ANALISIS FITOQUÍMICO Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
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ANALISIS FITOQUÍMICO Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LAS HOJAS DE LA ESPECIE Piper imperiale (Piperaceae) ANGELA IVONNE JARA BELTRÁN UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.A FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C. 2013 ANALISIS FITOQUÍMICO Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LAS HOJAS DE LA ESPECIE Piper imperiale (Piperaceae) ANGELA IVONNE JARA BELTRÁN Trabajo de grado para optar para el título de químico Director Diego Ricardo Muñoz UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.A FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C. 2013 A mis padres Libardo y Rosa, mis hermanos Edwin, Cesar y Soraya y sobrinos Samuel y Felipe. AGRADECIMIENTO A mis padres Don Libardo y Doña Rosy, a mis hermanos, por todo su apoyo, compresión, amor y cariño, durante toda mi época de estudios y los momentos duros. A mi amiga Jenny Lizarazo por su compañía durante toda la carrera, por su apoyo, su compresión y por su ayuda para resolver mis dudas. A mi director de tesis el Profesor Diego Ricardo Muñoz y el Profesor Luis Eduardo Diaz, por ser pacientes, por haber confiado en mí y por haberme tenido en cuenta para este proyecto. A la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales, por permitirme hacer parte del grupo de investigación y su apoyo económico para realizar la parte experimental de mi proyecto de grado. CONTENIDO LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ 7 LISTA DE DIAGRAMAS .......................................................................................... 8 Abreviaturas ............................................................................................................. 9 Introducción ........................................................................................................... 11 1 MARCO TEORICO ............................................................................................ 12 1.1 Generalidades de la familia Piperaceae ....................................................... 12 1.2 Descripción botánica y taxonomía del genero Piper ..................................... 12 1.3 Distribución geográfica del genero Piper ...................................................... 13 1.4 Usos etnobotánicos del genero Piper ........................................................... 14 1.5 Estudios fitoquímicos del genero Piper......................................................... 15 1.5.1 Amidas ................................................................................................... 16 1.5.2 Flavonoides ............................................................................................ 17 1.5.3 Propilfenoles ........................................................................................... 19 1.5.4 Pironas ................................................................................................... 19 1.6.5 Terpenos ................................................................................................ 20 1.5.6 Lignanos y neolignanos .......................................................................... 21 1.6 Actividad biológica genero Piper .................................................................. 23 1.7 Actividad antioxidante del genero Piper........................................................ 25 1.8 Piper Imperiale.............................................................................................. 26 1.8.1 Morfología Piper imperiale...................................................................... 26 1.8.2 Clasificación taxonómica Piper imperiale ............................................... 27 2. Parte experimental ............................................................................................. 28 2.1 Procedimientos generales ............................................................................ 28 2.2 Recolección del material vegetal .................................................................. 28 2.3 Preparación del extracto ............................................................................... 28 2.4 Pruebas fitoquímicas preliminares ................................................................ 29 2.4.1 Análisis preliminar de alcaloides (Residuo I) .......................................... 30 2.4.3 Análisis preliminar de cumarinas y lactonas terpenicas ......................... 34 2.5 Fraccionamiento de extracto vegetal ............................................................ 35 2.6 Actividad antioxidante ................................................................................... 36 3. DISCUSIÓN Y RESULTADOS .......................................................................... 38 3.1 Pruebas fitoquímicas preliminares ................................................................ 38 3.2 Actividad antioxidante ................................................................................... 39 3.3 Elucidación estructural del compuesto 1. ..................................................... 43 Conclusiones ......................................................................................................... 57 Recomendaciones ................................................................................................. 58 LISTA DE TABLAS Tabla 1: Clasificación taxonómica genero Piper.................................................... 13 Tabla 2: Usos etnobotánicos de especies del genero Piper.................................. 15 Tabla 3: Taxonomía especie Piper imperiale[36] .................................................. 27 Tabla 4: Pesos hojas seco y molidas Piper imperiale y su extracto etanólico. ...... 29 Tabla 5: Concentración de diluciones patrón (Trolox) y extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale ....................................................................... 37 Tabla 6: Resultados pruebas fitoquímicas preliminares ........................................ 38 Tabla 7: Resultados obtenidos de absorbancia DPPH frente al Trolox a diferentes concentraciones ..................................................................................................... 40 Tabla 8: Resultados obtenidos de absorbancia y DPPH frente al extracto etanolico de las hojas de la especie P. imperiale .................................................................. 40 Tabla 9: Resultados obtenidos de Porcentaje inhibicion de DPPH frente al Trolox a diferentes concentraciones ................................................................................. 41 Tabla 10: Resultados obtenidos de Porcentaje de inhibicion de DPPH frente al extracto etanolico de la hojas de la especie Piper imperiale .................................. 41 Tabla 11: Asignación de señales 1H y 13C para el compuesto 1 aislado del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale.............................................. 54 Tabla 12: Comparacion compuesto aislado Hojas Piper imperiale con estructura sintetizada del ester etílico del ácido dihidroferúlico .............................................. 55 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Características morfológicas de las partes aéreas del genero Piper ..... 13 Figura 2: Distribución geográfica del genero Piper a nivel mundial[14] ............... 14 Figura 3: Distribución geografía del genero Piper en Colombia[15] ...................... 14 Figura 4: Piper Imperiale[35] ................................................................................. 27 Figura 5: Estructura del DPPH en su forma radical y no radical ........................... 36 Figura 6: Estructura del agente estándar trolox .................................................... 37 Figura 7: Efecto de degradación de color del DPPH con disoluciones extracto etanólico de las hojas especie Piper imperiale ...................................................... 39 Figura 8: % de inhibición por metodología DPPH para el patrón Trolox y el extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale ................................ 42 Figura 9: CCD en revelado UV a 365nm del compuesto 1 aislado del extracto etanólico hojas especie Piper imperiale ................................................................. 43 Figura 10: Espectro RMN 1H (CDCl3, 300MHz) del compuesto 1 aislado del extracto etanólico de la hojas especie Piper imperiale .......................................... 44 Figura 11: Ampliación del espectro 1H RMN entre 6.70 a 6.50 ppm para el compuesto 1 .......................................................................................................... 45 Figura 12: Ampliación del espectro RMN 1H entre 5.60 y 3.80ppm para el compuesto 1. ......................................................................................................... 46 Figura 13: Ampliación del espectro RMN 1H entre 3.0 a 1.0 ppm, para el compuesto 1. ......................................................................................................... 46 Figura 14: Espectro RMN 13C (CDCl3 75 MHz,) del compuesto 1. ........................ 47 Figura 15: Espectro COSY 1H-1H del Compuesto 1.............................................. 48 Figura 16: Ampliación espectro HSQC RMN 1H (δ 2.0 a 7.0ppm y RMN 13C δ 25 a 125ppm) del compuesto 1. .................................................................................... 49 Figura 17: Isómeros posibles de la estructura del compuesto 1 aislado del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale.............................................. 50 Figura 18: Ampliación del espectro HMBC. Ubicación cadena alifática en anillo aromático. .............................................................................................................. 51 Figura 19: Ampliación del espectro HMBC. Ubicación grupo hidroxilo y metoxilo en el anillo aromático. ............................................................................................ 52 Figura 20: Ampliación espectro HMBC. Ubicación grupo carbonilo y grupo metileno unido a un átomo electronegativo oxigeno en cadena alifática ............... 53 Figura 21: Estructura del compuesto 1 con sus respectivas correlaciones identificadas por el espectro HMBC 1H - 13C ......................................................... 53 Figura 22: Estructura elucidada del extracto etanólico de la hojas de la especie Piper imperiale Etil Dihidroferulato. ........................................................................ 54 Figura 23: Estructura del pentadecil ferulato derivado del acido ferúlico aislado de la especie Salicornea herbacea ............................................................................. 56 Figura 24: Derivados del acido ferulico aislados de Plumeria bicolor ................... 56 LISTA DE DIAGRAMAS Diagrama 1: Tratamiento del material vegetal para realizar pruebas fitoquímicas preliminares ........................................................................................................... 29 Diagrama 2: Prueba para el reconocimiento de alcaloides. .................................. 31 Diagrama 3: Análisis de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o antroaquinonas, taninos y saponinas ............................................................................................... 32 Diagrama 4: Análisis de cumarinas y lactonas terpenicas .................................... 34 Diagrama 5: Fraccionamiento de Columna del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale ...................................................................................... 36 Abreviaturas CCD µL AcOEt CC CDCl3 CH2Cl2 Cromatografía de Capa Delgada Microlitros Acetato de Etilo Cromatografía de Columna Cloroformo Deuterado Diclorometano CHCl3 d DPPH EdP EtOH HCl Hz J M MeOH Mg MHz mL NaOH Nm Q Ppm RMN RMN 13C RMN 1H S T UV Δ Cloroformo Doblete 1,1-difenil-2-picril-hidrazil Éter de Petróleo Etanol Acido Clorhídrico Hertz Constante de acoplamiento Multiplete Metanol Miligramos MegaHertz Mililitros Hidróxido de Sodio Nanómetros Cuarteto Parte por millón Espectroscopia Resonancia Magnética Nuclear Resonancia Magnética Nuclear de Carbono 13 Resonancia Magnética Nuclear de Hidrogeno Singlete Triplete Ultravioleta Desplazamientos químicos (RMN) 9 Resumen A partir del extracto etanólico de las hojas de la especie vegetal Piper imperiale se realizo la determinación de la actividad antioxidante por el método de radical libre DPPH y adicionalmente, a través del fraccionamiento por CCD y CC se logro el aislamiento y la identificación del ester etílico del ácido dihidroferúlico (β-(4hydroxy-3-methoxy-phenyl)-propionato de etilo. A una parte del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale, se le realizaron pruebas fitoquímicas preliminares obteniendo resultados positivos para alcaloides, esteroides, flavonoides, taninos y cumarinas. Con la actividad antioxidante por la metodología de radical libre DPPH sobre el extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale se observó que posee un porcentaje de inhibición frente a radicales libres como el DPPH de 46,9% a una concentración de 500ppm. El compuesto 1 se aisló a través del fraccionamiento por cromatografía en columna del extracto etanólico de la especie Piper imperiale, el cual pudo ser elucidado por técnicas espectroscópicas de RMN 1H y 13C de 1 y 2 dimensiones, obteniendo un metabolito derivado del acido dihiferúlico. 10 Introducción Colombia se caracteriza por su biodiversidad vegetal y el uso de una gran variedad de plantas por las comunidades indígenas con fines medicinales y sociales, plantas que al ser estudiadas por el hombre podrían ser una fuente de nuevos compuestos químicos que aporten soluciones a varios inconvenientes medicinales. Los cambios climáticos, la deforestación y la gran pérdida de vegetación por la falta de conciencia del hombre podrían impedir el estudio de muchos géneros y especies vegetales y con ellos, los compuestos que estos contengan y les brinden propiedades medicinales, por esto es necesario realizar pronto un estudio de estas especies vegetales que han sido poco exploradas por el hombre. Al norte de los Andes colombianos se puede encontrar la mayor diversidad de plantas del neotrópico, entre ellas la familia Piperaceae la cual posee una variedad de especies que pueden ser estudiadas y analizadas[1], obteniendo resultados que podrían ser la solución para problemas de carácter medicinal. Dentro de la familia Piperaceae se destacan las especies del genero Piper las cuales en su mayoría son utilizados como condimentos porque sus frutos son aromáticos y picantes, pero también se caracterizan por sus propiedades insecticidas, antibacterianas y anti-inflamatorias como por ejemplo los extractos de acetato de etilo y hexano de la especie Piper porphyrophyllum que presenta una elevada actividad frente a bacterias como Staphylococcus aereus y un alta actividad antiinflamatoria[2, 3]. Pocos estudios sobre la especie Piper imperieale han mostrado que posee cierta actividad antioxidante frente a metodologías como el DPPH y FRAP, además se han logrado identificar una cierta cantidad de compuestos naturales como polifenoles entre ellos el acido ferúlico[4], estos compuestos se caracterizan por ser antioxidantes y se han convertido en un tema importante debido que ayudan a prevenir y retrasar la aparición de enfermedades como el cáncer, cirrosis hepatitis y diabetes causadas por la presencia de radicales libres[5], por esta razón era necesario realizar un estudio sobre la especie Piper imperiale, sus propiedades antioxidantes y su composición, contribuyendo al conocimiento químico y biológico de la especie, y ayudando en avances médicos frente a enfermedades provocadas por la presencia de radicales libres. 11 1 MARCO TEORICO 1.1 Generalidades de la familia Piperaceae La familia Piperaceae es una de las más antiguas e importantes familias de plantas que ha proporcionado una gran variedad de medicamentos y fuentes de alimentos para las civilizaciones del pasado y presente, su origen se dio en el sudoeste de la India con el uso de su especie más conocida y cultivada la Piper nigrum (pimienta) gracias a su utilidad como condimento en las comidas[6, 7]. En la medicina tradicional latinoamericana algunas especies de la familia han brindado algunos beneficios como por ejemplo las hojas de P. hispidum aplicada en forma de ungüento para el tratamiento de ulceras cutáneas y la P. aduncum usada para el control de inflamaciones, otra propiedad de las especies de la familia es su actividad insecticida gracias a que están constituidas por compuestos como piperamidas[8, 9]. La familia está distribuida en lugares tropicales y subtropicales, constituida por 10 a 12 géneros entre los que se incluyen: Piper, Peperomia, Trianaeopiper, Ottonia, Arctottonia, Macropiper, Manekia, Pothomorphea, Sarcorhachis, Verhuellia y Zippeli[10]. En Colombia se pueden encontrar el Piper, Peperomia, Pothomorphea, Sarcorhachis y Trianaeopiper[11] y cerca de 2000 especies. Las especies de la familia Piperaceae se caracterizan por ser arbustos, pequeños arboles o lianas, sus hojas son simples, enteras con glándulas con aceites esenciales y sus flores son muy pequeñas bisexuales o unisexuales que forman racimos o espigas[12]. 1.2 Descripción botánica y taxonomía del genero Piper El género Piper es uno de los más importantes de la familia Piperaceae, está constituida por más de 1000 especies, las cuales se caracterizan por ser hierbas terrestres o epifitas, arboles pequeños en raras ocasiones bejucos o arbustos, de sexualidad hermafrodita, polígamos o dioicos. Sus tallos tienen forma de nudos abultados, sus hojas segregan aceites esenciales gracias a que poseen unas células secretoras, sus flores son pequeñas , bracteadas y sus inflorescencias son en forma de espigas flexibles, poseen un ovario unicelular con un ovulo que se desarrolla en forma de fruto en baya (Figura 1) [13]. 12 Figura 1: Características morfológicas de las partes aéreas del genero Piper En la Tabla 1 se muestra la clasificación taxonómica del genero[10, 13]: Tabla 1: Clasificación taxonómica genero Piper Clasificación taxonómica REINO Plantae DIVISION Magnoliophyta (Angiospermas) CLASE Magnoliopsida (Dicotiledóneas) SUBCLASE Magnoliidae ORDEN Piperales FAMILIA Piperaceae GENERO Piper 1.3 Distribución geográfica del genero Piper El género Piper se encuentra ampliamente distribuido en regiones tropicales y subtropicales del mundo, sus lugares de mayor concentración son los trópicos americanos con alrededor de 700 spp., y el sur de Asia y América Central con 300 spp. En la región Andina del territorio Colombiano en los bosque húmedos y tropicales se han encontrado una gran variedad de especies pertenecientes al género y en los alrededores de la Sierra Nevada de Santa Marta (Figura 2 y 3) [14, 15]. 13 Figura 2: Distribución geográfica del genero Piper a nivel mundial[14] Figura 3: Distribución geografía del genero Piper en Colombia[15] 1.4 Usos etnobotánicos del genero Piper Las especies del genero Piper han sido de gran utilidad para la vida cotidiana, por su importancia a nivel económico, comercial y medicinal, entre ellas podemos encontrar la P. nigrum donde sus frutos secos son pulverizados para obtener la pimienta[6]. En Colombia las especies de este género se conocen como anises y son utilizadas para el tratamiento de enfermedades como diarrea, disentería, dolores de estomago, caries dentales y cicatrizantes. Tribus indígenas como los motilones en el Norte de Santander y los Embera en el Choco las utilizan como analgésicos, antiinflamatorios y contra picaduras de serpientes[7]. En la Tabla 2 se encuentran algunos usos etnobotánicos del género Piper: 14 Tabla 2: Usos etnobotánicos de especies del genero Piper FORMA DE NOMBRE PARTE USO USO Piper angostifolium Raíz En decocción Piper cubeba Fruto Extracto del fruto en agua Piper erithroxyloides Tallos Masticado Hojas Piper guineense En infusión Semillas Hojas Frescas y trituradas Piper marginatum Raíz Piper methysticum Raíz Piper sylvaticum Raíz Piper tuberculatum Hojas En decocción En infusión Secas y trituradas Control de dolores menstruales y hemorragias internas[16]. Uso como diurético y antiséptico de las vías urinarias, empleado para combatir afecciones como cistitis y uretritis[17]. La tribu Bari usa los tallos para prevenir la caries y como estimulante, produciendo un efecto narcótico que duerme la lengua[7]. Se emplean como remedios para la tos. Usadas como tratamiento para los dolores de estomago[8] Se emplea como astringente para detener hemorragias traumáticas y como hemostático externo[18]. Usada contra paludismo[19] el Se utiliza para el tratamiento de trastornos de ansiedad, estrés y tensión nerviosa[20] Usada como antídoto contra la picadura de serpiente[10] Se utilizan para eliminar los piojos[9]. 1.5 Estudios fitoquímicos del genero Piper Las especies del genero Piper han mostrado gran potencial frente actividades antitumorales, antibióticos, antifúngicos e insecticidas, razones por las que se han realizado investigaciones fitoquímicas encontrando que las especies están compuestas por metabolitos de tipo flavonoide, amida, propinilfenoles, lignanos, neolignanos, kavapironas y terpenos[21, 22]. 15 1.5.1 Amidas Las amidas (conocidas en el género Piper como piperamidas) son los compuestos más característicos del genero Piper porque han mostrando resultados de propiedades insecticidas y fungicidas. Especies como la Piper tuberculatum están constituidas por amidas como la N-[10-(13,14-metilenedioxifenil)-7(E),9(Z)pentadienoil]-pirrolidina y la arboreumina las cuales poseen propiedades antifungicas[23]. CH3 O O H H O H CH3 H H3C CH3 NH H3C CH3H3C CH3 NH OH OH Arberoumina De las hojas de la Piper arboreum se han aislados pirrolidinas que son activas contra el hongo Cladosporium sphaerospermum[23]. O O N O N-[10- (13,14-metilenedioxifenil)-7(E)-pentaenoil]-pirrolidina O O N O N-[10-(13,14-metilenedioxifenil)-pentanoil]-pirrolidina 16 De los extractos en diclorometano de las hojas de Piper elonatum y Piper glabratum se han logrado aislar cuatro amidas como las nombradas a continuación[10]: R OH HO O NH OCH3 O NH R2 R1 1 R1= OCH3 R2=OH 2 R1= OH R2=H 3 R= OCH3 4 R=H 4-metoxi-N-[2-(4-metoxi-5-hidroxi-fenil)-etil]-benzamida 4-hidroxi-N-[2-(4-metoxi-fenil)-etil]-benzamida N-cis-feruloil-tiramina N-pcumaroil-tiramina 1.5.2 Flavonoides Los flavonoides de mayor abundancia en el género Piper son las chalconas, flavanonas y dihidrochalconas. Las chalconas y dihidrochalconas por lo general no poseen sustituyentes en el anillo B pero se han encontrado excepciones como la asebogenina y flavokavaina C las cuales han sido aisladas de las especies P. aduncum y P. methysticum. Las dihidrochalconas presentes en el género Piper han demostrado actividad antiparasitaria frente a especies de Leishmania sp. y Plasmodium falciparum (parasito causante de la malaria)[7]. 17 OH H3CO OH OH O Asebogenina OH H3CO OH OCH 3 O Flavokavaina C Del extracto etanólico de las partes aéreas de la especie P. septuplinervium, se han logrado aislar dos compuesto de tipo flavonoide (uvangoletina y chrysina) que presentan actividad frente dos hongos fitopatogeneticos como el Fusarium oxysporum f. sp. dianthi y Botrytis cinerea[24]. HO O OH O Chrysina HO OCH3 OH O Uvangoletina 18 Flavononas de gran importancia como la pinocembrina y pinostrobina por estar relacionadas con la inhibición de crecimiento y toxicidad contra hongos y la preservación de la madera se han aislado de la especie Piper steerni[25]. R1O O OH R1= H → R1=CH3→ Pirocembrina Pirostrobina O 1.5.3 Propilfenoles Compuestos propenilfenolicos como el hidroxichavicol, eugenol, chavibetol y chavicol se han encontrado en las hojas de ciertas especies del genero Piper como por ejemplo la P. betle[22]. R5 R4 CH2 R3 R1 R1=R4=R5=H R2=OH R3=OCH3→ R1=R4=R5=H R2=OAc R3=OCH3→ R1= R2=R4=R5=H R3=OH→ R1= R4=R5=H R2= OCH3 R3=OH→ R1= R4=R5=H R2=R3=OH→ Chavibetol Chavibetol acetato Chavicol Eugenol Hidroxichavicol R2 1.5.4 Pironas Las pironas también conocida como kavalactonas se creía que eran compuestos encontrados solamente en la especie Piper methysticum, pero en algunos estudios se han logrado aislar de la especie Piper sanctum[9, 20]. 19 OCH3 R4 O R1 O R3 R2 Kavalactonas 10-Methoxyyagonina Desmethoxyyagonina Dihydromethusticina Hydroxykavaina Kavaina Methysticina Yangonina R1 OCH3 R2 R3 OCH3 R4 C5 – C6 = = C7 – C8 = = = = = = = OCH2O OH OCH2O OCH3 1.6.5 Terpenos Los aceites esenciales del genero Piper esta constituidos por una gran variedad de monoterpenos como borneol, alcanfor, cineol, eugenol, cubebol y safrol. En la especie Piper auritum se han identificado compuestos como nonanal, miristicina y safrol, siendo este ultimo el de mayor concentración con alrededor de 90%[26]. H3C CH3 CH3 O CH3 H3C H H3C OH Cineol Borneol 20 OH OCH3 O O CH2 CH2 Safrol Eugenol CH3 CH2 O H3C HO O H O H3C Miristicina H3C CH3 Cubebol 1.5.6 Lignanos y neolignanos De especies como la Piper futodadsura se han aislado neolignanos y lignanos como kadsurenona, (+)-Galbelgin y (+)-Veraguensin[22, 27]. En otras especies como la Piper sarmentosum se han aislado lignanos de tipo furofuranico como la sesamina y fargesina[9]. H3CO H3C H3CO CH2 H3CO O Kadsurenona 21 O O O O O O H H H H O H3CO O Sesamina Fargesina O H3CO O También se han logrado aislar algunos neolignanos de especies P. clarkii, P. decurrens como el clarkinol, conocorpan y cuneifolin[22]. H3C CH3 HO O Conocorpan H3C O H3C CH3 O CH2 HO O HO Cuneifolin O CH3 22 1.6 Actividad biológica genero Piper El género Piper se ha caracterizado por poseer algunos compuestos biológicamente activos, como por ejemplo el extracto etanólico de la especie Piper aduncum que ha presentado una actividad antiplasmodial estando constituida por compuestos como la aduncamida, borneol y pinostrobinol[28]. OCH 3 CH3 HO O OH HO H3C NH CH3 Borneol Aduncamida OCH 3 La pipernonaline presente en la especie P. longum ha mostrado una actividad fungicida moderada frente P. grisea, P. infestans[29]. . O O N O Pipernolanina Compuestos aislados de los frutos de la especie P. nigrum han mostrados un gran actividad larvicida contra C. pipiens pallens, A. aegypti y A. togoi. Los compuestos aislados son la N-isobutilamida pelitorina, guineensina, pipercide, retrofractamida A y la piperidina[30]. 23 CH3 H3C NH CH3 O N-isobulilamida pellitorina O CH3 NH O CH3 O Guineensina O CH3 NH O CH3 O Pipercida O CH3 NH CH3 O O Retrofractamida A O N O O Piperidina 24 1.7 Actividad antioxidante del genero Piper Durante los últimos años se ha descubierto actividad antioxidante en algunas especies de plantas gracias a que en su composición se encuentran compuestos que poseen una gran actividad antioxidante tales como polifenoles, vitaminas y flavonoides; compuestos que ayudan a combatir enfermedades provocadas por reacciones entre radicales libres[31]. Especies del genero Piper han mostrado propiedades antioxidantes frente a radicales libres; especies como la P. Daniel-gonzalezii ha mostrado resultados positivos frente a metodologías que evalúan la capacidad antioxidante como FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma)[32]. Las hojas de la especie P. peltatum han mostrado prueba positiva frente a pruebas fitoquímicas para compuestos fenólicos los cuales se caracterizan por su actividad antioxidante, la cual se ha comprobado con ensayos de DPPH y FRAP[33]. La partes aéreas (hojas, flores y madera) de la especie P. imperial están constituidas por compuestos fenólicos como el acido gálico, la catequina, epicatequina, acido ferúlico, resveratrol y quercetina, además han mostrado un elevada actividad antioxidantes en ensayos de ABTS y DPPH[4]. OH O O H3CO OH HO OH OH Acido Galico HO Ácido Ferúlico 25 OH OH OH OH HO O HO O OH OH OH O OH Quercetina OH O Catequina OH OH HO HO O OH OH OH Epicatequina OH Resveratrol 1.8 Piper Imperiale Las partes aéreas de la especie Piper imperiale han mostrado una elevada actividad antioxidante y actividad antibacterial frente a bacterias causantes de la tuberculosis, esto puede ser atribuido al elevado contenido de compuestos como polifenoles, flavonoides y estilbenos que están presentes en ellas[4]. 1.8.1 Morfología Piper imperiale Árbol o arbusto de 2 a 6 m de alto, con tallos verdes, algo vellosos o con puntas blandas gruesos de 2 cm de ancho, de pocas ramas. Hojas alternadas, por lo general dos a lo largo del tallo, verrugosas de 20 a 60 cm de largo y 15 a 35 cm de ancho, con forma de corazón, ápice acuminado, base asimétrica cordaba con un lado pegado al peciolo. Sus flores de color verde y en algunas ocasiones moradas, de espigas colgantes hasta de 28 a 55 cm de largo y 8-10 mm de espesor. Fruto carnoso de color verde a marrón rojizo de 0,2 cm de ancho [34, 35]. 26 Figura 4: Piper Imperiale[35] 1.8.2 Clasificación taxonómica Piper imperiale Tabla 3: Taxonomía especie Piper imperiale[36] REINO DIVISION CLASE ORDEN FAMILIA GENERO ESPECIE Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Piperales Piperaceae Piper Imperiale 27 2. Parte experimental 2.1 Procedimientos generales En las cromatografías de capa delgada (CCD) se utilizaron placas de sílica gel 60 F254 de 20 x 20 cm con 0.20 mm de espesor de marca Merck. Como fase móvil se utilizo una variedad de sistemas de solventes como EdP/AcOEt, benceno/AcOEt, CHCl3/acetona, CH2Cl2/acetona, EdP/acetona, EdP/CHCl3, tolueno/AcOEt. Como agentes reveladores se utilizo lámpara UV de λ 254 y 365 nm y cámara de yodo. En el montaje de cromatografías en columna CC se utilizo como fase estacionaria sílica gel 60 de 0,063 – 0,2 mm marca Merck y como fase móvil se utilizaron los sistemas de solventes nombrados anteriormente. Los espectros RMN 1H y 13C fueron tomados en un equipo Bruker 300MHz utilizando como disolvente cloroformo deuterado CDCl3. Las pruebas de actividad antioxidante se realizaron con la metodología de radical libre difenilpicrilhidrazilo (DPPH), usando concentraciones de 500, 250, 125, 80, 62,5 y 50ppm del extracto en metanol. Las pruebas fitoquímicas preliminares se realizaron con base a la metodología del profesor Antonio Sanabria del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia. 2.2 Recolección del material vegetal La muestra vegetal fue recolectada en el “Santuario de Fauna y Flora Guanenta Alto Rio Fonce” ubicado en la Cordillera Oriental en la Regio Andina entre los departamento de Boyacá y Santander cerca al municipio de Charala en la vereda de Birolin por el profesor Diego Ricardo Muñoz. Para confirmar su clasificación una muestra de la especie fue enviada al Herbario Nacional Colombiano del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia. 2.3 Preparación del extracto De la especie vegetal se separaron las hojas, madera e inflorescencias. Las hojas se dejaron secar a la sombra por un periodo de tres semanas para luego ser moliendas y pesadas, obteniendo 350 g. El material vegetal ya molido se sometió a un proceso de extracción por maceración con etanol al 96% a temperatura ambiente. El extracto obtenido fue concentrado a presión reducida en rotavapor a 40 °C obteniendo 28 g. 28 Tabla 4: Pesos hojas seco y molidas Piper imperiale y su extracto etanólico. Peso Seco Material Peso Extracto (g) Vegetal (g) 350 28 2.4 Pruebas fitoquímicas preliminares La metodología utilizada para realizar estas pruebas es la recomendada por el profesor Antonio Sanabria del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia. El siguiente diagrama muestra la obtención del extracto vegetal y la división del mismo para realizar las pruebas preliminares[37]: Diagrama 1: Tratamiento del material vegetal para realizar pruebas fitoquímicas preliminares Extracto Etanolico Dividir en tres volúmenes diferentes Volumen II Volumen I Volumen III Eliminar solvente Eliminar solvente Extracto III Residuo I Residuo II Pruebas: Alcaloides Pruebas: Esteroides y/o triterpenoides, Flavonoides Nafto y/o antraquinonas Saponinas Taninos Pruebas: Lactonas terpenicas Cumarinas cardiotónicas 29 2.4.1 Análisis preliminar de alcaloides (Residuo I) Los alcaloides son reconocidos empleando reactivos de precipitación en donde sus reacciones se dan de la siguiente manera[38]: ∙ Los reactivos compuestos por yoduro de potasio y cloruro de mercurio reaccionan formando un precipitado de color rojo yoduro de mercurio, el cual es soluble en exceso de iones de yoduro por la formación de un anión complejo incoloro. HgCl2 + 2I- → 2Cl- + HgI2 HgI2 + I- → [HgI4]2Este complejo reacciona con amoniaco formado el oxiyoduro mecuriamonico un compuesto de color pardo que en exceso de complejo [HgI4]2- es soluble generando un intenso color amarillo Hg NH 2I O Hg Oxiyoduro mercuriamonico Por la presencia del nitrógeno en los alcaloides, estos actúan de forma similar con reactivos que contienen bismuto, los alcaloides forman yoduros dobles insolubles BiI3 BHI, en donde B es la base alcaloidal. 30 Diagrama 2: Prueba para el reconocimiento de alcaloides. Residuo I (Análisis alcaloides) 1. Extraer con 20 mL de HCl 5% a 60°C 2. Filtrar en frio Filtrado Residuo (Descartar) En 4 tubos de ensayo colocar 0,5mL del filtrado obtenido Tubo 1: 2 gotas Reactivo de Dragendorff. Tubo 2: 2 gotas Reactivo de Mayer Tubo 3: 2 gotas Reactivo de Valser Tubo 4: 2 gotas Reactivo Reineckato de Amonio Nota: Formación de precipitado prueba positiva para alcaloides Nota: Formación de precipitado prueba positiva para alcaloides Nota: Formación de precipitado prueba positiva para alcaloides Nota: Formación de precipitado prueba positiva para alcaloides Preparación de Reactivos. ∙ Reactivo de Dragendorff: Se disuelven 8g de Bi(NO3)3∙5H2O en 20mL de HNO3 y 27,2g de KI en 50mL de agua. Se mezclan las dos soluciones y se dejan reposar por 24 horas, luego la solución se decanta y se afora con agua a 100mL. ∙ Reactivo de Mayer: Se disuelven 1,36g de HgCl2 en 60mL de agua y 5g de KI en 10mL de agua. Se mezclan las dos soluciones y se aforan a 100mL. ∙ Reactivo de Valser: Se disuelven 10g de KI en 100mL de agua, se agrega un exceso de HgI2, dejar en contacto y filtrar. ∙ Reactivo Reineckato de Amonio: Se prepara una solución saturada de reineckato de amonio con 0,3g de clorhidrato de hidroxilamina y se acidula ligeramentc con HCl (conservar refrigerado). 31 2.4.2 Análisis preliminar de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o antroaquinonas, taninos y saponinas (Residuo II) Diagrama 3: Análisis de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o antroaquinonas, taninos y saponinas Residuo II (Análisis de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o antroaquinonas, taninos y saponinas) 1. Extracción con 20mL de EdP 2. Filtrar Filtrado Residuo Concentrar a 5mL de volumen 1. Extracción con 20mL de EtOH/H2O (1:7) 2. Filtrar Solución Residuo Solución B 5mL Nafto y/o antroquinonas Solución C 10mL Taninos y saponinas Esteroides y/o triterpenoides Tomar los volúmenes Solución A 5mL Flavonoides 2.4.2.1 Análisis preliminar esteroides y/o triterpenoides Los 5mL del filtrado se adicionan a un tubo de ensayo que contenga 10mL de solución MeOH/H2O (9:1), se agita y se deja en reposo hasta la separación de 2 capas, se toma la fase superior. La fase obtenida se aplica en una placa de CCD y se corre primero con una mezcla ciclo hexano/AcOEt (95:5) y luego con una mezcla de EdP/Éter etílico/Acido acético (80:20:1), se procede a marcar todas las manchas (no se toman en cuenta). Rociar sobre la placa Reactivo de LiebermannBurchard y calentar por 5 a 10 minutos a 110°C, si aparecen manchas de color rojo, azul o verde es prueba positiva para esteroides y/o triterpenoides. 32 2.4.2.2 Análisis preliminar de flavonoides Los flavonoides que poseen anillo de gammabenzopirona reaccionan con HCl concentrado y magnesio dando coloraciones[38]: O O + Mg/2HCl + MgCl2 O OH ∙ Reacción de shinoda: En un tubo de ensayo con 0,5g de magnesio en polvo, se adicionan 1mL de Solución A y unas gotas de HCl hasta final de desprendimiento de hidrogeno, observar cambio de coloración a rosada, roja, violeta o naranja, indicando prueba positiva para flavonoides. Las leucoantocianidinas forman antiocianinas de color rojo intenso en presencia de HCl y calentamiento[38]. O + O Cl HCl + OH H2O + H2 OH OH ∙ Reacción con acido clorhídrico: En un tubo de ensayo adicionar 1mL de solución A y 0,5mL de HCl concentrado, calentar al baño maría por 15 minutos una coloración roja indica prueba positiva para leucoantocianidinas. 2.4.2.3 Análisis preliminar de nafto y/o antraquinonas Para las nafto y/o antraquinonas se da la siguiente reacción: ∙ Reacción de Borrträger-krauss: En un tubo de ensayo se adicionan 5mL de Solución B, 1mL de agua oxigenada (20 volúmenes), 1mL de H2SO4 50% y se calienta a baño maría por 15 minutos y se hace una extracción con 5mL 33 de benceno. A 2mL de benceno utilizado para extracción se le adiciona 1mL de solución de NaOH 5% con 2% de NH4OH si la capa alcalina toma una coloración rosada-roja indica prueba positiva para nafto y/o antraquinonas. 2.4.2.4 Análisis preliminar de taninos y saponinas ∙ Reactivo de gelatina-sal: A 1mL de la solución C adicionar 1mL de reactivo de gelatina-sal; si hay precipitado, centrifugar y decantar el sobrenadante, disolver el precipitado en 2mL de solución de urea 10M si hay dilución añadir 3 gotas de FeCl3 la aparición de un precipitado verde, azul o negro indica prueba positiva para taninos. ∙ Prueba de espuma: En un tubo de ensayo adicionar 3mL de solución C, tapar y agitar vigorosamente, la formación de una espuma estable indica prueba positiva para saponinas. 2.4.3 Análisis preliminar de cumarinas y lactonas terpenicas Diagrama 4: Análisis de cumarinas y lactonas terpenicas Extracto III (Análisis de cumarinas y lactonas terpenicas) 1. Sln acetato de plomo 4% con 0,5% acido acético (hasta precipitación de clorofilas) 2. Reposar 15min 3. Filtrar al vacio Filtrado Residuo (Desechar) 1. Concentrar ¾ partes del volumen. 2. Extraer con 2 volúmenes de CHCl3 3. Se adiciona sulfato de sodio anhidro 4. Filtrar Filtrado Residuo 1. Concentrar a 3mL 2. Purificar con columna de 10mm de diámetro con silica gel como fase estacionaria y un sistema CHCl3/MeOH 9:1 como fase móvil Solución 1 34 2.4.3.1 Reconocimiento de lactonas terpenicas Aplicar en una placa de cromatografia de capa delgada con un capilar 3 veces la muestra de la solución 1 y desarrollar con un sistema CHCl3/Acetona 9:1, revelar con lámpara UV a 254 y 366nm marcar las manchas, rociar con una solución etanólica con 1% de vainillina y 10% de acido fosfórico, llevar a la estufa a 110°C por 10 minutos las manchas reveladas con una variedad de colores indican prueba positiva para lactonas terpenicas. 2.4.3.2 Reconocimiento de cumarinas Aplicar en una placa de cromatografía de capa delgada con un capilar 2 veces la muestra de la solución 1 y desarrollar con un sistema CHCl3/Acetona 9:1, revelar con lámpara UV a 254 y 366nm marcar las manchas, realizar reacción de hidroxamato férrico con una mezcla de clorhidrato de hidroxilamina al 2% en etanol y NaOH 2N y calentar por 15 minutos en la estufa, dejar enfriar la placa y rociar con una mezcla de HCl 2N y FeCl3 al 1% en etanol, la aparición de manchas de color naranja indica prueba positiva para cumarinas y lactonas terpenicas. 2.5 Fraccionamiento de extracto vegetal Del extracto etanolico de las hojas de la especie, se tomaron 13,695 g y se realizo un fraccionamiento por CC utilizando sílica gel como fase estacionaria y un sistema de solventes EdP/AcOEt 7:3 hasta llegar a una polaridad de 5:5, se obtuvieron 8 fracciones y una de lavado, de las cuales se reunieron en 5 fracciones gracias a su perfil en CCD y se denominaron como C1F1-C1F5. Con las fracciones obtenidas se realizaron CCD con varios juegos de solventes buscando la mejor separación, escogiendo la fraccion C1F3 con un peso de 460.2mg, la cual se fracciono en CC con una fase estacionaria de sílica gel y una fase móvil CH2Cl2/AcOEt 95:5, se recogieron 53 fracciones que se reunieron en 6 fracciones denominadas como C2F1-C2F8. De las fracciones anteriores se escogió la fracción C2F3 con un peso de 168.3mg y se fracciono con un sistema de solventes CHCl3/AcOEt 95:5 como fase móvil y sílica gel como fase estacionaria, recogiendo un total de 30 fracciones y se reunieron en 5 fracciones denominadas como C3F1-C3F5. De fracción C3F3 se obtuvo el compuesto 1 con un peso de 10.2mg. En el siguiente diagrama se muestra el fraccionamiento total del extracto de las hojas de la especie Piper imperiale 35 Diagrama 5: Fraccionamiento de Columna del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale 2.6 Actividad antioxidante Para determinar la actividad antioxidante se utilizo el método de barrido de radicales libres difenilpicrilhidrazilo (DPPH). El DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) se caracteriza por ser un radical estable gracias a la deslocalización de su electrón libre y su color violeta oscuro que posee una banda de absorción de 520nm aproximadamente cuando se encuentra disuelto en etanol(Figura 5) [39]. NO 2 O 2N NO 2 NH N NO 2 Difenilpicrilhidrazil (No radical) O 2N N N NO 2 Difenilpicrilhidrazil (Radical libre) Figura 5: Estructura del DPPH en su forma radical y no radical 36 Cuando una solución de DPPH se mezcla con una solución donadora de protones como un antioxidante, el radical se reduce perdiendo la intensidad de color y su absorbancia dándose la siguiente reacción[39, 40]: DPPH + DPPH + A AH Para la metodología se preparo una solución de DPPH al 0,004% diluida en metanol logrando una absorbancia menor a 1. Como agente estándar se utilizo trolox (ácido (S)-(-)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) (Figura 6) para el cual se prepararon diluciones al igual que para el extracto etanólico de las hojas de la piper imperiale como se muestra en la tabla 5[5]: CH3 HO O H3C O CH3 OH CH3 Trolox Figura 6: Estructura del agente estándar trolox Tabla 5: Concentración de diluciones patrón (Trolox) y extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale MUESTRA Trolox Hojas piper imperiale CONCENTRACION (mg/mL) 200 500 100 250 75 175 50 125 20 80 5 62,5 50 La reacción se realizo directamente en las celdas del espectrofotómetro adicionando en cada una de ellas 0,1 mL de las muestras a sus diferentes concentraciones y 3 mL de solución de DPPH, también fue necesaria la preparación de un blanco de metanol y DPPH. Luego se dio un tiempo de reacción de 30 minutos para realizar la lectura en un espectrofotómetro y obtener los resultados de absorbancia (la medición se realizo por triplicado). 37 3. DISCUSIÓN Y RESULTADOS 3.1 Pruebas fitoquímicas preliminares Tabla 6: Resultados pruebas fitoquímicas preliminares Extracto etanólico METABOLITO PRUEBA Hojas Piper imperiale Alcaloides Dragendorff + Esteroides, terpenos Liebermann-Burchard, Vainillina en H2SO4 + Flavonoides Vapores NH3, FeCl3 + Quinonas Bornträger - Taninos Gelatina-sal + Lactonas Terpenicas Vainillina en Acido fosforico - Saponinas Cloruro de zinc - Cumarinas KOH en metanol + Como se observa en la tabla, el extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale está compuesta por metabolitos secundarios como alcaloides, esteroides, flavonoides, taninos y cumarinas. Los alcaloides son compuestos con estructuras complejas de propiedades alcalinas con átomos de nitrógeno en anillos heterocíclicos que se encuentran normalmente en las hojas de especies vegetales [41]. En el extracto etanólico de las hojas de la especie P. imperiale se obtuvo prueba positiva para alcaloides, corroborando la presencia de compuestos de este tipo en el género Piper, ya que en especies como la P. arboreum se ha logrado aislar alacaloides pirrolidinicos[23]. Se comprobó la presencia de compuestos de tipo terpenoide y esteroles en el extracto etanólico de las hojas de la especie P. imperiale con un resultado positivo en las pruebas fitoquímicas preliminares, estudios anteriores mostraron la presencia de monoterpenos en el genero Piper (P. auritum)[26]. 38 Los flavonoides son compuestos que se caracterizan por poseer un esqueleto de tipo C6C3C6 y en el género Piper se ha encontrado la presencia del tipo chalconas, flavanonas y dihidrochalconas, las pruebas fitoquímicas para flavonoides fueron positivas en el extracto etanólico de las hojas de la especie P. imperiale corroborando la presencia de este tipo de compuestos en el género Piper y en la especie. Compuestos fenilpropanos como las cumarinas que dentro de su estructura poseen un esqueleto C6 o C6C3, hacen parte de la composición de las hojas de la especie P. imperiale por su resultado positivo frente a la pruebas fitoquímicas preliminares de Gelatina-Sal y KOH en metanol. Las pruebas fitoquímicas preliminares ayudaron a determinar qué tipo de compuesto posee el extracto etanólico de las hojas de la especie P. imperiale, compuestos que quizás sean los causantes de las características antioxidantes de la especie, como por ejemplo la presencia de taninos que se caracterizan por poseer una actividad antioxidante[42]. Pero también hay que tener en cuenta la presencia de flavonoides y alcaloides que le pueden brindar propiedades antiparasitarias y antifúngicas a la especie. 3.2 Actividad antioxidante El extracto etanólico de la especie P. imperiale mostro actividad antioxidante con la metodología de radical libre difenilpicrilhidrazilo (DPPH), notándose una decoloración del radical frente a la diferentes disoluciones preparadas del extracto (Figura 7) y una disminución en la absorbancia. Figura 7: Efecto de degradación de color del DPPH con disoluciones extracto etanólico de las hojas especie Piper imperiale 39 En las tablas 7 y 8 se muestran los resultados obtenidos de absorbancia determinados para las disoluciones del patrón Trolox y el extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale. Tabla 7: Resultados obtenidos de absorbancia DPPH frente al Trolox a diferentes concentraciones TROLOX [ ] µg/mL ABSORBANCIA 200 0,057 0,059 0,057 100 0,067 0,064 0,063 75 0,132 0,125 0,119 50 0,319 0,327 0,312 20 0,583 0,574 0,573 5 0,741 0,703 0,721 Tabla 8: Resultados obtenidos de absorbancia y DPPH frente al extracto etanolico de las hojas de la especie P. imperiale Extracto etanolico hojas Piper imperiale [ ] µg/mL ABSORBANCIA 500 0,416 0,425 0,393 250 0,575 0,574 0,481 175 0,648 0,66 0,57 125 0,687 0,663 0,612 80 0,71 0,725 0,641 62,5 0,724 0,717 0,694 50 0,748 0,743 0,755 El porcentaje de inhibición se determino con la siguiente fórmula: 40 Donde Ao corresponde a la absorbancia del blanco 0,7717 y Ab corresponde a la absorbancia de la muestra. En las tablas 9 y 10 se reportan los resultados para el Porcentaje Inhibicion del DPPH, desviación estándar y error estándar para el patrón Trolox y el extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale. Tabla 9: Resultados obtenidos de Porcentaje inhibicion de DPPH frente al Trolox a diferentes concentraciones Trolox % INHIBICION [] µg/mL MEDICION 1 MEDICION 2 MEDICION 3 PROMEDIO DESVIACION ERROR ESTANDAR 200 92,61 92,35 92,61 92,53 0,15 0,02 100 91,32 91,71 91,84 91,62 0,27 0,03 75 82,89 83,80 84,58 83,76 0,84 0,09 50 58,66 57,63 59,57 58,62 0,97 0,13 20 24,45 25,62 25,75 25,27 0,71 0,14 5 3,98 8,90 6,57 6,48 2,46 0,97 Tabla 10: Resultados obtenidos de Porcentaje de inhibicion de DPPH frente al extracto etanolico de la hojas de la especie Piper imperiale Extracto etanolico Hojas Piper imperiale % INHIBICION [] µg/mL MEDICION 1 MEDICION 2 MEDICION 3 PROMEDIO 500 46,09 44,93 49,07 250 25,49 25,62 175 16,03 125 10,98 80 DESVIACION ERROR ESTANDAR 46,70 2,14 0,31 37,67 29,59 7,00 1,29 14,47 26,14 18,88 6,33 1,46 14,09 20,69 15,25 4,96 1,27 8,00 6,05 16,94 10,33 5,81 1,81 62,5 6,18 7,09 10,07 7,78 2,03 0,73 50 3,07 3,72 2,16 2,98 0,78 0,45 41 En el siguiente grafico se muestras los porcentajes de inhibición para el patrón Trolox y el extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale. Figura 8: Porcentaje de inhibición por metodología DPPH para el patrón Trolox y el extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale Como agente estándar se utilizo el Trolox un análogo de la vitamina E capaz de reaccionar con varios radicales libres[43], con el que se noto que a una mayor concentración de Trolox se logra un mayor porcentaje de inhibición del DPPH logrando un IC50 de 49.08 µg/mL, al comparar este estándar con el porcentaje de inhibición del DPPH frente al extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale se nota que es menor, ya que ni siquiera con la mayor concentración utilizada de 500 µg/mL del extracto se logro un porcentaje de inhibición de 50, obteniendo solamente un porcentaje de inhibición de DPPH de 46.7 ± 2.14, esto puede ser debido a que en el extracto hay una variedad de compuestos que pueden disminuir su actividad antioxidante. 42 En estudios previos realizados al extracto etanolico de las hojas de la especie Piper imperiale se encontró que este posee un IC50 de 27.3±1.1 µg/mL, utilizando como estándar hidroxiquinona y concentraciones de 2, 4, 6, 8 y 10 g/mL para el estándar y el extracto[4]. Se hubiera podido obtener unos mejores resultados para el porcentajede inhibición del DPPH con el extracto etanólico de las hojas de la especie Piper impereale utilizando concentraciones mayores del extracto como nos muestra análisis previos, pero se debe tener en cuenta una buena solubilidad del extracto en el metanol porque mientras se realizo el procedimiento no se logro su solubilidad total. 3.3 Elucidación estructural del compuesto 1. El compuesto 1 es de tipo aceito color verde, que se revelaba en la luz ultravioleta (Figura 9), y con una coloración café al reaccionar con yodo. Figura 9: CCD en revelado UV a 365nm del compuesto 1 aislado del extracto etanólico hojas especie Piper imperiale En el espectro de RMN 1H del compuesto 1 (Figura 10), se pueden apreciar 8 señales que integran para alrededor de 20 protones. 43 TMS CDCl3 Figura 10: Espectro RMN 1H (CDCl3, 300MHz) del compuesto 1 aislado del extracto etanólico de la hojas especie Piper imperiale En la ampliación del espectro de RMN 1H en 6.70 a 6.50ppm se observan dos señales, la primera de δ 6.83 (1H, d, J = 7.8 Hz), y la segunda de δ 6.69 (2H, m, J = 8.3 Hz y J = 1.84) con una constante de acoplamiento cercana a 8 Hz y a 2Hz que integran para 1 y para 2 respectivamente, lo que indica la presencia de dos protones aromáticos en posición orto y un protón en posición meta con respeto a alguno de los otros dos protones (Figura 11) . 44 J=8.30 Hz J=7.80 Hz J=1.84 Hz Figura 11: Ampliación del espectro 1H RMN entre 6.70 a 6.50 ppm para el compuesto 1 En la ampliación del espectro de RMN 1H en 5.60 a 3.80ppm se pueden observar dos señales de protones en δ 5.51 (1H, s) y 3.87 (3H, s), que corresponde a un protón de grupo hidroxilo y a tres protones de un grupo metilo que está unido a un átomo electronegativo que posiblemente sea oxigeno. En la misma zona se encuentra una señal con un desplazamiento δ 4,12 (2H, q, J = 7.21) perteneciente a dos protones de un grupo metileno también unido a un átomo electronegativo (Figura 12). 45 J=7.21Hz Figura 12: Ampliación del espectro RMN 1H entre 5.60 y 3.80ppm para el compuesto 1. En la región de 1.0 a 3.0 ppm se encuentran tres señales que corresponde a δ 2.88 (2H, t, J = 7.76), 2.58 (2H, t, J = 7.76), 1.24 (7H, m) (Figura 13) pertenecientes a protones de grupos metilenos y metilos de una cadena alifática. J=7.76Hz J=7.76Hz Figura 13: Ampliación del espectro RMN 1H entre 3.0 a 1.0 ppm, para el compuesto 1. 46 Con el espectro de RMN 13C JMOD a 75 MHz (Figura 14) se puede establecer que el compuesto 1 posee 12 señales de carbono, con las características de: cuatro carbonos tipo cuaternario δ173.29, 146.39, 143.98, 132.28, dos carbonos tipo metilo δ56.26, 14,23, tres carbonos tipo metileno δ 60.23, 36.60, 30.75 y tres señales tipo metino δ 121.13, 114.49, 110.64. Las señales de los carbonos cuaternarios pertenecen a: un carbono de un grupo carboxilo en δ173.29 y tres carbonos aromáticos sustituidos en δ146.39, 143.98, 132.28. Desplazamiento que indican la presentica de una estructura con un anillo aromático trisustituido. También se encuentran tres señales de carbonos de tipo metino en δ121.13, 114.49, 110.64 de un anillo aromático; dos señales en δ60.23 y δ 56.26 de carbonos de tipo metileno y metilo respectivamente unidos cada uno a un átomo electronegativo oxigeno, y por último se observan señales en δ36.60, 30.75 de carbonos metilenos y en δ 14.23 de un carbono metilo los cuales hacen parte de la cadena alifática. Figura 14: Espectro RMN 13C (CDCl3 75 MHz,) del compuesto 1. 47 El espectro COSY 1H – 1H del compuesto 1 (Figura 15), muestra la correlación entre protones de carbonos vecinos, confirmando la presencia de protones aromáticos en posición orto por las correlaciones entre δ 6.83 (d, J = 7.8 Hz, 1H), y 6.69 (d, J = 8.3 Hz, 2H). En el espectro también se muestran otras dos correlaciones; la primera entre los protones del grupo metileno unido a un átomo electronegativo oxigeno δ 4.12 y los protones de tipo metilo δ1,24; y la segunda entre protones de tipo metileno con desplazamientos en δ2.88, 2.58. Estos protones hacen parte de la cadena alifática presente en la estructura del compuesto. Figura 15: Espectro COSY 1H-1H del Compuesto 1. El espectro HSQC (Figura 16) mostro la conectividad entre hidrógenos y sus respectivos carbonos, designando que hidrogeno pertenece a que carbono con la correlación de señales arrojadas por el espectro. Para el anillo aromático se notaron conectividades de los tres protones de tipo metino así: el protón de desplazamiento δ6.83 (d, J = 7.8 Hz, 1H), y los dos protones con desplazamiento 6.69 (d, J = 8.3Hz, J = 1.84, 2H) con el carbono de desplazamiento δ 114.49 y los dos carbonos con desplazamiento δ 110.64, 121.13 respectivamente. 48 También se corroboraron correlaciones entre los protones de tipo metilo unido al átomo electronegativo oxigeno con su carbono correspondiente con desplazamiento en RMN 1H en δ 3,87 y un desplazamiento en RMN 13C en δ56.23. Otras correlaciones encontradas fueron las de los protones de tipo metileno δ 2.58, 2,88 con los carbonos δ 36.60, 30.75. Figura 16: Ampliación espectro HSQC RMN 1H (δ 2.0 a 7.0ppm y RMN 13C δ 25 a 125ppm) del compuesto 1. Con los espectros de RMN 1H, RMN 13C, COSY y HSQC se pudo determinar que la estructura del compuesto 1 corresponde a un anillo aromático con tres protones (dos en posiciones orto y uno en posición meta con respecto a los otros dos protones) y tres sustituciones; un grupo hidroxilo, un grupo metoxilo y una cadena alifática con un grupo ester, obteniendo la posibilidad de seis isómeros para la estructura del compuesto 1 (Figura 17). 49 CH3 O H OH H H O H OH H H H R H H O R H3C OH H CH3 R OH H O OH R R H O CH3 CH3 H H R H H O H H OH H3C Figura 17: Isómeros posibles de la estructura del compuesto 1 aislado del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale. Gracias al espectro HMBC se determino la ubicación de los sustituyentes en el anillo aromático y de los carbonos cuaternarios presentes en el compuesto 1, llegando a un isómero especifico para el compuesto aislado. La posición de la cadena alifática se ubico en el carbono entre los dos protones aromáticos gracias a las correlaciones del protón metileno en δ 2.88 con los carbonos de tipo metino en δ 110.64, 121,13 y el carbono cuaternario en δ 132.28 (Figura 18). 50 Figura 18: Ampliación del espectro HMBC. Ubicación cadena alifática en anillo aromático. Se determino que la ubicación del grupo metoxilo en el anillo aromático esta sobre el carbono cuaternario δ 146.39 por su correlación con los protones en δ 3,87 (Figura 19). Para el grupo hidroxilo se determino que este se encuentra entre el carbono con el grupo que posee el grupo metoxilo y un carbono de tipo metino por sus correlaciones de protón en δ 5.51 con los carbonos δ 114.49, 143.97, 146.39 (Figura 19). 51 Figura 19: Ampliación del espectro HMBC. Ubicación grupo hidroxilo y metoxilo en el anillo aromático. Para la cadena alifática se pudo determinar la ubicación del grupo carbonilo por su correlación con protones de tipo metileno δ 2.88 y 2.52 (Figura 20). Los protones del grupo metileno unido al átomo electronegativo oxigeno δ4,12 poseen una correlación con un carbono de tipo metilo δ 14.23 y con el carbono del grupo carbonilo δ 173.29 (Figura 20) dando la ubicación del grupo ester en la cadena alifática. 52 Figura 20: Ampliación espectro HMBC. Ubicación grupo carbonilo y grupo metileno unido a un átomo electronegativo oxigeno en cadena alifática Los sustituyentes del carbono aromático y los carbonos cuaternarios se pudieron determinar gracias a las correlaciones entre H – C a 2 y 3 enlaces como se muestra en la figura 21: OH H O CH3 H H3C O H O Figura 21: Estructura del compuesto 1 con sus respectivas correlaciones identificadas por el espectro HMBC 1H - 13C 53 Gracias a la información recolectada con los espectros RMN 1H, RMN 13C, COSY, HSQC Y HMBC se realizo la designación completa para cada uno de las señales con sus respectivos desplazamientos para el compuesto 1 aislado del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale. En la figura 22 se muestra la estructura para el compuesto 1 y en la tabla 11 las asignaciones para cada uno de sus átomos de Carbono e Hidrogeno. OH 4 H O 3 3a CH3 5 2 H 9 O H3C H 1 7 8 1' 2' 6 O Figura 22: Estructura química para el compuesto 1. Tabla 11: Asignación de señales 1H y 13C para el compuesto 1 aislado del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale 1 POSICION RMN H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1’ 2’ 3a 4a 6.69 (m, J=1.84Hz) 6.85 (d, J=7.8 Hz) 6.69 (m, J=8.3, 1.84 Hz) 2.85 (t, J=7.76) 2.52 (t, J=7.76) 4.12 (q, J=7.21) 1.24 (m) 3.87 (s) 5.51 (s) RMN 13 C (JMOD) 132.28 (C) 121.13 (CH) 146.39 (C) 143.97 (C) 114.49 (CH) 110.64 (CH) 30.75 (CH2) 36.60 (CH2) 173.29 (C) 60.23 (CH2) 14.23 (CH3) 56.23 (CH3) - HMBC C1, C3, C4, C6, C1, C3, C4 C1, C2, C7 C1, C2, C6, C8, C9 C1, C7, C9 C9, C2’ C1’ C3 C3, C4, C5 54 El compuesto 1 es un metabolito secundario por primera vez aislado del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale, derivado del acido dihidroferúlico. Para verificar la elucidación del compuesto aislado se realizaron revisiones bibliográficas y se pudo encontrar los RMN 13C para la estructura sintetizada del ester etílico del ácido dihidroferúlico [44] comparando sus desplazamientos (Tabla 12), y se encontró que la mayoria de estos coincidían con la estructura elucidada corroborando que el compuesto aislado si es el ester etílico del ácido dihidroferúlico Tabla 12: Comparacion compuesto aislado Hojas Piper imperiale con estructura sintetizada del ester etílico del ácido dihidroferúlico RMN 13 C POSICION Estructura aislada Hojas Piper imperiale Estructura sintetizada 1 2 3 4 5 6 132.28 (C) 121.13 (CH) 146.39 (C) 143.97 (C) 114.49 (CH) 110.64 (CH) 132.5 (C) 120.9 (CH) 146.6 (C) 144.1 (C) 114.5 (CH) 111,1 (CH) 7 30.75 (CH2) 30.8 (CH2) 8 36.60 (CH2) 36.5 (CH2) 9 173.29 (C) 173.2 (C) 1’ 60.23 (CH2) 60.5 (CH2) 2’ 14.23 (CH3) 14.3 (CH3) 3a 56.23 (CH3) 55.9 (CH3) De la especie Salicornea herbacea se han logrado aislar compuesto derivados del acido ferulico similares al ester etílico del ácido dihidroferúlicopero con cadenas alifáticas con un mayor numero de carbonos como por ejemplo el pentadecil ferulato (Figura 23), además se demostró que este posee características antioxidantes evaluadas con la metodología de radical libre DPPH[45] 55 CH3 O O CH3 O HO Figura 23: Estructura del pentadecil ferulato derivado del acido ferúlico aislado de la especie Salicornea herbacea Otros compuestos de este tipo son el 34-hidroxi tetratriacontanil ferulato y 34-Oacetil tetratriacontanil ferulato, dos metabolitos derivados del acido ferulico (Figura 24) aislados de la especie Plumeria bicolor, que al igual que el pentadecil ferulato han presentado actividad antioxidante frente a pruebas como el DPPH y FRAP[46]. HO H3C O O 1 2 O R=H R=COCH3 34-Hydroxi tetratriacontanIl ferulato 34-O-acetil tetratriacontanil ferulato (CH 2)32 OR Figura 24: Derivados del acido ferulico aislados de Plumeria bicolor El ester etílico del ácido dihidroferúlico aislado del extracto etanolico de la especie P. imperiale es un metabolito secundario que podría poseer características de actividad antioxidante ya que estructuras similares como las nombradas anteriormente han sido estudiadas y dado prueba positiva frente a metodologías de DPPH y FRAP, además se ha encontrado que el acido ferulico posee actividad antioxidante[47] una característica que también podrían tener sus derivados, además en estudios previos se logro identificar la presencia del acido ferulico en el extracto etanolico de las hojas de la especie Piper imperiale[4]. 56 Conclusiones Del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale se logro el aislamiento e identificación de un compuesto derivado del Acido ferúlico compuesto que no había sido aislado hasta ahora, ya que en este extracto solamente se había logrado identificar la presencia de polifenoles como el Acido ferúlico, Acido gálico, Catequina, Quercetina, sin embargo se han encontrado reportes de compuestos derivados del acido ferúlico aislados de otras especies como la Salicornea herbacea y Plumeria bicolor, pero se debe tener en cuenta que no en especies del genero Piper. La actividad antioxidantes (DPPH) del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale resulto ser positiva, donde se demostró que con una concentración de 500ppm de extracto se logra un porcentaje de inhibición del 46%, esto quizás sea por la presencia de compuestos antioxidante de tipo fenólico. Las pruebas fitoquímicas preliminares indican que el extracto etanólico de las hojas de la especie P. imperiale está compuesto por metabolitos secundarios como alcaloides, flavonoides, taninos y cumarinas. 57 Recomendaciones Se recomienda realizar pruebas de actividad antioxidante al compuesto 1 aislado del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale para confirmar si este es uno de los que le brinda dicha la actividad antioxidante a la especie. Durante el tratamiento del extracto vegetal se debe controlar la temperatura a la que se realiza la maceración, que el extracto se encuentre seco y el solvente sea de alta pureza para evitar reacciones de los compuestos presentes en la planta. Para establecer que el compuesto aislado es un producto de la biosíntesis de la planta y no un artefacto que se formo durante la extracción se recomienda hacer la extracción con otros solventes y realizar un seguimiento por HPLC. 58 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Callejas, R., Especies nuevas de Piperaceae de los Andes al Sur de Colombia. Novon, 1997. 7. Celis, A., Mendoza C., Extractos vegetales utilizados como biocontroladores con enfasis en la familia Piperaceae. Agronomia Colombiana, 2008. 26. Ahmad, F., Emrizal, Antimicrobial and anti-inflammatory activities of Piper porphyrophyllum (Fam. Piperaceae). Arabian Journal of Chemistry, 2010. 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