia a mucus intestinal, se analiza su perfil de resistencia a antibióticos y
la posible producción de determinados metabolitos indeseados. A todo ello se suman estudios bioquímicos
y fisiológicos in vitro e in vivo con animales de experimentación que permitan definir las bases moleculares de la actuación del probiótico en la patología o
función fisiológica objeto de estudio. Este hecho es
uno de los requisitos de la nueva reglamentación sobre alegaciones funcionales.
Optimizar la producción industrial de un probiótico no es tarea fácil. Cada cepa tiene un comportamiento diferencial, lo que obliga a definir los
parámetros de crecimiento (medio de cultivo, temperatura, agitación, oxigenación, fase de crecimiento) y conservación (fase de cultivo para la recogida,
tipo de secado, crioprotector, temperatura de almacenamiento) para cada nuevo probiótico. A pesar
de su precio, se suelen utilizar medios complejos
como los denominados BFM, MRS o TPY (4). En el
caso de las bifidobacterias y Lb. acidophilus, dada
su baja actividad proteolítica se suelen añadir al medio aminoácidos, extracto de levadura o hidrolizados de caseína (5,6). Se optimiza el inóculo inicial,
la temperatura y, si se trabaja en feed-batch, el régimen de alimentación del nutriente limitante. Suele
ser crítica la aireación y en consecuencia el potencial redox, por lo que se suele crecer el microorganismo en un ambiente anaerobio. En ocasiones es
adecuado añadir algunos compuestos con actividad
antioxidante como el ácido ascórbico o la L-cisteína
(7,8). En cualquier caso, esta fase de producción del
probiótico debe ir ligada a la siguiente que se refiere
a su conservación. En este sentido, la liofilización
suele ser el método más conveniente. Para optimizar esta fase se analiza la fase de cultivo en la que
recoger la biomasa (fase logarítmica versus fase estacionaria), se ensayan diferentes crioprotectores y
su efecto sobre la viabilidad del microorganismo, la
textura del probiótico desecado y su influencia organoléptica en el alimento final. Con todo ello se estudian distintas temperaturas de almacenamiento y se
define la vida útil del probiótico como ingrediente
alimentario en las condiciones subóptimas de almacenamiento.
Finalmente hay que escoger la matriz alimentaria a
la que añadir el probiótico. Una vez seleccionada hay
50
ALIM. NUTRI. SALUD
que asegurar la dispersión homogénea del mismo en el
seno del alimento. Este trabajo es más sencillo al trabajar con bebidas que con alimentos sólidos donde se hace necesario afinar las operaciones unitarias de mezcla. Sin duda, en esta fase lo más importante es definir
la concentración del probiótico en el alimento o bebida
final. Dicha concentración debe ser un compromiso
entre la dosis efectiva diaria de probiótico y la ingesta
usual diaria del alimento. A título orientativo, la Federación Internacional de Lechería o la Asociación Japonesa para los Derivados Lácteos recomiendan 107
ufc/ml en matrices líquidas. En el caso de alimentos
sólidos los expertos sugieren cifras en torno a las 109
ufc/g. El problema es que las distintas matrices alimentarias pueden afectar diferencialmente a la viabilidad
de un mismo probiótico. Para conocer este efecto se
analiza la supervivencia del probiótico almacenando el
alimento en las condiciones de venta. En estos trabajos
hay que considerar entre otros la influencia del pH, el
oxígeno o el tipo de envase. Se han descrito casos de
grandes pérdidas de viabilidad (menos de 103 ufc/ml o
106 ufc/g en el alimento final) que invalidarían el efecto funcional (9). Es un problema especialmente grave
en el caso de alimentos con larga vida útil (papillas infantiles) y también con determinados probióticos (bifidobacterias). Una de las formas de evitarlo es acudir a
la microencapsulación del probiótico. En este sentido
se ha descrito la microencapsulación en lípidos como
una estrategia de mejora de la vida útil tras tratamientos térmicos y también el empleo de gelatina, gomas
vegetales o geles de alginato como materiales de encapsulación que podrían incluso proteger al probiótico
de las condiciones extremas de acidez del tracto digestivo tras la ingesta (10,11).
ÚLTIMOS PASOS: EVALUACIÓN CLÍNICA
Y REQUISITOS LEGALES
Como antes se indicó, el nuevo reglamento europeo sobre alegaciones funcionales exigirá conocer las bases moleculares de la alegación funcional
asociada al probiótico, pero también obligará a demostrar su efecto en al menos dos ensayos clínicos
en hospitales diferentes. Para llevar a cabo este tipo de experimentación clínica se recomienda seguir las directrices del grupo de expertos
FAO/OMS que en el año 2001 se reunieron en la
ciudad argentina de Córdoba (12). En esencia, estas recomendaciones sugieren una dinámica de
evaluación comparable a la que se lleva a cabo con
fármacos aunque con una exigencia menor. Es importante destacar que las evaluaciones clínicas
siempre se deben llevar a cabo con el alimento final adicionado con el probiótico y no con el probiótico aislado. Como en el caso de las evaluaciones de fármacos se habla de distintas fases.
05. D. RAMON
3/7/06
13:27
Vol. 13, N.º 2, 2006
Página 51
PROBIÓTICOS: ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS Y TECNOLÓGICOS
La llamada fase I, o fase de evaluación de la seguridad, implica un trabajo previo de determinación del
perfil de resistencia a antibióticos del probiótico, la ausencia de producción de compuestos indeseados y, a
ser posible, su estatus GRAS. Si el desarrollo del producto se ha llevado a cabo de forma racional, buena
parte de este trabajo ya habrá sido abordado durante
la selección del probiótico (vide supra). La fase II, o fase de evaluación de la eficacia, conlleva los ensayos en
voluntarios humanos informados. Deben ser ensayos
al azar a doble ciego y con un control de placebo. Como antes indicamos, se recomienda llevar a cabo al
menos dos ensayos en centros clínicos independientes. La fase III o fase de evaluación de la efectividad es
opcional. Consiste en comparar la efectividad del probiótico con la ejercida por un producto comparable
(otro probiótico previamente comercializado o un fármaco). En la medida de lo posible conviene llevar a cabo estas evaluaciones en poblaciones sanas. Como antes se indicó, el coste de este tipo de evaluaciones
implica que las empresas del sector no abordan su ejecución hasta tener una completa seguridad de la validez tecnológica del probiótico.
Superadas todas estas evaluaciones se llega a la comercialización del alimento adicionado con el probiótico. En la actualidad en la Unión Europea (UE) se comercializan muchos productos con probióticos. Con
más frecuencia de la deseada en su publicidad existe
un marketing demasiado agresivo y se hace uso de
alegaciones funcionales que no se corresponden con la
experimentación preclínica y clínica abordada para esa
cepa concreta. En la UE no existe una definición legal
ni una legislación sobre probióticos pero existe una serie de legislaciones horizontales que las empresas productoras deben tomar en consideración (13). La primera de ellas es el reglamento de nuevos alimentos. El
listado de categorías de nuevos alimentos incluidos en
esta reglamentación incluye un apartado para ingredientes alimentarios que sean o consistan en microorganismos. Una interpretación razonada de este requisito implicaría reconocer como nuevo alimento
cualquier nuevo probiótico. Sin embargo, a pesar de
haberse presentado desde el año 1997 un total de 53
aplicaciones de nuevo alimento, ninguna ha hecho referencia a un nuevo probiótico. La segunda es la regulación sobre producción orgánica que limita el empleo
del término “bio” o “eco” para los productos de la
agricultura ecológica. La falta de base científica para
tal decisión sólo puede ser explicada por los intereses
económicos y las presiones políticas que la promovieron. Lo bien cierto es que un producto que contenga
un probiótico no podrá usar esta terminología a menos que se haya elaborado siguiendo las directrices de
la agricultura ecológica. El resto de normativas horizontales que afectarán a la comercialización de probióticos en la UE aún no están en vigor. Son el anteriormente mencionado reglamento sobre alegaciones
funcionales y la propuesta de la Comisión para la regulación del yogur y los productos similares al yogur. Sin
duda, su aprobación marcará pautas de comercializa-
ción y etiquetado de los alimentos con probióticos, sobre todo el primero de ellos que pretende que: a) la
evaluación científica sea el único motor del desarrollo
de alimentos funcionales; b) las alegaciones funcionales se basen en pruebas fundadas, objetivas y apropiadas; c) las pruebas se sustenten en exigencias científicas en vigor; y d) las alegaciones sean verdaderas y no
induzcan al error al consumidor.
EL FUTURO
El futuro de la investigación en probióticos vendrá
de la mano de las nuevas tecnologías “ómicas”. Debemos incrementar nuestro conocimiento sobre la ecología microbiana del tracto gastrointestinal para, de esa
forma, desarrollar probióticos más eficaces. En este
sentido es interesante destacar el comienzo de algunos
proyectos de metagenómica de bacterias de la cavidad
bucal y el tracto gastrointestinal (14). A ello habrá que
sumar los estudios de secuenciación de genomas de
probióticos. En la fecha de redacción de este artículo
hay secuencia pública del genoma de tres cepas probióticas (B. longum NCC2705, Lb. johnsonii
NCC533 y Lb. plantarum WCFS1) aunque existen
proyectos en marcha de otras muchas más (15). La información que de ellas obtengamos, unida a estudios
de transcriptómica y proteómica, será la base de los
probióticos de la próxima década.
Llegados a este punto conviene recordar que ya se
han desarrollado los primeros probióticos transgénicos. Se han diseñado cepas transgénicas de Lactococcus lactis que expresan el gen de la subunidad B de la
toxina tetánica (16) o genes de interleuquinas (17) y
también cepas transgénicas de Lactobacillus que producen antígenos capsulares de rotavirus (18). La poca
receptividad de los consumidores europeos a este tipo
de productos dificulta su desarrollo aunque nadie duda
de su valor en algunos países en vías de desarrollo.
Desde la UE, con la barriga llena, es fácil decir no a estos desarrollos que solventan problemas sanitarios que
no afectan a nuestra sociedad. La pregunta clave es:
¿aceptaría un consumidor europeo un probiótico
transgénico eficaz contra la enfermedad celiaca? Quizás en este caso la respuesta fuera otra. Lo que es probable es que ese desarrollo marcaría un antes y un después de la investigación con probióticos
CORRESPONDENCIA:
Daniel Ramón Vidal
Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública,
Ciencia de los Alimentos, Toxicología y Medicina Legal
Facultad de Farmacia
Universitat de Valencia
Avda. Vicent Andrés Estellés, s/n
46100 Burjassot, Valencia
e-mail: [email protected]
51
05. D. RAMON
3/7/06
13:27
Página 52
D. RAMÓN VIDAL
ALIM. NUTRI. SALUD
BIBLIOGRAFÍA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
52
O’May GA, Macfarlane GT. Health claims associated with
probiotics. In: Probiotic dairy products. Tamime AY, editor. Oxford: Blackwell Publishing; 2005. p. 138-66.
Shortt C. The probiotic century: historical and current
prospective. Trends in Food Science and Technology
1999; 10: 411-7.
Anónimo. Short life dairy products. Müller Market Report.
2003.
Shah NP. Probiotic bacteria: selective enmeration an survival in dairy foods. J Dairy Sci 2000; 83: 894-907.
Desai A, Powell IB, Shah NP. Survival and activity of probiotic lactobacilli in skim milk containing prebiotics. J Food
Sci 2004; 69: 57-60.
Lucas A, Sodini I, Monnet C, Jolivet P, Corrieu G. Probiotic cell counts and acidification in fermented miles supplemented with milk protein hydrolisates. International Dairy
Journal 2004; 14: 47-53.
Dave RI, Shah NP. Effectiveness of ascorbic acid as an oxygen scavenger in improving viability of probiotic bacteria in
yoghurts made with commercial strater cultures. International Dairy Journal 1997; 7: 435-43.
Dave RI, Shah NP. Effectiveness of cysteine as redox potential reducing agent in improving viability of probiotic
bacteria in yoghurts made with commercial strater cultures.
International Dairy Journal 1997; 7: 537-45.
Tamime AY. Fermented milks: a historical food with modern applications-a review. Eur J Clin Nutr 2002; 56: 215.
Rao AV, Shivnarain N, Maharaj I. Survival of microencapsulated Bifidobacterium pseudolongum in simulated gastric
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
and intestinal juices. Journal of Canadian Institute of Food
Science and Technology 1989; 22: 345-9.
Sheu TY, Marshall RT. Microentrapment of lactobacilli in
calcium alginate gels. J Food Sci 1993; 54: 557-61.
http://www.fao.org/es/ESN/Probio/probio.htm
Hickey M. Current legislation on probiotic products. In:
Probiotic dairy products. Tamime AY, editor. Oxford:
Blackwell Publishing; 2005. p. 73-97.
Nelson K. The future of microbial genomics. Environmental Microbiology 2003; 5: 1223-5.
Dellaglio F, Felis GE, Torriani S, Sørensen K, Johansen E.
Genomic characterisation of starter cultures. In: Probiotic
dairy products. Tamime AY, editor. Oxford: Blackwell Publishing; 2005. p. 16-38.
Maasen CBM, Laman JD, den Bak-Glashouwer MJH,
Tielen FJ, van Holten-Neelen JCPA, Hoogteijling L, et
al. Instruments for oral disease-intervention strategies:
recombinant Lactobacillus casei expressing tetanus toxin
fragment C for vaccination or myelin proteins for oral tolerance induction in multiple sclerosis. Vaccine 1999;
17: 2117-28.
Steidler L, Hans W, Schotte L, Neirynck S, Obermeier F,
Falk W, et al. Treatment of murine colitis by Lactococcus
lactis secreting interleukin-10. Science 2000; 289: 13525.
Monedero V, Rodríguez-Díaz J, Viana R, Buesa J, PérezMartínez G. Selection of single-chain antibodies against the
VP8* subunit of rotavirus VP4 outer capsid protein and
their expression in Lactobacillus casei. Appl Environ Microbiol 2004; 70: 6936-9.