11Determinacion de 2..

Determinación de ácido 2,4-diclorofenoxiacético
acuosas por extracción en fase sólida y HPLC
en
matrices
Montti,M.; Chaulet,M.; Visciglio,S.; Martínez,H.; Nuñez Croattini,M.; Biondi, M.
Univ. Nac.de Entre Ríos. Facultad de Cs. de la Alimentación. L.I.R.A. Monseñor Tavella
1450. Concordia. E. R. Arg. TE/Fax: 0345-4231450. E-mail: [email protected]
Resumen
El ácido 2,4-diclorofenoxiacético es un herbicida selectivo de aplicación en el sector
agrícola, utilizado además en el drencher con el fin de prevenir la perdida del cáliz en los
frutos cítricos.
Teniendo en cuenta que las mayores exigencias del mercado hacen necesario el
desarrollo de metodologías analíticas tenientes a la determinación de contenidos
residuales a niveles traza; se planteó como objetivo del presente trabajo la optimización
del proceso extractivo del ácido 2,4-diclorofenoxiacético en matrices acuosas y su
determinación cuantitativa por Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC).
La optimización del método implicó la selección del adsorbente y eluyente más
adecuados para la separación del analito por extracción en fase sólida, la determinación
de las condiciones cromatográficas, características de la fase móvil y condiciones de
operación.
La extracción empleando octadecilsilano como adsorbente y fase móvil de H2KPO4
0,005 M - Acido acético 0,01% y Acetonitrilo-Metanol (1:1) v/v - Acido acético 0,01%, en
una proporción de 35:65 v/v; permitió una adecuada separación del analito.
Las condiciones cromatográficas óptimas se establecieron a una longitud de onda
de 240 nm, a una temperatura de columna de 40°C con una velocidad de flujo de 1
ml/min.
El tratamiento estadístico de los resultados permitió determinar que el método es
lineal en todo el rango de concentración previsto, con un porcentaje de recuperación
medio de 98.3 % (α = 0.05), una desviación estándar de 0.88 y coeficiente de variación
relativo de 0.9. La sensibilidad del método es adecuada, con límites de detección y de
cuantificación de 0.86 y 3.5 ng respectivamente.
Palabras clave: 2,4-diclorofenoxiacético – Extracción en Fase Sólida – Matrices acuosas
Introducción
La producción citrícola constituye una de las principales actividades agrícolas de la
zona, siendo una importante fuente de desarrollo socio-económico en toda la región.
El incremento de las exportaciones y la apertura hacia nuevos mercados
internacionales, exigen en la actualidad una adecuación del sistema productivo a las
normas de calidad, especialmente en cuanto a manejo de agroquímicos se refiere.
Las mayores exigencias en cuanto a limites de tolerancia de residuos de
agroquímicos en los productos, hacen necesario el desarrollo de metodologías analíticas
tenientes a la determinación de contenidos residuales a niveles traza con adecuado rigor
científico, a fin de brindar al sector productivo las herramientas de control analítico
necesarias para promover la adecuada inserción de sus productos en el mercado.
El ácido 2,4-diclorofenoxiacético es un herbicida selectivo de aplicación en el sector
agrícola, cuyos residuos pueden encontrase como contaminantes en diversos recursos
hídricos tales como ríos, lagos, etc.; dada su capacidad de drenar a través de los
diferentes tipos de suelos. Este derivado fenoxiácido es utilizado además como producto
hormonal en el drencher, con el fin de prevenir la perdida del cáliz en los frutos cítricos;
su aplicación es previa al desverdizado en concentraciones no superiores a 10 ppm a fin
de minimizar los residuos sin disminuir el ritmo de desverdización.
En el presente trabajo se planteó como objetivo la optimización del proceso
extractivo del ácido 2,4-diclorofenoxiacético en matrices acuosas y su determinación
cuantitativa por Cromatografía Líquida de Alta Performance.
Materiales y Métodos
Se utilizo el siguiente equipamiento: Cromatógrafo Hewlett Packard Modelo 1050
para Cromatografía Líquida de Alta Performance, detector de longitud de onda variable
Modelo 79856AX y columna cromatográfica HP C18 fase reversa, de acero inoxidable de
200 mm x 4,6 mm od con Hipersil ODS tamaño de partícula 5µ. Inyector Rheodyne Mod.
7125, loop de 100 µl conectado a la columna. Método de inyección: llenado total del
loop. Chem Station HP 3365 Series II.
Distribuidor de vacío para extracción en fase sólida (SPE), control de flujo para
cada tubo de extracción. Columnas de SPE: cartuchos de polipropileno de 25 ml. Frit y
relleno con 500 mg de adsorbente fase normal C18 (Alltech).
Se utilizaron los siguientes reactivos: Acetonitrilo grado HPLC (Sintorgan), Metanol
grado HPLC (Sintorgan). Acido Fosfórico grado HPLC (Anedra). Fosfato diácido de potasio
(Biopack). Acido acético glacial (Biopack). Agua grado 1.
Solución estándar certificado de 2,4D (ACCU STANDARD INC).
Las soluciones de estándar a diferentes concentraciones, preparadas a partir de una
solución stock de 1000 mg/l de 2,4D en metanol, se conservaron bajo refrigeración.
Plan de muestreo y preparación de las muestras
Dado que se trata del desarrollo de una metodología analítica el plan de muestreo
se limita al tratamiento de muestras acuosas adicionadas.
El número de muestras a analizar se estableció en función de la variabilidad y el
grado de confiabilidad esperado (α = 0,05). Las muestras fueron fortificadas a diversas
concentraciones, de acuerdo a los factibles niveles del analito esperados en muestras
acuosas.
Las muestras acuosas (agua grado 1) se adicionaron a diferentes concentraciones
con estándar de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, por triplicado para cada concentración. En
función de las propiedades fisicoquímicas del analito (pKa 2,64) las mismas se
acidificaron con ácido fosfórico hasta pH 2.
Metodología
Para el desarrollo de la metodología analítica, se han tenido en cuenta las
siguientes etapas:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Determinación de las condiciones cromatográficas
Tratamiento previo de la muestra
Selección del adsorbente
Selección del eluyente
Selección de la fase móvil
Se efectuaron tres lecturas cromatográficas por cada triplicado, obteniéndose un
total de nueve resultados por muestra.
Los resultados se analizaron estadísticamente a fin de determinar: desviación
estándar, coeficiente de variación, porcentaje de recuperación, linealidad, precisión,
exactitud, limite de detección y cuantificación.
ƒ
Condiciones Cromatográficas: la longitud de onda óptima de trabajo se determinó por
escaneo de espectros con estándares.
ƒ
Tratamiento previo de la muestra: tal como se indicó anteriormente las muestras
acuosas adicionadas se acidificaron con ácido fosfórico hasta pH 2.
ƒ
Selección de la Fase Móvil: se realizaron ensayos con diferentes fases móviles a fin de
optimizar el proceso cromatográfico. La composición de las mismas se detalla a
continuación:
-
Fase
Fase
Fase
Fase
Fase
Móvil
Móvil
Móvil
Móvil
Móvil
A: KH2PO4 0,005M - Ácido acético 0,01%.
B: Acetonitrilo-Metanol (1:1) v/v - Ácido acético 0,01%.
C: Acetonitrilo-Agua (32,5:67,5) v/v - Ácido acético 0,01%.
D: Metanol-Agua (50:50) v/v, pH 4,5-5.
E: Metanol-Agua acidificada con Ácido Fosfórico al 0,8% (56:44) v/v.
A fin de lograr una proporción óptima de volúmenes de las fases móviles A y B, se
efectuaron diferentes gradientes de ambas soluciones mediante el uso de la bomba
cuaternaria del equipo.
Selección del adsorbente, clean up y concentración en fase sólida: previo análisis de
la polaridad del analito y características de los adsorbentes, se efectuaron diferentes
ensayos con los siguientes adsorbentes: Octilsilano (C8), Octadecilsilano (C18), Sílica y
Florisil.
Para la extracción del analito de las muestras acuosas se emplearon cartuchos o
columnas rellenas con 0.5 g de C18. La etapa de activación del adsorbente se llevó a cabo
con 2 ml de metanol y 2 ml de agua acidulada con ácido fosfórico a pH 2.
ƒ
ƒ
Selección del eluyente: la fuerza elutora del eluyente debe ser máxima a fin de lograr
una adecuada desorción del analito del adsorbente, por lo que se utilizaron como
eluyentes soluciones de diversa composición, tales como:
-
Fase Móvil: (A:B) 35 /65 v/v
Fase Móvil: (A:B) 45/55 v/v
Fase Móvil: (A:B) 70/30 v/v
Metanol
Metanol-Agua (50:50) v/v
Resultados y discusión
Condiciones Cromatográficas
El escaneo de espectro de estándares permitió establecer la longitud de onda en
230 nanómetros. Se estableció una temperatura de columna de 40°C y velocidad de
Flujo de la fase móvil por columna en 1 ml/min.
Selección de la Fase Móvil
Tal como se indicó anteriormente las fases móviles utilizadas fueron:
-
Fase
Fase
Fase
Fase
Fase
Móvil
Móvil
Móvil
Móvil
Móvil
A: KH2PO4 0,005M - Ácido acético 0,01%.
B: Acetonitrilo-Metanol (1:1) v/v - Ácido acético 0,01%.
C: Acetonitrilo-Agua (32,5:67,5) v/v - Ácido acético 0,01%.
D: Metanol-Agua (50:50) v/v, pH 4,5-5.
E: Metanol-Agua acidificada con Ácido Fosfórico al 0,8% (56:44) v/v.
Diferentes mezclas de fase móvil A y B, permitieron observar respuestas
cromatográficas adecuadas, no siendo así para las restantes fases móviles.
A fin de establecer una relación óptima de las fases móviles A y B se efectuaron
diferentes gradientes de ambas soluciones, mediante el uso de la bomba cuaternaria del
equipo.
La relación óptima correspondió a una relación de las fases A y B de 55:45 v/v
respectivamente.
Selección del adsorbente, clean up y concentración en fase sólida
Los mayores porcentajes de recuperación del analito se obtuvieron utilizando como
adsorbentes octilsilano (C8) y octadecilsilano (C18). Se seleccionó el C18 ya que presentó
una mayor capacidad de retención y concentración del analito en la fase sólida.
Selección del eluyente
Los rangos de porcentajes de recuperación medios obtenidos para cada uno de los
eluatos permiten establecer el eluyente más adecuado para el proceso.
En la siguiente tabla se detallan los porcentajes medios de recuperación para las
diferentes composiciones de los eluyentes.
Tabla 1. Niveles comparativos de recuperación de 2,4-D para diferentes eluyentes
Eluyente
% de recuperación
Fase Móvil: (A:B) 35 /65 v/v
>95
Fase Móvil: (A:B) 45/55 v/v
70-75
Fase Móvil: (A:B) 70/30 v/v
30
Metanol
Metanol-Agua (50:50) v/v
<10
30
Los resultados indican que la solución con mayor poder elutrópico corresponde a la
solución de Fase Móvil (A:B) en una proporción 35/65 v/v a pH 2 - 2,5.
Los resultados onbtenidos se analizaron estadísticamente, determinándose:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Linealidad: inyecciones por triplicado de muestras acuosas adicionadas con
estándar de 2,4-D a 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1 y 2 ppm.
Sensibilidad: inyección por triplicado de tres muestras de baja concentración
(0.1, 0.05 y 0.03 ppm) de 2,4-D. Determinación de límites de detección y
cuantificación.
Precisión: del sistema y el método, determinada para tres concentraciones (2,
0.5 y 0.1 ppm)de 2,4-D por triplicado de muestras adicionadas.
Exactitud: procesamiento por triplicado de muestras adicionadas con 2,4-D a 2,
1 y 0.5 ppm; para determinar % de recuperación del método.
Las siguientes gráficas muestran los resultados obtenidos del tratamiento
estadíetico. En las mismas se representan valores medios de las correspondientes
respuestas cromatográficas.
3000
Linealidad
Sensibilidad
Respuesta cromatográfica (Altura de pico)
Respuesta Cromatográfica (Altura de pico)
70000
y = 33318x - 1014.1
2
R = 0.9999
60000
50000
40000
30000
20000
10000
y = 26142x - 104.76
R2 = 0.9952
2500
2000
1500
1000
500
0
0
0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
1
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9
2
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
Concentraciones (ppm)
Concentración (ppm)
Figura 1: Linealidad
Figura 2: Sensibilidad
Los límites de detección y cuantificación, para un volumen inyectado de 100 µl,
fueron 0.86 y 3.5 ng respectivamente.
En el siguiente cuadro se detallan los resultados obtenidos para la determinación de
la precisión del método:
Tabla 2: Precisión
Concentración
ppm
Media
Desv. Std.
RSD
%
Intervalo de confianza
0.1
0.07866
0.00198
2.52
± 0.042
0.5
0.46800
0.01424
3.04
± 0.027
2
1.93886
0.01634
0.84
± 0.0318
Se indica a continuación los resultados obtenidos en la determinación de exactitud
dell método: para n = 9, recuperación media 98,31 %, desviación standard 0,88, RSD
0,90 %. Siendo el t observado = 0,64 y ttabla (α=0.05y n-1) = 2.306, lo que permite
establecer que no existen diferencias significativas entre recuperación media y 100 %.
Conclusiones
La determinación de ácido 2,4-Diclorofenoxiacético a partir de muestras acuosas
por extracción en fase sólida y cromatografía líquida de alta performance, empleando
octadecilsilano (C18) como adsorbente y fase móvil como eluyente en el proceso
extractivo; a una longitud de onda de 240 nm, temperatura de columna de 40°C y
velocidad de flujo de 1 ml/min como condiciones cromtográficas; permitió la
cuantificación del analito con porcentajes de recuperación relevantes.
Las condiciones óptimas de extracción se establecieron para una composición de la
fase móvil correspondiente a la resultante de la mezcla de las siguientes soluciones:
H2KPO4 0,005 M - Acido acético 0,01% y Acetonitrilo-Metanol (1:1) v/v - Acido acético
0,01%.
El método optimizado es lineal en todo el rango de concentración previsto, con un
porcentaje de recuperación medio de 98.3 % para un nivel de confianza del 95%, una
desviación estándar de 0.88 y coeficiente de variación relativo de 0.9. La sensibilidad del
método es adecuada, con límites de detección y de cuantificación de 0.86 y 3.5 ng
respectivamente.
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