rinotraqueitis bovina infecciosa / vulvovaginitis pustular

CAPÍTULO 2.3.5.
RINOTRAQUEITIS BOVINA INFECCIOSA /
VULVOVAGINITIS PUSTULAR INFECCIOSA
RESUMEN
La rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa, causada por el herpesvirus 1
bovino (BHV1), es una enfermedad del ganado bovino doméstico y silvestre. El virus está
distribuido por todo el mundo, pero se ha erradicado de Austria, Dinamarca, Finlandia, Suecia y
Suiza, y otros países han iniciado programas de control.
La enfermedad se caracteriza por síntomas clínicos del tracto respiratorio superior, como
descargas nasales (muco) purulentas, y conjuntivitis. Los síntomas generales son fiebre,
depresión, inapetencia, aborto y reducción de la producción de leche. El virus también puede
infectar el tracto genital y originar vulvovaginitis pustular y balanopostitis. El análisis post-mortem
revela rinitis, laringitis y traqueitis. La mortalidad es baja. Muchas infecciones siguen un curso
subclínico. Las infecciones bacterianas secundarias pueden ocasionar una enfermedad respiratoria
más grave.
Identificación del agente: El virus se puede aislar de frotis nasales durante la fase aguda de la
infección, y de varios órganos post-mortem. El examen post-mortem revela rinitis, laringitis y
traqueitis.
Para aislar el virus se utilizan varios tipos de cultivos celulares de origen bovino, como
células secundarias de cultivos de pulmón o riñón, o la línea celular Madin-Darby de riñón bovino.
A los 2-4 días el virus produce efecto citopático. Se identifica por métodos de neutralización o de
detección de antígenos con sueros monoespecíficos o anticuerpos monoclonales. Los aislamientos
de BHV1 se pueden subtipar por análisis del ADN con enzimas de restricción.
Se han desarrollado métodos de detección del ADN vírico y la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa puede ser particularmente útil en estudios a partir de muestras de semen.
Pruebas serológicas: Las pruebas utilizadas más ampliamente para la detección de anticuerpos
son las de neutralización del virus y varios tipos de enzimoinmunoensayos (ELISAs). Los
anticuerpos se pueden detectar en la leche con un método ELISA.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se dispone de vacunas
atenuadas y muertas. Las vacunas deben proteger clínicamente al ganado en caso de infección y
reducir notablemente la liberación subsiguiente de virus. Las vacunas no deben producir
enfermedad, aborto ni reacciones locales o sistémicas y deben ser genéticamente estables. En
1995, se consiguieron vacunas con un mutante deleccionado. El uso de una técnica gE ELISA
permite distinguir entre ganado infectado y ganado vacunado con esas vacunas marcadas.
A. INTRODUCCIÓN
La rinotraqueitis bovina infecciosa/ vulvovaginitis pustular infecciosa (RBI/VPI), causada por el herpesvirus bovino
tipo 1(BHV1), es una enfermedad del ganado bovino doméstico y salvaje. El BHV1 es un miembro del género
Varicellovirus de la subfamilia Alfaherpesvirinae, que pertenece a la familia Herpesviridae. El genoma vírico es
ADN bicatenario que codifica para unas 70 proteínas, de las que se conocen 33 que son estructurales y hasta 15
que no son estructurales. Las glicoproteínas víricas, que se localizan en la envoltura superficial del virión, tienen
un papel importante en la patogénesis y en la inmunidad. Por diferencias en el análisis del ADN con enzimas de
restricción, el BHV1 se puede diferenciar en los subtipos 1.1 (infecciones respiratorias), 1.2 (infecciones
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respiratorias y genitales) y 1.3 (infecciones neurológicas; BHV5), 2a y 2b (17). El virus del subtipo 2 parece
menos virulento que el del subtipo 1 (7). Sin embargo, solo hay un tipo antigénico de BHV1.
El nombre de la enfermedad indica los síntomas clínicos más destacables. Después de un período de incubación
de 2-4 días, se evidencia una notable descarga nasal serosa, salivación, fiebre, inapetencia y depresión. En unos
pocos días las descargas nasales y oculares cambian a mucopurulentas. Las lesiones necróticas en la nariz
pueden progresar hasta formar úlceras y pústulas recubiertas por una seudomembrana que obstruye las vías
respiratorias altas y conduce a una respiración bucal. La infección también puede producir aborto y una
disminución de la producción de leche (10). Donde se practica la monta natural, la infección genital puede
originar vulvovaginitis o balanopostitis. Éstas se caracterizan por lesiones necróticas ligeras o graves de la
mucosa vaginal o prepucial. Después de la inseminación artificial con semen infectado, puede aparecer
endometritis (12). En terneros infectados con HBV1, se desarrolla una enfermedad sistémica, con lesiones
necróticas focales en las vísceras y posiblemente con una gastroenteritis pronunciada. Muchas infecciones
siguen un curso subclínico (32). La meningoencefalitis parece ser el resultado de una infección por un
herpesvirus relacionado, pero distinto, recientemente designado como BHV5 (27), aunque la infección por BHV1
también puede causar meningoencefalitis de forma esporádica. El BHV1 puede afectar a animales de cualquier
edad, pero es más común en animales de edad superior a 6 meses.
Los casos de enfermedad respiratoria o genital provocados por BHV1 sin complicaciones duran 5-10 días. Las
infecciones bacterianas secundarias, por ejemplo con Pasteurella spp., pueden originar síntomas clínicos más
graves debido a la afección de vías respiratorias más profundas.
El virus penetra en el animal por la nariz y se replica con títulos altos en las membranas mucosas del tracto
respiratorio superior y en las amígdalas. Después se disemina a las conjuntivas y por transporte por el axón de
las neuronas alcanza el ganglio trigémino. En ocasiones se presenta un nivel bajo de viremia. En una infección
genital, el BHV1 se replica en la membrana mucosa de la vagina o del prepucio, y se establece en forma latente
en los ganglios sacros. El ADN del virus permanece en las neuronas de los ganglios, probablemente durante toda
la vida del hospedador. El estrés, como el producido por el transporte o el parto, puede inducir la reactivación de
la infección latente. El virus puede, por tanto, liberarse al medio de modo intermitente.
La lesión primaria consiste en una necrosis focal de las membranas mucosas nasales, laríngeas, traqueales o
genitales. Esta lesión es, probablemente, la secuela directa de la replicación del virus y su consiguiente efecto
citopático (ECP). El animal reacciona con una respuesta inflamatoria intensa. Las lesiones se pueden unir
formando grandes pústulas que muestran una infiltración masiva de leucocitos. Los leucocitos de la sangre
periférica pueden contener BHV1 (9, 19). Una infección aguda por BHV1 produce apoptosis en las células
linfoides (35). Cuando aparecen infecciones bacterianas secundarias, se puede desarrollar una neumonía. En
fetos abortados, se presentan pequeños focos necróticos en diversos tejidos, particularmente en el hígado.
Normalmente una infección induce una respuesta de anticuerpos y una respuesta inmune mediada por células en
7-10 días. La respuesta inmune parece durar toda la vida, aunque puede estar bajo los límites de detección de
algunas pruebas. No obstante, la inmunidad protectora después de la infección no es duradera: el ganado puede
reinfectarse. Los anticuerpos maternos se transfieren por el calostro a los terneros jóvenes que están, por
consiguiente, protegidos contra la enfermedad ocasionada por el BHV1 (16). Estos anticuerpos maternos tienen
una vida media de aproximadamente 3 semanas, pero en ocasiones se pueden detectar en animales de hasta 9
meses de edad, y raramente en animales más viejos.
El virus se distribuye por todo el mundo, en paralelo con la distribución del ganado doméstico. Otros rumiantes se
pueden infectar por el BHV1, pero probablemente no influyen en la extensión del BHV1 entre el ganado
doméstico. No existen otros reservorios de BHV1 aparte de los rumiantes. No se conoce la dosis infectiva mínima
del BHV1. Después de la infección, se detecta la liberación nasal de virus durante 10-14 días, con títulos
máximos de 108-1010 DICT50 (dosis infecciosa 50% cultivo tisular) por ml de secreción nasal. A distancias cortas
es posible la transmisión aérea del BHV1 (15). El semen de un toro infectado puede contener BHV1 y el virus
puede por tanto transmitirse por monta natural y por inseminación artificial (21).
El control del BHV1 se basa en las medidas higiénicas normales de una granja. Idealmente, se impone al ganado
de nueva adquisición un período de cuarentena de 2-3 semanas y solo el que sea seronegativo para BHV1
resulta admitido. En general, las vacunas evitan el desarrollo de síntomas clínicos graves y reducen la liberación
del virus después de la infección, pero no evitan la infección. Solo se deben utilizar vacunas con eficacia y
seguridad demostradas (ver Sección C).
Se puede sospechar que la infección por BHV1 es la causa de la enfermedad por los síntomas clínicos,
patológicos y epidemiológicos. Sin embargo, para hacer un diagnóstico definitivo, se necesita el examen de
laboratorio. Un procedimiento de diagnóstico completo en el laboratorio trata de detectar el virus causante (o los
componentes víricos) y los anticuerpos específicos que induce.
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B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Recogida y procesamiento de muestras
Se recogen hisopos nasales de varios animales afectados (de cinco a diez) que estén en la primera fase de
la infección. Este ganado todavía mostrará descargas nasales serosas en vez de mucopurulentas. En los
casos de vulvovaginitis o balanopostitis toman hisopos de los genitales. Los hisopos deben frotarse
vigorosamente contra las superficies mucosas. También se puede lavar el prepucio con solución salina y
recoger el líquido de lavado. Las muestras se suspenden en medio de transporte (medio de cultivo de
células que contenga antibióticos y 2-10% de suero fetal bovino para evitar la inactivación de los virus), se
enfrían a 4ºC y se envían rápidamente al laboratorio.
Durante la necropsia, se recogen para la detección del virus las membranas mucosas del tracto respiratorio
y porciones de las amígdalas, pulmones y ganglios linfoides bronquiales. En casos de aborto, se examina el
hígado fetal, los pulmones, el bazo, el riñón y un cotiledón placentario. Las muestras se deben enviar al
laboratorio en hielo con la mayor rapidez posible.
Después de su llegada al laboratorio, los hisopos se agitan en el medio de transporte para desprender el
virus y se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues de extraer los bastoncillos se clarifica
el medio de transporte por centrifugación a 1.500 g durante 10 minutos. Los tejidos se homogenizan para
formar suspensiones al 10-20% (p/v) en medio de cultivo celular antes de centrifugar a 1.500 g durante 10
minutos. Los sobrenadantes de estas muestras se filtran a través de filtros de 0.45 µm y se utilizan para el
aislamiento de virus.
El aislamiento de virus a partir del semen requiere algunas adaptaciones particulares, porque el fluido
seminal contiene enzimas y otros factores que son tóxicos para las células e inhiben la replicación vírica
(ver más adelante).
b)
Aislamiento vírico
Para aislar los virus, se pueden utilizar varios tipos de cultivos celulares. Resultan adecuadas las células
primarias o secundarias de riñón de bovino, de pulmón o de testículos, las cepas celulares derivadas de
pulmón fetal bovino, cornetes nasales o tráquea, y las líneas celulares establecidas, como la línea celular
Madin-Darby de riñón bovino. Los cultivos celulares pueden cultivarse en tubos de vidrio o de plástico, en
placas o discos. Cuando se utilizan placas de plástico de 24 pocillos, se inocula en estos cultivos celulares
100-200 µl de los sobrenadantes descritos anteriormente. Después de un período de absorción de 1 hora,
se lavan los cultivos y se añade medio de mantenimiento. El suero empleado como suplemento del medio
de mantenimiento debe estar libre de anticuerpos contra BHV1. Los cultivos celulares se observan
diariamente para ECP, que normalmente aparece a los tres días de la inoculación. Se caracteriza por la
agrupación de células redondeadas en forma de racimos que se juntan alrededor de un hueco en la
monocapa; a veces, se pueden observar células gigantes con varios núcleos. Se requiere experiencia para
reconocer esta apariencia característica. Si después de 7 días no aparece ECP, se debe realizar otro pase.
El cultivo celular se congela y se descongela, se clarifica por centrifugación, y se usa el sobrenadante para
inocular monocapas recién preparadas.
Para identificar el virus que produce ECP como BHV1, el sobrenadante del cultivo debe neutralizarse con un
antisuero monoespecífico contra BHV1 o con un anticuerpo monoclonal (MAb) neutralizante. Con este
propósito, se llevan a cabo diluciones decimales del sobrenadante de prueba y se añade a cada dilución
antisuero monoespecífico contra BHV1 o un suero negativo como control. Después de incubar a 37ºC
durante 1 hora, se inoculan las muestras en un cultivo celular; a los 3-5 días se calcula el índice de
neutralización. El índice de neutralización es el título del virus (en log10) en presencia del suero control
negativo, menos el título del virus en presencia del antisuero específico. Si el índice de neutralización es
mayor de 1.5, el aislado se considera BHV1. Para acortar el procedimiento de aislar el virus, se pueden
inocular dos muestras en cultivo celular: una que se ha preincubado con antisuero monoespecífico y otra
que se ha incubado con el suero control negativo. Si el antisuero monoespecífico inhibe el ECP, el aislado
se considera BHV1.
Un método alternativo de identificar el virus es la demostración directa de antígeno de BHV1 en las células
próximas al ECP mediante una prueba de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (11) con antisuero
monoespecífico o con MAb conjugado.
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•
Aislamiento de virus del semen (Una prueba prescrita para el comercio internacional)
Se deben probar al menos 0,05 ml de semen natural, con dos pases en cultivo celular. Para semen
conservado, se debe hacer una aproximación que asegure que se examina el equivalente a 0,05 ml de
semen natural. El semen fresco natural es generalmente citotóxico y debe prediluirse antes de añadirlo a los
cultivos celulares. A veces surge un problema similar con el semen conservado. A continuación se expone
un procedimiento adecuado de prueba.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Diluir 200 µl de semen fresco en 2 ml de suero bovino fetal (libre de anticuerpos contra BHV1) que
contenga antibióticos.
ii)
Mezclar vigorosamente y mantener 30 minutos a temperatura ambiente.
iii)
Inocular 1 ml de la mezcla semen/suero en una monocapa de células susceptibles (ver arriba,
aislamiento de virus) en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
iv)
Incubar las placas 1 hora a 37ºC.
v)
Eliminar la muestra, lavar dos veces la monocapa con 5 ml de medio de mantenimiento, y añadir 5 ml
de medio de mantenimiento a cada pocillo.
vi)
Incluir en la prueba controles negativos y positivos para BHV1. Tener mucho cuidado para evitar la
contaminación de los pocillos de ensayo con el control positivo; por ejemplo, manejando siempre el
control al final, y utilizando placas separadas.
vii)
Observar diariamente las placas al microscopio para aparición de ECP. Si aparece ECP, se realizan
pruebas confirmativas para BHV1 por métodos de neutralización específica o de marcaje inmune (ver
antes).
viii) Si después de 7 días no se observa ECP, los cultivos se congelan y se descongelan, se clarifican por
centrifugación, y se utiliza el sobrenadante para inocular nuevas monocapas.
ix)
c)
La muestra se considera negativa si no se evidencia ECP a los 7 días de incubación de los cultivos del
nuevo pase.
Detección del antígeno vírico
Los hisopos nasales, oculares o genitales se pueden extender directamente, en portaobjetos de vidrio o
bien, después de centrifugar, se puede colocar en los portas el depósito celular (ver sección B.1.a.). Estos
portaobjetos se someten a una prueba estándar de inmunofluorescencia directa o indirecta. En la prueba de
inmunofluorescencia directa, el antisuero monoespecífico se conjuga con isotiocianato de fluoresceína,
mientras que en el procedimiento indirecto es el segundo anticuerpo contra la inmunoglobulina bovina el
que se conjuga al isotiocianato de fluoresceína. Para obtener los mejores resultados, se necesita muestrear
varios animales procedentes de una población que presenten fiebre y una descarga nasal serosa ligera. Los
frotis deben secarse al aire y se fijan con acetona dentro de las 24 horas. Los frotis de escobillones nasales
del ganado bovino con descargas nasales mucopurulentas o hemorrágicas suelen ser negativos (28). La
ventaja de esta técnica de detección de antígeno es que puede permitir el diagnóstico en el mismo día. Sin
embargo, la sensibilidad de este procedimiento es menor que la del aislamiento del virus (5). En cada
prueba se deben incluir controles positivos y negativos.
El tejido recogido post-mortem se puede analizar para la presencia de antígeno de BHV1 por la prueba de
inmunofluorescencia en secciones o cortes congelados. También se puede utilizar inmunohistoquímica. La
ventaja es que se puede determinar la localización del antígeno. El uso de MAbs para detectar antígeno de
BHV1 está creciendo, lo que conduce a un incremento de la especificidad de la prueba. Sin embargo, tales
MAbs deben ser seleccionados cuidadosamente, ya que deben dirigirse contra epitopos conservados que
estén presentes en todos los aislados de BHV1.
Otra posibilidad para la detección rápida y directa de antígeno vírico es el uso de un enzimoinmunoensayo
(ELISA). El antígeno se puede capturar por MAbs o por anticuerpos policlonales fijados a una fase
sólida, generalmente el pocillo de una microplaca. Se necesitan cantidades de antígeno equivalentes a 104105 DICT50 de BHV1 para obtener una tasa elevada de resultados positivos (4). Esto no resulta
excesivamente elevado porque el ganado bovino puede excretar títulos de 108-109 DICT50/ml de fluido
nasal a los 3–5 días de la infección. La sensibilidad se puede aumentar por sistemas de amplificación (ver la
ref. 6 para un ejemplo).
Las ventajas de los métodos de detección de antígeno frente a los de aislamiento de virus son que no se
necesitan servicios de cultivos celulares y que se puede hacer un diagnóstico de laboratorio en 1 día. Las
desventajas radican en la menor sensibilidad de la detección directa del antígeno y en la necesidad extra de
realizar el aislamiento del virus, si se necesita el aislado para estudios posteriores.
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d)
Detección del ácido nucleico
En la última década se han descrito varios métodos para demostrar la presencia del ADN del BHV1 en
muestras clínicas, incluyendo la hibridación ADN-ADN y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El
uso de la PCR en el diagnóstico rutinario está creciendo (18). En comparación con el aislamiento de virus, la
PCR tiene la ventaja principal de que es más sensible y más rápida: puede realizarse en 1-2 días. También
puede detectar ADN en ganglios sensoriales con infección latente (29). La desventaja es que es fácil de
contaminar y por consiguiente hay que tomar medidas para evitar falsos resultados positivos.
Hasta la fecha la PCR se ha utilizado principalmente para detectar ADN del BHV1 en muestras de semen
infectado artificial (37) o naturalmente (29, 30). Los investigadores destacan que es importante optimizar
cuidadosamente las condiciones de la prueba PCR, incluyendo la preparación de las muestras, la
concentración de Mg2+, los cebadores y la polimerasa Taq, y los programas de ciclos. La región a amplificar
debe estar presente en todas las cepas de BHV1 y la secuencia nucleotídica debe estar conservada. Se
han utilizado los genes TK, gB, gC, gD y gE como dianas para la amplificación por PCR. Para distinguir
entre el virus salvaje y el de cepas vacunales con el gen gE deleccionado se pueden utilizar PCRs basadas
en la detección de las secuencias de gE (9, 26). Con la técnica de la PCR no es posible discriminar entre la
infección con cepas IBR virulentas y la infección con otras cepas vivas atenuadas. Se han desarrollado
PCRs que distinguen entre BHV1 y BHV5 (1, 25).
Experimentalmente, la PCR resulta más sensible que el aislamiento de virus: detecta cinco veces más
muestras positivas que el aislamiento de virus. Además, tiene un límite de detección de tan solo tres
moléculas. Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad de falsos resultados negativos. Para identificar
posibles resultados falsos negativos se recomienda introducir un ADN molde de control interno en el tubo de
reacción de la muestra del semen, que se amplifique con los mismos cebadores. Tal ADN molde de control
se puede construir insertando, por ejemplo, un fragmento de 100 pares de bases en la región analizada.
Este molde de control también hace posible semicuantificar la cantidad de ADN detectada (25, 29, 30).
Antes de que se reconozca internacionalmente a la PCR como un instrumento de diagnóstico adecuado
para el comercio internacional, deberá ser validada por una prueba comparativa entre diferentes
laboratorios.
e)
Diferenciación de subtipos del herpesvirus bovino 1
Los subtipos 1 y 2b del BHV1 se pueden diferenciar por inmunofluorescencia, radioinmunoprecipitación,
inmunoperoxidasa o pruebas de inmunotransferencia (24, 36). El análisis con endonucleasas de restricción
permite diferenciar entre todos los subtipos reconocidos de BHV1 (17). El ADN se extrae primero de los
viriones o de células infectadas, se digiere con endonucleasas de restricción, y los fragmentos que resultan
se separan por electroforesis en gel de agarosa. El tamaño y el número de los fragmentos indican el subtipo
del virus. Tales técnicas son de un valor diagnóstico limitado, pero pueden ser útiles en estudios
epidemiológicos.
f)
Interpretación de los resultados
El aislamiento del BHV1 de un animal no significa necesariamente que el virus sea la causa del brote de la
enfermedad. Por ejemplo, puede ser un virus latente que se haya reactivado debido a condiciones de
estrés. Se debe hacer un diagnóstico de laboratorio confirmativo con un grupo de animales, y debe estar
acompañada de seroconversión de negativos a positivos o de un aumento en el título de anticuerpos contra
BHV1 de cuatro veces o más. El ganado del que se recogen los frotis nasales se sangra dos veces, con 2-3
semanas de diferencia. Estas muestras de pares de sueros se examinan juntas en una prueba serológica
para la presencia de anticuerpos específicos (ver Sección B.2).
2.
Pruebas serológicas
Las pruebas serológicas se pueden utilizar para diferentes fines:
i)
Para diagnosticar una infección aguda: se examinan en una prueba muestras de suero de las fases agudas
y de convalecencia de la infección en los mismos animales. Una seroconversión de negativos a positivos o
un aumento de cuatro veces o más en el título de anticuerpos se considera que es indicativo de infección.
ii)
Para demostrar la ausencia de infección, por ejemplo, con relación al mercado internacional.
iii)
Para determinar la prevalencia de la infección en estudios seroepidemiológicos.
iv)
Para apoyar programas de erradicación y el control subsiguiente.
v)
Para propósitos de investigación, por ejemplo, la evaluación de la respuesta de anticuerpos después de la
vacunación y de una infección de desafío.
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Para detectar anticuerpos contra el BHV1 en el suero se emplean normalmente pruebas de neutralización
vírica (NV) y varios ELISAs (13). Una prueba serológica alternativa es la inmunofluorescencia indirecta (33).
Como la latencia del virus es una secuela normal de la infección por BHV1, la identificación de animales
serológicamente positivos supone un indicador útil y fiable del estado infectivo. Cualquier animal con
anticuerpos contra el virus se considera un portador y un potencial excretor intermitente del virus. Las
únicas excepciones a esto son los terneros jóvenes que han adquirido de modo pasivo los anticuerpos por
el calostro de sus madres y el ganado no infectado, vacunado con vacunas inactivadas.
Los métodos ELISAs, incluyendo el gE-ELISA, se utilizan cada vez más para detectar anticuerpos en
muestras de leche entera, pero presentan algunas limitaciones. Una prueba de leche negativa indica que
menos del 20% de los adultos de la población lechera posee anticuerpos contra BHV1. Muchas vacas
individuales seropositivas presentan un título de anticuerpos en la leche menor de 1/5. Este título puede ser
variable, dependiendo del nivel de detección del ELISA utilizado. Por consiguiente, no es posible declarar
que un grupo de animales o una población esté libre de infección por BHV1 basándose en pruebas con
leche individual o colectiva, y una prueba de leche negativa debería continuarse con el análisis de muestras
individuales de suero de todo el ganado de la explotación. A efectos de un control general, las pruebas en
los tanques de leche entera pueden proporcionar una estimación de la prevalencia del BHV1 en una
manada, un área o un país (20). Éstas deberían suplementarse con pruebas de suero (individual o
colectivo) de explotaciones no lecheras.
a)
Neutralización de virus (una prueba prescrita para el comercio internacional)
Las pruebas de NV se llevan a cabo con varias modificaciones. Las pruebas varían respecto de la cepa de
virus utilizada en el protocolo de la prueba, la dilución inicial de suero, el período de incubación de la mezcla
virus/suero (1-24 horas), el tipo de células utilizadas, el día de la lectura final, y la lectura de punto final
(50% frente a 100%) (22). De estas variables, el período de incubación de la mezcla virus/suero posee el
efecto más importante sobre el título de anticuerpos. Un período de incubación de 24 horas puede detectar
títulos hasta 16 veces superiores que un período de incubación de 1 hora (2), y se recomienda cuando se
requiere la máxima sensibilidad (por ejemplo, a efectos del mercado internacional). En la prueba de NV
resulta adecuado utilizar varias células bovinas o líneas celulares, incluyendo células secundarias de riñón o
de testículo de bovino, estirpes celulares de pulmón de bovino o de células de la tráquea, o la línea celular
establecida de Madin-Darby de riñón bovino.
A continuación se indica un protocolo adecuado para una prueba de NV.
i)
Inactivar los sueros, incluidos los sueros control estándar, durante 30 minutos en un baño de agua a
56ºC.
ii)
Preparar diluciones dobles de los sueros de prueba en medio de cultivo celular. Comenzar con suero
no diluido y continuar horizontalmente hasta la dilución 1/1024 en una placa de microtitulación de
grado de cultivo celular, con 96 pocillos de fondo plano. Utilizar por lo menos dos pocillos por dilución y
50 µl por pocillo. En la prueba también se incluyen diluciones de un suero control positivo, de un
positivo débil y de un control negativo. Se utiliza un pocillo adicional con suero sin diluir como control
de toxicidad de los sueros.
iii)
Añadir a cada pocillo 50 µl del stock de BHV1 diluido en medio de cultivo de modo que suponga 100200 DICT50 por pocillo. En los pocillos de control de toxicidad, añadir 50 µl de medio de cultivo en lugar
de virus. Añadir 100 µl de medio de cultivo a diez pocillos vacíos para control de las células.
iv)
Hacer por lo menos cuatro diluciones decimales del stock residual de virus (re-titulación) en medio de
cultivo, 50 µl por pocillo y al menos cuatro pocillos por cada dilución.
v)
Incubar las placas durante 18-24 horas a 37ºC.
vi)
4
Añadir 100 µl por pocillo de la suspensión celular a razón de 3 x 10 células por pocillo.
vii)
Incubar las placas durante 3-5 días a 37ºC.
viii) Leer microscópicamente las placas para ECPs. Validar la prueba comprobando la re-titulación del virus
(que debería dar un valor de 100 DICT50, con una variación permisible de 30-300 DICT50), los sueros
control y los pocillos de control de células. El suero control positivo debería dar un título de + 1 dilución
doble (+ 0.3 unidades logarítmicas decimales) respecto a su valor. El suero positivo débil debería ser
positivo. El suero negativo no debería producir neutralización cuando se prueba sin diluir (equivalente
a una dilución final de ½ en la fase de neutralización). En los pocillos de control de células, la
monocapa debería estar intacta.
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ix)
b)
Los resultados de la prueba sobre el suero se expresan como el inverso de la dilución del suero que
neutraliza el 50% de los pocillos. Si en el 50% de los pocillos con suero no diluido se neutralizó el
virus, el título (de la dilución inicial) se considera 1 (1/2 utilizando la dilución final convencional). Si
todos los pocillos con suero no diluido y el 50% de los pocillos con suero diluido a 1/2 mostraran
neutralización del virus, el título (de la dilución inicial) sería 2 (dilución final 1/4). Para resultados
cualitativos, cualquier neutralización de título 1 o superior (dilución inicial convencional) se considera
positiva. Si se observa citotoxicidad en los pocillos de control de la toxicidad del suero, la muestra se
describe como tóxica (sin resultado), a menos que se observe neutralización del virus sin citotoxicidad
a diluciones más altas y se pueda establecer un título sin ambigüedad. Cuando existe citotoxicidad con
un suero del que resulta crítico obtener un resultado, el cambiar el medio en los pocillos de las
diluciones más bajas 16-24 horas después de añadir las células puede eliminar el efecto citotóxico con
muchos sueros problema.
Enzimoinmunoensayo (una prueba prescrita para el comercio internacional)
Los métodos ELISAs para detectar anticuerpos contra BHV1 parecen estar reemplazando gradualmente las
pruebas NV. No se ha establecido un procedimiento ELISA estándar. Hay disponibles varios tipos de ELISA,
incluyendo ELISAs indirectos y de bloqueo. Los procedimientos indirectos son los de uso más común.
Existen diversas preparaciones comerciales ELISA, muchas de las cuales son también adecuadas para
detectar anticuerpos en la leche. Por razones de estandarización en un país o estado, sería deseable
comparar la calidad de las preparaciones comerciales y probar cada lote respecto a criterios definidos
previamente en un laboratorio nacional de referencia, antes de su uso en otros laboratorios del país.
Existen ciertas variaciones en los procedimientos para ELISA. Los más comunes son: las preparaciones de
antígenos y los recubrimientos, la dilución de la muestra de ensayo, el período de incubación del antígeno y
la muestra de ensayo, y la solución de substrato/cromógeno. Antes de su uso rutinario, un ELISA debería
validarse respecto a sensibilidad, especificidad y reproducibilidad. Con este fin, se debería probar un juego
de sueros bien definidos (por ejemplo, mediante la prueba NV) que fueran muy positivos, débilmente
positivos y negativos.
•
Enzimoinmunoensayo indirecto
A continuación se presenta un ejemplo de procedimiento para un ELISA indirecto:
520
i)
Preparar el antígeno haciendo crecer BHV1 en cultivos celulares. Cuando se observa que se ha
desarrollado ECP, se congela el medio y las células a -20ºC. Después de descongelar, el lisado celular
resultante se centrifuga durante 4 horas a 8.500 g. El precipitado que contiene el virus se resuspende
en un pequeño volumen de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se enfría con hielo, y se
rompe en un desintegrador ultrasónico. Después, la preparación de antígeno se centrifuga 10 minutos
a 800 g y el sobrenadante se utiliza a una dilución apropiada para recubrir las placas. En la literatura
publicada sobre el tema se pueden encontrar muchos métodos alternativos de producción de antígeno.
ii)
Recubrir con antígeno los pocillos de la placa de microtitulación añadiendo 100 µl de antígeno diluido
(en 0,05 M de tampón carbonato, pH 9.6) a cada pocillo de la microplaca. Cerrar las placas con cinta,
incubar a 4ºC toda la noche o a 37ºC durante 1-2 horas, y guardar a -20ºC.
iii)
Antes de realizar la prueba, lavar las placas. Para evitar uniones inespecíficas en la prueba, que
originan niveles altos de fondo, se puede necesitar un segundo recubrimiento con una proteína no
relevante (por ejemplo, albúmina). Añadir tampón, la muestra de suero, y los controles de sueros
positivo, débilmente positivo y negativo. Normalmente las muestras de suero se diluyen de 1/10 a
1/100 en PBS con 0,05% de Tween 20. Agitar, sellar las placas e incubar durante 1 hora a 37ºC.
iv)
Lavar las placas cuidadosamente, añadir inmunoglobulina anti-bovina conjugada con peroxidasa de
rábano a una dilución predeterminada e incubar de nuevo 1 hora a 37ºC.
v)
Añadir una solución recién preparada de substrato/cromógeno (por ejemplo, tampón 0,1 M de citrato
fosfato, pH 4, que contenga 2, 2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6 ácido sulfónico]). 2NH4 [ABTS;
0,5 mg/ml] y una solución al 3% de H2O2 recién añadido [2 µl/ml], e incubar por un tiempo apropiado.
vi)
Medir la absorbancia de las placas en un fotómetro de microplacas a la longitud de onda adecuada.
vii)
Una muestra de ensayo se considera positiva si tiene un valor de absorbancia 0,2 veces mayor que el
control de suero negativo. La prueba es válida si los sueros positivo y débilmente positivo son positivos
y si el suero negativo tiene un valor de absorbancia menor de 0,2. Las pruebas no válidas deben
repetirse. Los límites aceptables para los valores control y de corte deben determinarse para el ensayo
individual.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.3.5. — Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa
•
Enzimoinmunoensayo de bloqueo
El principio del ELISA de bloqueo o competitivo se basa en bloquear la unión del antígeno a un antisuero
contra BHV1 o a un MAb anti-BHV1 marcado con una enzima, mediante los anticuerpos presentes en la
muestra de prueba. La presencia de anticuerpos en la muestra de prueba bloqueará la unión, originando un
descenso en el desarrollo del color después de añadir la solución de cromógeno/substrato. Una
comparación entre ELISAs indirectos y ELISAs bloqueantes mostró que el último tipo es por lo general más
sensible (22): Recientemente, se han descrito gE-ELISAs que se pueden utilizar juntamente con vacunas
marcadoras para detectar el ganado infectado en poblaciones vacunadas (31, 34). En una prueba gEELISA, la leche puede reemplazar al suero (34).
c)
Estandarización
En cada prueba serológica se deberían incluir controles adecuados de suero muy positivo, de suero
débilmente positivo, y de suero negativo. En Europa, un grupo de científicos encabezado por el grupo de
veterinarios de inseminación artificial de la Unión Europea (EU) ha acordado recientemente utilizar un suero
muy positivo, uno débilmente positivo y otro negativo para la estandarización de las pruebas sobre BHV1 en
los laboratorios que examinan rutinariamente muestras de centros de inseminación artificial (23). Estos
sueros se han adoptado como estándares internacionales de la OIE para pruebas con BHV1 y están
disponibles en los Laboratorios de Referencia de la OIE para RBI/VPI1. Las pruebas ordenadas con fines de
mercado internacional (NV o ELISA) deben ser capaces de registrar como positivos tanto los estándares
positivos fuertes como los débiles (o los estándares nacionales secundarios de potencia equivalente).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
En la actualidad se dispone de varias vacunas con BHV1 atenuado e inactivado. Las vacunas contienen cepas
de virus que por lo general han crecido durante múltiples pases en cultivo celular. Algunas de las cepas de virus
vacunales tienen un fenotipo sensible a la temperatura, es decir, no se multiplican a 39ºC o a temperaturas
superiores. Las vacunas atenuadas se administran intranasalmente o intramuscularmente. Las vacunas
inactivadas contienen altos niveles de virus inactivados o porciones de las partículas víricas (glicoproteínas)
suplementadas con un adyuvante para estimular una respuesta inmune adecuada. Las vacunas inactivadas se
administran intramuscularmente o subcutáneamente.
En varios países existen vacunas marcadoras. Estas vacunas marcadoras, atenuadas o inactivadas, se basan en
mutantes deleccionados o en una subunidad del virión, por ejemplo, la glicoproteína D. El uso de tales vacunas
marcadoras con pruebas diagnósticas paralelas permite distinguir entre el ganado infectado y el ganado
vacunado suministrando así las bases para nuevos programas de erradicación del BHV1. Los programas de
vacunación intensiva pueden reducir la prevalencia de animales infectados (3, 14), que puede ser analizada por
pruebas diagnósticas en paralelo. En situaciones donde resulte económicamente justificable, los animales
infectados restantes podrían ser eliminados si fuera necesario, lo que resultaría en una región libre de BHV1.
Algunos países han apoyado recientemente tal programa de erradicación y ya no permiten la vacunación.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en la Capítulo I.1.7. pretenden ser de naturaleza
tipo general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.
1.
Control de inóculos
a)
Características del inóculo
La vacuna se prepara utilizando un sistema de lotes de inóculo. Se debe documentar el origen, la historia de
los pases y las condiciones de mantenimiento del inóculo primario de virus (MSV). En el MSV se debe
realizar una prueba de identidad del virus. El lote de inóculo contiene cepas de BHV1 que se han atenuado
para originar una cepa viva vacunal. Las cepas se pueden atenuar por pases múltiples en cultivo celular, por
adaptación del virus a crecer a bajas temperaturas (mutantes sensibles a la temperatura), o mediante
ingeniería genética, por ejemplo seleccionando uno o más genes del virus que no sean esenciales para su
replicación. Debería haber algún medio de distinguir entre el virus vivo vacunal y el virus natural (por
ejemplo, mediante modelos de crecimiento específico dependientes de la temperatura, o por análisis del
polimorfismo en fragmentos de restricción). Las cepas utilizadas para la preparación de las vacunas
inactivadas no necesitan ser atenuadas. El lote de inóculo debe carecer de contaminantes.
1
Se pueden obtener del Central Institute for Animal Disease Control, Infectious Diseases Section, P.O. Box 2004, 8203 AA
Lelystad, The Netherlands, y de AFSSA Lyon, Laboratoire de pathologie bovine, 31 avenue Tony Garnier, BP 7033,
69342 Lyon Cedex 07, Francia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
521
Capítulo 2.3.5. —Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa
b)
Método de cultivo
Las células utilizadas para la producción de vacunas se preparan también mediante un sistema de lotes de
inóculo. El virus debe cultivarse en líneas celulares establecidas que se haya comprobado que resultan
adecuadas para producción de vacunas, por ejemplo la línea celular de Madin-Darby de riñón bovino. Se
debe conocer la historia de la línea celular. Debe estar libre de agentes indeseables y puede probarse para
capacidad oncogénica.
c)
Validación como vacuna
Cualquiera que sea el método de preparación del lote de inóculo del virus vacunal, el lote de virus de
siembra destinado para su incorporación a una vacuna viva debe ser eficaz, seguro y puro.
i)
Eficacia
Se debe demostrar en un experimento de desafío de la vacunación en condiciones de laboratorio. Se
presentan varios ejemplos de normas en una monografía de la Farmacopea Europea (8). En resumen,
se administra la vacuna a cinco terneros seronegativos para BHV1, de 2-3 meses de edad. Se
mantienen dos terneros como control. Todos los terneros se inoculan intranasalmente 3 semanas
después con una cepa virulenta de BHV1 que origina los síntomas típicos de la enfermedad. Los
terneros vacunados no deben mostrar síntomas o solamente síntomas suaves. El título máximo de
virus en la mucosa nasal de los terneros vacunados debe ser por lo menos 100 veces inferior al de los
terneros control. El período de excreción del virus debe ser al menos 3 días más corto en los terneros
vacunados que en los terneros control.
ii)
Inocuidad
Una cantidad de virus equivalente a diez dosis de vacuna debería (a) no inducir reacciones localizadas
o sistémicas significativas en terneros jóvenes, (b) no causar infección fetal o aborto, y (c) no revertir a
la forma virulenta durante cinco pases seriados en terneros. Para una vacuna inactivada, se suele
administrar generalmente una dosis doble. La prueba de reversión a la virulencia no es aplicable a las
vacunas inactivadas.
iii)
Pureza
El lote de inóculo se prueba para ausencia de virus extraños y para ausencia de contaminación con
bacterias, hongos y micoplasmas. En las vacunas con BHV1 se deben excluir específicamente los
siguientes virus indeseables: adenovirus, virus de Akabane, coronavirus bovino, herpesvirus bovino
tipos 1, 2, 4 y 5, parvovirus bovino, virus respiratorio sincitial de los bóvidos, rotavirus bovino, virus
vaccinia, y los virus de la enfermedad de Aujeszky, lengua azul, fiebre efímera bovina, leucemia
bovina, papiloma bovino, estomatitis popular bovina, diarrea vírica bovina, viruela vacuna, fiebre aftosa
o glosopeda, enfermedad nodular cutánea, fiebre catarral maligna, parainfluenza 3, rabia, peste
bovina, y estomatitis vesicular. Como el virus de la diarrea vírica bovina se ha encontrado con
frecuencia como contaminante de las vacunas, se debe tener especial cuidado para asegurar que está
ausente.
2.
Método de fabricación
Todas las substancias utilizadas en la producción de las vacunas deben estar libres de contaminación. Se deben
utilizar células que no tengan más de 20 pases a partir del inóculo inicial de células. El virus de inóculo no
debería de tener más de 5 pases a partir del MSV. Las cepas de virus vacunales obtenidas por ingeniería
genética se tratan del mismo modo que las cepas atenuadas por métodos convencionales. Cuando se crecen
suficientes células, se produce la infección de la línea celular con el virus de la vacuna. La adición de antibióticos
se reserva, por lo general, al medio líquido de cultivo. El sobrenadante se recoge cuando la producción de virus
(antígeno) alcanza el máximo. Para las vacunas vivas, el sobrenadante se clarifica, se mezcla con un
estabilizador, se liofiliza y se envasa. Para la producción de vacunas clásicas inactivadas, el sobrenadante se
homogeniza antes de añadir el agente inactivante para asegurar una inactivación adecuada. Después del
proceso de inactivación se lleva a cabo una prueba para comprobar la inactivación completa del virus. La prueba
consiste en efectuar al menos dos pases en células. La suspensión de virus inactivados se mezcla después con
un adyuvante y se envasa. La producción de vacunas debe seguir las directrices de Buenas Prácticas de
Producción (GMP).
3.
Control interno
El inóculo de células de trabajo y el inóculo de virus de trabajo deben estar libres de contaminación. Las células
deben tener su morfología normal antes de inocular el virus. Se comprueban para ECP durante el cultivo. Las
células control no inoculadas deben mantener su morfología hasta el tiempo de la recogida del material. Se
realiza una titulación del virus en el sobrenadante recogido. Durante la producción de vacunas inactivadas, se
522
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.3.5. — Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa
realizan pruebas que aseguran la inactivación. El material final debe ser probado para ausencia de
contaminantes.
4.
Control de lotes
Normalmente se realizan las siguientes pruebas en cada lote. Se pueden encontrar ejemplos de normas para
realizar el control de lotes en las directrices de la EU, la Farmacopea Europea y el Código de Regulaciones
Federales del Departamento de Agricultura de los EE.UU.
a)
Esterilidad
No deben estar presentes bacterias, hongos, micoplasmas ni virus ajenos. Las pruebas de esterilidad y de
ausencia de contaminación en los materiales biológicos se describen en el Capítulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Una dosis doble de vacuna, para el caso de vacunas inactivadas, y una dosis diez veces superior a la
normal, para el caso de vacunas vivas, no debe producir efectos adversos en terneros jóvenes que sean
seronegativos para BHV1.
c)
Potencia
Es suficiente probar un lote representativo para eficacia, como se describe en la Sección C.1.c.i. Para
vacunas vivas, se debe determinar el título de virus de cada lote y no debe ser superior a 1/10 de la dosis a
la que la vacuna es segura ni inferior al título mínimo de distribución. Para vacunas inactivadas, la potencia
se ensaya utilizando otro método validado, por ejemplo la determinación de la eficacia en terneros.
d)
Duración de la inmunidad
Es suficiente probar este parámetro en el lote de inóculo del virus de la vacuna. Una vacuna eficaz con
BHV1 debería inducir una inmunidad protectora por lo menos durante 1 año, aunque muchas vacunas
existentes no han sido probadas al respecto.
e)
Estabilidad
Para vacunas vivas, se deben realizar titulaciones de virus pasados 3 meses de la fecha de caducidad que
se indica. Además, se realizan pruebas para determinar el contenido en humedad, concentración de
conservantes y pH. Para vacunas inactivadas, también se prueba la viscosidad y la estabilidad de la
emulsión.
f)
Conservantes
Debe demostrarse la eficacia de los conservantes y comprobarse su concentración y persistencia durante el
período de validez. La concentración debe acomodarse a los límites de conservante establecidos.
g)
Precauciones (riesgos)
No se necesitan precauciones especiales. El BHV1 no es patógeno para el hombre.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Cada producto debe ser seguro por lo menos en dos terneros susceptibles que reciban una dosis doble de
vacuna (vacunas inactivadas) o diez veces superior (vacunas vivas).
b)
Potencia
Ver Sección C.4.c.
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Capítulo 2.3.5. —Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis
pustular infecciosa (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página
web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004