Tesis - Universidad de Colima

Universidad de Colima
Facultad de Medicina
EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE WRN Y PAI-1 EN RATON
NORMAL Y TRANSGENICO PARA WRN Y EL POSIBLE PAPEL DE
WRN COMO FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE PAI-1
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS MÉDICAS
PRESENTA
Q.F.B. VLADIMIR OVIEDO RODRÍGUEZ
ASESORES
Dra. ELENA MARGRITA CASTRO RODRÍGUEZ
Dr. RAFAEL JOSÉ COLL CÁRDENAS
Colima, Col., Junio 2004
Este trabajo fue realizado con el financiamiento
SEP- CONACyT clave 34543-N
DEDICADO:
A mi Dios por darme fuerzas en este momento importante de mi vida.
A mis padres.
José Guadalupe Oviedo Ávila y Maria Rodríguez Guízar.
A mis hermanos.
Edwin, Isis Jael y Miriam
A mi novia.
Maria Concepción Pérez Robles.
AGRADECIMIENTO:
Muy especial.
A la Dra. Elena Margarita Castro Rodríguez y al Dr. Rafael José Coll
Cárdenas por sus apreciadas enseñanzas, su confianza y apoyo.
Dr. Charles E. Ogburn, Miriam Salas Guillen, Guadalupe Saray Orozco
Hernández, José Ramón Farías Hernández y Cristina Fabiola Zepeda Peña por el
apoyo brindado en el trabajo del laboratorio.
A los profesores.
Al Dr. Benjamín Trujillo Hernández, Dr. José Clemente Vásquez Jiménez,
Dr. Oscar Uribarren Berrueta, Dr. Ernesto Reynoso Zúñiga, Dr. José Rafael
Cuauhtemoc Acoltzin Vidal y al Ing. Martín Eliseo Isais Ramírez.
A mis compañeros y amigos del CUIB especialmente.
Al Ing. Eduardo López Gil, Dr. Enrique Higareda Almaraz, Dr. Everardo
Paredes Molina.
A la Universidad de Colima, Facultad de Medicina por haberme brindado la
oportunidad de realizar este posgrado.
INDICE
RESUMEN---------------------------------------------------------------------------------------------1
ABSTRACT--------------------------------------------------------------------------------------------3
INTRODUCCIÓN-------------------------------------------------------------------------------------4
ANTECEDENTES------------------------------------------------------------------------------------6
Patobiología del Síndrome de Werner---------------------------------------------------6
Biología molecular del SW -------------------------------------------------------------------7
La helicasa de Werner-------------------------------------------------------------------------9
La aterosclerosis-----------------------------------------------------------------------------11
Importancia de PAI-1 en el proceso aterosclerótico y su relación con
WRN-----------------------------------------------------------------------------------------------11
JUSTIFICACIÓN------------------------------------------------------------------------------------14
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA--------------------------------------------------------15
HIPÓTESIS-------------------------------------------------------------------------------------------15
HIPOTESIS ESTADISTICA----------------------------------------------------------------------15
Hipótesis nula---------------------------------------------------------------------------------15
Hipótesis alterna------------------------------------------------------------------------------15
OBJETIVO GENERAL ---------------------------------------------------------------------------16
OBJETIVOS ESPECIFICOS---------------------------------------------------------------------16
MATERIAL Y METODO--------------------------------------------------------------------------17
Tipo de Estudio--------------------------------------------------------------------------------17
Unidad de Estudio----------------------------------------------------------------------------17
Tamaño de la Muestra-----------------------------------------------------------------------17
Operacionalización de Variables--------------------------------------------------------18
Aspectos Éticos-------------------------------------------------------------------------------19
Control de Calidad---------------------------------------------------------------------------19
Extracción del Tejido------------------------------------------------------------------------24
Extracción del RNA--------------------------------------------------------------------------24
Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de cDNA
generado por la Transcriptasa Inversa (RT) a partir de RNA (RT-PCR)----25
Electroforesis en Agarosa-----------------------------------------------------------------27
Ensayo de Western blotting---------------------------------------------------------------27
Gel de Poliacrilamida------------------------------------------------------------------------28
Sonda para Western blot-------------------------------------------------------------------28
Ensayos de Retardamiento de la Movilidad Electroforética
(Movility Shift)---------------------------------------------------------------------------------28
RNA Antisentido------------------------------------------------------------------------------29
Transfección de Células Eucariotas por el Método de Lipofección--------29
RESULTADOS--------------------------------------------------------------------------------------31
DISCUSION------------------------------------------------------------------------------------------45
CONCLUSIONES-----------------------------------------------------------------------------------48
PERSPECTIVAS------------------------------------------------------------------------------------49
ANEXOS----------------------------------------------------------------------------------------------50
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS-----------------------------------------------------------55
INDICE DE FIGURAS
1.- Síndrome de Werner-----------------------------------------------------------------6
2.- La helicasa en el proceso de desenrrollamiento del DNA--------------8
3.- Polimorfismo en el gen WRN----------------------------------------------------10
4.- Actividad de PAI-1 y PA en la regulación de procesos
trombótico, hemorrágico y aterogénico-------------------------------------13
5.- Metodología de la expresión de PAI-1 y WRN------------------------------20
6.- Detección de WRNp y PAI-1p por Western blot---------------------------21
7.- Metodología de la expresión de la RR-PAI-1 y WRNp
recombinante--------------------------------------------------------------------------22
8.- Metodología de la sobreexpresión de PAI-1 en cultivos celulares--23
9.- Análisis electroforético de los productos de RT-PCR-------------------32
10.- Expresión de WRN en tejido de ratón normal----------------------------34
11.- Expresión de PAI-1 en tejidos de ratón normal--------------------------36
12.- Sobreexpresión de PAI-1 en ratones transgénicos---------------------38
13.- Análisis de la expresión de WRNp y PAI-1p en ensayos de Western
blot-------------------------------------------------------------------------------------40
14.- Retardamiento de la movilidad electroforética de la región
reguladora de PAI-1 debido a la unión por WRNp recombinante--42
15.- Eliminación de la expresión del gen WRN por un Antisentido-----43
16.- Expresión del gen PAI-1---------------------------------------------------------44
RESUMEN
La aterosclerosis es una de las características más importantes que se
presentan en los pacientes con Síndrome de Werner (SW: o envejecimiento
prematuro) y una de las principales causas de muerte.
La relación de PAI-1 (inhibidor de los activadores del plasminogeno tipo 1 con
un gen recientemente clonado llamado helicasa de Werner (WRNp) y su relación con
el proceso aterosclerótico es lo que se pretende estudiar en este proyecto. Una gran
variedad de estudios apuntan al hecho de que una fibrinólisis defectuosa, a través de
una sobreproducción de PAI-1p (una proteína de respuesta aguda) es causa
inequívoca de aterosclerosis y se ha demostrado que PAI-1p es expresada a altos
niveles en tejido vascular de individuos de edad avanzada y en cultivo de fibroblastos
con fenotipo senescente, comparado con sus contrapartes jóvenes. Además PAI-1p
es sobreexpresada dramáticamente (750-1000 veces más) en cultivos primarios de
fibroblastos de pacientes con SW comparada con fibroblastos de individuos
normales.
Recientemente se ha desarrollado en ratón transgénico, el cual no expresa la
proteína WRNp. El presente estudio se diseñó para demostrar la relación que existe
entre la expresión de WRN y la sobreexpresión de PAI-1, puesto que suponemos
que WRNp, actúa como factor de transcripción, que regula la expresión del gen
PAI-1. Por ello, la primera parte de este estudio fue observar los niveles de expresión
de WRNp y PAI-1p en ratones normales mediante RT-PCR en diferentes tejidos y a
diferentes edades; así como demostrar la falta de regulación de la expresión
(sobreexpresión) de PAI-1, cuando WRNp no esta presente (ratones transgénicos).
La asociación de WRNp como factor de transcripción de PAI-1, fue estudiada
mediante ensayos de retardamiento de la movilidad electroforética y comprobada
por ensayos de Western blot.
1
Nuestros resultados indican que la proteína WRNp tiene actividad supresora
de la expresión del gen PAI-1, por lo tanto, cuando el gen WRN es inhibido, la
expresión de la proteína PAI-1p es elevada.
2
ABSTRACT
Atherosclerosis is one of the most important features of Werner Syndrome (or
premature aging; WS) patients, and one their major cause of death.
We want to study the relationship between Werner helicase (WRNp),
overexpression of PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor –type 1) gene, and
atherosclerosis process. Several studies point, that a defective fibrinolisis, through a
PAI-1p overproduction is unequivocal cause of atherosclerosis and has been
demonstrated that PAI-1 is high level expressed in vascular tissue at elderly
individuals and in cultured fibroblasts with senescent phenotype compared with their
youth counterparts. Moreover, PAI-1 is dramatically overexpressed (750 – 1000
times) in primary cultured fibroblasts from SW patients compared to fibroblasts from
normal individuals.
Recently has been made a transgenic mouse, which does not express WRNp.
This study was designed in order to demonstrate the relationship between WRN
expression and PAI-1 overexpression. We thought that WRNp acts as transcription
factor regulating expression of PAI-1 gene. The first part of this study, was to
measure the expression levels of WRN and PAI-1 in normal mice through RT-PCR in
several tissues and at several ages; and to demonstrate the fault of regulation
(overexpression) of PAI-1, when WRNp is not present (transgenic mice).
Association of WRN as transcription factor of PAI-1 was studied through
electrophoretic mobility shift assay and verified by Western blot assays.
Our results shown, that WRNp has suppression activity on expression of PAI-1
gene. Therefore, when WRN gene in inhibited, the expression of PAI-1 protein is
elevated.
3
INTRODUCCION
La aterosclerosis es una de las más importantes características en los
pacientes con Síndrome de Werner (SW) y una de las principales causas de muerte.
El gen causante de esta enfermedad (helicasa WRN) ha sido recientemente clonado
y secuenciado. Algunos reportes describen la asociación del polimorfismo del
extremo C- terminal de la proteína WRN (1367 Cisteina / Arginina (Cys/Arg) y 1074
Leucina / Fenilalanina (Leu/Phe)), con una disminución en el riesgo de infarto al
miocardio y con una mayor oportunidad de longevidad. Estas asociaciones son de
suma importancia para el estudio de la actividad de la helicasa de Werner en el
organismo.
Debido a las características que presentan los individuos enfermos con SW,
este síndrome es llamado también síndrome de envejecimiento prematuro.
La aterosclerosis es una de las primeras causas de muerte e incapacidad en
el mundo desarrollado; es un proceso que inicia desde la infancia y produce en los
adultos mayores gran cantidad de complicaciones vasculares (entre ellas infarto al
corazón e infartos cerebrales); es por esto que la aterosclerosis esta relacionada
directamente con el envejecimiento.
La aterosclerosis es de etiología multifactorial, sin embargo, la sobreexpresión
o la disminución de ciertos factores (sobre todo aquellos que tienen función
reguladora) se han relacionado con aparición y progresión de la aterosclerosis; tal es
el caso de la proteína PAI-1 (inhibidor del activador del plasminogeno tipo 1) que es
clave en el proceso de fibrinólisis.
Se ha demostrado que PAI-1p es expresada a altos niveles en tejido vascular
de individuos de edad avanzada y en cultivo de fibroblastos con fenotipo senescente,
comparado con sus contrapartes jóvenes.
4
Además PAI-1p es sobreexpresada dramáticamente (750-1000 veces más) en
cultivos primarios de fibroblastos de pacientes con SW comparada con fibroblastos
de individuos normales.
PAI-1p actúa principalmente sobre el activador del plasminogeno tisular (tPA),
el cual ha sido recientemente aprobado como tratamiento de isquemia cerebral por la
Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA), éstos datos
respaldan
la
relevancia
del
sistema
fibrinolítico
tPA-PAI-1 en el proceso
aterosclerótico.
Debido a la relación que existe entre el gen WRN y la sobrexpresión de PAI-1
y en vías de determinar su relación con aterogénesis, lo que se pretende en este
trabajo es:
1. Evaluar, en ratones normales (WRN +/+) y ratones transgénicos (WRN -/-)
la expresión de PAI-1p y observar si la falta de WRNp provoca la sobreexpresión de
PAI-1.
2.- Demostrar que la helicasa de Werner (WRNp) se une directamente con la
región reguladora del gen PAI-1.
3.- Observar la sobreexpresión de PAI-1, en cultivos celulares, cuando la
expresión de WRN es inhibida mediante un oligonucleótido antisentido.
5
ANTECEDENTES
Patobiología del Síndrome de Werner
El síndrome de Werner (SW) es un síndrome Autosómico recesivo,
caracterizado por la aparición prematura y progresión acelerada de múltiples
desórdenes relacionados con envejecimiento
(1,2,4)
. Los pacientes tienen la apariencia
de envejecimiento acelerado con encanecimiento, adelgazamiento y caída del
cabello; cambios en la cantidad y distribución de tejido adiposo, incluyendo atrofia de
grasa subcutánea; fibrosis, atrofia y ulceración de la piel (figura 1). Estos pacientes
desarrollan múltiples desórdenes comúnmente asociados con senescencia, los
cuales incluyen cataratas oculares bilaterales, gran susceptibilidad a desarrollar
diabetes mellitus tipo 2, atrofia gonadal, hiperlipidemia, osteoporosis y varias formas
de aterosclerosis, así como una gran susceptibilidad a varias formas de neoplasmas
benignos y malignos. Las más frecuentes causas de muerte de los pacientes con SW
son infarto al miocardio y cáncer (2).
Mujer de 48 años con signos característicos de
Síndrome de Werner
FIGURA 1.- Paciente con Síndrome de Werner que presenta las manifestaciones clínicas
tomado de Epstein et al, 1996.
6
(3)
,
Biología Molecular del SW
El SW resulta de la herencia de dos copias de mutaciones nulas de un gen
presente en el cromosoma 8 humano, llamado WRN. El RNA mensajero (RNAm)
tiene 5208 bases y origina una helicasa (WRNp) de 1432 amino ácidos.
Las helicasas son proteínas que usan energía derivada de la hidrólisis de ATP
o GTP y desdoblan la molécula duplex de DNA, exponiendo las cadenas simples a
los complejos de transcripción, recombinación, "splicing" y reparación. Las
mutaciones nulas que originan el SW, forman proteínas truncadas en el dominio
C-terminal (5, 6), las cuales eliminan una señal de localización nuclear (7).
La helicasa es llamada también proteína de Werner (WRNp). Estudios
bioquímicos de esta proteína han demostrado que contiene 5 dominios con actividad
exonucleasa y 7 dominios con actividad helicasa
(5)
. La proteína humana
recombinante de WRN (WRNp) es homóloga a la helicasa RecQ de E. coli (8- 10).
A nivel celular, los procesos tales como segregación de cromosomas,
translocación y proliferación celular pueden ser perturbados en ausencia de las
funciones normales de la helicasa. En bacterias la ausencia de las funciones
normales de las helicasa pueden incluso perturbar el ensamble de los ribosomas.
Helicasas mutadas son responsables de la inestabilidad del DNA en algunos
otros síndromes genéticos. Tales mutaciones pueden ocasionar el no reconocimiento
o eliminación de nucleótidos dañados durante la replicación (9,10).
El papel que juegan las helicasas en el proceso de desenrrollamiento del DNA
(figura 2), ha proporcionado una explicación razonable para el hecho de que los
individuos con SW, sufran también de una gran variedad de neoplasmas, pero poco
se sabe acerca de que el desdoblamiento del DNA y la inestabilidad genómica
7
derivada de las funciones defectuosas de las helicasas, puedan ser asociadas con
aterosclerosis y por consiguiente con enfermedades cardiovasculares.
FIGURA 2.- La helicasa o proteína de Werner actúa desenrollando la doble hebra del DNA en
el proceso de la replicación
(11)
.
8
La Helicasa de Werner
Como dijimos antes, las mutaciones nulas que originan el SW, originan
proteínas truncadas en el dominio C-terminal, las cuales eliminan una señal de
localización nuclear. Durante el estudio de las mutaciones, se identificaron diversos
polimorfismos en el gen humano WRN (6,7,12).
Se demostró que uno de estos polimorfismos, llamado 1367 Cisteina /
Arginina, debido a que la substitución nucleotídica Timina / Citosina (T/C) origina un
cambio de Cys por Arg en el residuo 1367 de la proteína, está asociado con
disminución en el riesgo de infarto al miocardio en una población Japonesa (13).
Otro de los polimorfismos, el cual también se encuentra localizado en el
extremo C-terminal de la proteína, es el llamado 1074 Leu/Phe debido a que la
substitución nucleotídica Timina / Guanina (T/G) origina un cambio de Leu por Phe
en el residuo 1074 de la proteína, ha sido asociado a una mayor oportunidad de
longevidad en poblaciones Mexicana y Finlandesa. (Poblaciones con alta incidencia
de aterosclerosis;
(14)
)(figura 3). Estos resultados demuestran la importancia de la
helicasa WRNp en el proceso aterosclerótico.
9
FIGURA 3.- El polimorfismo del gen WRN donde el alelo L esta asociado a protección contra
EC isquémico y enfermedad arterio coronaria. El alelo R está asociado a protección contra infarto al
(15)
miocardio en una población japonesa
.
10
La Aterosclerosis
La aterosclerosis es una enfermedad progresiva de las arterias que empieza
en la niñez. Las lesiones están formadas por células y matriz extracelular que se
acumulan progresivamente hasta el punto potencial de la obstrucción total de los
vasos sanguíneos.
Las lesiones ateroscleróticas progresan en tres estados: en el primero hay una
acumulación de células llenas de lípidos (células espumosas) en el espacio
subendotelial, el segundo estado es una lesión proliferativa, donde una capa fibrosa
producida por células de músculo liso, cubre un núcleo de lípidos formado de
colesterol y esteres extracelulares. El tercer estado es una lesión complicada, la cual
puede manifestar, calcificación, hemorragia, ulceración y trombosis.
La aterosclerosis es una de las causas más comunes de morbilidad y
mortalidad, asociadas con envejecimiento
(16)
, un proceso que esta grandemente
acelerado en SW. La aterogénesis incluye procesos que producen fibrina, un
componente primordial en el coágulo sanguíneo, y procesos que previenen la
remoción de esta fibrina (fibrinólisis defectuosa
(17)
). Una proteína de fase aguda muy
importante en la regulación de la fibrinólisis es el inhibidor de activadores del
plasminogeno (PAI-1p).
Importancia de PAI-1p en el proceso aterosclerótico y su relación con
WRN
La fibrina en el organismo es formada en respuesta a un daño vascular, es un
factor muy importante en la formación del coagulo sanguíneo.
Los mecanismos de regulación de la formación y eliminación de fibrina son
importantes para evitar una coagulación deficiente (excesiva ó insuficiente).
11
Uno de estos mecanismos es el que forma la plasmina; esta proteína es la
encargada de degradar la fibrina formada durante el daño vascular.
La plasmina es formada a partir del plasminogeno por la acción de los
activadores del plasminogeno de tejido y de urokinasa (tPA y uPA), y su formación es
inhibida por los inhibidores de los activadores del plasminogeno (PAI-1 y PAI-2). El
eje de tPA-PAI-1 es el eje de regulación de plasmina más importante en la
vasculatura. El equilibrio entre estos dos factores de regulación (tPA y PAI-1) es de
suma importancia ya que la plasmina, además de degradar la fibrina, activa la matriz
metalo proteasas (MMP) responsables de la degradación de la matriz extracelular.
Un exceso de PAI-1 puede ocasionar una cantidad deficiente de plasmina
cuyo resultado final, puede ser una trombosis y un crecimiento de las lesiones
(figura 4).
PAI-1p esta directamente involucrada en la degradación de la fibrina, es
considerada un factor de riesgo para la recurrencia de infarto al miocardio y su
sobreexpresión es causa inequívoca de aterosclerosis
(18)
(figura 4). El gen de PAI-1p
(PAI-1), es expresado a altos niveles en tejidos vasculares de individuos de edad
avanzada,(19) (la edad es sin duda, un factor de riesgo para la aterogénesis). PAI-1p
se encuentra sobreexpresada, aproximadamente 11 veces más en células IMR90
(fibroblastos de pulmón humano fetal), en estado de senescencia replicativa,
comparado con fibroblastos jóvenes
(20, 21)
y es sobreexpresada hasta 1,000 veces
más en fibroblastos de pacientes con SW comparados con fibroblastos provenientes
de individuos sanos
(22, 23)
. Estas evidencias nos hacen pensar en la existencia de
una relación directa entre la expresión de los genes WRN y PAI-1. Esta interacción,
provoca que cuando WRN es defectuoso (SW), se produce una enorme
sobreexpresión (hasta 1,000 veces más) de PAI-1.
12
FIGURA 4.-
La regulación de la proteína PAI-1 esta involucrada en el proceso de la
degradación de la fibrina.
13
JUSTIFICACION
La aterosclerosis es uno de los problemas de mortalidad y morbilidad en
nuestra población Mexicana. Los riesgos de tener infarto al miocardio y otras
enfermedades vasculares ó degenerativas son más frecuentes con la presencia de
este factor.
En 2001, la SSA reporto 17,950 muertes por enfermedades isquémicas del
corazón y enfermedad cerebrovascular en individuos de edad productiva entre 15 y
64 años de edad en la República Mexicana. Reportó también en ese mismo año
495,639 casos nuevos de hipertensión arterial, enfermedades isquémicas del
corazón y enfermedades cerebrovasculares(24).
En Colima, aparecieron solamente 633 casos nuevos, lo cual equivale al
0.13% del total para la República Mexicana (24). La mayoría de estos pacientes
reciben solamente tratamientos que retardan la aparición de complicaciones que
pueden ocasionar su muerte.
El conocimiento de la regulación a nivel génico de PAI-1, el cual es uno de los
más importantes factores de riesgo para la aterogénesis (que es lo que se pretende
estudiar en este trabajo), puede sentar las bases para el desarrollo de nuevos
fármacos y estrategias terapéuticas, y para conocer y dar tentativas de solución por
los problemas de mortalidad y morbilidad ocasionados por la aterosclerosis en
nuestra población. Si estas nuevas estrategias a mediano y largo plazo se utilizaran,
solamente en Colima, esto equivaldría a tener tratamiento para al menos un 0.13%
de población total de México.
14
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿ La helicasa WRNp es un factor que regula la expresión de PAI-1?
HIPOTESIS
La helicasa WRNp actúa como factor supresor de la transcripción de PAI-1 de
modo que cuando la helicasa esta afectada (como es el caso de SW), la supresión
es inhibida y la transcripción se lleva a cabo en forma desmedida (sobreexpresión de
PAI-1).
HIPÓTESIS ESTADÍSTICA
Hipótesis nula
La helicasa WRNp no es un factor de transcripción que regule la expresión de
PAI-1 (si falta WRNp, la expresión de PAI-1 no se modifica).
Hipótesis alterna
La helicasa (WRNp) es un factor de transcripción que regula la expresión de
PAI-1.
15
OBJETIVO GENERAL
- Estudiar el papel de la helicasa WRNp en el control de la transcripción de
PAI-1, determinando si existe una relación física directa entre la helicasa WRNp y la
región reguladora de PAI-1. Y si la falta de WRNp provoca la sobreexpresión de
PAI-1.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.- Determinar cuales son los niveles de expresión de los genes PAI-1 y WRN
en diferentes tejidos y a diferentes etapas de desarrollo en ratones normales
(WRN+/+).
2.- Determinar los niveles de expresión de PAI-1 en ratones transgénicos que
no expresan WRN (WRN-/-).
3.- Demostrar la asociación física entre la proteína WRNp y la región
reguladora del gen PAI-1 (RRPAI-1).
4.- Eliminar la expresión del gen WRN en un cultivo celular con un
oligonucleótido antisentido para el RNA mensajero de la helicasa WRNp. Y observar
la sobreexpresión de PAI-1.
16
MATERIAL Y METODOS
Tipo de Estudio
Experimental “in vitro” e “in vivo”
Unidad de Estudio
DNA celular, RNA celular, oligonucleotidos, cultivos celulares transfectados,
ratones transgénicos y normales de la cepa C57BL/6.
Tamaño de la Muestra
Como la secuencia del DNA celular, la expresión de genes y los cultivos
celulares transfectadas son únicas entonces se trabajará con la unidad de estudio.
17
Operacionalización de Variables
VARIABLE
NATURALEZA
INTERRELACION
NIVEL DE
MEDICION
EXPRESION DEL
GEN WRN
SEMICUANTITATIVA
INDEPENDIENTE
RAZON
DENSIDAD DE
MARCA EN UN
GEL DE AGAROSA
EXPRESIÓN DEL
GEN PAI-1
SEMICUANTITATIVA
DEPENDIENTE
RAZON
DENSIDAD DE
MARCA EN UN
GEL DE AGAROSA
CUALITATIVA
DEPENDIENTE
NOMINAL
CUALITATIVA
DEPENDIENTE
NOMINAL
UNION DE WRN CON
LA REGION
REGULADORA DE
PAI-1 (RRPAI-1)
SOBREEXPRESION
DE PAI-1 POR LA
ELIMINACION DE
WRN CON
ANTISENTIDO
18
INDICADORES
RETARDAMIENTO
DE LA MOVILIDAD
ELECTROFORETICA
PRESENCIA ó
AUSENCIA EN UN
GEL DE
AGAROSA AL 1%
PRUEBA
ESTADISTICA
MEDIA
DES. ESTA.
MEDIA
DES. EST.
_
_
Aspectos Éticos
Este proyecto se clasifica SIN RIESGO de acuerdo al reglamento de la Ley
General de Salud en Materia de Investigación para la Salud. Articulo 17, categoría I,
sin embargo, se observan reglas para evitar contaminación ambiental con material
biológico transformado o material peligroso.
Con la finalidad de la protección propia y para asegurar la integridad de las
muestras, el investigador usó guantes, cubreboca y bata mientras realiza su trabajo.
El material biológico se inactivó con hipoclorito de sodio o esterilización, antes de ser
desechado; el material peligroso, en su lugar, se incineró para evitar riesgos al medio
ambiente.
Control de Calidad
El presente estudio se basa en los protocolos de Current Protocols In
Molecular Biology(25) y Molecular Cloning (26), ya que estos protocolos están
establecidos para cualquier método de Biología Molecular.
19
En este estudio fueron utilizados ratones de la cepa C57BL/6 normales y
transgénicos (mutación K477M
(6)
en el gen WRN; mutación dominante negativa). No
expresa WRN a diferentes edades. La expresión de WRN y PAI-1 fue evaluada
semicuantitativamente mediante RT-PCR (Transcripción Reversa y Reacción en
Cadena de la Polimerasa) en diferentes tejidos (páncreas, cerebro, corazón y
testículo) (figura 5).
FIGURA 5.- Método de la expresión del gen PAI-1 y WRN.
20
Los productos de RT-PCR fueron sometidos a electroforesis y analizados por
densitometría a partir de imágenes obtenidas con un documentador de geles
(Gel,Doc de BIO-RAD). Los niveles de expresión fueron normalizados con los
valores de expresión de β-actina para cada muestra, la presencia de proteína fue
evaluada por ensayos de hibridación (Wester blot) (figura 6).
FIGURA 6.- Método de detección de WRNp y PAI-1p por Western blot
21
Para evaluar la unión física de WRNp con la región reguladora del gen PAI-1
(RRPAI-1) está fue amplificada a partir de DNA genómico humano mediante PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa). La unión específica de la proteína WRN
recombinante
(27)
a la RRPAI-1 se evaluó por el retardamiento en el corrimiento
electroforético de la RR-PAI-1 en un gel de agarosa (figura 7).
FIGURA 7.- Método del ensayo de retardamiento.
22
Se intentó observar la sobreexpresión de PAI-1 en cultivos celulares (mediante
RT-PCR), en respuesta a la inhibición de la traducción de WRN mediante la
transfección de un oligonucleótido antisentido especifico (figura 8).
FIGURA 8.- Método para evaluar si la eliminación de WRNp en cultivos celulares, ocasiona la
sobreexpresión de PAI-1.
23
Extracción del Tejido(26)
Se utilizaron 35 ratones normales y 35 ratones transgénicos (no expresan
WRN) de la cepa C57BL/6, para la extracción de los tejidos (páncreas, cerebro,
corazón y testículo).
Los ratones fueron colocados en una cámara cerrada con cloroformo para ser
sacrificados, en grupos de 5 normales y 5 transgénicos de la misma edad de 0, 3, 6,
9, 15, 21 y 24 meses, se extrajo el corazón, el páncreas, testículo y cerebro de cada
ratón. Todos los tejidos fueron colocados en 7 ml de TRIZOL TM (isotiocianato de
guanidina y fenol: INVITROGENTM 15596-026). El tejido fue disgregado con un
homogenizador de pistilo PRO250 durante 2 min. a 250 rpm (revoluciones por
minuto) se extrajo el RNA y se determinó la expresión de PAI-1 y WRN, mediante
RT-PCR.
Extracción de RNA(26)
Este método involucra la lisis de las células con una solución de fase orgánica
donde el DNA y las proteínas son extraídos del RNA restante (sobrenadante
acuoso). El RNA total se precipito de la fase acuosa con isopropanol.
Para tejidos se lavó el trozo de tejido 30 seg. de 1 a 6 veces con agua estéril
y se homogenizaron las muestras con una apropiada cantidad de trizol.
Para células se lavaron las células con PBS 1X estéril, se dejo reposar la caja
por 30 seg., se removió la mayor cantidad de PBS posible, se le adicionaron 3 ml de
trizol pipeteando varias veces para romper las células, se recolectó el trizol y las
células libres en un tubo de 15 ml.
24
Se adicionaron 0.2 ml de cloroformo por cada ml de trizol, se agitaron los
tubos vigorosamente por 15 seg. en vortex se incubaron los tubos a temperatura
ambiente por 3 min. y se centrifugaron a 9000 rpm a 4°C por 15 min. Se transfirió la
fase acuosa de cada muestra a un tubo limpio y se agregaron 0.5 ml de alcohol
isopropilico por 1 ml de trizol utilizado al principio de la homogenización, se incubaron
las muestras a temperatura ambiente por 10 min. y se centrifugaron a 12000 rpm a
4°C por 10 min. Se removió el sobrenadante, se lavó el botón de RNA con 1 ml de
etanol al 75%, se mezcló la muestra en el vortex y se centrifugó a 12000 rpm a 4°C
por 5 min. Se removió el etanol y se dejo secar el botón del RNA al aire libre
aproximadamente 10 min. El RNA total se resuspendió en agua tratada con Dietil
Pirocarbonato (H2O-DEP) libre de RNAsas.
Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de cDNA
generado por la Transcriptasa Inversa (RT) a partir de RNA (RT-PCR)
Este es un método usado para amplificar copias de cDNA (DNA codificante)
obtenidos a partir de RNA. El RT-PCR es usado para generar grandes cantidades de
cDNA de cantidades pequeñas de RNAm (RNA mensajero). Los detalles de la
técnica puede variar de un protocolo a otro, pero los conceptos fundamentales son
constantes y relativamente simples; donde el primer paso es la conversión
enzimática de RNA de una sola hebra a un templado de cDNA. Un “primer”
oligodeoxinucleotido es hibridizado con el RNAm y este es extendido por una DNA
polimerasa dependiente de RNA (RT) para crear una copia de cDNA que puede ser
amplificada por PCR.
1µg de RNA total de cada muestra estudiada, fue utilizado para la evaluación
de la expresión de los genes WRN y PAI-1 mediante RT-PCR, utilizando para ello, el
kit Super Script One Step RT-PCR (INVITRO GEN; catalogo 10928-034), y siguiendo
las indicaciones del productor.
25
Los “primers” iniciadores utilizados para amplificar fueron:
WRN F: CTGGAACATCTAAGTGACCC
(Con 55°C de temperatura de
WRN R: GCCTGGAGTCTGGTCTACTG
alineamiento)
PAI-1 F: CAAGGATGAGATCAGCACCACAG (Con 65°C de temperatura de
PAI-1 R: GGGTTCCATCACTTGGCCCATG
alineamiento)
β-actina F: GCTGATCCACATCTGCTGG
(Con 55°C de temperatura de
β-actina R: CCAGCAGATGTGGATCAGC
alineamiento)
Brevemente: 1µg de RNA total fue colocado en un tubo eppendorf con los
siguientes componentes:
- 200 µg de dNTP´s
- 50 µM de oligo dT
- 0.2 µM de cada “primer” (F yR)
- Mezcla de RT/Taq Polimerasa
- 1.2 mM de Sulfato de Magnesio
(4U de c/u)
Cada reacción fue sometida al siguiente protocolo de temperatura en un
termociclador iCycler de (BIO-RAD).
-
1 Ciclo de 30 min a 50°C / 2 min a 94°C.
-
40 Ciclos de desnaturalización a 94°C / 15 seg. alineamiento a (55°C para
actina y WRN; 65°C para PAI-1) / 30 seg de polimerización 72°C / 1 min.
-
1 Ciclo 72°C / 5 min.
Los tubos fueron colocados a 4°C hasta que las muestras fueron sometidas a
electroforesis en agarosa.
26
Electroforesis en Agarosa(26)
Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis en agarosa al 3% en
TBE (89 mM de Tris-borato, 2 mM de EDTA), durante 2 horas a 100 V, usando como
buffer de corrimiento, TBE al 0.5 X.
Los geles fueron teñidos colocándolos en un baño de agua con Bromuro de
Etidio.
Se obtuvieron imágenes de los geles con un documentador de geles Gel.Doc
(BIO-RAD), los cuales fueron sometidos a densitometría con un software del equipo
para obtener valores numéricos.
Ensayo de Western blotting(26)
Esta técnica separa electroforeticamente proteínas que son transferidas de un
gel a un soporte sólido y sondeadas con reactivos que son específicos para
secuencias particulares de aminoácidos. Las sondas usualmente son anticuerpos
que reaccionan específicamente con epitopes antigénicos de las proteínas blancos
en el soporte sólido. El Western blotting es por lo tanto extremadamente útil para la
identificación y cuantificación de proteínas especificas en muestras complejas de
proteínas. La técnica es casi tan sensitiva como el radioinmunoensayo en fase sólida
estándar e inmunoprecipitación diferencial, no se requiere que la proteína blanco
este radioetiquetada, además la separación electroforética de proteínas es conducida
bajo condiciones desnaturalizantes, para eliminar problemas de solubilidad,
agregación, y cooprecipitación de las proteínas blancos con proteínas agregadas.
En Western blotting, las muestras examinadas son solubilizadas con
detergentes y agentes reductores, separadas por electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS, y transferidos a un soporte sólido (usualmente una nitrocelulosa
o filtro PVDF). El filtro es subsecuentemente expuesto a un anticuerpo específico
27
(para la proteína blanco) sin etiquetar. Finalmente, la unión del anticuerpo es
detectado por uno de varios reactivos inmunológicos.
Gel de Poliacrilamida(26)
Se prepararó un gel de corrimiento de acrilamida al 7% con Tris 180mM pH
8.8, SDS 1% y un gel concentrador de acrilamida al 4% con Tris 65mM pH 6.8,
SDS 1%. Fueron colocados 50µl de cada muestra por línea y el gel fue corrido toda
la noche a 35 V usando como buffer en el cátodo, una solución de Tris-base 100 mM,
Tricina 100mM, SDS 10% (pH 8.25) y como buffer en el ánodo, una solución de Trisbase 200mM pH 8.9. Las proteínas separadas, fueron electrotransferidas a
membranas Immobilon-PMR (Millipore) en un buffer de transferencia a 35 mA durante
toda la noche.
Sondas para W estern blot(26)
Las membranas fueron prehibridadas con el buffer que contiene (5% de leche
carnation sin grasa, 0.02% de azida de sodio, 0.02% de Tween 20 en PBS; (130mM
de NaCl, 2.7 mM de KCl, 10 mM de Na 2HPO4 y 2 mM de KH2PO4) durante una hora
a 37ºC. La presencia de WRNp o PAI-1p, fue evaluada mediante el reconocimiento
de anticuerpos policlonales específicos como primer anticuerpo, el anticuerpo
secundario fue un anticuerpo monoclonal Anti conejo acoplado a biotina, para ambas
proteínas. Para revelar las membranas se utilizó un sistema biotina avidina
(VectastinMR; VECTOR) y el reactivo RPN2109MR (Amersham) para detección con
peroxidasa. Las membranas fueron expuestas a placas de rayos X para obtener
imágenes.
Ensayos de Retardamiento de la Movilidad Electroforética (Movility Shift) (26)
Para determinar la unión entre la helicasa WRN y la secuencia reguladora de
PAI-1. La proteína WRN recombinante pura (amablemente donada por el Dr. Mattew
Grey del Departamento de Patología de la Escuela de Medicina de la Universidad de
28
Washington), se incubaron con la RRPAI-1 (obtenida por PCR a partir de DNA
genómico humano), durante 30 min a 25ºC en concentraciones de 100 ng de
fragmento por 1, 2 y 5 pmol de proteína. El retardamiento en la movilidad
electroforética (se corrió en un gel de agarosa al 1% y teñidos con bromuro de
etidio), fue
evaluada con respecto al corrimiento de los fragmentos solos. La
especificidad de dicha unión no fue evaluada.
RNA Antisentido
El RNA antisentido fue un oligonucleótido sintético de 23 bases con un grupo
"psoralen"
(28)
en el extremo 5’ (5’-GAT CCA GTC CAA CAG GTC TTC TT-3’). Este
RNA Antisentido es complementario al fragmento 124-147 del RNAm de WRN.
Transfección de Células Eucariotas por el Método de Lipofección(26).
Este método es usado para introducir DNAs exógenos dentro de cultivos
celulares de mamíferos. El DNA es recubierto por un lípido para ser transfectado, lo
cual interactúa directamente con la membrana plasmática de la célula y es llevada
dentro de la célula por endocitosis.
Se utilizaron 16 cajas de cultivos celulares de la línea de fibroblastos de ratón
3T3 donde 8 cajas de cultivo se utilizaron para la transfección con el oligonucleótido
Anti-WRN y las otras 8 cajas de cultivo se utilizaron para la transfección sin
Anti-WRN.
Se coloco en un tubo de 15 ml 10µg de Anti-WRN y 200µl de Opti-MEM,
posteriormente se coloco en otro tubo de 15 ml 200µl de Opti-MEM y 20µl de
lipofectina, se incubaron ambos tubos durante 1 hora a temperatura ambiente. Se
combinaron el contenido de ambos tubos, se incubaron 15 minutos a temperatura
ambiente sin mover. Se retiro el medio del cultivo de las células y se lavaron una vez
con Opti-MEM sin suero, se elimino el medio lo mejor posible (inclinando la caja de
29
cultivo). Se agrego 3.2 ml de Opti-MEM a la mezcla del Anti-sentido y lipofectina y se
le adiciono a las células. Se incubaron 12 horas a 37°C en atmósfera con 5% de
CO2. Se cambio el medio de cultivo y se incubo a 37°C durante 24 horas. Se
monitoreo la expresión de la transfección lisando las células, se llevo a cabo un RTPCR para monitorear la expresión de WRN y PAI-1.
30
RESULTADOS
Expresión de WRN y PAI-1.
Mediante la técnica de RT-PCR, se evaluó semicuantitativamente la cantidad
de RNAm de WRN y PAI-1 presente en muestras de diferentes tejidos (páncreas,
corazón, cerebro y testículo) obtenidos de ratones normales (WRN +/+) a diferentes
edades (0, 3, 6, 9, 15, 18 y 24 meses).
Lo mismo se hizo para ratones transgénicos (WRN -/-). Los productos de RTPCR, fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 3% y teñidos con
bromuro de etidio. Los valores numéricos de la cantidad de RNAm fueron obtenidos
sometiendo dichos geles a densitometría mediante un documentador digital. La
figura 9 muestra un ejemplo de estos geles, utilizando muestras de los cuatro tejidos
estudiados, en ratones normales y transgénicos de 3 meses de edad.
La expresión de β-actina sirvió como control positivo de la expresión, así como
para normalizar los valores obtenidos de los otros dos genes (WRN y PAI-1).
31
FIGURA 9.-Se analizó la expresión de WRN y PAI-1 mediante RT-PCR. Se escogieron
muestras al azar de diferentes tejidos de ratones adultos de 3 meses, control (WRN+/+) y
transgénicos (WRN-/-). Para observar la expresión de los genes, se amplificaron fragmentos de
732 pb y 484 pb de PAI-1 y WRN respectivamente, con “primers” que no presentaban
complementariedad mutua. Los productos fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al
3% y teñidos con Et Br. A partir de estos geles, se obtuvieron valores numéricos mediante un análisis
densitométrico por medio de un analizador de geles Gel. Doc (BIO-RAD). Los valores numéricos
fueron normalizados mediante la comparación de la expresión del gen de β-actina cuyo fragmento
amplificado fue de 1053 pb. M: Marcadores de peso molecular (100pb ladder), P: páncreas,
Co: corazón, Ce: Cerebro, T: testículo
32
La evaluación semicuantitativa de la expresión mediante RT-PCR de WRN en
diferentes tejidos de ratón normales, se resume en la figura 10. Los valores son
unidades arbitrarias obtenidos del análisis densitométrico de los productos de RTPCR (RNAm), sometidos a electroforesis en geles de agarosa y teñidos con bromuro
de etidio. La media y desviación estándar de 5 ratones diferentes fueron
normalizados con los valores para β-actina de las mismas muestras.
Se puede observar que el testículo es el tejido que expresa mayor cantidad de
RNAm de WRN, seguido por el corazón, el páncreas y el cerebro. Se observa
también que a mayor edad de los ratones, la expresión de WRN, disminuye,
encontrándose en individuos de 24 meses valores por debajo de la mitad (en
páncreas y cerebro) de los valores obtenidos para los ratones recién nacidos.
Un dato importante es que en testículo y corazón (en ratones de las mismas
edades), los valores disminuyen hasta 1/3 parte de los valores iniciales.
33
FIGURA 10.- Evaluación semicuantitativa por RT-PCR, de la cantidad de RNAm del gen WRN
en páncreas, corazón, cerebro y testículo de ratones normales a diferentes edades. Los valores
mostrados son el promedio y la desviación estándar de 5 muestras diferentes.
34
La figura 11 muestra las diferencias en expresión del gen PAI-1 en diferentes
tejidos de ratones normales a diferentes edades.
Los valores mostrados son la media y la desviación estándar de RNAm de
PAI-1, normalizados con los valores obtenidos de la expresión de β-actina. La
cantidad de RNAm esta mostrada en valores arbitrarios obtenidos mediante
densitometría de los productos de RT-PCR sometidos a electroforesis en geles de
agarosa. Se puede observar que la expresión de PAI-1 tiende a aumentar, cuando
los individuos envejecen, encontrándose valores hasta tres veces mayores
(0 meses = 1.5 y 24 meses = 4.02) en páncreas, (0 meses = 0.9 y 24 meses = 3.2)
corazón y hasta 2 veces mayores (0 meses = 0.63 y 24 meses = 1.3) en cerebro y
(0 meses = 0.25 y 24 meses = 0.5) en testículo.
En testículo, la expresión de WRN disminuyo hasta menos de un tercio
(0 meses = 0.82 y 24 meses = 0.22 figura 10) y la expresión de PAI-1, aumento
menos de 2 veces (0 meses = 0.25 y 24 meses = 0.5 figura 11).
35
FIGURA 11.- Evaluación semicuantitativa por RT-PCR, de la cantidad de RNAm del gen PAI-1
en páncreas, corazón, cerebro y testículo de ratones normales (WRN +/+) a diferentes edades. Los
valores mostrados son el promedio y la desviación estándar de 5 muestras diferentes.
36
Sobreexpresión de PAI-1
La comparación de la expresión de PAI-1 en los diferentes tejidos, los ratones
transgénicos (WRN -/-) y ratones normales (WRN +/+), se presentan en la figura 12.
La cantidad de RNAm de PAI-1 (evaluada por RT-PCR), se muestra como media
todos los ratones estudiados a todas las edades y ha sido normalizada con la
expresión
de
β-actina.
La
expresión
de
PAI-1 en los ratones normales
independientemente del valor, ha sido tomada como 1, de tal modo que los valores
obtenidos de los ratones transgénicos se ha tomado como el número de veces que
sobrepasa este valor (sobreexpresión).
El cerebro es el tejido que menor cantidad de PAI-1 sobreexpresa (20.5 veces)
y el corazón es el tejido que sobreexpresa mas PAI-1 (92.7 veces).
Este es un dato importante ya que se debe recordar que los individuos con
SW mueren principalmente de infarto al corazón.
37
FIGURA 12.- Comparación de niveles de expresión de PAI-1 en ratones normales y
transgénicos en los diferentes tejidos estudiados. Los valores mostrados son una media de todos los
ratones de todas las edades.
38
La presencia de las proteínas WRNp y PAI-1p en los diferentes tejidos se
demostró mediante Western blot.
La figura 13 muestra los resultados utilizando los diferentes tejidos extraídos
de ratones de 3 meses de edad. Se muestran el páncreas, corazón, cerebro y
testículo de un ratón normal y solamente el corazón de un ratón transgénico.
Pueden observarse las dos isoformas de PAI-1 (4.4 KD y 2.9 KD), presentes
en todos los tejidos ensayados.
39
FIGURA 13.- Presencia de WRN y PAI-1 en ratones normales (WRN+/+) y ratones
transgénicos
(WRN-/-) por Western blot. Se escogieron muestras al azar de diferentes tejidos de
ratones adultos de 3 meses. Para observar la presencia de WRN y PAI-1, se obtuvieron lisados
celulares de los diferentes tejidos y se sometieron a electroforesis PAGE-SDS. Los geles fueron
electrotransferidos a membranas de nitrocelulosa (Immobilon-P
MR
Millipore) e hibridados con
anticuerpos policlonales específicos para PAI-1 y WRN; se utilizó un anticuerpo anti conejo acoplado a
biotina como segundo anticuerpo. Las membranas fueron reveladas con un kit biotina-avidina
(Vectastin
MR
MR
; VECTOR) y el reactivo RPN2109
(Amersham) para detección con peroxidasa.
40
Con el fin de demostrar la interacción directa entre la proteína WRNp y el gen
de PAI-1, se llevo a cabo un ensayo de retardamiento de la movilidad electroforética
de la región reguladora del gen PAI-1 (obtenido mediante PCR a partir de DNA
genómico de humano) cuando WRNp está presente. Los resultados de dicho ensayo
se muestran en la figura 14.
Se puede observar que RR-PAI-1 solo, tiene mayor movilidad electroforética
que cuando WRNp está presente en la solución.
Las bandas obtenidas cuando WRNp está presente en la solución, puede
interpretarse como la unión entre WRNp y RR-PAI-1.
41
FIGURA 14.- La región reguladora del gen PAI-1, obtenida por PCR a partir de DNA genómico
humano, fue incubada 30 min a 25°C con diferentes concentraciones de WRN recombinante (5, 50,
200 nM) en buffer conteniendo: 100 mm de Tris (pH7.5), 10 mM de MgCl2, 200 mM de NaCl, 500
µg/ml de BSA y 10 mM de DTT. 25 µl de cada mezcla fue analizada por electroforesis en geles de
agarosa al 3 %. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio. Las imágenes fueron obtenidas con
un analizador de imágenes Gel. Doc de BIO-RAD.
42
La expresión de WRN fue inhibida mediante un oligonucleótido antisentido,
transfectado en fibroblastos de ratón 3T3 cultivados “in vitro”.
La expresión de WRN y PAI-1 fue evaluada mediante RT-PCR a diferentes
tiempos post-transfección. La figura 15 muestra los resultados de la expresión de
WRN y la figura 16 los resultados de la expresión de PAI-1.
FIGURA 15.- Expresión de la proteína de WRN en diferentes tiempos de transfección de
ANTI-WRN.
43
FIGURA 16.- Expresión de la proteína de PAI-1 en diferentes tiempos de transfección de
ANTI-WRN.
44
DISCUSION
Hemos estudiado el papel, que la helicasa WRNp tiene sobre la expresión de
PAI-1 y se encontró que probablemente interviene en la regulación de su expresión,
actuando como un represor. Según los datos obtenidos en este estudio, la expresión
de WRN tiende a disminuir con el envejecimiento (figura 10), mientras que la
expresión de PAI-1 tiende a aumentar (figura 11) en todos los tejidos estudiados.
Además, la ausencia de WRNp en el organismo (WRN-/-), causa sobreexpresión de
PAI-1 (figura 12). El mayor efecto de la falta de WRNp se encontró en corazón y
testículo, tejidos que se ven más afectados en los individuos con SW. La actividad
reguladora que tiene WRNp posiblemente se extiende a genes que tienen diferentes
funciones según el tipo celular en donde WRN se exprese y que es ésta la causa de
que las mutaciones en WRN puedan ocasionar gran cantidad de trastornos
relacionados con diabetes, aterosclerosis, hipogonadismo, atrofia de la piel, atrofia
de grasa subcutánea, etc. En humanos sanos el RNAm de WRNp se ha encontrado
en células epiteliales de tubos seminíferos y células de Leydig en testículos; en
células hacinares de páncreas y las zonas fascicular y reticular en la corteza de las
glándulas adrenales.(29) Los factores de transcripción SP1 y AP2 (que regulan WRN)
aparecieron de una manera edad dependiente en aquellas regiones donde WRN se
expresó (SP1 en testículo y adrenales y AP2 en páncreas; 29)
En este estudio, la expresión de PAI-1, se elevó hasta 68.6 veces y 58.8
veces en testículo y páncreas respectivamente, en los ratones transgénicos
(WRN -/-; figura 12) indicando que estos son los principales órganos afectados
cuando WRNp no está presente en el organismo. Sin embargo en este estudio, el
corazón fue el órgano que sobreexpresó PAI-1 en mayor cantidad
(92.7 veces;
figura 12) posiblemente el mismo efecto se lleve a cabo en humanos y esta sea la
causa de que gran parte de los individuos afectados con SW, mueran de infarto al
corazón. Hasta hace poco se pensaba que los individuos con SW no presentaban
alteraciones del sistema nerviosos central relacionados con la edad, sin embargo
recientemente se demostró que los individuos con SW pueden tener alteraciones en
45
el sistema nervioso central, que incluyen la acumulación del péptido beta
(30)
. En
nuestro estudio en ratones, el cerebro también expresó gran cantidad de WRN y se
elevó la expresión de PAI-1 (hasta 20.5 veces; figura 12), cuando WRNp no estuvo
presente. Los resultados anteriores, nos hicieron pensar que WRNp posiblemente
podría intervenir directamente en la expresión de PAI-1, como un factor regulador de
la expresión. Estudiando ésta interacción por medio de ensayos de retardamiento de
la
movilidad
electroforética,
nosotros
encontramos
que
WRNp
se
une
específicamente a la región reguladora del gen PAI-1 (figura 14) y posiblemente
actúe como regulador negativo de dicha expresión. Nosotros quisimos demostrar la
sobreexpresión de PAI-1 inhibiendo la expresión de WRN en un cultivo celular de
fibroblastos, sin embargo no pudimos demostrar el aumento en la expresión de
PAI-1. Aún así, nuestros resultados apoyan fuertemente la hipótesis de que WRNp
está actuando como un factor de transcripción del gen de PAI-1.
No es raro encontrar casos en los que los factores de transcripción tienen
actividad de helicasa
(31; 32)
y este parece ser el caso de la actividad de WRNp sobre
la expresión de PAI-1, encontrada en el presente estudio. Recientemente se ha
demostrado que WRNp interviene en la transcripción de una RNA Polimerasa
demostró que WRNp se une al surco menor de una DNA Polimerasa
(34)
es regulada y fosforilada por una proteína cinasa dependiente de DNA
(33)
. Se
y que WRNp
(35; 36)
, lo que
habla de su naturaleza regulatoria. Todos estos hechos, apoyan nuestras
observaciones de que WRNp está actuando en la regulación de la expresión de PAI1 y posiblemente en la regulación de la expresión de otros muchos genes que aún no
han sido estudiados.
Es importante hacer notar que los tejidos más afectados en los individuos con
SW, son aquellos donde WRN se expresa en mayor nivel (páncreas, testículo,
corazón, piel; 5), de tal modo que posiblemente, la actividad de factor de transcripción
regulador de WRNp, no se limite a PAI-1, sino que esté involucrada en la regulación
de otros genes y que, cuando WRN falta (como es el caso del SW), se origine el mal
funcionamiento de los tejidos a través de la sobreexpresión o subexpresión de estos
46
genes. En páncreas, actuando en genes que, cuando están desregulados producen
diabetes. En testículo y ovarios, actuando sobre genes que, cuando están
desregulados pueden ocasionar hipogonadismo, etc. Algunos otros genes sobre los
cuales WRN pudiera actuar como factor de transcripción son: la molécula de
adhesión intracelular tipo 1 (ICAM-1; que también se ha postulado como posible
factor de riesgo para aterosclerosis), la fibronectina (indispensable para la
diferenciación de fibroblastos) y el receptor activado por proliferador de peroxisomas
gamma (PPARγ; el cual se ha descrito como receptor a drogas sensibles a insulina y
cuyos genes blanco regulan la diferenciación de adipositos y regulan la
concentración de glucosa y lípidos en plasma (37).
La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial, casi todos los estudios
encaminados a entender el proceso aterosclerótico se basan en el hecho de que,
independientemente del agente etiológico que la dispare, la aterosclerosis es
producida por un daño en la pared vascular, este daño debe ser sistémico, ya que
una persona que tiene un proceso aterosclerótico avanzado, está propensa a sufrir
gran cantidad de trastornos (diabetes mellitus, infarto al miocardio, infarto
cerebrovascular, obesidad, etc.) Posiblemente los genes que promueven el estado
aterosclerótico, no sean muchos, pero el efecto debe ser solamente cuestión de
susceptibilidad (polimorfismos) del tejido que es afectado mas fácilmente por estos
genes desregulados. Esto nos habla de que los genes desregulados posiblemente
tengan también actividad de regulación de la transcripción, esto es, que sean
factores de transcripción, como es el caso de WRNp.
47
CONCLUSIONES
En ratones normales los niveles de expresión de WRN disminuyeron con el
envejecimiento de los individuos.
En ratones normales los niveles de expresión de PAI-1 aumentaron con el
envejecimiento de los individuos.
Los niveles de expresión de PAI-1 aumentan decenas de veces, cuando
WRNp no está presente (individuos WRN -/-).
La proteína WRNp puede unirse a la región reguladora del gen PAI-1
demostrando su posible actividad reguladora.
48
PERSPECTIVAS
En los pacientes con SW, los tejidos que primero desarrollan problemas
relacionados con aterosclerosis, son aquellos donde WRNp se expresa en mayor
cantidad, en condiciones normales; esto es, los tejidos más afectados son aquellos
en donde la actividad o actividades de WRNp hacen falta: páncreas (diabetes
mellitus), corazón (infarto al miocardio) piel (fibrosis, atrofia y ulceración) tejido
adiposo (atrofia), gónadas (atrofia;1, 2, 4), además se ha observado que estos mismos
tejidos sobreexpresan PAI-1 cuando sufren algún daño, aun cuando este no sea
ocasionado por la falta de WRNp: páncreas
(38)
; corazón
(39)
, piel
(40; 41; 42)
;
gónadas (43, 44).
Tal parece ser que los tejidos mas afectados cuando WRNp hace falta en el
organismo, son aquellos relacionados con la línea fibroblástica.
Ya que WRNp es importante en la regulación de genes que intervienen en el
proceso aterosclerótico, es muy importante conocer las vías en las cuales WRNp
actúa.
Recientemente se ha demostrado que además de PAI-1, existe una elevada
concentración de la molécula de adhesión intracelular tipo 1 (ICAM-1) en sangre de
individuos con SW
(23)
. Se ha encontrado también un aumento en la producción de
fibronectina en cultivos de fibroblastos provenientes de pacientes con SW (45).
De tal manera que las perspectivas de este trabajo serían determinar si WRNp
actúa también como factor regulador en la expresión de estas proteínas (ICAM-1 y
fibronectina), además de estudiar el mismo efecto, sobre el gen PPARγ que es un
regulador de la diferenciación de adipositos, implicado en la patología de numerosas
enfermedades que incluyen obesidad, diabetes, aterosclerosis y cáncer y requiere la
misma vía de señalización de la proteína PAI-1
fisiológica con diabetes mellitus.
49
(46)
, además de que tiene conexión
ANEXOS
Glosario.
Anticuerpo: Es una proteína (inmunoglobulina) producida por los linfocitos B que
reconoce un “antígeno” extraño particular, y pone así en marcha la respuesta
inmune.
Antisentido: Es la cadena de DNA que dirige la síntesis de RNAm por medio de los
pares complementarios de bases.
DNA Polimerasa: Es una enzima que puede sintetizar una nueva cadena de DNA a
partir de una cadena molde.
RNA Polimerasa: Es una enzima que sintetiza RNA utilizando un molde de DNA
(descrita formalmente como RNA polimerasa-DNA dependiente).
RNA Replicasa: Es una enzima que sintetiza RNA utilizando un molde RNA
(utilizada para la replicación por los virus RNA).
Cariotipo: Es el complemento cromosómico completo de una célula o de una
especie (tal y como se ve durante la mitosis).
Clon: Describe un gran numero de células o de moléculas idénticas a una molécula
o célula ancestral única.
Código Genético: Es la correspondencia entre los tripletes en el DNA (o RNA) y los
aminoácidos de las proteínas.
Codon: Es un triplete de nucleótidos que representa un aminoácido o una señal de
terminación.
50
Correpresor: Es una pequeña molécula que pone en marcha la represión de la
transcripción uniéndose a una proteína reguladora.
Cromosoma: Es una unidad discreta del genoma que transporta muchos genes.
Cada cromosoma consiste en una molécula muy larga de DNA dúplex y una masa
aproximadamente igual de proteínas. Sólo es visible como entidad morfológica
durante la división celular.
Desnaturalización: Del DNA o del RNA describe su conversión desde la cadena
doble al estado de cadena sencilla; la separación de las cadenas se consigue sobre
todo mediante calentamiento.
Dominio: De una proteína es una parte continua discreta de la secuencia de
aminoácidos que se puede asimilar con una función en particular.
Endonucleasas: Son enzimas que rompen uniones dentro de una cadena de un
ácido nucleico; pueden ser especificas para el RNA o bien para DNA de cadena
sencilla o doble.
Enzimas de Restricción: Son las que reconocen secuencias cortas especificas del
DNA y rompen el dúplex (a veces en un sitio blanco, a veces en otro, dependiendo
del tipo).
Exón: Es cualquier segmento de un gen interrumpido que esta representado en el
producto del RNA maduro.
Exonucleasas: Estas rompen los nucleótidos uno cada vez desde el extremo de una
cadena de polinucleótidos; pueden ser especificas bien para el extremo 5´ o 3´ del
DNA o del RNA.
51
Fenotipo: Es el aspecto u otras características de un organismo, que resulta de la
interacción de su constitución genética con el medio.
Fosfatasa: Es una enzima que elimina grupos fosfato de los sustratos.
Fragmento de Okasaki: Son fragmentos cortos de 1000-2000 bases, que se
producen durante la replicación, ellos actúan en la cadena retrasada del DNA.
Gen: Es el segmento de DNA involucrado en producir una cadena polipeptídica;
comprende regiones que preceden y siguen a la región codificadora (líder y cola) así
como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificadores individuales.
Gen Regulador: Es el que codifica un RNA o un producto proteínico cuya función es
controlar la expresión de otros genes.
Genotipo: Es la constitución genética de organismo.
Helicasa: Es una enzima que separa las cadenas de DNA, utilizando por lo general
la hidrólisis del ATP para proporcionar la energía necesaria.
Hibridación: Es el apareamiento de cadenas complementarias de DNA y RNA para
dar lugar a un híbrido DNA-RNA.
Hibridación en Situ: Es la que se lleva a cabo desnaturalizando el DNA de células
aplastadas sobre un cristal portaobjetos de manera que es posible la reacción con un
DNA o RNA de cadena sencilla añadidos; la preparación añadida es etiquetada de
forma radiactiva y su hibridación se sigue mediante autorradiografía.
Horquilla: Describe una región de doble hélice formada por apareamiento de bases
entre secuencias complementarias adyacentes (invertidas) en una cadena única de
RNA o DNA.
52
Horquilla de Replicación: Es el punto en el que se separan las cadenas del DNA
dúplex parental de manera que se puede llevar a cabo la replicación.
Intrón: Es un segmento de DNA que se transcribe, pero que es eliminado del interior
de la transcripción por un splicing entre las secuencias de los (exones) situados a
cada lado del mismo.
Marcador: (DNA) fragmento de tamaño conocido que se usa para calibrar un gel de
electroforesis.
Mutación Nula: Es la que elimina completamente la función de un gen, por lo
general porque lo borra físicamente.
Oncogenes: Son genes cuyos productos tienen la capacidad de transformar células
eucarióticas de manera que crecen de manera análoga a las células tumorales. Los
oncogenes transportados por retrovirus tienen nombres de la forma v-onc.
Origen (ori): Es una secuencia de DNA donde se inicia la replicación.
Par de Bases (pb): Es un apareamiento de A con T o de C con G en una doble
hélice de DNA; se pueden formar otros pares en el RNA bajo determinadas
circunstancias.
PCR (Reacción en cadena de polimerasa): Describe una técnica en la que se
utilizan ciclos de desnaturalización, primers y extensión con DNA polimerasa para
amplificar el número de copias de una secuencia blanco de DNA hasta > 106 veces.
Polimorfismo: Se refiere a la presencia simultanea en la población de genomas que
muestran variaciones alélicas (como se ven bien en alelos que producen fenotipos
diferentes o, por ejemplo, en cambios en el DNA que afectan al patrón de
restricción).
53
Primers: Es una secuencia corta (a menudo de RNA) que está apareada con una
cadena de DNA y proporciona un extremo libre 3´-OH donde un DNA polimerasa
comienza la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.
Promotor: Es una región del DNA que participa en la unión de la RNA polimerasa
para iniciar la transcripción.
Proteínas de Acción Cis: Tienen la propiedad excepcional de actuar solamente en
la molécula de DNA a partir de la cual se expresan.
Proteínas Reguladoras Positivas: Son las necesarias para la activación de una
unidad de transcripción.
Replicación: Es la que se logra separando las cadenas de un dúplex parental,
actuando entonces cada una de las cadenas como molde para la síntesis de una
complementaria.
Splicing: Describe la eliminación de intrones y la unión de los exones en el RNA;
así, los intrones se eliminan, mientras que los exones se empalman unos con otros.
Supresor: Es habitualmente un gen que codifica un RNA mutante que lee el codón
mutado bien en el sentido del codón original o para dar un sentido alternativo del
significado original.
Traducción: Es la síntesis de proteínas sobre el molde de RNAm.
Transcripción: Es la síntesis del RNA sobre un molde de DNA.
Transfección: De células eucarióticas es la adquisición de nuevos marcadores
genéticos por la incorporación de un DNA añadido.
54
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