INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE ACAYUCAN QUIMICA ANALITICA II “ CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN ” ING. CRUZ PALACIOS GERONIMO INTEGRANTES: CELDO ISIDORO ERIKA MERINO CULEBRO MARIA GUADALUPE PADRON GONZALEZ INGRID REYES CANUTO CAMILO RODRIGUEZ TORRES ROSALIA “ CROMATOGRAFIA ” La cromatografía puede definirse como una técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser líquida o sólida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre sí y con respecto a la fase móvil. La base de la separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la migración de los mismos. Notas Históricas El botánico ruso Mijail Tswett estableció las ventajas de la técnica, adopto la terminología y definió los procedimientos experimentales básicos para esta técnica, se considera que es el Padre de la Cromatografía. En los años 30 y 40 empezó su desarrollo y aplicación en diferentes procedimientos de experimentación. Principios La palabra Cromatografía significa EscribirenColores, porque cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una técnica o método físico de separación basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos en un disolvente llamado eluyente (fase móvil) a través de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil o fluido que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la separación se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la estacionaria y de la distribución de las sustancias entre las dos fases. Las moléculas que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídas más rápido que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que tienden a quedar retenidas. En resumen se fundamenta en la separación entre la fase estacionaria sólida o liquida y la fase móvil liquida o gaseosa Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son la adsorción y la absorción. El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la fijación o retención de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas químicas y físicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno determina la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente con la misma. “ CROMATOGRAFIA DE ADSORCION” La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen. En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas. • Las únicas fases utilizadas en HPLC liquidosólido son : la sílice y la alúmina, siendo la primera la que se prefiere para la mayoría, cuando no todas, las aplicaciones debido a su mayor capacidad de carga y a su mayor diversidad de presentaciones. • Las características de adsorción de los dos adsorbentes son similares. EL ORDEN DE LOS TIEMPOS DE RETENCION ES: Oleofinas <hidrocarburos aromáticos < haluros,sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres ≈ aldehídos ≈ cetonas < alcoholes ≈ Aminas < sulfonas < sulfóxidos <amidas < ácidos carboxílicos. • Las superficies de sílice y alúmina son muy polares , y las eluciones se realizan en general con alguna de las fases móviles menos polares. • Por ello se trata a la cromatografía de adsorción como un tipo de cromatografía de reparto en fase normal. CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO (HPLC) Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución. El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílice requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector. En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente. CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA EFICACIA • (HPLC): es la técnica analítica de separación mas utilizada con ventas de equipo aproximados a mil millones de dólares. • Características: sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas ,idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles, aplicabilidad a sustancias de primordial interés industrial. • Algunos de estos materiales incluyen: • Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una variedad de sustancias inorgánicas. APARATO DE HPLC RECIPIENTES PARA LA FASE MÓVIL Y SISTEMAS PARA EL TRATAMIENTO DE LOS DISOLVENTES Un aparato moderno de HPLC está equipado con uno o más recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene de 200 a 1.000 mL de un disolvente. Los recipientes, a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos -en general oxígeno y nitrógeno- que interfieren formando burbujas en la columna y en los sistemas de detección. Estas burbujas provocan ensanchamientos de banda y a menudo interfieren en el funcionamiento del detector. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, sistemas de purga que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión en los disolventes para evitar que estas partículas dañen la bomba o los sistemas de inyección u obturen la columna. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC . Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos a vacío a través de un filtro (millipore) de tamaño de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases, así como la materia en suspensión. CROMATOGRAFIA LIQUIDA EN FASE NORMAL • La fase sólida es mas polar que la fase móvil. • Los enlaces de la fase estacionaria presentan momentos dipolares mayores que los enlaces de las moléculas del disolvente. • Las fases estacionarias son normalmente polímeros inorgánicos con un gran número de poros de tamaño molecular ( de pocos nm a decenas de nm). • Su area superficial es muy grande. • Los dos materiales más comunes son: óxidos de silicio hidratados( sílice o gel de sílice) y polímeros de óxido de aluminio hidratados ( alúmina). • Cuando se producen uniones fuertes entre estos soportes y los componentes de la muestra , se dice que el soporte está activo. • Su actividad depende de la densidad de grupos hidroxilo en la superficie y de su forma química ( si están o no desprotonados). • Los enlaces Si- O se hidrolizan en medio básico, la sílice se disuelve lentamente en fases móviles con elevados valores de PH. • Es conveniente pasar primero la disolución por una pequeña precolumna colocada delante de la columna analítica, sacrificándolo con el objeto de preservar el deterioro de la columna analítica. • La polaridad del disolvente es el principal factor que determina los volúmenes de elusión. • Con disolventes más polares los solutos se mueven más rápidamente y eluyen antes. Los disolventes más polares compiten mejor por el soluto que los menos polares. • La predicción de las propiedades eluyentes de los disolventes ayudara en el desarrollo de análisis por separación en fase normal. • Si la alusión es demasiado lenta se utiliza un listado llamado “ series eluotrópicas”en donde se buscara algún disolvente más polar que el utilizado. • Este clasifica a los disolventes en una relación semicuantitativa basada en la capacidad de eluir los solutos en un fase estacionaria específica. Parámetro e° (fuerza del disolvente) para soportes de alúmina: Serie eluotropicasa Por orden alfabético Por orden numérico de menor a mayor Disolvente e° Disolvente e° Acetato de etilo Acetona Acetonitrilo Ac.acético Agua Benceno Ciclohexano Clorobenceno Cloroformo Cloruro de metileno Dicloruro de etileno Dimetilsulfóxido Dioxano Éter etílico Éter de petróleo Hexano Iso-propanol Metanol Metil-etil-cetona Pentano Piridina n-propanona Tetracloruro de carbono Tetrahidrofurano Tolueno Xileno ae° 0.58. 0.56 0.65 1.0 Superior 0.32 0.04 0.30 0.40 0.42 0.49 0.62 0.56 0.38 0.01 0.01 0.82 0.95 0.51 0.00 0.71 0.82 0.18 0.45 0.29 0.26 Pentano Éter de petróleo Hexano Ciclohexano Tetra cloruro de carbono Xileno Tolueno Clorobenceno Benceno Eter etílico Cloroformo Cloruro de etilo Tetrahidrofurano Dicloruro de etileno Metil etil cetona Dioxano Acetona Acetato de etilo Dimetil sulfoxido Acetonitrilo Piridina Iso-propanol n-propanol Metanol Acido acético Agua 0.00 0.1 0.1 0.4 0.18 0.16 0.29 0.30 0.32 0.38 0.40 0.42 0.45 0.49 0.51 0.56 0.56 0.58 0.62 0.65 0.71 0.82 0.82 0.95 1.0 superior es la energía de absorción de la fase móvil por unidad de área de la superficie adsorbente del patrón Grupos representativos de la fase ligada usados para la separación Tipo Acido iminodiacetico-Ni2+ Nitriloacetato-Cu2+) Sero albúmina bovina (una proteína) Aminoácidos (Cu2+ en la fase móvil Ciclodextrinas (oligo-D_glucopiranosa) Ferrocenilpropil amina Aplicación Proteínas, polipéptidos Separaciones de racematos Separaciones quirales Proteínas, polipéptidos Separaciones quirales Separaciones quirales SELECCIÓN DEL DISOLVENTE • En esta cromatografía líquido-sólido, la única variable que se puede utilizar para optimizar K´ y ∞ es la composición de la fase móvil ( a diferencia de la cromatografia de reparto ,donde el relleno de la columna tiene un efecto acusado sobre ∞.) • En la cromatografía de adsorción ,las modificaciones del disolvente provocan una gran variación en la resolución y en el tiempo de retención ,y solo en raras ocasiones no se puede encontrar la fase móvil adecuada. FUERZA DEL DISOLVENTE • El índice de polaridad P´ puede servir como guía aproximada de la fuerza de los disolventes en cromatografía de adsorción. • Un índice mucho mejor es : la fuerza eluyente €º que es la energía de adsorción del disolvente por unidad de superficie.Este parámetro depende del adsorbente,siendolos valores de €º para sílice 0.8 veces los de la alúmina. • Las diferencias de €º entre los disolventes se corresponden aproximadamente con las que se dan entre los valores de P´. “ELECCION DEL DISOLVENTE” •Es semejante al de separaciones de reparto. •Se eligen dos disolventes compatibles, uno de los cuales es demasiado fuerte (€º demasiado grande) y el otro que es demasiado débil. Variando la relacion de volumen entre los dos disolventes se obtiene el valor adecuado para K`. • Un aumento de 0,05 unidades en el valor de €º por lo general disminuye de 3 a 4 veces los valores de K´. • Se puede conseguir grandes variaciones de K´ ,y casi siempre se puede encontrar un sistema binario entre los disolventes que proporcionen unos tiempos de retención adecuados para cualquier tipo de muestra. • €º no varía linealmente con la relacion de volùmenes,como era el caso de P` en la cromatografía de reparto; por ello es mas difícil calcular la mezcla óptima para la separación. • Se han desarrollado algunos gráficos que relacionan €º con la composición de las mezclas binarias de los disolventes más comunes. • Cuando se produce un solapamiento de picos, el cambio de un disolvente fuerte por otro, mientras que K` se mantiene más o menos constante, permitirá cambiar los valores de ∞ y a menudo obtener la resolución que se desea. • Estas pruebas al tanteo son tediosas e infructuosas, por ello se han desarrollado métodos para sistematizar y simplificar la búsqueda. • Uno de ellos consiste en experimentos preliminares mediante cromatografía en capa fina, que es la versión en lecho abierto de la cromatografía de adsorción. CUADRO DE LAS CLASIFICACIONES CROMATOGRAFICAS tipo líquidosólido interca mbio iónico líquido -líquido gaslíquido fase estacionaria fase movil sólido inerte como gel de sílice o alúmina resina cambiadora disolventes soluciones acuosas líquido adsorbido en un soporte sólido líquido película de líquido adsorbida sobre un soporte sólido gas La más utilizada en química orgánica es cromatografía líquido-sólido en sus dos variantes: cromatografía en columna (CC) y cromatografía de capa fina (TLC) Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna como las que se pueden ver en la figuras. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y d el disolvente se enrasada hasta el nivel del soporte. A continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo El orden aproximado de elusión de compuestos es aproximadam el que se indica. y la polaridad de los disolventes se recoge en el gráfico de la izquierda La técnica de cromatografía en capa fina (TLC) es una de las más comunes empleadas en un laboratorio de Química Orgánica. Entre oras cosas permite: *Determinar el grado de pureza de un compuesto *Comparar muestras *Realizar el seguimiento de una reacción *Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columna La cromatografía en capa fina usa como fase estacionaria un sólido como gel de sílice a alúmina conteniendo algún material que hace que se mantenga la fase estacionaria sobre un soporte tal y como placas de vidrio, aluminio e incluso materiales plásticos. Las placas pueden prepararse en el laboratorio o adquirirse en el mercado. Para realizar una cromatografía en columna se procede de la siguiente manera: 1) Preparar o cortar, en su caso, una placa de tamaño adecuado. 2) Disolver una pequeña cantidad de la muestra y, mediante un capilar de vidrio, pinchar en la parte inferior de la placa a cierta distancia del borde. 3) Introducir la placa en un recipiente con el disolvente adecuado. Dicho recipiente debe presentar una atmósfera saturada en el vapor del disolvente por lo que se pone trozo de papel de filtro en la parte posterior y disponer de un sistema de cierre. 4. Cerrar el recipiente y dejar que el líquido ascienda por capilaridad. 5) Revelar la placa para poner de manifiesto donde se encuentran los puntos . 6) Determinar las posiciones relativas de los puntos mediante el cálculo del Rf APLICACIONES • Es la más adecuada para compuestos no polares con masas moleculares inferiores a 5.000.Los métodos de cromatografía de adsorción y reparto son complementarios dado que se superponen en algunos casos. • La cromatografía liquido- sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares, y que por tanto tienen una solubilidad limitada en los disolventes acuosos que son los que se utilizan en los procedimientos de reparto en fase inversa. • En cromatografía de reparto, los compuestos que tienen distintos grupos funcionales por lo general se pueden separar. • Una característica particular de la cromatografía de adsorción, que no es compartida por otros métodos, es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas. • La separación de isómeros es por lo común mejor con el método de adsorción. La cromatografia de adsorción se elige con frecuencia para separar especies no polares,isomeros estructurales y grupos de compuestos como,por ejemplo, los hidrocarburos alifaticos de los alcoholes alifáticos. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS