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ANÁLISIS DE LA INFECCIÓN DE VELLOSIDADES AISLADAS
DE RATÓN LACTANTE POR EL ROTAVIRUS HOMÓLOGO
ECwt LUEGO DE CHOQUE TÉRMICO
Manuel Ricardo García A1; Carlos A Guerrero F2
Resumen
Los rotavirus son agentes infecciosos capaces de causar enfermedades del tracto gastrointestinal en el
hombre y animales de interés económico como porcinos, bovinos y aves. Los rotavirus son capaces
de transmitirse entre el hombre y los animales, además que su incidencia en las poblaciones humanas
no depende estrictamente de las condiciones de higiene. La proteína Hsc70 se localiza en la
membrana citoplasmática y está implicada como receptor rotaviral en las líneas celulares MA104 y en
las células intestinales aisladas de ratón lactante, es probable que al someter las células al choque
térmico se aumente su expresión a nivel de membrana y esto se correlacione con un aumento en la
infección. Este trabajo buscó analizar la infección de vellosidades aisladas de ratón lactante por el
virus ECwt luego del choque térmico. Encontramos que los enterocitos de las vellosidades aisladas
del intestino de ratón se mantienen viables por encima del 90% en condiciones de choque térmico e
infección; Los niveles de la proteína Hsc70 a nivel de membrana y citoplasmática aumentan
aproximadamente 5 veces cuando se someten los enterocitos a choque térmico. Al comparar la
infección evaluando los antígenos virales, en células con y sin choque térmico se encontró que no
hay diferencias. Sin embargo, al evaluar la producción de viriones infecciosos re-infectando
vellosidades con el lisado procedente de células infectadas con y sin choque, se encontró mayor
número de viriones en las vellosidades que previamente habían recibido choque térmico, en especial
al evaluar a las 4 y 8 h.p.i. Esto sugiere que las proteínas relacionadas con el choque térmico
favorecen el ensamblaje de viriones. La proteína Hsp70 no se expresa a nivel de membrana, pero el
choque térmico aumenta su expresión entre 40 y 60 veces a nivel membranal y citoplasmático
respectivamente. La infección por rotavirus aumenta 15 veces la cantidad de células que expresan la
proteína, aunque no hubo un aumentó por encima de estos niveles cuando ambos tratamientos se
combinaron.
Abstract
Rotaviruses are infectious agents capable of causing diseases of the gastrointestinal tract in humans
and animals of economic interest as pigs, cattle and poultry. Rotavirus is capable of transmission
between humans and animals, in addition to its impact on the human population does not depend
strictly hygienic conditions. The Hsc70 protein is localized in the cytoplasmic membrane and is
implicated as rotavirus receptor in cell lines MA104 and intestinal cells isolated from suckling mouse,
is likely to subject the cells to heat shock expression is increased level of membrane and this
correlated with increased infection. This study sought to analyze the infection of suckling mouseisolated villi by ECWT virus after heat shock. We found that the enterocytes of the intestinal villi
isolated mouse remains viable above 90% under thermal shockand infection; Levels HSC70 level and
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Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias Básicas, Bogotá.
Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá.
Correspondencia a: Carlos A. Guerrero MD, MSc, PhD. Profesor de Medicina, Departamento de Ciencias
Fisiológicas, Facultad of Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia. Dirección: Carrera 45 #
26-85, Bogotá D.C. [email protected]. Teléfono: -3165000 Ext. 15052
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cytoplasmic membrane increases about 5-fold when enterocytes are heat shock. Comparing
evaluating infection viral antigens in cells with and without heat shock found no differences.
However, in assessing the production of infectious virions re-infecting villi with the lysate from
infected cells with and without shock, as many virions was found in the villi had previously received
thermal shock, especially when evaluating the 4 and 8 hpi. This suggests that proteins related to the
heat shock favor virion assembly. Hsp70 protein is not expressed at membrane level, but the thermal
shock increases expression between 40 and 60 times respectively membrane and cytoplasmic level.
Rotavirus infection increases 15 times the amount of cells expressing the protein, although there was
no increased above these levels when both treatments were combined.
Palabras claves: vellosidades, ratón, rotavirus, ECwt, humanos y animales.
Key words villi, mouse, rotavirus, ECwt, humans and animals.
Introducción
La diarrea es una de las enfermedades infantiles más comunes tanto en naciones desarrolladas como
en vías de desarrollo. Una de las causas es infección por rotavirus cuya transmisión es oral-fecal. Esta
afección gastrointestinal está diseminada en todo el mundo principalmente durante los dos primeros
años de vida. Una estrategia optima para el manejo de la diarrea infantil consiste en la terapia de
rehidratación oral, correcta alimentación, no uso de antidiarreicos y cuidados adecuados por parte de
la madre o cuidador del paciente.
La sintomatología comienza con vómito seguido por la diarrea acuosa, esta puede ser blanda y de
corta duración o severa con deshidratación secundaria. Son frecuentes la fiebre y el dolor abdominal.
El vómito y la fiebre cesan durante los 2 a 3 días iniciales de la enfermedad y la diarrea suele persistir
durante 4 ó 5 días. Las infecciones tienden a ser más severas en niños entre 3 y 24 meses de edad,
asimismo los niños infectados por rotavirus durante los 3 primeros meses de edad suelen ser
asintomáticos probablemente debido a los anticuerpos maternos. De igual manera las personas con
infecciones repetidas pueden ser asintomáticas o presentar síntomas leves debido a la inmunidad
adquirida por infecciones anteriores (Desselberger & Gray, 2005; OPS, 2007)
El virus conserva su patogenicidad y viabilidad por horas e incluso días en manos y superficies
sólidas, de manera que las manos, juguetes e incluso alimentos contaminados pueden actuar como
medios para la diseminación del virus. La excreción aproximada de 108 a 1011 partículas por gramo de
heces, su permanencia en el agua potable y recreativa, la incapacidad de los desinfectantes de
contacto y jabones para mano para remover eficientemente la carga viral infectiva de superficies, la
infección cruzada con animales, y la excreción de virus en heces incluso antes de que comiencen los
síntomas de diarrea, hace que los rotavirus se conviertan en un agente que afecta todos los estratos
sociales y esté ampliamente distribuido en el mundo (Vasickova et al., 2005)
Las infecciones predominan en invierno en países templados, mientras que en los países tropicales
las afecciones suelen ocurrir durante todo el año con probables picos mayores durante la época de
lluvia (OPS, 2007). En general, los genotipos más frecuentemente identificados en Bogotá, Cali y
Barranquilla fueron G3 [P8] (32,7%), G2P [4] (21,1%) y G1P [8] (19,1%) además de algunos
genotipos mixtos en 8,5% de las muestras (Cáceres et al., 2006)
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Los rotavirus conforman el género Rotavirus dentro de la familia Reoviridae, se caracterizan por (i)
tener partículas maduras de 100nm de diámetro con tres capas concéntricas de proteína
icosahédrica, (ii) 60 espículas proteicas que se proyectan de la capa externa, (iii) requerimientos de
calcio para mantener la integridad estructural de la capa externa, (iv) presencia de RNA polimerasa
dependiente de RNA y otras enzimas capaces de producir transcritos (v) genoma de 11 segmentos de
RNA doble cadena, (vi) posible recombinación genética entre virus del mismo grupo, (vii) la
replicación viral se lleva a cabo en el citoplasma, (viii) el clivaje del polipéptido de las espículas de la
cápside mejora la infectividad in vitro (ix) las partículas virales se forman mediante gemación a través
del retículo endoplasmático para producir partículas con envoltura, la cual se pierde posteriormente
antes de ser liberadas por lisis o transporte vesicular no clásico en células epiteliales polarizadas. El
nombre rotavirus se refiere a que las partículas icosahédricas parecen ruedas con sus espículas a
modo de radios en una rueda, existen como TLPs (con sus tres capas intactas) y DLPs sin la más
externa, por lo que estos son incapaces de una infección exitosa dado que carecen de los dominios
con receptores celulares (Estes & Kapikian, 2007).
Existen 7 grupos de rotavirus (A a la G) de los cuales A, B y C infectan animales y humanos por
igual mientras que los demás sólo se han reportado en animales, a pesar de la capacidad que tienen
estos agentes infecciosos de reorganización genómica entre cepas relacionadas. Los rotavirus del
grupo A son los causantes de episodios diarreicos en niños y en crías de mamíferos y aves, el grupo
B agrupa a agentes causantes de epidemias de diarrea severa en adultos chinos, y por último están los
del grupo C que son detectables esporádicamente en las heces de niños durante epidemias familiares
(Estes & Kapikian, 2007)
Los rotavirus hacen uso de por lo menos dos receptores distintos para interactuar con sus células
hospederas, los de adhesión que le permiten unirse a la superficie celular, y los de entrada que
permiten la internalización de las partículas virales para iniciar el ciclo replicativo. Estos últimos
también reciben el nombre de co-receptores, de posteriores a la unión, fusión o de entrada (López &
Arias, 2004; López & Arias, 2006)
El proceso de entrada de los rotavirus a la célula es poco conocido y aunque podría darse por
penetración directa mediada por la proteína VP5* (Denisova et al., 1999), la entrada por medio de
endosomas le permite desprenderse de este por la baja concentración de Ca2+ en los
compartimentos endosómicos antes de ser llevados a lisosomas para la pérdida de la primera capa y
conversión en DLP. La liberación de esta DLP transcripcionalmente activa en el citoplasma genera
una producción de transcritos mRNA (+) a través de los canales de las vértices de la cápside.
La familia de proteínas denominadas genéricamente como proteínas de choque térmico o HSPs (por
sus siglas en ingles “Heat Shock Proteins”) ayuda en el plegamiento, transporte y ensamble de otras
proteínas, por lo cual se les conoce como chaperonas. La proteína “Heat Shock Protein Cognate”
Hsc70 pertenece a la familia de proteínas de 70 kDa (HSP’s70) y se identificó primero en células
sometidas a estrés, aunque posteriormente se encontró también en células no estresadas. Está
compuesta de dos dominios principales: un dominio de ATPasa que tiene una estructura terciaria
similar a la actina (Flaherty, et al. 1990) y un dominio carboxi – terminal que tiene una estructura
secundaria similar al dominio de unión a péptidos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad
(MHC) de clase I. (Becker & Craig, 1994; Bruce & Churchich, 1997; Kiang & Tsokos, 1998;
Daugaard et al., 2007)
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Las principales funciones que se han descrito para Hsc70 son citoplasmáticas y se desconoce aún
cómo esta proteína se transporta y se ancla en la membrana citoplasmática. Se ha encontrado por
citometría de flujo e inmunofluorescencia, que la proteína Hsc70 está en la superficie de la
membrana citoplasmática de algunas líneas celulares y células tumorales, así como en células
normales luego de someterlas a choque térmico. Entre las funciones básicas se encuentra la
solubilización de agregados proteicos denaturados, restauración de la estructura/ función proteica
luego del estrés térmico y eliminación de proteínas irreparables a proteasomas u organelos de
degradación (Becker & Craig, 1994; Bruce & Churchich, 1997; Kiang & Tsokos, 1998; Daugaard et
al., 2007)
Estudios realizados sugieren que durante el proceso de entrada de múltiples pasos del Rotavirus a la
célula, la partícula viral además de utilizar las proteínas de la cápside externa VP4 y VP7 también
utiliza la proteína VP6 la cual se une a moléculas receptoras como Hsc70. Probablemente en cada
interacción se inducen cambios conformacionales en las proteínas del virión y en las proteínas
receptoras exponiendo diferentes dominios de VP4, VP7 y VP6, lo cual facilita la entrada del virus a
la célula (Guerrero et al., 2002; Gualtero, et al., 2007). Partimos del raciocinio que la proteína HSC70
se localiza en la membrana citoplasmática y está implicada como receptor rotaviral en las líneas
celulares MA104 y en las células intestinales aisladas de ratón lactante, es probable que al someter las
células al choque térmico se aumente su expresión a nivel de membrana y esto se correlacione con un
aumento en la infección. Por esta razón este trabajo busca analizar la infección de vellosidades
aisladas de ratón lactante por el virus ECwt luego del choque térmico. Para esto, determinamos la
viabilidad de las células aisladas del intestino delgado de ratón lactante. Evaluamos la expresión de
antígenos virales en diferentes tiempos post-infección con el virus ECwt en vellosidades aisladas
sometidas a choque térmico y evaluamos la expresión de la proteína Hsc70 en la membrana
citoplasmática luego de someter las células aisladas de ratón lactante al choque térmico
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño experimental
El primer factor de diseño es la infección de los enterocitos de ratón con el rotavirus homólogo
silvestre ECwt, los niveles de este factor son infectados y no infectado. El segundo factor de diseño
es el choque térmico de los enterocitos aislados, los niveles de este factor son con choque y sin
choque. Se combinarán todos estos niveles así: choque térmico no infectado (Ch NI), sin choque
térmico infectado (NCh Inf) y con choque térmico e infectadas (S Inf).
Sujetos experimentales, virus y anticuerpos
Los sujetos experimentales fueron ratones lactantes cepa ICR de 10 a 12 días, obtenidos de Instituto
Nacional de Salud, sin distinción de sexos para mantener las condiciones aleatorias que podrían
surgir in vivo. La cepa homóloga ECwt (EDIM CAMBRIDGE Wildtype) P17 G3 se obtuvo como
donación del Dr. Harry Greenberg del Stanford University, a partir de una muestra proporcionada
por el Dr. Manuel Franco del Instituto de Genética de la Pontificia Universidad Javeriana. También
se utilizó la cepa heteróloga RRV (rotavirus de simio Rhesus) donada por el Dr Carlos Arias del
Instituto de Biotecnología de la UNAM, México. Los dos virus fueron replicados en el laboratorio de
Biología Molecular de Virus de la unidad de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia.
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Para todos los ensayos se agregaron los rotavirus RRV (MOI de 9) y ECwt (MOI de 5), previamente
activados con tripsina (1μg/ml) durante 30 minutos a 37 OC. Para la infección se utilizó una dilución
1:1 v/v de RRV (cuyo título en células MA104 fue de 4.3 X106 UFF/ml). El rotavirus ECwt se tituló
en cultivo de vellosidades y se usó en dilución 1:10 v:v (título aproximado de 8 x 106 UFF/ml,
titulado en vellosidades aisladas).
Como control de especificidad viral se utilizó el virus denominado Reovirus, que pertenece a la
misma familia de rotavirus (Reoviridae), también produce diarrea, aunque los síntomas son leves,
respecto a rotavirus, pero el mecanismo de infección es diferente.
Obtención de enterocitos separados de las vellosidades
Esta metodología fue probada para intentar obtener una mayor cantidad de células a partir del
intestino de ratón y para ver qué tan factible podría resultar el trabajo con los enterocitos de forma
individual, lo cual podría facilitar el conteo con inmunocitoquímica y además establecer cómo
responden las células a la separación entre sí. Para aislar enterocitos del intestino delgado se siguió
una metodología descrita por varios autores (Weiser, 1973; Whitt & Savage, 1988, Simmy et al., 2001.
Santana 2009). El proceso se llevó a cabo en cabina de flujo laminar bajo condiciones de esterilidad.
Luego de sacrificar los animales por dislocación cervical (Beaver et al, 2001), la piel del abdomen se
limpió con alcohol y se cortó de forma longitudinal. Se ubicó el píloro y se cortó el extremo distal del
intestino delgado, se extrajo y se mantuvo en Medio Esencial Mínimo EAGLE modificado (MEM).
Se puso una jeringa por el extremo más ancho (duodeno) y se lavó con 5 ml de medio de cultivo con
antibiótico y antimicótico (Kanamicina: 100µg/ml, Ampicilina: 100µg/ml y Anfotericina B: 2,5
µg/ml). Para obtener enterocitos aislados de las vellosidades, el intestino se lavó con 5 ml de medio
con antibiótico y EDTA 3 mM. El intestino se cortó en forma longitudinal, luego se cortó en
fragmentos de más o menos 0.5 cm, en una caja de Petri con 7 ml de medio de cultivo que contenía
EDTA 3 mM, Ditiotreitol (DTT) 1mM y antibiótico. Los fragmentos se recuperaron en un tubo de
centrífuga de 15 ml y se incubó por 30 minutos a 37 oC con agitaciones de 400 rpm.
Obtención de vellosidades intestinales
Para obtener las vellosidades completas, se siguió la metodología estandarizada en el laboratorio
(Santana 2009). Para esto, se sacrificó el ratón lactante, se extrajo el intestino, se lavó con 5 ml de
medio de cultivo con antibiótico y EDTA 1,5 mM. El intestino se cortó en forma longitudinal, luego
se cortó en fragmentos de más o menos 0.5 cm, en una caja de Petri con 7 ml de medio de cultivo
que contenía EDTA 1,5 mM y antibiótico. Los fragmentos se recuperaron en un tubo de centrífuga
de 15 ml y se incubó por 15 minutos a 37 oC con agitaciones de 400 rpm. Con una punta de
micropipeta de 1 ml cortada en el extremo terminal, se disgregó dentro de cada tubo las células,
luego se pasaron, con la misma punta, por una malla estéril (1mm2 de poro) que estaba sobre una
caja de Petri. Los fragmentos que no pasaron nuevamente se colocaron en el tubo de centrífuga con
5 ml de medio con EDTA 1,5 mM y antibiótico, realizando una segunda extracción bajo las mismas
condiciones. Las vellosidades que pasaron el poro de la malla la primera vez se recuperan y se
mezclan con la segunda extracción. La mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 3000rpm para
retirar el medio con EDTA. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en 5 ml de
medio con antibiótico para lavarlos. El procedimiento se repitió tres veces. Las células obtenidas se
mantuvieron en medio de cultivo sin EDTA a 4 OC hasta realizar la infección con los rotavirus.
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Viabilidad por Medio de Tinción con Azul de Tripán
Para determinar la viabilidad de los enterocitos aislados de las vellosidades o de las vellosidades
integras aisladas del intestino, en función de la integridad membranal, se realizó la técnica con azul de
tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan ruptura
en la membrana. Se usó Azul de Tripán 93595 (Sigma Aldrich) en solución para microscopía. Se
puso Azul de Tripán y vellosidades intestinales o enterocitos aislados de las vellosidades, en
proporción 1:1 por 1 minuto y se contaron las células sin teñir (viables) y células de color azul (no
viables) en 10 campos representativos para cada uno de los tiempos post-extracción. Esta
metodología se aplicó a las células utilizadas en todos los experimentos que se describen en este
trabajo.
Tinción Celular con Hoechst 33342 (Sigma Aldrich)
Este colorante se ubica de forma intercalada entre las cadenas de DNA y permite evidenciar señales
de fragmentación del material nucléico consideradas como señales terminales de un proceso
apoptótico. Para esto, las células se fijaron con metanol, luego se aplicó el colorante diluido 1:200 por
20 min en cámara oscura, de una solución stock de Hoechst 1 mg/ mL en agua estéril. Las células
fueron analizadas en un microscopio de fluorescencia (Van Guard). Esta metodología se aplicó a las
células utilizadas en todos los experimentos que se describen en este trabajo.
Ensayos de Choque Térmico
Para el ensayo de Choque Térmico, los enterocitos aislados de las vellosidades o las vellosidades
integras aisladas del intestino, se pusieron en un baño de María a 42ºC por 30 minutos y luego se
incubaron por 30 minutos a 37ºC en ambiente con CO2 al 5% para que las células se restablecieran
luego del choque térmico. Las células se utilizaron para los diferentes procedimientos descritos en el
trabajo.
Infección de vellosidades aisladas con el virus ECwt, RRV y Reo, con o sin choque térmico.
Se quiso comparar la capacidad replicativa del rotavirus ECwt y RRV en vellosidades aisladas de
intestino de ratón con y sin choque térmico. Para esto, las vellosidades aisladas del intestino se
dividieron en dos fracciones: una recibió choque térmico y otra no, la cual se mantuvo a 37°C y se
denomina control. Posteriormente se fraccionaron según las necesidades experimentales (variables a
examinar). Las vellosidades con y sin choque térmico se sembraron en cajas de 96 pozos y se les
agregó el rotavirus ECwt (MOI de 5), RRV (MOI de 9) que se había activado con tripsina (1g/ml)
durante 30 minutos a 37 OC. Luego se cosecharon en los siguientes tiempos: 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12
horas; cada punto se realizó por triplicado y se repitió tres veces. En algunos experimentos las
vellosidades se cosecharon todas al cabo de 12hs. Las vellosidades cosechadas se analizaron mediante
las técnicas de ELISA o inmunocitoquímica.
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Infección de vellosidades aisladas utilizando lisados provenientes de vellosidades infectadas
con virus ECwt o RRV con o sin choque térmico.
Es importante determinar si existen diferencias en la capacidad infectiva de lisados provenientes de
células sometidas a choque térmico, respecto a las que no lo recibieron y que fueron infectadas. Es
decir, se quiso determinar si existen diferencias en la cantidad de viriones ensamblados en cada uno
de estos tratamientos. Para esto, las vellosidades aisladas con o sin choque térmico fueron infectadas
y cosechadas en los tiempos 0, 4, 8 y 12 h.p.i. (horas post infección). Luego fueron congeladas (20°C) y descongeladas dos veces. Posteriormente, se activaron con tripsina (1g/ml) durante 30
minutos a 37 OC. De otro lado, nuevamente se aislaron vellosidades, según la técnica descrita, y estas
se pusieron en caja de 96 pozos. A estas nuevas vellosidades se le adicionó el lisado cosechado en
cada una de las horas señaladas anteriormente en la siguiente proporción: el lisado que contenía
ECwt se aplicó en una dilución 1:5 (v:v) y el que contenía RRV se aplicó en dilución 1:1 (v:v). Las
vellosidades infectadas con el lisado se cultivaron a 37°C durante 12hs. Transcurrido este tiempo, se
cosecharon a las 12 h.p.i. y se fijaron para evaluar la infección por inmunocitoquímica, utilizando Acs
contra proteínas estructurales de los rotavirus.
Ensayo de ELISA de Captura
Las vellosidades aisladas, con y sin choque térmico, infectadas y/o no infectadas, cosechadas para
analizarlas mediante la técnica de ELISA fueron congeladas a -20°C hasta la realización de la técnica.
Posteriormente, se congelaron y descongelaron 3 veces, se puso buffer de lisis RIPA (NaCl 150mM,
Nonident-P40 1%, Ácido Deoxicólico 0.5%, SDS 0.1% y Tris 50mM pH 8.0) en proporción 1:10.
La placa de ELISA contenía Ac de captura en una dilución 1: 500 (contra RRV hecho en Conejo) o
1:500 (contra ECwt generado en Cobayo) y se incubó a 37ºC por 1 hora y luego a 4ºC durante toda
la noche. Se lavó tres veces con PBS 1X (pH 7.0) para retirar el anticuerpo que no se unió a la caja,
cada lavado fue de 3 minutos. Posteriormente se adicionó leche descremada al 5% en PBS 1X y se
dejó 1 hora a 37ºC para bloquear. Luego se puso el lisado de las vellosidades cosechadas, con azida
de sodio, y se incubó a 37ºC por dos horas. Se colocó el Ac primario 1: 1000 de origen animal
diferente al usado como Ac de captura diluido en PBS 1X + Ázida de Sodio, se dejó 2 horas a 37ºC.
Se lavó tres veces con PBS 1X para retirar el Ac que no se unió. Se puso el Ac. secundario 1: 3000
(100 µg/mL Santa Cruz) conjugado con peroxidasa, de origen animal igual al Ac primario, en PBS +
Leche descremada al 0.5% y se incubó 1 hora a 37ºC. Se lavó tres veces con PBS 1X y se reveló con
peroxidasa en tampón citrato (ácido cítrico 0.1M, citrato sódico 0.1M) y OPD (orto-fenilendiamina
dihidrocloruro) 0.001g/ml y se leyó a 492nm (Biorad®). La absorbancia de las células no infectadas
se restó a todas las demás absorbancias, las cuales corresponden al delta (Δ) de la absorbancia que se
graficó.
Inmunocitoquímica
Las vellosidades aisladas, con y sin choque térmico, infectadas y no infectadas, cosechadas para
analizarlas mediante la técnica de inmunocitoquímica se prefijaron con Metanol – Ácido Acético (3:1
v/v) por 5 minutos, adicionando 10 l - 50 l al medio con células. Se centrifugó a 3000g a por 10
minutos y se descartó el sobrenadante. Posteriormente las células se fijaron adicionando Metanol –
Ácido Acético por 20 minutos a 0ºC. El precipitado se centrifugó a 3000g a 4ºC por 10 minutos, se
descartó el sobrenadante y se lavó tres veces con PBS 1X, cada lavado con 1mL. Se guardó la
muestra en PBS + Ázida de Sodio a 4ºC para evitar la proliferación de hongos y bacterias, de esta
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forma quedan listas las células para realizar Inmunocitoquímica. Las vellosidades se colocaron sobre
laminillas cubreobjetos (4x4mm), posteriormente se secaron a 50ºC para que se adhirieran a la
laminilla. Luego se puso Ac primario contra las proteínas no estructurales NSP4 1:400 o NSP5 1:500
o contra proteínas estructurales de ECwt o RRV en dilución 1:2000, generados en conejo. El Ac se
incubó por 1 hora a 37ºC manteniéndolos en cámara húmeda. Se lavó el exceso de anticuerpo tres
veces con PBS 1X por goteo suave, sin dejar secar las células se puso Ac secundario conjugado con
peroxidasa 1:3000 de un stock 200 ug/0.5ml (Santa Cruz) por 1h a 37ºC en cámara húmeda. Se lavó
tres veces con PBS 1X por goteo suave y se reveló utilizando como sustrato amino etil carbazol 0,64
mg/ml (AEC) en buffer acetato (acetato de sodio 0,030 M-ácido acético 0.012 M) y peroxido de
hidrógeno al 0,36%. El AEC se preparó previamente a 4 mg/ml en dimetilformamida. Las células se
incubaron hasta detección de coloración roja en las células infectadas. Los controles fueron células
infectadas e incubadas con Acs no relacionados y células no infectadas incubadas con Acs contra
rotavirus. Las vellosidades se analizaron en un microscopio de luz a 40x (Van Guard). Se tomaron
fotos de 10 campos representativos y a partir de estas imágenes se estableció el porcentaje de células
infectadas relacionando las células positivas/células positivas + negativas x100.
Citometría de Flujo
Para determinar la presencia o ausencia de las proteínas de choque térmico HSC70 y HSP70 en la
membrana citoplasmática y en el interior de los enterocitos aislados se utilizó la citometría de flujo.
Para esto, las vellosidades aisladas se fijaron con para-formaldehido (Sigma) al 4% en PBS 1X
durante 30 min a 37°C, se realizaron dos lavados con PBS 1X. Para disgregar los enterocitos de las
vellosidades se adicionó PBS 1X con EDTA (4.5mM) durante 1 h a 37°C y luego toda la noche a
4°C. Luego se realizaron tres lavados, re suspendiendo las células con vórtex durante cinco minutos
entre lavado y lavado, se eliminaron los cúmulos evidentes en suspensión, y en el caso de las células
destinadas a la detección de HSC70 y HSP70 intracelular se pusieron en TritónX100 0.2% por 5 min
o con saponina 0.25% 30 min a 4ºC. Posteriormente, las células se incubaron con anticuerpos contra
HSC70 (SC1059 Santa Cruz) o contra HSP70 monoclonales (8μg/ml, ZYMED) o policlonales
(4μg/ml, SC1060 Santa Cruz). Los anticuerpos se dejaron 1h a 37°C, se lavaron tres veces y se
incubaron con el anticuerpo secundario, según la especie, conjugado-FITC (Santa Cruz). Se detectó
la fluorescencia en un citómetro de flujo FACSCALIBUR (Beckton Dickinson) y se analizaron los
datos por medio del programa CELLQUEST con los parámetros apropiados. Los resultados
mostrados corresponden a 3 experimentos independientes para cada una de las proteínas evaluadas.
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Resultados
Ensayo de Viabilidad con azul de tripán
Los resultados del ensayo mostrados en la figura 1A se refieren a la extracción de vellosidades
intestinales empleando una concentración de EDTA 1.5mM; como se puede apreciar la viabilidad de
las células durante las 12h que duró el experimento, es superior al 90% para todos los tratamientos.
La mayoría de las células teñidas con azul de tripán durante los ensayos de viabilidad eran las del
ápice de la vellosidad. La tendencia a disminuir la viabilidad en las células infectadas, que resulta
probablemente de la ruptura parcial de las membranas en las células cuando el virus empieza a salir,
puede haber ocurrido, dado que desde las 8h se empezaron a observar detritos celulares en todos
tratamientos.
Figura 1. Viabilidad de las Vellosidades aisladas. A. Las vellosidades de 3 ratones ICR fueron
extraídas usando EDTA 1.5mM y se mezclaron, se dividieron en tres fracciones. Una fracción
recibió choque térmico por 30min a 42ºC (barra gris), otra se infectó con el rotavirus ECwt (barra
negra), y la otra se cultivo directamente, sin choque térmico ni infección y que denominamos control
(barra blanca); las muestras se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO2 y fueron cosechadas en los
tiempos indicados. El azul de tripán y las vellosidades intestinales se pusieron en proporción 1:1 por
1 minuto. Se contaron las células sin teñir (viables) y células de color azul (no viables) en 10 campos
representativos. B. Viabilidad de los enterocitos separados de las vellosidades. Para separar los
enterocitos de las vellosidades, estas fueron extraídas y los enterocitos se separaron usando EDTA 3
mM. Los enterocitos se mezclaron y se dividieron en dos fracciones: una se infectó con el rotavirus
ECwt (barra negra), y la otra no se infecto (control, barra blanca). C. Tinción de Hoechst 33342.
Evaluación de la fragmentación del DNA en enterocitos separados de las vellosidades con EDTA 3
mM. Los enterocitos de 3 ratones ICR fueron extraídos usando EDTA 3 mM, se mezclaron y se
dividieron en dos fracciones: una se infectó con el rotavirus ECwt (barra negra), y la otra no se
infecto (control, barra blanca). Se adicionó el Hoechst (5 μg/ml) por 20 minutos, protegido de la luz
y se observaron en un microscopio de fluorescencia (Van Guard).
Para explorar la posibilidad de que se obtuviera mayor cantidad de células usando el doble de la
concentración usual de EDTA (3.0mM), y que los enterocitos completamente disgregados de la
vellosidad intestinal pudieran ser más fáciles de contar al realizar las inmunocitoquímicas, se realizó el
experimento mostrado en la figura 1B. En este ensayo se encontró que transcurridas las 2 primeras
horas, la viabilidad de los enterocitos estaba alrededor de 90% para las enterocitos control (no
infectadas) y cerca al 100% para las infectadas.
9
El descenso en la viabilidad de los enterocitos separados de las vellosidades desciende gradualmente,
alcanzando un valor cercano al 50% para las 5h en ambos tratamientos. Pasadas las 10h, se observó
que la viabilidad de las células para ambos tratamientos era cercano al 10%, y para las 12h los valores
obtenidos eran del 5% para ambos tratamientos. Fue una sorpresa encontrar que hay tendencia a un
mayor porcentaje de células viables de los enterocitos infectados, observada a lo largo del
experimento, dado que a priori se esperaba lo contrario.
Se evaluó la integridad del DNA nuclear cuando los enterocitos son disgregados completamente
empleando EDTA 3 mM y se analizó la diferencia en la fragmentación del DNA nuclear en los
enterocitos aislados de las vellosidades infectadas y no infectadas. Para las 10h de cultivo, los
enterocitos infectados tienen menor porcentaje de fragmentación respecto a los no infectados.
Durante las primeras 10h los enterocitos infectados no alcanzan el 50%, mientras que los no
infectados lo alcanzan entre 7 y 8 h. A las 11 - 12h la fragmentación del DNA es similar en los dos
tratamientos. La figura 1C muestra que el porcentaje de células con fragmentación del DNA nuclear,
como indicio de un posible proceso apoptótico, en los enterocitos no infectados tiene 10-30% más
fragmentación que las infectadas. En conjunto, los resultados indican que los enterocitos infectados
muestran una tendencia clara a disminuir la apoptosis, sugiriendo que el virus puede tener una acción
anti-apoptótica en las primeras 6-8 horas de infección.
Infección de vellosidades aisladas con el virus ECwt, RRV y Reo, con o sin choque térmico.
Se quiso explorar la idea de si al dar choque térmico (42ºC por 30 min), se sobre expresaba la
proteína Hsc70 en la membrana de las vellosidades intestinales de ratón y al existir más receptores en
la membrana celular se aumentaba la infección. La figura 2A indica que no hay diferencias en la
infección entre las células que recibieron el choque térmico de las que no lo recibieron. Cabe aclarar
que esta técnica permite evaluar la cantidad total de antígenos virales presentes, pero no
necesariamente de partículas infectivas ensambladas.
10
Figura 2. Detección de antígenos virales en vellosidades infectadas A. ELISA de captura de
la infección de vellosidades aisladas con los virus ECwt, RRV y Reo. Se extrajeron las
vellosidades intestinales de 3 ratones ICR con 1.5mM de EDTA, se mezclaron y luego dividieron en
porciones para cada uno de los tratamientos. Unas se sometieron a choque térmico por 30 min a
42ºC, y luego a 37ºC por 30 min como periodo de restablecimiento; otra porción se mantuvo a 37ºC.
Luego las vellosidades se infectaron con los rotavirus ECwt (homólogo), RRV de simio Rhesus
(heterólogo) y Reo (reovirus) por un periodo de 12h, luego se congeló y descongeló la muestra tres
veces. La placa de ELISA se incubó con un Ac de captura generado en cobayo (1:1000), se bloqueó,
se adicionó el lisado y se puso el Ac primario contra proteínas estructurales (1: 3000 de conejo). Se
lavó y se puso Ac secundario HRP anticonejo (0.08 mg/ml). Se reveló con OPD en tampón citrato y
se leyó a 492nm en un lector Biorad®. Inmunocitoquímica. B. Proteínas estructurales. Se
procedió como se menciono en A, luego se infectaron las vellosidades con el virus ECwt y se
cosecharon las muestras cada 2 horas hasta completar 12h y se fijaron con metanol-ácido acético 3:1.
Se pusieron sobre una lámina cubreobjetos y se mantuvo a 50ºC durante 30 min. Se adicionaron
Anticuerpos por 1h contra proteínas estructurales del virus. Se lavó, se adicionó Ac secundario
anticonejo acoplado a peroxidasa (0.13 mg/ml), y se reveló con amino etil carbazol por 1h. Las
laminillas cubreobjetos se pusieron en una lámina portaobjetos y se contaron las células de 10
campos representativos con el objetivo de 40x. El experimento se realizó 3 veces, cada uno con 3
repeticiones. C. Proteína no estructural NSP4. Todo el procedimiento es similar a lo descrito en
B, excepto el anticuerpo que es anti-NSP4. El * indica diferencias estadísticamente significativas por
medio de la prueba t de Student con α 0.05. D. Proteína no estructural NSP5. Todo el
procedimiento es similar a lo descrito en B, excepto el anticuerpo que es anti-NSP5. El * indica
diferencias estadísticamente significativas por medio de la prueba t de Student con α 0.05
La figura 2B indica que, en términos generales, no hay diferencias en la infección entre las células que
recibieron el choque térmico de las que no lo recibieron. Al igual que con la técnica de ELISA, esta
evalúa la cantidad total de antígenos virales presentes, pero no necesariamente de partículas infectivas
ensambladas. Indica que la cantidad de células infectadas iniciales es de alrededor del 25% para las
11
primeras 2h, aumentando cerca del 10% por cada par de horas adicionales que transcurren hasta
alcanzar un punto cercano al estancamiento de la replicación viral alrededor de las 8 y 10h post
infección, para aumentar ligeramente durante las últimas dos horas, culminando en un 75-84% de
células infectadas al cabo de 12h.
Al analizar la infección utilizando anticuerpos contra proteínas no estructurales (NSP5 y NSP4) no se
observan grandes cambios respecto a lo observado al analizar las proteínas estructurales. Sin
embargo, al examinar en detalle la figura 2C se observa que a partir de las 2h post infección hay un
32% de células infectadas en el tratamiento sin choque y 49% para el choque térmico. Sin embargo,
la tendencia se revierte a las 4 h.p.i., con una diferencia de 10% entre ambas y a las 6 hpi con una
diferencia del 3%. Esta misma diferencia se mantiene a las 8 hpi pero a favor de las células con
choque térmico. A las 10 y 12 h.p.i. existe una mayor proporción de células infectadas con el choque
térmico, con valores de casi 20% de diferencia a las 10 h.p.i. y de 12% e a las 12 h.p.i.
Al examinar en detalle la figura 2D se observa que a partir de las 2 h.p.i. la infectividad del virus es de
40% en las células sin choque y de 57% con el choque térmico. A las 4hpi la tendencia se mantiene
64% sin choque y 70% con el choque térmico. A las 6hpi la tendencia se revierte y se observa una
mayor proporción de células infectadas en ausencia de choque térmico (71%) en comparación con el
64% observado con el choque térmico. A las 8, 10 y 12 h.p.i. la infectividad de las células con
choque es de 75% y las de sin choque de 58%, 60% y 75% respectivamente.
Infección de vellosidades aisladas utilizando lisados provenientes de vellosidades infectadas
con los rotavirus ECwt o RRV, con o sin choque térmico.
Dado que en las técnicas de ELISA o inmunocitoquímica se evalúa la cantidad total de antígenos
virales presentes, pero no necesariamente de partículas infectivas ensambladas, es importante
determinar si existen diferencias en la capacidad infectiva de lisados provenientes de células
sometidas a choque térmico, respecto a las que no lo recibieron y que fueron infectadas.
12
Figura 3. Re-infección. Inmunocitoquímica evaluando la infección de vellosidades aisladas
utilizando lisados virales provenientes de vellosidades infectadas con virus ECwt o RRV, con
o sin choque térmico. Se extrajeron las vellosidades intestinales de 3 ratones ICR con 1.5mM de
EDTA, se mezclaron y luego dividieron en porciones para infectar y cosechar en los tiempos 0, 4, 8 y
12 h.p.i., luego fueron congeladas (-20°C) y descongeladas dos veces. Después, se activaron con
tripsina (1g/ml) durante 30 minutos a 37 OC. Posteriormente, a vellosidades recién aisladas se le
adicionó el lisado cosechado en cada una de las horas señaladas en la siguiente proporción: el lisado
que contenía ECwt se aplicó en una dilución 1:5 (v:v) y el que contenía RRV se aplicó en dilución 1:1
(v:v). Las nuevas vellosidades infectadas con el lisado se cultivaron a 37°C durante 12hs. Se
cosecharon a las 12 h.p.i. y se fijaron para evaluar la infección por inmunocitoquímica, utilizando
anticuerpos contra proteínas estructurales de los rotavirus. Las células infectadas se contaron en 10
campos representativos con el objetivo de 40x (VanGuard). El experimento se realizó 3 veces, cada
uno con 3 repeticiones. Los lisados se habían infectado con: A. ECwt. B. RRV
Los resultados de la figura 3 muestra que hay una tendencia hacia mayor infección en los lisados
provenientes de vellosidades que fueron sometidas a choque térmico respecto a las que no lo
recibieron. En la figura 3A a las 0 h.p.i. el porcentaje de células infectadas con el lisado procedente de
células infectadas (ECwt) y sometidas a choque térmico, es 5 veces mayor que las que provenientes
de lisados sin choque. A las 4hpi y 8hpi la diferencia es del 15% y 10% entre infectadas con choque e
infectadas sin choque. A las 12hpi no se observan diferencias.
La figura 3B a las 0 h.p.i. el porcentaje de células infectada con el lisado procedente de células que
fueron infectadas (RRV) y sometidas a choque térmico, generó un 25% más vellosidades infectadas
en comparación con las infectadas sin choque. A las 4 h.p.i. y 8 h.p.i. la diferencia es
aproximadamente del 20% entre infectadas con choque e infectadas sin choque. A las 12 h.p.i. la
diferencia es aproximadamente del 5% entre infectadas con choque e infectadas sin choque.
La proteína Hsc70 aumenta su expresión en vellosidades infectadas con ECwt y en choque
térmico, o cuando se combinan los dos procedimientos.
Al hacer los ensayos de infección en células sometidas a choque térmico se buscaba aumentar la
expresión de la proteína de choque térmico Hsc70 en la membrana del enterocito y con esto explorar
si el virus aumentaba su infección. Se evaluó por citometría de flujo (FACS) si la proteína Hsc70 se
sobre expresa o no, luego del choque térmico, dado que ésta es constitutiva. Como punto de
13
referencia se examinó la proteína inducible Hsp70, homóloga de Hsc70. Igualmente se examinó si la
infección con el rotavirus modifica la expresión de estas proteínas.
Al analizar enterocitos que no fueron sometidos a choque térmico, correspondientes a la figura 4, se
observa que el porcentaje de células que expresan la proteína Hsc70 en la membrana citoplasmática
es del 7.01% (A), e intracelular es del 35.8% (B), lo cual corresponde al nivel basal de expresión de
dicha proteína. Cuando estas vellosidades se infectan con el rotavirus ECwt, el porcentaje de células
que expresa la Hsc70 en la membrana es del 25,31% (C), e intracelular del 34.57% (D).
Cuando las vellosidades son sometidas a choque térmico por 30 min a 42ºC la proporción de células
que expresan la Hsc70 en la membrana citoplasmática es del 37.18% (E), 5 veces más que el nivel
basal, lo cual contrasta con su expresión a nivel intracelular, la cual es del 37.01% (F). Cuando se
combina el choque térmico y la infección, se observa un aumento en la cantidad de células que
expresan a nivel de la membrana citoplasmática la Hsc70, alcanzado 65.33% (G), 9 veces más que el
nivel basal y casi el doble del valor alcanzado sólo con la infección por rotavirus. A nivel intracelular
alcanza un 51.12% (H).
Figura 4. Citometría de Flujo de Hsc70. Para evaluar los cambios en la expresión de la proteína
HSC70 a nivel de membrana citoplasmática e intracelular, se extrajeron las vellosidades intestinales
de 3 ratones ICR con 1.5mM de EDTA, se mezclaron y se fijaron con paraformaldehido (Sigma) al
4% en PBS. Luego se disgregaron los enterocitos de las vellosidades con EDTA (4.5mM) y se
eliminaron los cúmulos. Para permeabilizar se adicionó Tritón X100 0.2% por 5 min y saponina
0.25%, 30 min a 4ºC . Se adicionó Ac anti-Hsc70 (0.2 mg/ml, SC1059 Santa Cruz) durante 1h a
37°C, se lavaron y se adicionó el Ac secundario conjugado con FITC (0.5 mg/ml, Santa Cruz). A.
células no permeabilizadas B. células permeabilizadas, C. Infectadas con ECwt, no permeabilizadas
D. Infectadas con ECwt y permeabilizadas E. Choque térmico por 30 min a 42ºC, no
permeabilizadas F. Choque térmico por 30 min a 42ºC y permeabilizadas, G. Choque térmico e
infección con ECwt, no permeabilizadas. H. Choque térmico e infección con ECwt permeabilizadas.
14
Se detectó la fluorescencia en un citómetro de flujo FACSCALIBUR (Beckton Dickinson) y se
analizaron los datos por medio del programa CELLQUEST con los parámetros apropiados. Los
resultados mostrados corresponden a 3 experimentos independientes para cada una de las proteínas
evaluadas.
Expresión de Hsc70 en vellosidades intestinales evaluada por citometría de flujo
Membrana Celular
Intracelular
NCh NI
7,01%
NCh NI
35,38%
NCh Inf
25,31%
NCh Inf
34,57%
Ch NI
36,18%
Ch NI
37,01%
Ch Inf
65,33%
Ch Inf
51,12%
Tabla 1. Expresión membranal e intracelular de Hsc70 en vellosidades intestinales
evaluada por citometría de flujo. Valores expresados como porcentaje de células positivas
para la proteína Hsc70 siguiendo la metodología mencionada anteriormente. Resultados
obtenidos a partir de dos experimentos utilizando anticuerpos comerciales mono y
policlonales (Santa Cruz).
La proteína Hsp70 aumenta su expresión en vellosidades infectadas con ECwt y en choque
térmico, pero no cuando se combinan los dos procedimientos.
Al analizar enterocitos de la figura 5 que no fueron sometidos a choque térmico se observa que el
porcentaje de células que expresan la proteína Hsp70 en la membrana citoplasmática es de 0.0% (A),
e intracelular es de 1.62% (B), lo cual corresponde al nivel basal de expresión de dicha proteína.
Cuando estas vellosidades se infectan, con el rotavirus ECwt, el porcentaje de células que expresa la
Hsp70 en la membrana es del 13,1% (C), e intracelular del 17% (D).
Cuando las vellosidades son sometidas a choque térmico por 30 min a 42ºC la proporción de células
que expresan la Hsp70 en la membrana citoplasmática es del 61.02% (E) e intracelular del 44.39%
(F). Cuando se combina el choque térmico y la infección, la expresión a nivel de la membrana
citoplasmática es del 17.41% (G), e intracelular del 1.29% (H).
15
Figura 5. Citometría de Flujo de Hsp70. Para evaluar los cambios en la expresión de la proteína
Hsp70 en la membrana citoplasmática e intracelular, se extrajeron las vellosidades intestinales de 3
ratones ICR con 1.5mM de EDTA, se mezclaron y se fijaron con paraformaldehido (Sigma) al 4% en
PBS. Luego se disgregaron los enterocitos de las vellosidades con EDTA (4.5mM) y se eliminaron
los grumos. Cuando se permeabilizó se adicionó Tritón X100 0.2% por 5 min y saponina 0.25%, 30
min a 4ºC . Se adicionó Ac monoclonal anti-Hsp70 (1 μg/ml, ZYMED) o policlonal (0.2 mg/ml,
SC1060 Santa Cruz), durante 1h a 37°C, se lavaron y se adicionó el Ac secundario conjugado con
FITC (0.5 mg/ml, Santa Cruz). Se detectó la fluorescencia en un citómetro de flujo FACSCALIBUR
(Beckton Dickinson) y se analizaron los datos por medio del programa CELLQUEST con los
parámetros apropiados. Los resultados mostrados corresponden a 3 experimentos independientes
para cada una de las proteínas evaluadas. A. células no permeabilizadas B. células permeabilizadas C.
Infectadas con ECwt, no permeabilizadas D. Infectadas con ECwt y permeabilizadas, E. Choque
térmico por 30 min a 42ºC, no permeabilizadas F. Choque térmico por 30 min a 42ºC y
permeabilizadas, G. Choque térmico e infección con ECwt, no permeabilizadas. H. Choque térmico
e infección con ECwt permeabilizadas.
16
Expresión de Hsp70 en vellosidades intestinales evaluada por citometría de flujo
Membrana Celular
Intracelular
NS NI
0,00%
NS NI
1,62%
NS Inf
13,00%
NS Inf
17,00%
S NI
61,02%
S NI
44,39%
S Inf
17,41%
S Inf
1,29%
Tabla 2. Expresión membranal e intracelular de Hsp70 en vellosidades intestinales
evaluada por citometría de flujo. Valores expresados como porcentaje de células positivas para la
proteína Hsp70 siguiendo la metodología mencionada anteriormente. Resultados obtenidos a partir
de dos experimentos utilizando anticuerpos comerciales mono y policlonales (Santa Cruz).
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los enterocitos aislados de las vellosidades y las vellosidades aisladas se les examinó la viabilidad
comparando las vellosidades infectadas respecto a las no infectadas. Como se muestra en la figura 1, al
comparar las células infectadas con las no infectadas, el porcentaje de viabilidad fue similar durante las
12 horas en que fueron examinadas, determinada con la técnica de azul Tripán y analizando la
fragmentación del DNA nuclear mediante Hoechst. Hay una tendencia hacia la disminución la
viabilidad en las células no infectadas, sugiriendo que los enterocitos infectados tienen una tendencia a
disminuir la apoptosis.
Por otro lado, la mayoría de las células teñidas con azul de tripán durante los ensayos de viabilidad eran
las del ápice de la vellosidad, lo cual está acorde con lo reportado (Boshuizen et al., 2003) sobre un
incremento de la apoptosis de las células apicales, dado que se conoce que los rotavirus tienen un
tropismo particular hacia estas células. Llama la atención que el rotavirus infecte preferencialmente los
enterocitos del ápice de las vellosidades, puesto que son las que más rápido se desprenden. Pudiera ser
que el rotavirus cuando ingresa tiene efectos antiapoptóticos, pero una vez se ha replicado y formado
viriones maduros se induce apoptosis, la cual parece estar programada para las 24 h.p.i. y 4 d.p.i. (días
post infección) como lo mostró Boshuizen et al. (2003) en un estudio in vivo
Los datos obtenidos por Chaïbi et al. (2005) indican que los procesos apoptóticos que sufren las células
infectadas por rotavirus, como RRV, se deben a que este agente infeccioso estimula el aumento de la
concentración de Ca+2 al interior de la célula, alterando el potencial de la membrana mitocondrial
durante su replicación, causando un aumento del citocromo C liberado al citosol.
Durante los experimentos observamos que el número de células en la alícuota de células infectadas fue
disminuyendo paulatinamente, respecto a las no infectadas, por la lisis que causa el virus, aunque se
mantiene la proporción de células viables en las células infectadas respecto a las no infectadas. Lo
anterior obedece a que el virus lisa las células y solo se examinan las restantes que no están infectadas o
apenas están en el inicio del proceso. Los fragmentos de las células lisadas se pierden con los lavados
durante la fijación a la placa cubreobjetos y al retirar el reactivo (Hoescht), lo que explica que no se
puedan ver al examinar las células con inmunocitoquímica.
No hay diferencias en la infección entre las células que recibieron el choque térmico de las que no lo
recibieron, aunque se aprecia una tendencia de mayor infección en las células con choque térmico a las
17
2 h.p.i. En este caso, las técnicas empleadas para evaluar la infección fueron ELISA e
inmunocitoquímica. En las dos técnicas se utilizan Acs que reconocen proteínas virales, ya sea que
estén haciendo parte de viriones maduros o estén dispersas en el citoplasma de las células, es decir, aún
no ensambladas en el virión. Debido a esto, solo podemos decir que no hay diferencias en la detección
de antígenos virales cuando se comparan vellosidades con y sin choque térmico. Una probable razón es
que a partir de las 4 h.p.i. la replicación viral es tan alta que la proporción de células susceptibles a
infección es baja, con relación a los viriones infectivos, de manera que aún si hay muchos virus
presentes la cantidad de células infectadas permanece prácticamente igual.
Sin embargo, los resultados de la figura 3 muestran que hay una tendencia hacia mayor infección en los
lisados provenientes de vellosidades que fueron sometidas a choque térmico, respecto a las que no lo
recibieron. Esto sugiere que en las vellosidades, el choque térmico facilita el ensamblaje más rápido de
los viriones a partir del aumento de la expresión de estas proteínas de estrés térmico. Esto concuerda
con lo reportado para la línea celular MA104 (Pulido et al., 2007) donde se observa que existe una
correlación entre células infectadas con un aumento de la expresión de la proteína Hsc70 respecto a las
no infectadas. Estos datos contrastan con lo observado en líneas celulares como BHK y MA104,
donde no se encontró un aumento del nivel global de expresión de la Hsc70 ante condiciones similares
de choque térmico por medio de Western Blot, y usando la citometría de flujo se encontró que aún si
se sometieron las células a 47-48ºC por 20 min usando medio DMEM precalentado a 47-48ºC, no
hubo cambios en la expresión de Hsc70 en la membrana celular de estas líneas celulares (López et al.,
2006)
Al analizar los resultados de la citometría de flujo el porcentaje de vellosidades que expresan Hsc70 no
cambia cuando se compara la Hsc70 intracelular basal de vellosidades no infectadas, respecto a las
infectadas. Se debe tener en cuenta que la forma en que se presentan los datos de la citometría se
relaciona el número de células positivas para este marcador, no el cambio de la expresión de Hsc70 en
las células individualmente. Sin embargo, cuando se analiza el marcador Hsp70, se observa que esta
proteína intracelular aumenta su expresión basal cuando se comparan vellosidades infectadas con las
no infectadas, sin choque térmico. Podría ser que Hsp70 también participe en el ensamblaje de las
proteínas virales para formar viriones. Esto concuerda con lo reportado (Cuadras et al., 2002) donde
por la técnica de micro arreglos encuentran que Hsp70 se sobre expresa en células MA104 infectadas
con rotavirus.
Por medio de las técnicas Western blot y citometría (FACS) López et al. (2006) encontró que la línea
celular BHK no mostró presencia de Hsp70 en la membrana de células no sometidas a choque
térmico, aunque sí después 8 h después de dar el choque térmico. La línea MA104 presentó un nivel
basal de expresión de Hsp70, el cual aumentó vertiginosamente a partir de las 2 h siguientes al choque
térmico en el citoplasma. No se detectó la presencia de Hsp70 en la membrana citoplasmática de
células BHK o MA104 sin importar si estas habían sido sometidas a choque térmico o no.
Llama la atención que se disminuya el porcentaje de vellosidades infectadas y con choque térmico que
expresan la Hsp70 a nivel intracelular, podría suceder que la Hsp70 esté siendo exportada hacia la
membrana como encontró Broquet et al. (2003). Es posible que esta proteína, en las condiciones de
choque térmico, esté involucrada negativamente en la replicación y ensamblaje del rotavirus. Por esta
razón, es probable que el rotavirus tenga mecanismos moleculares para inhibir la expresión selectiva de
Hsp70 y no de Hsc70. Es decir, en las condiciones de choque térmico Hsp70 Y Hsc70 pueden tener
funciones opuestas relacionadas con la replicación del rotavirus. Este análisis concuerda con lo
reportado por Broquet et al. (2007) que muestra que la Hsp70 afecta negativamente la biodisponibilidad
18
de las proteínas de rotavirus, en la línea Caco-2.
El porcentaje de vellosidades que expresan Hsc70 aumenta con el choque térmico a nivel de la
membrana citoplasmática. Cuando se cosechan las vellosidades infectadas entre cero y cuatro horas, y
luego este lisado se usa para infectar vellosidades que se cosecharán 12 h.p.i se observa mayor
infección respecto a los lisados procedentes de vellosidades infectadas sin choque. Esto sugiere que
aunque son tiempos relativamente cortos de infección, hay un mayor ingreso de partículas virales a las
células, las cuales se replicaron y formaron viriones rápidamente. El mismo fenómeno no se observa
en 8, 10 y 12 h.p.i. probablemente porque cuando ingresa gran cantidad de viriones, que se replican y
destruyen rápidamente las células, las cuales no son detectadas por la inmunocitoquímica. Es decir, en
este procedimiento, el error técnico consistió en no haber hecho mayores diluciones de los lisados a las
0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 h.p.i. que se emplearon para la re-infección. En este caso solo diluimos cinco veces
el lisado que contenía ECwt y una sola vez el de RRV. Es probable que se requieran mayores
diluciones de los lisados para poder determinar si existen diferencias claras entre vellosidades con y sin
choque térmico. Esto es debido a que alrededor de las 6 h.p.i., hasta las 12 h.p.i., la concentración de
viriones es mucho mayor que la de células susceptibles a la infección, de manera que la cantidad de
células potencialmente infectables se constituye como un factor limitante de la infección. Por esta
razón, en el ELISA no se observan diferencias porque son lisados de 12hpi y no discrimina entre
viriones y proteínas virales no ensambladas y que están en suspensión. Los Acs pueden estar
reconociendo mayoritariamente proteínas virales no ensambladas en las vellosidades que no recibieron
choque, en cambio los Acs pueden estar detectando principalmente viriones en las vellosidades que
recibieron el choque térmico; esto asumiendo que la proporción de viriones es mayor, respecto a las
proteínas virales no ensambladas en las vellosidades con choque térmico, cuando se compara con las
que no lo recibieron.
19
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